NKS is supported by NIH award K08 AI108690.

Tüm çalışmalar Laboratuar Hayvanları Bilimi için Amerikan Derneği (AALAS) tarafından belirlenen veteriner standartlarını karşılayan Harvard Tıp Okulu&#39;nda Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) göre sıkı inceleme ve kuralları uyarınca yapılmıştır. Co-konut yoluyla Bakterilerin 1. Yatay İletim (İsteğe bağlı) <ol><li> yiyecek ve her ikisi de otoklavlanmış edilmiş su kullanarak, steril tek kullanımlık kafesleri montaj sırasında (gnotobiyotik fareler kullanılarak özellikle) eksojen kontaminasyonu en aza indirmek için, aseptik teknik uygulama. </li><li> Kullanım kulak yumruklar veya etiketleri tek tek farklı microbiotas liman ve aynı kafeste onlara ev 6 haftalık C57BL / 6 fareler işaretlemek için. fareler coprophagic ve kafes yerden fekal pelet yemek göz önüne alındığında, mikroplar doğal fareler arasında yatay iletilecektir. </li><li> ≥1 hafta Co-ev fareler analizden önce mikrobiyal transferi ve immünolojik değişim için zaman tanımak için. </li></ol&gt; Küçük bağırsak intraepitelyal Katman ve lamina propria bir Tek Hücre Süspansiyon 2. Hazırlık <ol><li> Çözümler hazırlanması <ol><li> (Ince bağırsak başına) Ekstraksiyonu hazırlanması: 30 ml RPMI + 93 ul% 5 ditiyotreitol (DTT) (w / v) + 60 ul 0.5 M EDTA + 500 ul cenin sığır serumu (FBS). Kullanmadan önce hemen DTT ekleyin. </li><li> 25 ml RPMI + 12.5 mg dispase + 37.5 mg kollajenaz II + 300 ul FBS: (ince bağırsağın başına) sindirim ortamı hazırlayın. Kullanmadan önce hemen dispase ve kollajenaz ekleyin. </li><li> 37 ° C, 37 ° C, ön ısıtılması çözeltiler gerçekleştirilen tüm inkubasyon için. </li></ol></li><li> Servikal dislokasyon tarafından takip CO 2 boğulma fare Euthanize. </li><li> aşağı fare dorsal yüzü koyun ve% 70 etanol ile karın püskürtün. sırayla fro ventral orta hat boyunca cilt ve sonra periton fasya keserek bir laparotomi gerçekleştirmek için makas kullanınböylece periton boşluğuna açığa kılıç şeklinde sürecine pubis eklemi m. </li><li> pilor sfinkter bölücü ile mideden ince bağırsağa ayırmak için makas kullanın. Yavaşça mezenterik yağ uzak alay, periton ince bağırsak kaldırın. <ol><li> Tamamen ince bağırsak kaldırmak için, ileo-çekal kavşakta ikinci bir kesim yapmak. Soğuk izole edilmiş ince bağırsağa yerleştirin (yani., 4 ° C),% 10 FBS içeren RPMI hücre canlılığı üst düzeye çıkarır. </li></ol></li><li> Yavaşça kavisli bir forseps kullanarak yağ büyük parçalar çıkarın. yağ çıkarmak isterken bağırsak dokusu kendisini yırtılmasını önlemek için dikkatli kullanın. </li><li> bir şırınga yapıştırılmış bir 18 G besleme iğne kullanılarak soğuk PBS 20 ml - 15 ile bağırsak içeriği, hafifçe yıkayın bağırsakları kaldırmak için. </li><li> PPS tüketim için makas kullanın ve% 5 FBS içeren soğuk RPMI içine koyun. PPs ince bağırsak antimezenterik tarafında bulunur ve bir çok-lobüle beyaz görünürkitle. 12 PPS - Belirli zorlanma bağlı olarak, bir fare, genellikle 8 sahiptir. </li><li> 4 inçlik segmentlerine - 3 içine ince bağırsak kesti. </li><li> uzak dokudan yağ kızdırmak için sıkıcı bir neşter kullanılarak, RPMI ile nemlendirilmiş bir kağıt havlu üzerine her ince bağırsak segmenti yuvarlayarak kalan yağ çıkarmak. </li><li> kavisli bir forseps ile bağırsak segmentleri kanüle ve doku distal ucunu tutarak dışarı içinde doku çevirin. Sonra yavaşça doku ters olan sonuçlanan (proksimal ucunda başlar) kavisli bir forseps doku segmenti çıkarmak için düz forseps bir çift kullanın. </li><li> 30 emme ml ortam ve bir karıştırma çubuğu ihtiva eden bir kap içinde, doku bölümleri yerleştirin. fincan kapağı elde edin ve 37 ° C&#39;de 15 dakika boyunca 500 rpm&#39;de karıştırıldı; karıştırma dinç ama çalkantılı olmamalıdır. </li><li> kuluçkadan sonra bulutlu görünmelidir epitel içeren süpernatant, doku parçaları ayırmak için çelik süzgeç kullanın. Bu yüzer madde i içerir2.23 - adımda 2.18 numune süzme işlem yolu ile, arzu edildiği takdirde daha da analiz edilebilir ntraepithelial lenfositler. </li><li> El ile artık çıkarma medya yıkayacak RPMI doku parçaları çalkalayın. </li><li> kuru bir kağıt havlu üzerine doku yerleştirin ve ekstraksiyon ortamı tarafından serbest değildi bakiye mukus çıkarılmasını kolaylaştırmak için son birkaç kez sona çevirin. </li><li> Sindirim ortamının 600 ul, 1.5 ml bir tüp içinde doku parçaları yerleştirin. </li><li> parçalar artık makas sopa ve çözüm homojen görünene kadar doku kıyma için makas kullanın. Bu adım, doku tam enzimatik sindirim sağlamak için çok önemlidir. </li><li> sindirim medya 25 ml içeren bir bardağa kıyılmış ince bağırsak ekleyin. 37 ° C&#39;de 30 dakika boyunca 500 rpm&#39;de karıştırılır. Yarım sindirim yoluyla (yani., 15 dk), pipetlemeyin yukarı ve serolojik pipet ile aşağı dokusunun herhangi büyük boyutta break up yardımcı olur. </li><li> Filtre Sindirilmiş doku (veya epithadım 2.12 Elial tabaka halinde 50 ml&#39;lik bir tüp içine 100 mikron hücre süzgecinden işleme IELS). % 10 FBS ihtiva eden RPMI 20 ml süzgeç durulayın. </li><li> 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 500 x g&#39;de filtre solüsyonu santrifüjleyin. </li><li> Dikkatle% 10 FBS ihtiva eden RPMI 1 ml süpernatan ve tekrar süspansiyon pelet süzün. </li><li> Filtre 50 ml&#39;lik bir tüp içine, 40 mikron hücre süzgecinden hücreler yeniden süspansiyon haline getirildi. % 10 FBS ihtiva eden RPMI 20 ml süzgeç durulayın. </li><li> Santrifüj, 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 500 xg&#39;de çözelti filtre edilmiştir. </li><li> Dikkatle% 2 FBS içeren RPMI 1 ml süpernatan, ve tekrar süspansiyon pelet süzün. </li></ol> Peyer yamaları tek bir hücre süspansiyonu 3. hazırlanması <ol><li> Transferi 25 sindirim medya ml ve bir karıştırma çubuğu ile bir fincan PPS eksize. Güvenli kapağı ve 37 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 500 rpm&#39;de döndürün. </li><li> Filtre 50 ml&#39;lik bir tüp içine 40 mikron hücre süzgecinden PPS sindirilmiş. herhangi bir yığınının Rema Eğeriçinde, bir 1 ml şırınga pistonu düz ucunu kullanarak süzgeç aracılığıyla basın. </li><li> % 10 FBS ihtiva eden RPMI 10 ml süzgeç durulayın. </li><li> Santrifüj, 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 500 xg&#39;de çözelti filtre edilmiştir. </li><li> Dikkatle% 2 FBS içeren RPMI 1 ml süpernatan, ve tekrar süspansiyon pelet süzün. </li></ol> Akım Sitometrisi 4. Yüzey Boyama <ol><li> Hücre kısım uygun hacmi (örneğin., LPLs 200 ul) 96-çukurlu yuvarlak tabanlı plaka. </li><li> 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 500 x g&#39;de santrifüjleyin. plakayı ters çevirerek süpernatant süzün. </li><li> RPMI% 2 FBS içeren 90 ul içinde süspanse hücreleri ve bir 1: anti-CD16 / 32 (Fc Block) 100 dilüsyon. 4 ° C&#39;de 10 dakika süreyle inkübe edilir. </li><li> 10 ul PBS ekleyin. 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 500 x g&#39;de santrifüjleyin. plakayı ters çevirerek süpernatant süzün. </li><li> 250 ul PBS içinde süspanse edin hücreleri. 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 500 x g&#39;de santrifüjleyin. tarafından decant süpernatantplakayı tersini. </li><li> üreticinin protokolünü takip ederek, eğer istenirse canlılığı boya ile (isteğe bağlı) boyama hücreleri. </li><li> 100 ul% 1 formalin içinde süspanse hücreler düzeltmek için. 4 ° C&#39;de karanlıkta 1 saat süreyle inkübe edin. </li><li> 200 ul PBS ekleyin. 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 500 x g&#39;de santrifüjleyin. plakayı ters çevirerek süpernatant süzün. </li><li> 250 ul PBS içinde süspanse edin hücreleri. 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 500 x g&#39;de santrifüjleyin. plakayı ters çevirerek süpernatant süzün. </li><li> 200 ul PBS içinde süspanse edin hücreleri. bir akış sitometresinin kullanarak hücrelerin analiz edin. </li></ol>

<ol>
	<li>Cummings, D. E., Overduin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastrointestinal+regulation+of+food+intake.">Gastrointestinal regulation of food intake.</a> J Clin Invest. 117 (1), 13-23 (2007).</li><li>Mowat, A. M., Agace, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regional+specialization+within+the+intestinal+immune+system.">Regional specialization within the intestinal immune system.</a> Nat Rev Immunol. 14 (10), 667-685 (2014).</li><li>Round, J. L., Mazmanian, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gut+microbiota+shapes+intestinal+immune+responses+during+health+and+disease.">The gut microbiota shapes intestinal immune responses during health and disease.</a> Nat Rev Immunol. 9 (5), 313-323 (2009).</li><li>Sartor, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+influences+in+inflammatory+bowel+diseases.">Microbial influences in inflammatory bowel diseases.</a> Gastroenterology. 134 (2), 577-594 (2008).</li><li>Tlaskalova-Hogenova, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Commensal+bacteria+(normal+microflora),+mucosal+immunity+and+chronic+inflammatory+and+autoimmune+diseases.">Commensal bacteria (normal microflora), mucosal immunity and chronic inflammatory and autoimmune diseases.</a> Immunol Lett. 93 (2-3), 97-108 (2004).</li><li>Wen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+immunity+and+intestinal+microbiota+in+the+development+of+Type+1+diabetes.">Innate immunity and intestinal microbiota in the development of Type 1 diabetes.</a> Nature. 455 (7216), 1109-1113 (2008).</li><li>Pabst, R., Russell, M. W., Brandtzaeg, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+distribution+of+lymphocytes+and+plasma+cells+and+the+role+of+the+gut.">Tissue distribution of lymphocytes and plasma cells and the role of the gut.</a> Trends Immunol. 29 (5), 206-208 (2008).</li><li>Surana, N. K., Kasper, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+yin+yang+of+bacterial+polysaccharides:+lessons+learned+from+B.+fragilis+PSA.">The yin yang of bacterial polysaccharides: lessons learned from B. fragilis PSA.</a> Immunol Rev. 245 (1), 13-26 (2012).</li><li>Surana, N. K., Kasper, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+the+tete-a-tete+between+the+microbiota+and+the+immune+system.">Deciphering the tete-a-tete between the microbiota and the immune system.</a> J Clin Invest. 124 (10), 4197-4203 (2014).</li><li>Gauguet, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+microbiota+of+mice+influences+resistance+to+Staphylococcus+aureus+pneumonia.">Intestinal microbiota of mice influences resistance to Staphylococcus aureus pneumonia.</a> Infect Immun. , (2015).</li><li>Ochoa-Reparaz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+polysaccharide+from+the+human+commensal+Bacteroides+fragilis+protects+against+CNS+demyelinating+disease.">A polysaccharide from the human commensal Bacteroides fragilis protects against CNS demyelinating disease.</a> Mucosal Immunol. 3 (5), 487-495 (2010).</li><li>Wu, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gut-residing+segmented+filamentous+bacteria+drive+autoimmune+arthritis+via+T+helper+17+cells.">Gut-residing segmented filamentous bacteria drive autoimmune arthritis via T helper 17 cells.</a> Immunity. 32 (6), 815-827 (2010).</li><li>Goodyear, A. W., Kumar, A., Dow, S., Ryan, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+murine+small+intestine+leukocyte+isolation+for+global+immune+phenotype+analysis.">Optimization of murine small intestine leukocyte isolation for global immune phenotype analysis.</a> J Immunol Methods. 405, 97-108 (2014).</li><li>Chung, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gut+immune+maturation+depends+on+colonization+with+a+host-specific+microbiota.">Gut immune maturation depends on colonization with a host-specific microbiota.</a> Cell. 149 (7), 1578-1593 (2012).</li><li>Resendiz-Albor, A. A., Esquivel, R., Lopez-Revilla, R., Verdin, L., Moreno-Fierros, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Striking+phenotypic+and+functional+differences+in+lamina+propria+lymphocytes+from+the+large+and+small+intestine+of+mice.">Striking phenotypic and functional differences in lamina propria lymphocytes from the large and small intestine of mice.</a> Life Sci. 76 (24), 2783-2803 (2005).</li><li>Carrasco, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+lymphocyte+isolation+methods+for+endoscopic+biopsy+specimens+from+the+colonic+mucosa.">Comparison of lymphocyte isolation methods for endoscopic biopsy specimens from the colonic mucosa.</a> J Immunol Methods. 389 (1-2), 29-37 (2013).</li><li>Van Damme, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+agents+and+enzymes+used+for+the+extraction+of+gut+lymphocytes+influence+flow+cytometric+detection+of+T+cell+surface+markers.">Chemical agents and enzymes used for the extraction of gut lymphocytes influence flow cytometric detection of T cell surface markers.</a> J Immunol Methods. 236 (1-2), 27-35 (2000).</li></ol>

No conflicts of interest declared.

Biz izolasyonu için bir protokol mevcut ve PPS&#39;de LPLs, IELS ve lenfositler de dahil olmak üzere ince bağırsak lenfosit, sitometrik karakterizasyonu akar. Mikrobiyota değişiklikler ince bağırsak bağışıklık sistemini nasıl etkilediğini değerlendirmek ilgilenenler için, detay farklı microbiotas barındıran fareler arasında organizmaların yatay iletim dahil basit adımlar. Bu protokol, ince bağırsakta odaklanır rağmen, prosedür tek fark hiçbir PPs kaldırmak için vardır (kolon yamalar mevcut olmasına rağmen, bunlar fena halde genelde görünmez) varlık ile, kalın bağırsağın analizi için aynıdır. ince bağırsak dokusundan lenfositlerin optimum izolasyon ulaşmada birkaç temel adım vardır. adipoz dokudan titiz kaldırma lenfosit canlılığı ve optimal verim sağlamak için kesinlikle çok kritiktir. Buna ek olarak, DTT ekstre kullanılan önemli bir mukolitik birEpitel hücrelerinin. istikrarsız doğası göz önüne alındığında, yeniden dondurma kullanılmayan hacim ≤-20 ° C de% 5 çözeltisi tek kullanımlık alikotları depolamak olup öneriyoruz. EDTA epitel hücreleri 15 çıkarılmasına yardımcı olmak için ekstraksiyon ortamı olarak kullanılır, ancak varlığı - hem de aşırı FBS ya da mukus - sindirim süreci sırasında kolajenazları inhibe edebilir. Kolajenaz kullanılan konsantrasyonu farklı olarak yüzey işaretleyici ifade ve hücre canlılığı 13,16,17 etkilediği gösterilmiştir. Ayrıca, ilgi konusu yüzey işaretleyici bağlı olarak, kolajenaz farklı bir formülasyon (ör., Kolajenaz tip I, II, VI ya da VIII) 13,17 optimaldir olabilir. Bazı ampirik optimizasyonu partiden partiye değişiklik, belirli bir çok ve kolajenaz göreli aktivite seviyesine bağlı olarak, belirli bir deney soruya bağlı olarak gerekli olabilir. Ayrıca, ek optimizasyon Belir bağlı olarak gerekli olabiliric zorlanma ve fare yaşı kullanılır. Örneğin, burada listelenen kez ~ 6 hafta eski C57BL / 6 fare için optimize edilmiştir; A ~ 8 haftalık İsviçre Webster fare için, sindirim süresi 40 dakikaya artırılabilir. Özetle, biz ince bağırsak lamina propria lenfositler, intraepitelyal tabaka ve PPS izolasyonu için ayrıntılı bir protokol hazırladık. Bir kez hakim bir makul 4 fareler işlemek ve ~ 4 saat boyanma hazır tek hücre süspansiyonları olabilir. Biz akım sitometri karakterizasyonu için bu hücrelerin hemen boyama tarif olsa da, bir alternatif olarak, sitokin üretimini değerlendirmek diğer hücre tipleri ile in vitro etkileşimleri bakmak için transkripsiyon ve / veya proteomik analizler, ya da kültür hücreleri hücreleri sıralamak için bu hücreleri uyarabilir. Bu lenfosit popülasyonu odaklanmış Dahası, bu protokol, aynı zamanda miyeloid hücreleri incelemek için kullanılabilir. Tek ce izole etmek, birlikte bu aerodinamik yaklaşım benimsemiştirçeşitli bağırsak bölmelerden ll nüfusları bir sorguya sağlar hem de çeşitli faktörler (örneğin., Mikrobiyota, diyet antijenler) bu hücreler ekstra-bağırsak hastalıkları ilgili olabilir ne de bağırsak bağışıklık sisteminin ontogenezini etkilemek ve nasıl.

İnce bağırsağın temel görevi, genellikle besinlerin 1 sindirim ve emilim olarak kabul edilir. Bu metabolik fonksiyon açıkça gerekli iken, ince bağırsak lümeninin 2 içinde bulunan çevresel antijenlere sürekli baraj konağı korunmasında eşit derecede önemli bir role sahiptir. Bağırsak dış dünyayı ayıran (örn., Lümen antijenler) Sadece tek bir hücre tabakası kalınlığında bir epitel tabakası ile konağın iç ortamdan. Bu şekilde, ince bağırsak, bağışıklık sistemi, işgalci patojenlere karşı güçlü bir yanıtın monte ederken, minimal mukoza girmek için diyet ve ortakçı mikroplardan yabancı antijenleri sağlayan, herhangi bir halinde, bir bağışıklık tepkisi reaktivite için eşik dengeleme üstün görevi, öteki &quot;zararlı&quot; antijenler. Bu antijenlere karşı aşırı ya da uygunsuz immün yanıtlar (patolojik hastalığa yol açabilir, örneğin., Inflamasyonedici bağırsak hastalığı, tip I diyabet, çok merkezli skleroz) ve 3-6 kaçınılmalıdır. Genel olarak, mide-bağırsak yolu, tüm antikor salgılayan hücreler 7% 70 üzerinde içeren, vücudun en büyük immün organı temsil ettiği düşünülmektedir. Lamina propriya (LP), intraepitelyal tabaka ve Peyer yamaları (PPS) - - ince bağırsak bağışıklık sistemi 3 ana bölmeden oluşur, her lenfosit 2 ayırt edici bir grubu içerir. LP lenfositleri (LPLs) ~% 20 B hücreleri ile esas TCRαβ + T hücreleridir; intraepitelyal lenfositler (IELS) TCRαβ + T hücreleri daha TCRγδ + T hücreleri çok az sayıda B hücrelerini içeren; ve ince bağırsak duvarında gömülü ikincil lenfoid organlar PPs, ~% 80 B hücrelerini içerirler. Bu anatomik bölgelerin her biraz farklı fonksiyonları ve ontolojik üsleri olmasına rağmen, onlar işlev aharmonized moda patojenik hakaretlere gelen ev sahibi korumak için. Ayrıca, Mikrobiyota özel mikroplar ve özellikle hücre soylarının 8,9 ontogeny arasındaki soydaş ilişkinin tanıma artan bağırsak bağışıklık sisteminin gelişimi için kritik bir belirleyicisi olduğunu büyüyen takdir var. Ayrıca, bağırsak bağışıklık sisteminin eğitim anatomik uzak bölgelerde bağışıklık tepkilerini etkiler göz önüne alındığında (örneğin., Artrit, multipl skleroz, pnömoni), daha önce 10 tanıdı daha bağırsak bağışıklık sisteminin gelişmesi daha hastalık süreçleri ile ilgili olduğu açıkça ortaya çıktı -12. Bu nedenle, kantitatif bağırsak bağışıklık sistemini değerlendirirken ilgi şimdi konak-ortakçı etkileşimleri ve birçok sistemik hastalığın patogenezi de içerecek şekilde konak-patojen etkileşimleri aşmıştır. mevcut yöntemlerin değişkenliği göz önüne alındığındabağırsak lenfosit izolasyonu gerekli zamanı dengeleme giderek kritik iken verimi, canlılığı ve tutarlılık için optimize edilmiş bir yöntem. Percoll geçişlerini içeren protokoller, zaman ve emek yoğun ve insan hatası potansiyel olarak daha yatkındır değişken verim giden ve 13 canlılığı. Burada, 3 ince bağırsak immün bölmelerden lenfositlerinin izolasyonu ve karakterizasyonu için optimize edilmiş bir protokol sağlar. Buna ek olarak, mukozal bağışıklık sistemi mikrop kaynaklı değişikler verilen artan bir ilgi, bu değişikliklerin kantitatif bağırsak bağışıklık sistemini nasıl etkilediği değerlendirmek için fareler arasında mikroorganizmaların yatay aktarım sağlamak için kullanılabilir adımları içerir.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sterile Gloves</td>
			<td>Kimberly-Clark</td>
			<td>555092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sterile mouse cage</td>
			<td>Innovive</td>
			<td>MS2-AD</td>
			<td>contains lid, cage bottom, and alpha-dri bedding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>metal feeder</td>
			<td>Innovive</td>
			<td>M-FEED</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>water bottle</td>
			<td>Innovive</td>
			<td>M-WB-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>card holder</td>
			<td>Innovive</td>
			<td>CRD-HLD-H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>autoclavable rodent chow (NIH-31M)</td>
			<td>Zeigler</td>
			<td>4131207530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI medium 1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875-119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5545-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA (pH 8.0)</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>GemBio</td>
			<td>100-510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dispase II</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17105-041</td>
			<td>the concentration in the protocol is based on an activity level of 1.878 U/mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>collagenase, type II&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17101-015</td>
			<td>the concentration in the protocol is based on an activity level of 245 U/mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dissecting scissors</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>feeding needle (18 G, 2&#34; length)</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>FN-7905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 ml syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>305482</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Scalpel (15 blade)</td>
			<td>Miltex</td>
			<td>4-415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>curved forceps</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>straight forceps</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>multi-purpose cups, 120 ml</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89009-662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stir bar</td>
			<td>VWR</td>
			<td>58949-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>multi-position stir plate, 9-position</td>
			<td>VWR</td>
			<td>12621-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stainless steel conical strainer, 3 inch&#160;</td>
			<td>RSVP</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 ml tube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030 125.150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#956;m cell strainer</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>08-771-19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#956;m cell strainer</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>08-771-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate, round-bottom</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse CD16/32 (Fc block)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>101320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(optional) fixable viability dye eFluor 780</td>
			<td>eBiosciences</td>
			<td>65-0865-18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% formalin, neutral buffered</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>5725</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and flow cytometric characterization of murine small intestinal lymphocytes

bağırsaklar - Vücutta herhangi bir organın bağışıklık hücrelerinin en fazla sayıda içerirler - sürekli yabancı antijenleri, mikrobik ve diyet hem de maruz kalmaktadır. bağırsak sistemik hastalıkların bir dizi için kritik olan bu lümen antijenler immün yanıtı ve bağışıklık hücrelerinin eğitimin şekillenmesine yardımcı olduğunu giderek artan bir anlayış göz önüne alındığında, bağırsak bağışıklık sistemini karakterize ilgi var artmıştır. Bununla birlikte, bir çok yayınlanmış protokoller zor, zaman alıcıdır. Biz, hızlı, tekrarlanabilir ve zahmetli Percoll geçişlerini gerektirmez ince bağırsak lamina propria, intraepitelyal tabaka ve Peyer yamaları lenfositlerin izolasyonu için burada basitleştirilmiş bir protokol mevcut. Protokol, ince bağırsakta üzerine odaklanmış olmakla beraber, bu da kolon analizi için de uygundur. Ayrıca, biz belirli bir bilimsel ques bağlı olarak ek optimizasyon gerekebilir bazı yönlerini vurgulamakyon. Bu yaklaşım daha sonra, akış sitometrik analizinde ve özellikleri alternatif yollarla kullanılabilir uygulanabilir lenfositler, çok sayıda ayrı olarak elde edilir.

Splenositler (Şekil 1A ve 1B) halinde ileri içindeki ve yan saçılma özelliklere sahip farklı bir hücreler popülasyonu elde gereken ince bağırsak lenfositlerin tekli hücre süspansiyonları, akış sitometrik analizi. Doku izolasyon ilk aşamalarında, 4 ° C de muhafaza değilse lenfositleri daha düşük bir ileri dağılım olan ve diğer epitel ve ölü hücrelerden ayırmak için daha zor olan lenfosit popülasyonu ile sonuçlanan, kalıp başlayabilir (Şekil 1C) . Ince bağırsak dokusu tamamen mezenterik yağ temizliği değil Ayrıca, eğer, lenfositler (Şekil 1D) tam bir kayıp hemen hemen yoktur. Bu özellikler hızla çalışan nasıl örnek kalitesini sağlamak için gerekli olan (mezenterik yağ hatta küçük miktarlarda kaldırarak, yani.) (Yani., Doku ısınmak için izin verilmez) ve detaylara dikkat göstermektedir. Typically biz ~ ince bağırsak LPLs (Şekil 1 E)% 80 canlılığı elde. Şekil 2A Mikrobiyota bileşimi büyük ölçüde belirli bir hücre popülasyonlarının sayıları nasıl etkilediğini gösterir. Daha önce gösterildiği gibi, herhangi bir mikroorganizma tamamen yoksun olan mikropsuz (GF) fareler, spesifik patojensiz (SPF) fareler ile karşılaştırıldığında belirgin bir şekilde olgunlaşmamış küçük bağırsak bağışıklık sistemine sahip ve GF farelerin kolonizasyonu ince bağırsak, bağışıklık sisteminin 14 yeniden normal bir fare Mikrobiyota (MMB) sonuçları. Buna karşılık, gnotobiyotik fareler normal bir insan Mikrobiyota (Hmb) barındıran - ve bu benzer bir sayı ve MMB fareler gibi fekal bakteri çeşitliliği var - GF fareler 14 farksız olan bir ince bağırsak bağışıklık sistemi var. Dan yararlanmakFarelerin coprophagic doğa, eş-konut fareler bir araya fareler arasında organizmaların yatay iletimine izin veren için basit, ama güçlü bir yöntem temsil eder. Bu yaklaşım bir Mikrobiyota sonuçlanan değişim ince bağırsak bağışıklık sistemini etkileyip etkilemediğini test etmenizi sağlar. Bir örnek olarak, SI LP (Şekil 2B) 14, CD3 + CD8 + T hücrelerinin sayısı normalleşmesine yolaçtı, 4 hafta boyunca MMB farelerle co-gövde HMB fareler gösterdi. Farenin birbirine eş yuva üstesinden varyasyonlar - Bu sonuç, Şekil 2A&#39;da görülen MMB ve HMB fareleri arasındaki fark, bu fareler arasında Mikrobiyota değişimlerine bağlı olduğunu onaylar. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54114/54114fig1.jpg" /> . D. D - Şekil 1. Bağırsak Lenfositler FSC ve splenositler, A Benzer DGM Özellikleri sahipoptimal hazırlanan splenositlerin (A) ve ince bağırsak lamina propria (SI LP) hücreleri (- D B) SSC ve FSC gösteren ot araziler. B. SI LP örneği tarif edilen protokole göre hazırlandı. C. bağırsak doku kasıtlı SI LP hücreleri daha düşük bir FSC sahip başlar göstermek ısınmaya bırakılmıştır. D. mezenterik yağ bir fark SI LP lenfosit nüfus kaybına neden tek hücrelerin hazırlanması öncesinde ince bağırsak kapalı temizlenmiş değildi. E. paneli B tasvir örnek sabitlenebilir canlılığı boya ile adım 4.7 lekeli (örn., EFluor 780) üreticinin talimatlarına göre. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54114/54114fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/54114/54114fig2.jpg" /> Şekil 2. Küçük intest ve Mikrobiyota Etkileri Olgunlaşmainal Bağışıklık Sistemi. A. CD3 +, CD8 + T hücreleri, SPF, MMB, HMB ve GF farelerin SI LP numaralanmıştır. B. HMB farenin eş barındırılmıştır önceden SI lp, CD3 + CD8 + T hücreleri numaralandırma 4 hafta içinde MMB fareler. co-yer değil MMB ve HMB farenin karşılaştırma amacıyla analiz edildi. Her veri noktası, bağımsız bir fare temsil eder ve Dikey çubuklar, ortalamayı yansıtır. NS, anlamlı değil; * P &lt;0.05; ** P &lt;0.01; *** P &lt;0.001. Şekiller yeniden-ile olan izni-başvuruya 14, B. hafif değişiklik ile <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54114/54114fig2large.jpg" target="_blank">bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes at JoVE.com

Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes

There is growing interest in the quantitative characterization of intestinal lymphocytes owing to increasing recognition that these cells play a critical role in a variety of intestinal and systemic diseases. In this protocol, we describe how to isolate single cell populations from different small-intestinal compartments for subsequent flow cytometric characterization.

Fare Küçük Bağırsak Lenfositler izolasyonu ve Akım Sitometrisi Karakterizasyonu

The intestines &#8212; which contain the largest number of immune cells of any organ in the body &#8212; are constantly exposed to foreign antigens, both ...

isolation-flow-cytometric-characterization-murine-small-intestinal

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

27.3K Görüntüleme.  Boston Children’s Hospital. There is growing interest in the quantitative characterization of intestinal lymphocytes owing to increasing recognition that these cells play a critical role in a variety of intestinal and systemic diseases. In this protocol, we describe how to isolate single cell populations from different small-intestinal compartments for subsequent flow cytometric characterization. 

Video: Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes

Flow Cytometric Isolation of Primary Murine Type II Alveolar Epithelial Cells for Functional and Molecular Studies

Throughout the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII) to various aspects of immune regulation in the lung has been increasingly recognized. AECII have been shown to participate in cytokine production in inflamed airways and to even act as antigen-presenting cells in both infection and T-cell mediated autoimmunity 1-8. Therefore, they are especially interesting also in clinical contexts such as airway hyper-reactivity to foreign and self-antigens as well as infections that directly or indirectly target AECII. However, our understanding of the detailed immunologic functions served by alveolar type II epithelial cells in the healthy lung as well as in inflammation remains fragmentary. Many studies regarding AECII function are performed using mouse or human alveolar epithelial cell lines 9-12. Working with cell lines certainly offers a range of benefits, such as the availability of large numbers of cells for extensive analyses. However, we believe the use of primary murine AECII allows a better understanding of the role of this cell type in complex processes like infection or autoimmune inflammation. Primary murine AECII can be isolated directly from animals suffering from such respiratory conditions, meaning they have been subject to all additional extrinsic factors playing a role in the analyzed setting. As an example, viable AECII can be isolated from mice intranasally infected with influenza A virus, which primarily targets these cells for replication 13. Importantly, through ex vivo infection of AECII isolated from healthy mice, studies of the cellular responses mounted upon infection can be further extended.
Our protocol for the isolation of primary murine AECII is based on enzymatic digestion of the mouse lung followed by labeling of the resulting cell suspension with antibodies specific for CD11c, CD11b, F4/80, CD19, CD45 and CD16/CD32. Granular AECII are then identified as the unlabeled and sideward scatter high (SSChigh) cell population and are separated by fluorescence activated cell sorting 3.
In comparison to alternative methods of isolating primary epithelial cells from mouse lungs, our protocol for flow cytometric isolation of AECII by negative selection yields untouched, highly viable and pure AECII in relatively short time. Additionally, and in contrast to conventional methods of isolation by panning and depletion of lymphocytes via binding of antibody-coupled magnetic beads 14, 15, flow cytometric cell-sorting allows discrimination by means of cell size and granularity. Given that instrumentation for flow cytometric cell sorting is available, the described procedure can be applied at relatively low costs. Next to standard antibodies and enzymes for lung disintegration, no additional reagents such as magnetic beads are required. The isolated cells are suitable for a wide range of functional and molecular studies, which include in vitro culture and T-cell stimulation assays as well as transcriptome, proteome or secretome analyses 3, 4.

We describe the rapid isolation of primary murine type II alveolar epithelial cells (AECII) by flow cytometric negative selection. These AECII show high viability and purity and are suitable for a wide range of functional and molecular studies regarding their role in respiratory conditions such as autoimmune or infectious diseases.

Fonksiyonel ve Moleküler Çalışmalar Birincil murin Tip II alveol epitel hücrelerinde akım sitometri İzolasyonu

Throughout  the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII)  to various aspects of immune regulation in the lung has been ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Isolation of Lymphocytes from Mouse Genital Tract Mucosa

Mucosal surfaces, including in the gastrointestinal, urogenital, and respiratory tracts, provide portals of entry for pathogens, such as viruses and bacteria 1. Mucosae are also inductive sites in the host to generate immunity against pathogens, such as the Peyers patches in the intestinal tract and the nasal-associated lymphoreticular tissue in the respiratory tract. This unique feature brings mucosal immunity as a crucial player of the host defense system. Many studies have been focused on gastrointestinal and respiratory mucosal sites. However, there has been little investigation of reproductive mucosal sites. The genital tract mucosa is the primary infection site for sexually transmitted diseases (STD), including bacterial and viral infections. STDs are one of the most critical health challenges facing the world today. Centers for Disease Control and Prevention estimates that there are 19 million new infectious every year in the United States. STDs cost the U.S. health care system $17 billion every year 2, and cost individuals even more in immediate and life-long health consequences. In order to confront this challenge, a greater understanding of reproductive mucosal immunity is needed and isolating lymphocytes is an essential component of these studies. Here, we present a method to reproducibly isolate lymphocytes from murine female genital tracts for immunological studies that can be modified for adaption to other species. The method described below is based on one mouse.&#x2003;

An efficient way to isolate lymphocytes from mouse genital tract is described. This method takes advantage of enzyme digestion and Percoll gradient separation to allow efficient isolation. This technique is also adaptable to for use in other species

Fare Genital Sistemlerinin Mukozanin gelen Lenfosit İzolasyonu

Mucosal surfaces, including in the gastrointestinal, urogenital, and respiratory tracts, provide portals of entry for pathogens, such as viruses and ...

Isolation and Th17 Differentiation of Na&iuml;ve CD4 T Lymphocytes

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets including Th1, Th2, and regulatory T cells. Th17 cells have emerged as a central culprit in overzealous inflammatory immune responses associated with many autoimmune disorders. In this method we purify T lymphocytes from the spleen and lymph nodes of C57BL/6 mice, and stimulate purified CD4+ T cells under control and Th17-inducing environments. The Th17-inducing environment includes stimulation in the presence of anti-CD3 and anti-CD28 antibodies, IL-6, and TGF-&#946;. After incubation for at least 72 hours and for up to five days at 37 &#176;C, cells are subsequently analyzed for the capability to produce IL-17 through flow cytometry, qPCR, and ELISAs. Th17 differentiated CD4+CD25- T cells can be utilized to further elucidate the role that Th17 cells play in the onset and progression of autoimmunity and host defense. Moreover, Th17 differentiation of CD4+CD25- lymphocytes from distinct murine knockout/disease models can contribute to our understanding of cell fate plasticity.

Isolation and Th17 Differentiation of Na&#239;ve CD4 T Lymphocytes

With effector functions distinct from other T cell subsets, Th17 cells have been centrally implicated in inflammatory autoimmunity. This in vitro Th17 differentiation protocol provides a means to determine whether na&#239;ve CD4+ T lymphocytes can differentiate into Th17 cells, and to further examine their role in autoimmunity and host response.

İzolasyon ve naif CD4 T Lenfositler Th17 Farklılaşma

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident cells. A key mechanism of this inflammatory response is the migration of circulating immune cells to the ischemic brain facilitated by chemokine release and increased endothelial adhesion molecule expression. Brain-invading leukocytes are well-known contributing to early-stage secondary ischemic injury, but their significance for the termination of inflammation and later brain repair has only recently been noticed.
Here, a simple protocol for the efficient isolation of immune cells from the ischemic mouse brain is provided. After transcardial perfusion, brain hemispheres are dissected and mechanically dissociated. Enzymatic digestion with Liberase&#160;is followed by density gradient (such as Percoll) centrifugation to remove myelin and cell debris. One major advantage of this protocol is the single-layer density gradient procedure which does not require time-consuming preparation of gradients and can be reliably performed. The approach yields highly reproducible cell counts per brain hemisphere and allows for measuring several flow cytometry panels in one biological replicate. Phenotypic characterization and quantification of brain-invading leukocytes after experimental stroke may contribute to a better understanding of their multifaceted roles in ischemic injury and repair.

Inflammation plays a central role in the pathogenesis of ischemic stroke. Increasing evidence suggests that it acts as a double-edged sword which exacerbates early brain injury, but also contributes to later repair. This protocol describes the isolation of immune cells from the ischemic brain and their subsequent flow cytometric phenotyping.

İskemik Fare Beyin gelen Bağışıklık Hücreleri İzolasyon ve Akım Sitometrisi Analizi

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Glioma-infiltrating Peripheral Blood Mononuclear Cells

Our laboratory has recently demonstrated that natural killer (NK) cells are capable of eradicating orthotopically implanted mouse GL26 and rat CNS-1 malignant gliomas soon after intracranial engraftment if the cancer cells are rendered deficient in their expression of the &#946;-galactoside-binding lectin galectin-1 (gal-1). More recent work now shows that a population of Gr-1+/CD11b+ myeloid cells is critical to this effect. To better understand the mechanisms by which NK and myeloid cells cooperate to confer gal-1-deficient tumor rejection we have developed a comprehensive protocol for the isolation and analysis of glioma-infiltrating peripheral blood mononuclear cells (PBMC). The method is demonstrated here by comparing PBMC infiltration into the tumor microenvironment of gal-1-expressing GL26 gliomas with those rendered gal-1-deficient via shRNA knockdown. The protocol begins with a description of&#160;how to culture and prepare GL26 cells for inoculation into the syngeneic C57BL/6J mouse brain. It then explains the steps involved in the isolation and flow cytometric analysis of glioma-infiltrating PBMCs from the early brain tumor microenvironment. The method is adaptable to a number of in vivo experimental designs in which temporal data on immune infiltration into the brain is required. The method is sensitive and highly reproducible, as glioma-infiltrating PBMCs can be isolated from intracranial tumors as soon as 24 hr post-tumor engraftment with similar cell counts observed from time point matched tumors throughout independent experiments. A single experimentalist can perform the method from brain harvesting to flow cytometric analysis of glioma-infiltrating PBMCs in roughly 4-6 hr depending on the number of samples to be analyzed. Alternative glioma models and/or cell-specific detection antibodies may also be used at the experimentalists&#8217; discretion to assess the infiltration of several other immune cell types of interest without the need for alterations to the overall procedure.

Presented here is a straightforward method for the isolation and flow cytometric analysis of glioma-infiltrating peripheral blood mononuclear cells that yields time-dependent quantitative data on the number and activation status of immune cells entering the early brain tumor microenvironment.

İzolasyon ve Glioma-sızmakta periferik kan mononükleer hücrelerinin Akışı Sitometrik Analizi

Our laboratory has recently demonstrated that natural killer (NK) cells are capable of eradicating orthotopically implanted mouse GL26 and rat CNS-1 ...

Isolation and Activation of Murine Lymphocytes

B and T cells, with their extremely diverse antigen-receptor repertoires, have the ability to mount specific immune responses against almost any invading pathogen1,2. Understandably, such intricate abilities are controlled by a large number of molecules involved in various cellular processes to ensure timely and spatially regulated immune responses3. Here, we describe experimental procedures that allow rapid isolation of highly purified murine lymphocytes using magnetic cell sorting technology. The resulting purified lymphocytes can then be subjected to various in vitro or in vivo functional assays, such as the determination of lymphocyte signaling capacity upon stimulation by immunoblotting4 and the investigation of proliferative abilities by 3H-thymidine incorporation or carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) labeling5-7. In addition to comparing the functional capacities of control and genetically modified lymphocytes, we can also determine the T cell stimulatory capacity of antigen-presenting cells (APCs) in vivo, as shown in our representative results using transplanted CFSE-labeled OT-I T cells.

Lymphocytes are the major players in adaptive immune responses. Here, we present a lymphocyte purification protocol to determine the physiological functions of the desired molecules in lymphocyte activation in vitro and in vivo. The described experimental procedures are suitable for comparing functional capacities between control and genetically modified lymphocytes.

İzolasyon ve murin lenfositlerin aktivasyonu

B and T cells, with their extremely diverse antigen-receptor repertoires, have the ability to mount specific immune responses against almost any invading ...

Flow Cytometric Analysis of Particle-bound Bet v 1 Allergen in PM10

Flow cytometry is a method widely used to quantify suspended solids such as cells or bacteria in a size range from 0.5 to several tens of micrometers in diameter. In addition to a characterization of forward and sideward scatter properties, it enables the use of fluorescent labeled markers like antibodies to detect respective structures. Using indirect antibody staining, flow cytometry is employed here to quantify birch pollen allergen (precisely Bet v 1)-loaded particles of 0.5 to 10 &#181;m in diameter in inhalable particulate matter (PM10, particle size &#8804;10 &#181;m in diameter). PM10 particles may act as carriers of adsorbed allergens possibly transporting them to the lower respiratory tract, where they could trigger allergic reactions.
So far the allergen content of PM10 has been studied by means of enzyme linked immunosorbent assays (ELISAs) and scanning electron microscopy. ELISA measures the dissolved and not the particle-bound allergen. Compared to scanning electron microscopy, which can visualize allergen-loaded particles, flow cytometry may additionally quantify them. As allergen content of ambient air can deviate from birch pollen count, allergic symptoms might perhaps correlate better with allergen exposure than with pollen count. In conjunction with clinical data, the presented method offers the opportunity to test in future experiments whether allergic reactions to birch pollen antigens are associated with the Bet v 1 allergen content of PM10 particles &#62;0.5 &#181;m.

Here, we present a protocol to quantify allergen-loaded particles by flow cytometry. Ambient particulate matter particles may act as carriers of adsorbed allergens. We show here that flow cytometry, a method widely used to characterize suspended solids &#62;0.5 &#181;m in diameter, can be used to measure these allergen-loaded particles.

PM10 parçacık bağlı Bet v 1 Allergen Akışı Sitometrik Analizi

Flow cytometry is a method widely used to quantify suspended solids such as cells or bacteria in a size range from 0.5 to several tens of micrometers in ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Human Endocervical Gamma Delta T Cells

The female reproductive tract (FRT) mucosal immune system serves as the first line of defense. Better knowledge of the genital mucosa is therefore essential for understanding pathogenicity of different pathogens including HIV. Gamma delta (GD) T cells are the prototype of &#39;unconventional&#39; T cells and represent a relatively small subset of T cells defined by their expression of heterodimeric T-cell receptors (TCRs) composed of gamma and delta chains. This sets them apart from the classical and much better known CD4+ helper T cells and CD8+ cytotoxic T cells that are defined by alpha-beta TCRs. GD T cells often show tissue-specific localization and are enriched in epithelium. GD T cells orchestrate immune responses in inflammation, tumor surveillance, infectious disease, and autoimmunity.
Here, we present a method to reproducibly isolate and analyze human endocervical intraepithelial GD T lymphocytes. We have used endocervical cytobrush samples from women participating in the Women&#39;s Interagency HIV Infection Study (WIHS). Knowledge about GD T cells interactions during conditions in which there is an insult to the vaginal mucosal could be applied to any clinical study in which mucosal vulnerability is addressed, including the development of vaginal microbicides.In addition, knowledge about mucosal GD T cell responses has potential for application of GD T cell-based immune therapy in treating infectious diseases.

We describe here an isolation method to obtain human endocervical intraepithelial lymphocytes for the analysis of intraepithelial gamma delta T cells. This protocol can be extended for the purification of endocervical gamma delta T cells by magnetic beads or by cell sorting.

İnsan Endoservikal Gamma Delta T Hücreleri İzolasyon ve Akım Sitometrisi Analizi

The female reproductive tract (FRT) mucosal immune system serves as the first line of defense. Better knowledge of the genital mucosa is therefore ...

Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System

The intestinal immune system plays an essential role in maintaining the barrier function of the gastrointestinal tract by generating tolerant responses to dietary antigens and commensal bacteria while mounting effective immune responses to enteropathogenic microbes. In addition, it has become clear that local intestinal immunity has a profound impact on distant and systemic immunity. Therefore, it is important to study how an intestinal immune response is induced and what the immunologic outcome of the response is. Here, a detailed protocol is described for the isolation of lymphocytes from small intestine inductive sites like the gut-associated lymphoid tissue Peyer&#39;s patches and the draining mesenteric lymph nodes and effector sites like the lamina propria and the intestinal epithelium. This technique ensures isolation of a large numbers of lymphocytes from small intestinal tissues with optimal purity and viability and minimal cross compartmental contamination within acceptable time constraints. The technical capability to isolate lymphocytes and other immune cells from intestinal tissues enables the understanding of immune responses to gastrointestinal infections, cancers, and inflammatory diseases.

Here we describe a detailed protocol for the isolation of lymphocytes from the inductive sites including the gut-associated lymphoid tissue Peyer&#39;s patches and the draining mesenteric lymph nodes, and the effector sites including the lamina propria and the intestinal epithelium of the small intestinal immune system.

Lenfositler fare küçük bağırsak bağışıklık sistemi yalıtma

The intestinal immune system plays an essential role in maintaining the barrier function of the gastrointestinal tract by generating tolerant responses to ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and their important role in lung development and function, as well as their lung-localized responses to infection and inflammation. To date, no unified method for identification, isolation, and handling of alveolar macrophages from humans and mice exists. Such a method is needed for studies on these important innate immune cells in various experimental settings. The method described here, which can be easily adopted by any laboratory, is a simplified approach to harvesting alveolar macrophages from bronchoalveolar lavage fluid or from lung tissue and maintaining them in vitro. Because alveolar macrophages primarily occur as adherent cells in the alveoli, the focus of this method is on dislodging them prior to harvest and identification. The lung is a highly vascularized organ, and various cell types of myeloid and lymphoid origin inhabit, interact, and are influenced by the lung microenvironment. By using the set of surface markers described here, researchers can easily and unambiguously distinguish alveolar macrophages from other leukocytes, and purify them for downstream applications. The culture method developed herein supports both human and mouse alveolar macrophages for in vitro growth, and is compatible with cellular and molecular studies.

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

This communication describes methodologies for isolation and culture of alveolar macrophages from humans and murine models for experimental purposes.

Yalıtım ve fare ve insan alveoler makrofajlar Vitro kültürü

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...