The authors would like to thank Katrin Bossmann, Anett Neumann and Eike Wolter (German Environment Agency) for their valuable preparatory work.

NOTA: Questo protocollo descrive la colorazione indiretta di particelle PM10 con un anticorpo monoclonale (mouse anticorpo monoclonale IgG1, clone MA-3B4) contro Bet v 1, il principale componente polline di betulla antigene, più un Allophycocyanin (APC) -labeled anticorpo secondario (anti anticorpo -mouse IgG1, clone A85-1) e la successiva analisi su un citofluorimetro. Con opportune altri anticorpi disponibili, questo metodo potrebbe essere esteso al rilevamento di altri antigeni legati alle particelle nell&#39;aria ambiente. 1. PM10 campionamento <ol><li> Raccogliere PM10 dal nell&#39;aria ambiente politetrafluoroetilene (PTFE) filtri utilizzando un campionatore basso volume con una portata di 2,3 m 3 / hr (Figura 1). Una caratterizzazione del campionatore utilizzato per gli esperimenti descritti qui si trova in 16. Tempo di esecuzione dipende dalla quantità di PM10 necessario (solitamente tra 1 e 10 giorni). </li><li> Al termine del periodo di incubazione, rimuovere il filtro dal campionatore e congelare a-20 ° C fino al momento dell&#39;uso. </li></ol><img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54721/54721fig1.jpg" /> Figura 1. Basso volume PM10 campionatore. Esempio di un basso volume di campionatore PM10. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54721/54721fig1large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> Rimozione 2. PM10 e conte di particelle <ol><li> Lasciate che il disgelo filtro in PTFE per circa 5 minuti. Poi, mettere il filtro in polistirolo pulito Petri (Figura 2A). Prendere un nuovo piatto Petri per ogni filtro, se più di un filtro viene elaborato. </li><li> Successivamente, sovrapporre il filtro PTFE con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS). Questo protocollo è stabilito per una concentrazione di PM10 finale della 8x10 6 particelle per ml (vedi punto 3.3). Per ottenere almeno quella concentrazione, utilizzare il seguente volume di empirica di PBS di sovrapporre il filtro con: Se il tempo di raccolta PM10 era &lt;<html> 2 giorni, utilizzano 2 ml. Per tempi di incubazione ≥ 2 giorni, utilizzare 4 ml. NOTA: Al fine di aumentare la concentrazione di particelle della sospensione PM10, sospensioni di diversi filtri possono essere raggruppati, se questo è appropriato. </li><li> Tenere il filtro in PTFE con una pinzetta e pennello con uno spazzolino da denti elettrico con una testa sensibile pennello per 1 min (figure 2B, 2C). Trasferire la particella-PBS-sospensione, sospensione PM10 seguito definito, ad un tubo di reazione pulito. </li></ol><img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/54721/54721fig2.jpg" /> Figura 2. rimozione PM10 con uno spazzolino elettrico. Un filtro di politetrafluoroetilene con campionamento PM10 viene posto in un polistirolo Petri (A) ed è rivestito con 4 ml di PBS. Poi, PM10 viene rimosso con uno spazzolino elettrico (B: prima di spazzolatura e C: dopo la spazzolatura per 1 min).= &quot;Http://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54721/54721fig2large.jpg&quot; target = &quot;_ blank&quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. <ol start="4"><li> Misurare la concentrazione di particelle PM10, ad esempio, mediante l&#39;uso di un contatore di particelle. Diluire un volume adeguato di PM10 sospensione ad esempio 50 microlitri in 10 ml tampone di misura isotonico, misurare tre volte e calcolare il numero totale medio di particelle per ml. Assicurarsi di utilizzare un contatore di particelle in grado di rilevare le particelle di dimensioni rilevanti. </li></ol> 3. Bet v 1 colorazione <ol><li> Calcolare il numero di provette di reazione richiesti per l&#39;analisi del campione: Almeno tre sono necessari tubi di reazione: (i) un tubo con un solo campione (controllo nativo) (ii) un tubo con il campione più anticorpo secondario (controllo negativo), e ( iii) un tubo con il campione più anticorpo primario e secondario (campione specifico). Se misurato per la prima volta, preparare almeno due provette per (i) (ii),e (iii) di avere abbastanza materiale per regolare correttamente le impostazioni citofluorimetro (vedi punto 4.1). </li><li> Calcolare la quantità di sospensione PM10 richiesto per il numero di provette di reazione. Ogni tubo reazione richiede 50 ml di sospensione. </li><li> Regolare la concentrazione di particelle misurata nel passo 2.4 per il volume della sospensione calcolata al punto 3.2 ad una concentrazione finale di 8x10 6 particelle per ml aggiungendo una quantità appropriata di PBS. NOTA: La sospensione PM10 rimanente può essere congelato a -20 ° C per gli esperimenti futuri, anche se per questo protocollo appena Si raccomanda la sospensione PM10 preparati. </li><li> Block legame aspecifico completando la sospensione PM10 con albumina di siero bovino (BSA) ad una concentrazione finale di 0,02%, utilizzando una soluzione madre, ad esempio 1% BSA preparato con PBS. Vortex brevemente e incubare per 20 min a temperatura ambiente. </li><li> Per ogni campione da analizzare mediante citometria di flusso, trasferire 50 ml di sospensione dal punto 3.4 a corrente alternatatubo di reazione magra. Aggiungere un anticorpo monoclonale di topo contro Bet v 1 ad una concentrazione finale di 0,02 mg / mL per le provette di reazione designati per la colorazione specifica, vortex brevemente e incubare per 60 min a temperatura ambiente. <ol><li> Lasciare le provette di reazione con la sospensione PM10-BSA designato per il controllo nativo e il controllo negativo anche stare per 60 min a temperatura ambiente. </li></ol></li><li> Lavare tutti i campioni con l&#39;aggiunta di 500 microlitri di PBS integrato con 0,02% BSA per ciascun tubo di reazione, brevemente vortex e centrifugare i campioni successivamente a 4.700 xg per 5 min a temperatura ambiente. Eliminare il surnatante con cura utilizzando una pompa a vuoto. </li><li> Ripetere il punto 3.6. </li><li> Determinare la quantità totale di anticorpo anti-IgG1 di topo secondario APC-etichettato necessario: 1 mg anticorpi sciolto in 50 ml di PBS integrato con 0,02% di BSA per tubo di reazione. Diluire la quantità appropriata di anticorpi con il rispettivo volume di PBS integrato con 0,02% BSA. </li><li> Aggiungere 50 ml di anticorpo secondario diluito a tutte le provette di reazione ad eccezione del tubo di reazione designato per il controllo nativo. Supplemento quest&#39;ultima con 50 ml di PBS integrato con 0,02% di BSA. Vortex tutti i campioni per alcuni secondi. </li><li> Incubare tutti i campioni per 30 minuti al buio. </li><li> Ripetere il punto 3.6 due volte. </li><li> Aggiungere 50 ml di PBS per ogni reazione tubo, vortice e analizzare i campioni su un citofluorimetro. </li></ol> 4. analisi di citometria di flusso <ol><li> Utilizzando il controllo nativo, regolare le seguenti citometro parametri per ottimizzare l&#39;analisi dei dati. <ol><li> Utilizzando il controller soglia di forward scatter (FSC) visualizzato sulla scheda di controllo del dispositivo, impostare la soglia FSC al valore più basso (200) e avviare l&#39;analisi. </li><li> Usando il regolatore di tensione a dispersione, regolare l&#39;FSC e dispersione laterale (SSC) in questo modo che tutte le particelle PM10 possono essere rilevati e che la popolazione di particelle si trova a circa in the centro dell&#39;asse FSC e nella metà inferiore dell&#39;asse SSC. </li><li> Utilizzando il regolatore di tensione di fluorescenza, regolare la tensione APC e un&#39;altra tensione di fluorescenza come isotiocianato di fluoresceina (FITC), che non emette alla stessa lunghezza d&#39;onda come APC, se necessario. Assicurarsi che tutte le particelle sono visibili nella metà inferiore di entrambi gli assi di fluorescenza. </li></ol></li><li> Consecutivamente, esaminare ogni campione compreso il controllo nativo e memorizzare i dati FSC, SSC, APC, e FITC di almeno 10.000 particelle per campione. </li><li> Valutare i dati con il relativo software. contenuto allergenico adsorbito nel campione specifico può essere quantificato in due modi: <ol><li> Analizzare l&#39;intensità di fluorescenza APC di tutte le particelle (valore mediano) come misura di Bet v 1 carico su tutte le particelle PM10. NOTA: Se il campione specifico conteneva allergene, intensità di fluorescenza APC dovrebbe aumentare nel campione specifico rispetto al controllo negativo. Al contrario, altre fluorintensità escence (ad es., FITC intensità di fluorescenza) non devono cambiare in modo significativo. </li><li> Calcolare la percentuale di particelle PM10 con limite anti-Bet v 1 anticorpi. In tal modo, nel controllo negativo, impostare un cancello intorno particelle considerate APC positivo, copia e incolla questo cancello nel campione specifico e sottrarre la percentuale di APC particelle positive nel controllo negativo dalla percentuale di APC particelle positive nel campione specifico. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Cakmak, S., Dales, R. E., Coates, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Does+air+pollution+increase+the+effect+of+aeroallergens+on+hospitalization+for+asthma?.">Does air pollution increase the effect of aeroallergens on hospitalization for asthma?.</a> J Allergy Clin Immunol. 129 (1), 228-231 (2012).</li><li>Barraza-Villarreal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Air+pollution,+airway+inflammation,+and+lung+function+in+a+cohort+study+of+Mexico+City+schoolchildren.">Air pollution, airway inflammation, and lung function in a cohort study of Mexico City schoolchildren.</a> Environ Health Perspect. 116 (6), 832-838 (2008).</li><li>Chen, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+association+of+ambient+air+pollution+with+airway+inflammation+in+schoolchildren.">The association of ambient air pollution with airway inflammation in schoolchildren.</a> Am J Epidemiol. 175 (8), 764-774 (2012).</li><li>Cyprowski, M., Buczynska, A., Szadkowska-Stanczyk, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Indoor+allergens+in+settled+dust+from+kindergartens+in+city+of+Lodz,+Poland.">Indoor allergens in settled dust from kindergartens in city of Lodz, Poland.</a> Int J Occup Med Environ Health. 26 (6), 890-899 (2013).</li><li>Brough, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+peanut+protein+in+the+home+environment.">Distribution of peanut protein in the home environment.</a> J Allergy Clin Immunol. 132 (3), 623-629 (2013).</li><li>Galli, S. J., Tsai, M., Piliponsky, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+allergic+inflammation.">The development of allergic inflammation.</a> Nature. 454 (7203), 445-454 (2008).</li><li> World Health Organisation, R. O. f. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenology+and+human+health:+allergic+disorders:+report+on+WHO+meeting+Rome,+Italy.">Phenology and human health: allergic disorders: report on WHO meeting Rome, Italy.</a> , 256 (2003).</li><li>Wuthrich, B., Schindler, C., Leuenberger, P., Ackermann-Liebrich, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+of+atopy+and+pollinosis+in+the+adult+population+of+Switzerland+(SAPALDIA+study).+Swiss+Study+on+Air+Pollution+and+Lung+Diseases+in+Adults.">Prevalence of atopy and pollinosis in the adult population of Switzerland (SAPALDIA study). Swiss Study on Air Pollution and Lung Diseases in Adults.</a> Int Arch Allergy Immunol. 106 (2), 149-156 (1995).</li><li>Grote, M., Valenta, R., Reichelt, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abortive+pollen+germination:+a+mechanism+of+allergen+release+in+birch,+alder,+and+hazel+revealed+by+immunogold+electron+microscopy.">Abortive pollen germination: a mechanism of allergen release in birch, alder, and hazel revealed by immunogold electron microscopy.</a> J Allergy Clin Immunol. 111 (5), 1017-1023 (2003).</li><li>Namork, E., Johansen, B. V., Lovik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+allergens+adsorbed+to+ambient+air+particles+collected+in+four+European+cities.">Detection of allergens adsorbed to ambient air particles collected in four European cities.</a> Toxicol Lett. 165 (1), 71-78 (2006).</li><li>S&#252;ring, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PM10+contains+particle-bound+allergens:+Dust+analysis+by+Flow+Cytometry.">PM10 contains particle-bound allergens: Dust analysis by Flow Cytometry.</a> Env Technol Inn. 5, 60-66 (2016).</li><li>Schappi, G. F., Suphioglu, C., Taylor, P. E., Knox, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concentrations+of+the+major+birch+tree+allergen+Bet+v+1+in+pollen+and+respirable+fine+particles+in+the+atmosphere.">Concentrations of the major birch tree allergen Bet v 1 in pollen and respirable fine particles in the atmosphere.</a> J Allergy Clin Immunol. 100 (5), 656-661 (1997).</li><li>Buters, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+allergen+Bet+v+1+in+fractions+of+ambient+air+deviates+from+birch+pollen+counts.">The allergen Bet v 1 in fractions of ambient air deviates from birch pollen counts.</a> Allergy. 65 (7), 850-858 (2010).</li><li>Buters, J. T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Release+of+Bet+v+1+from+birch+pollen+from+5+European+countries.+Results+from+the+HIALINE+study.">Release of Bet v 1 from birch pollen from 5 European countries. Results from the HIALINE study.</a> Atmos Environ. 55, 496-505 (2012).</li><li>Ormstad, H., Johansen, B. V., Gaarder, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Airborne+house+dust+particles+and+diesel+exhaust+particles+as+allergen+carriers.">Airborne house dust particles and diesel exhaust particles as allergen carriers.</a> Clin Exp Allergy. 28 (6), 702-708 (1998).</li><li>Brough, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peanut+protein+in+household+dust+is+related+to+household+peanut+consumption+and+is+biologically+active.">Peanut protein in household dust is related to household peanut consumption and is biologically active.</a> J Allergy Clin Immunol. 132 (3), 630-638 (2013).</li><li>Jochner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seasonal+variation+of+birch+and+grass+pollen+loads+and+allergen+release+at+two+sites+in+the+German+Alps.">Seasonal variation of birch and grass pollen loads and allergen release at two sites in the German Alps.</a> Atmos Env. , (2015).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Un punto critico del protocollo è l&#39;uso di un filtro appropriato per la raccolta di particelle PM10 da aria ambiente (vedi passo 1.1). Il filtro deve essere abbastanza forte da sopportare spazzolatura con uno spazzolino elettrico, e non tutti i materiali filtranti soddisfare questo requisito. Il protocollo di colorazione è stato istituito con una concentrazione di particelle PM10 di 8x10 6 particelle per ml. Tuttavia, se il materiale è limitato e il raggruppamento dei campioni non è appropriato, il metodo sarà probabilmente funziona pure, ma le concentrazioni di anticorpi (vedere i passi 3.5 e 3.8) potrebbe avere da regolare. Bet v 1 colorazione delle particelle PM10 non ha provocato distinte popolazioni di particelle positivamente e negativamente macchiati. Questo potrebbe essere causato da quantità variabili di Bet v 1 allergeni adsorbiti a ciascuna delle particelle che vanno da pochissimo fino a una quantità elevata. Ciò potrebbe causare l&#39;espansione del segnale APC spostando così la popolazione versoAPC positività. Poiché è difficile separare il positivo dalle particelle negative, due metodi di quantificazione sono stati usati per determinare le differenze nel contenuto Bet v 1 del PM10&gt; 0,5 esemplari: (i) quantificazione relativa misurando la mediana intensità di fluorescenza APC di tutte le particelle e (ii) determinare la percentuale di APC particelle positive. Per quanto riguarda il Bet v 1 carico di particelle di bassa e alta stagione polline PM10&gt; 0.5, entrambi i metodi hanno rivelato risultati simili. Ancora, quantificazione relativa, intensità di fluorescenza media delle particelle è raccomandato in quanto è indipendente posizionare il cancello e quindi probabilmente meno soggetto a errori. Fino ad oggi molti studi esaminare il contenuto allergenico di particolato nell&#39;aria ambiente estraendo il rispettivo allergene e la successiva quantificazione con ELISA 5,12-14,17. Vi è una differenza fondamentale tra il procedimento descritto qui e il quantification con Elisa: ELISA quantifica l&#39;antigene estratto e sciolto, mentre citometria a flusso analizza l&#39;antigene in particelle. Mediante ELISA Bet v 1 carico dei campioni PM10 testati (n = 8) era inferiore al limite di rilevamento di 1,2 ng / ml (dati non mostrati). Allo stesso modo, Buters e altri identificati senza Bet v 1 nel PM &lt;2,5 micron frazione e solo il 7% in 10 micron&gt; PM&gt; 2,5 micron frazione, ma oltre il 93% nel PM&gt; 10 micron frazione di aria ambiente 13. I risultati contrastanti della ELISA da un lato e l&#39;analisi FACS invece, possono essere causate da differenze nel metodo di rilevamento in concomitanza con sensibilità divergenti. Ulteriori ricerche, tuttavia, è necessaria per comprendere appieno questa differenza. Un metodo per visualizzare particelle legato antigene è microscopio elettronico a scansione 10,14. In microscopia elettronica a scansione, Ormstad et al. Visualizzato Bet v 1 sulla superficie opaca particolato sospesole particelle di fuliggine R campionate in alta stagione dei pollini e, in misura minore sulle particelle campionate in bassa stagione dei pollini 15. Inoltre, gli allergeni da polline, lattice e anche beta-glucani sono stati trovati ad essere assorbiti da particelle di combustione nell&#39;aria ambiente 10. Questo metodo, tuttavia, non consente la quantificazione del allergene particelle. Con l&#39;utilizzo di citometria a flusso, particella-bound Bet v 1 allergene potrebbe essere quantificato. Così, la citometria a flusso può offrire un nuovo modo di caratterizzare 10 al 0,5 micron frazione biologica di PM10 come con altri anticorpi adatti a portata di mano, questo metodo potrebbe essere esteso al rilevamento di altri antigeni su particelle dell&#39;aria ambiente, ad esempio, muffe, acari allergeni o LPS. Come le particelle PM10 assorbono non solo materiale biologico, ma anche sostanze chimiche e metalli abbastanza facilmente, non specifico legame degli anticorpi potrebbe, però, rappresentare un problema. Se un nuovo anticorpo è testato, un passaggio fondamentale è quello di dimostrare bind specificaing. Questo può essere fatto, per esempio, bloccare la capacità di legame dell&#39;anticorpo specifico con dell&#39;antigene corrispondente Prima della marcatura 11. Come Bet v 1 contenuto di aria ambiente possono differire dai betulla pollini 12,13,18, i sintomi allergici potrebbero forse correlare meglio con il livello di allergeni che con polline contare 14,18. Quindi, il metodo presentato, unitamente ai dati clinici permette di esaminare in esperimenti futuri se le reazioni allergiche a Birch corrispondono alla Bet v 1 carico allergenico di PM10&gt; 0.5.

L&#39;inquinamento atmosferico viene considerato come una causa importante ambientale della maggiore incidenza e la gravità delle allergie respiratorie osservate negli ultimi decenni 1-3. Inoltre, c&#39;è stato un crescente interesse nella distribuzione di allergeni comuni in 4,5 polvere. Birch polline può provocare febbre da fieno, ma può anche essere un trigger importante di asma allergica 6-8. Tutta polline di betulla non è in grado di penetrare nel tratto respiratorio inferiore o di interesse PM10 a causa delle sue dimensioni (22 micron di diametro). Tuttavia, gli allergeni del polline di betulla come Bet v 1, il principale componente polline di betulla allergene, possono essere rilasciati dopo la rottura polline 9 e possono legarsi alle particelle dell&#39;aria ambiente 10, quindi, eventualmente immettere le vie respiratorie inferiori. Infatti, è stato dimostrato che PM10 può contenere allergeni biologicamente attive come dimostra l&#39;attivazione in vitro di basofili da un polline probando allergica 11 </sup&gt;. Bet v 1 contenuto di allergene in campioni di PM10 è stato studiato estraendo il rispettivo allergene e la successiva quantificazione con ELISA 12-14. Con la tecnica ELISA, l&#39;allergene disciolto è stato misurato, ma la quantità di particelle allergene-caricato rimaneva ancora sconosciuta. Microscopia elettronica a scansione ha rivelato particelle allergene-caricato, ma non ha permesso la quantificazione 10,15. Questo studio si avvale di citometria a flusso per quantificare la percentuale di particelle PM10 Bet v 1-caricati in campioni di aria ambiente. A causa del limite di rilevazione del citofluorimetro solo particelle più grandi di 0,5 micron può essere esaminato. L&#39;&gt; 0,5 micron frazione PM10 sarà ulteriormente definito come PM10&gt; 0,5.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="645">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Teflon filter</td>
			<td style="width:143px;">Pall Life Sciences, USA</td>
			<td style="width:119px;">R2PL047</td>
			<td style="width:167px;">47 mm, 1.0 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">low volume sampler&#160;</td>
			<td>Sven Leckel Ingenieur B&#252;ro GmbH, Germany</td>
			<td style="width:119px;">LVS3</td>
			<td>air flow of 2.3 m3/h</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Phosphate-buffered saline</td>
			<td style="width:143px;">Biochrom, Germany</td>
			<td style="width:119px;">L1825</td>
			<td>without Ca/Mg, low endotoxin</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">electrical toothbrush&#160;</td>
			<td style="width:143px;">Braun, Germany</td>
			<td style="width:119px;">Oral-B Vitality Sensitive</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Casy cell counter&#160;</td>
			<td style="width:143px;">Sch&#228;rfe System GmbH, Germany</td>
			<td style="width:119px;">Model TTC</td>
			<td>range of detectable particle size: 0.7 &#181;m to 45 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">FACSCanto II&#160;</td>
			<td style="width:143px;">Becton Dickinson, USA</td>
			<td style="width:119px;">3-laser, 8-color (4-2-2)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">FACS Diva Software v6.1.3&#160;</td>
			<td style="width:143px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">bovine serum albumin (BSA)&#160;</td>
			<td style="width:143px;">Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td style="width:119px;">A2153-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">monoclonal mouse IgG1 antibody against Bet v 1</td>
			<td style="width:143px;">Indoor Biotechnologies, UK</td>
			<td style="width:119px;">&#160;MA-3B4</td>
			<td style="width:167px;">clone MA-3B4</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">APC (Allophycocyanin)-labeled secondary anti-Mouse IgG1 antibody&#160;</td>
			<td style="width:143px;">Becton Dickinson</td>
			<td align="right" style="width:119px;">560089</td>
			<td>clone A85-1</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">SPSSTM software version 18&#160;</td>
			<td style="width:143px;">PASW Statistics 18, Hongkong, China</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Petri Dish</td>
			<td style="width:143px;">Gosselin, France</td>
			<td style="width:119px;">BP50-02</td>
			<td>D 55mm, H 15mm&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">FACS Tube&#160;</td>
			<td style="width:143px;">Becton Dickinson, USA</td>
			<td style="width:119px;">REF 352054</td>
			<td>5ml Polystyrene</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">CASYton</td>
			<td style="width:143px;">Roche 
			Germany</td>
			<td style="width:119px;">REF 05651808001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Matrix Blank Tubes</td>
			<td style="width:143px;">Thermo Scientific, USA</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4140</td>
			<td>1,4 ml, PP</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:143px;">Heraeus, Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">Megafuge 40R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Vacuum Pump</td>
			<td style="width:143px;">INTEGRA Biosciences AG, Switzerland</td>
			<td style="width:119px;">Model 158 320</td>
			<td>Inetrgra Vacusafe</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">recombinant Bet v 1a antigen&#160;</td>
			<td style="width:143px;">Indoor Biotechnologies, UK</td>
			<td style="width:119px;">LTR-BV1A-1</td>
			<td>Concentration:&#160; 2.0 mg/ml</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flow cytometric analysis of particle-bound bet v 1 allergen in pm10

Citometria di flusso è un metodo ampiamente utilizzato per quantificare solidi sospesi come cellule o batteri in un range da 0,5 a diverse decine di micrometri di diametro. Oltre ad una caratterizzazione delle proprietà di dispersione in avanti e di lato, consente l&#39;uso di marcatori fluorescenti etichettati come anticorpi per rilevare rispettive strutture. Utilizzando indiretta colorazione degli anticorpi, citometria a flusso è impiegato qui per quantificare betulla allergeni del polline (BET appunto v 1) MOLLA particelle di 0,5 a 10 micron di diametro nel particolato inalabile (PM10, la dimensione delle particelle ≤10 micron di diametro). le particelle PM10 possono agire come vettori di allergeni adsorbiti forse li trasporta al tratto respiratorio inferiore, dove avrebbero potuto scatenare reazioni allergiche. Finora il contenuto allergenico di PM10 è stata studiata per mezzo di enzimi legati analisi immunoassorbimento (ELISA) e microscopia elettronica a scansione. ELISA misure del sciolto e non la particellaallergene -bound. Rispetto al microscopio elettronico a scansione, che può visualizzare le particelle allergeni-caricato, citometria a flusso potrebbero inoltre li quantificare. Come contenuto allergenico di aria ambiente può deviare dal conteggio del polline di betulla, i sintomi allergici potrebbero forse correlare meglio con esposizione agli allergeni che con pollini. In concomitanza con i dati clinici, il metodo presentato offre la possibilità di testare in esperimenti futuri se le reazioni allergiche al polline betulla antigeni sono associati con il Bet v 1 contenuto allergenico di particelle PM10&gt; 0,5 micron.

Bet v 1 allergene adsorbimento di PM10&gt; 0,5 particelle è stata quantificata mediante colorazione anticorpi indiretta e successiva analisi su un citofluorimetro. Un campione PM10 da alta stagione dei pollini servito come modello. Come indicato nel passo 3.1, il controllo negativo costituito da particelle PM10 incubati con APC marcato anticorpo secondario solo (Figura 3A). Le particelle PM10 colorati con anti-Bet v 1 anticorpo più anticorpo secondario visualizzati l&#39;allergene caricato particelle (Figura 3B). Come descritto nel passaggio 4.3, sono stati utilizzati due metodi per quantificare il carico allergenico: da un lato, il valore medio dell&#39;intensità di fluorescenza APC di tutte le particelle è stato analizzato essendo 137 per il controllo negativo e 904 per il campione specifico. D&#39;altra parte, la percentuale di particelle con bound anti-Bet v 1 &#39;anticorpo è stato determinato: Un cancello è stato fissato intorno alle particelle positive APC nel controllo negativo e successivamente copied e incollato nel campione specifico. Nel controllo negativo, 3% delle particelle PM10&gt; 0,5 sono stati considerati positivi APC. Questa percentuale di particelle falsi positivi è stata sottratta dalla percentuale di particelle positive nel campione specifico conseguente 77,5% APC PM10 positivo&gt; 0,5 particelle nel campione specifico. Per dimostrare che il legame del anti-Bet v 1 anticorpo osservato era specifico, capacità di legame è stato bloccato con il corrispondente antigene prima della colorazione. Questo diminuita legame del anti-Bet v 1 anticorpi del 69%, se quantificato da intensità di fluorescenza APC, e dal 84%, se quantificato dalla percentuale di Bet v 1 PM10 positivo&gt; 0,5 particelle (Figura 3C). <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54721/54721fig3.jpg" /> Figura 3. Particle-bound Bet v 1 allergene può essere visualizzato mediante citometria di flusso. Intensità di fluorescenza APC di un campione di PM10 da alta PoMolto llen tinto solo con l&#39;APC marcato anticorpo secondario (A), colorati con l&#39;anti-Bet v 1 anticorpo primario e successivamente con l&#39;APC marcato anticorpo secondario (B), e dopo aver bloccato l&#39;anticorpo primario con ricombinante Bet v 1 antigene (C ). Il cancello P APC + è stato fissato attorno alle particelle considerate APC positivo (visualizzato in rosso) e rispettive percentuali sono dati. Questa cifra è stata leggermente modificata dalla 11. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54721/54721fig3large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> Per verificare se questo metodo potrebbe essere adottato per rivelare differenze nella quantità di adsorbito Bet v 1 contenuto di PM10&gt; 0,5 campioni provenienti da alti e da bassa stagione dei pollini, 13 PM10 campioni di alta e 6 campioni di PM10 da bassa stagione dei pollini sono stati analizzati. Figura 4raffigura significative differenze nell&#39;intensità APC fluorescenza e della percentuale di Bet v 1 PM10 positivo&gt; 0,5 particelle di campioni di PM10 da alta stagione polline rispetto ai campioni di PM10 da bassa stagione dei pollini. Entrambi i metodi di quantificazione presente ha mostrato risultati simili. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54721/54721fig4.jpg" /> Figura 4. I campioni di PM10 da bassa e alta stagione dei pollini si differenziano per la loro quantità di adsorbita Bet v 1. Basso PM10 stagione dei pollini è stata campionata in autunno / inverno 2013 (n = 6), alta polline stagione PM10 nel maggio 2012 e il 2013 (n = 13). (A) L&#39;intensità della fluorescenza APC di PM10&gt; 0,5 particelle di alta stagione dei pollini è stata significativamente superiore a quello di bassa stagione dei pollini (mediana / min / max alta stagione dei pollini: 796/313/1097; mediana / min / max bassa stagione dei pollini: 197 / 85/277). (B) PM10 da alta stagione dei pollini contenuti RILIEVOtly più Bet v 1 PM10-positivo&gt; 0,5 particelle di PM10 da bassa stagione dei pollini (mediana / min / max alta stagione dei pollini: 45,2 / 18,5 / 74,5; mediana / min / max bassa stagione dei pollini: 11,8 / 4,4 / 19,8). trame di dialogo Mostra valori mediani (linea interna della scatola), 25. e 75. percentili, rispettivamente (i bordi inferiore e superiore della scatola) e valori minimi e massimi (baffi). *** P &lt;0.001 vs bassa stagione dei pollini, Mann Whitney U test. Questa cifra è stata leggermente modificata dalla 11. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54721/54721fig4large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometric Analysis of Particle-bound Bet v 1 Allergen in PM10 at JoVE.com

Flow Cytometric Analysis of Particle-bound Bet v 1 Allergen in PM10

Qui, vi presentiamo un protocollo per quantificare le particelle allergeni-caricati mediante citometria di flusso. le particelle di particolato ambientali possono agire come vettori di allergeni adsorbiti. Noi mostriamo che la citometria a flusso, un metodo ampiamente utilizzato per caratterizzare solidi sospesi&gt; 0,5 micron di diametro, può essere utilizzato per misurare queste particelle allergeni caricato.

Flusso analisi di citometria di Particle-bound Bet v 1 allergene in PM10

Flow cytometry is a method widely used to quantify suspended solids such as cells or bacteria in a size range from 0.5 to several tens of micrometers in ...

flow-cytometric-analysis-of-particle-bound-bet-v-1-allergen-in-pm10

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

7.5K Views.  Federal Environment Agency.  Qui, vi presentiamo un protocollo per quantificare le particelle allergeni-caricati mediante citometria di flusso. le particelle di particolato ambientali possono agire come vettori di allergeni adsorbiti. Noi mostriamo che la citometria a flusso, un metodo ampiamente utilizzato per caratterizzare solidi sospesi> 0,5 micron di diametro, può essere utilizzato per misurare queste particelle allergeni caricato. 

Video: Flow Cytometric Analysis of Particle-bound Bet v 1 Allergen in PM10

Murine Model of Allergen Induced Asthma

Asthma is a major cause of morbidity and mortality, affecting some 300 million people throughout the world.1 More than 8% of the US population has asthma, with the prevalence increasing.2 As with other diseases, animal models of allergic airway disease greatly facilitate understanding of the underlying pathophysiology, help identify potential therapeutic targets, and allow preclinical testing of possible new therapies. Models of allergic airway disease have been developed in several animal species, but murine models are particularly attractive due to the low cost, ready availability, and well-characterized immune systems of these animals.3 Availability of a variety of transgenic strains further increases the attractiveness of these models.4 Here we describe two murine models of allergic airway disease, both employing ovalbumin as the antigen. Following initial sensitization by intraperitoneal injection, one model delivers the antigen challenge by nebulization, the other by intratracheal delivery. These two models offer complementary advantages, with each mimicking the major features of human asthma.5
The major features of acute asthma include an exaggerated airway response to stimuli such as methacholine (airway hyperresponsiveness; AHR) and eosinophil-rich airway inflammation. These are also prominent effects of allergen challenge in our murine models,5,6 and we describe techniques for measuring them and thus evaluating the effects of experimental manipulation. Specifically, we describe both invasive7 and non-invasive8 techniques for measuring airway hyperresponsiveness as well as methods for assessing infiltration of inflammatory cells into the airways and the lung. Airway inflammatory cells are collected by bronchoalveolar lavage while lung histopathology is used to assess markers of inflammation throughout the organ. These techniques provide powerful tools for studying asthma in ways that would not be possible in humans.

Experimental mouse models of allergic asthma offer new possibilities for studying disease pathogenesis and developing new therapeutics. These models are well suited to measuring factors governing the allergic immune response, airway inflammation, and pulmonary pathophysiology.

Modello murino di asma indotta da allergene

Asthma is a major cause of morbidity and mortality, affecting some 300 million people throughout the world.1 More than 8% of the US population has asthma, ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Whole-animal Imaging and Flow Cytometric Techniques for Analysis of Antigen-specific CD8+ T Cell Responses after Nanoparticle Vaccination

Traditional vaccine adjuvants, such as alum, elicit suboptimal CD8+ T cell responses. To address this major challenge in vaccine development, various nanoparticle systems have been engineered to mimic features of pathogens to improve antigen delivery to draining lymph nodes and increase antigen uptake by antigen-presenting cells, leading to new vaccine formulations optimized for induction of antigen-specific CD8+ T cell responses. In this article, we describe the synthesis of a &#8220;pathogen-mimicking&#8221; nanoparticle system, termed interbilayer-crosslinked multilamellar vesicles (ICMVs) that can serve as an effective vaccine carrier for co-delivery of subunit antigens and immunostimulatory agents and elicitation of potent cytotoxic CD8+ T lymphocyte (CTL) responses. We describe methods for characterizing hydrodynamic size and surface charge of vaccine nanoparticles with dynamic light scattering and zeta potential analyzer and present a confocal microscopy-based procedure to analyze nanoparticle-mediated antigen delivery to draining lymph nodes. Furthermore, we show a new bioluminescence whole-animal imaging technique utilizing adoptive transfer of luciferase-expressing, antigen-specific CD8+ T cells into recipient mice, followed by nanoparticle vaccination, which permits non-invasive interrogation of expansion and trafficking patterns of CTLs in real time. We also describe tetramer staining and flow cytometric analysis of peripheral blood mononuclear cells for longitudinal quantification of endogenous T cell responses in mice vaccinated with nanoparticles.

We describe whole-animal imaging and flow cytometry-based techniques for monitoring expansion of antigen-specific CD8+ T cells in response to immunization with nanoparticles in a murine model of vaccination.

Imaging Whole-animale e di citometria a flusso tecniche di analisi di Antigen-specific CD8 + cellule T Risposte dopo nanoparticelle vaccinazione

Traditional vaccine adjuvants, such as alum, elicit suboptimal CD8+ T cell responses. To address this major challenge in vaccine development, various ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident cells. A key mechanism of this inflammatory response is the migration of circulating immune cells to the ischemic brain facilitated by chemokine release and increased endothelial adhesion molecule expression. Brain-invading leukocytes are well-known contributing to early-stage secondary ischemic injury, but their significance for the termination of inflammation and later brain repair has only recently been noticed.
Here, a simple protocol for the efficient isolation of immune cells from the ischemic mouse brain is provided. After transcardial perfusion, brain hemispheres are dissected and mechanically dissociated. Enzymatic digestion with Liberase&#160;is followed by density gradient (such as Percoll) centrifugation to remove myelin and cell debris. One major advantage of this protocol is the single-layer density gradient procedure which does not require time-consuming preparation of gradients and can be reliably performed. The approach yields highly reproducible cell counts per brain hemisphere and allows for measuring several flow cytometry panels in one biological replicate. Phenotypic characterization and quantification of brain-invading leukocytes after experimental stroke may contribute to a better understanding of their multifaceted roles in ischemic injury and repair.

Inflammation plays a central role in the pathogenesis of ischemic stroke. Increasing evidence suggests that it acts as a double-edged sword which exacerbates early brain injury, but also contributes to later repair. This protocol describes the isolation of immune cells from the ischemic brain and their subsequent flow cytometric phenotyping.

Isolamento e analisi citofluorimetrica delle cellule immunitarie dal cervello ischemica mouse

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Glioma-infiltrating Peripheral Blood Mononuclear Cells

Our laboratory has recently demonstrated that natural killer (NK) cells are capable of eradicating orthotopically implanted mouse GL26 and rat CNS-1 malignant gliomas soon after intracranial engraftment if the cancer cells are rendered deficient in their expression of the &#946;-galactoside-binding lectin galectin-1 (gal-1). More recent work now shows that a population of Gr-1+/CD11b+ myeloid cells is critical to this effect. To better understand the mechanisms by which NK and myeloid cells cooperate to confer gal-1-deficient tumor rejection we have developed a comprehensive protocol for the isolation and analysis of glioma-infiltrating peripheral blood mononuclear cells (PBMC). The method is demonstrated here by comparing PBMC infiltration into the tumor microenvironment of gal-1-expressing GL26 gliomas with those rendered gal-1-deficient via shRNA knockdown. The protocol begins with a description of&#160;how to culture and prepare GL26 cells for inoculation into the syngeneic C57BL/6J mouse brain. It then explains the steps involved in the isolation and flow cytometric analysis of glioma-infiltrating PBMCs from the early brain tumor microenvironment. The method is adaptable to a number of in vivo experimental designs in which temporal data on immune infiltration into the brain is required. The method is sensitive and highly reproducible, as glioma-infiltrating PBMCs can be isolated from intracranial tumors as soon as 24 hr post-tumor engraftment with similar cell counts observed from time point matched tumors throughout independent experiments. A single experimentalist can perform the method from brain harvesting to flow cytometric analysis of glioma-infiltrating PBMCs in roughly 4-6 hr depending on the number of samples to be analyzed. Alternative glioma models and/or cell-specific detection antibodies may also be used at the experimentalists&#8217; discretion to assess the infiltration of several other immune cell types of interest without the need for alterations to the overall procedure.

Presented here is a straightforward method for the isolation and flow cytometric analysis of glioma-infiltrating peripheral blood mononuclear cells that yields time-dependent quantitative data on the number and activation status of immune cells entering the early brain tumor microenvironment.

Isolamento e analisi citofluorimetrica di-Glioma infiltrazione sangue periferico mononucleari Cellule

Our laboratory has recently demonstrated that natural killer (NK) cells are capable of eradicating orthotopically implanted mouse GL26 and rat CNS-1 ...

Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes

The intestines &#8212; which contain the largest number of immune cells of any organ in the body &#8212; are constantly exposed to foreign antigens, both microbial and dietary. Given an increasing understanding that these luminal antigens help shape the immune response and that education of immune cells within the intestine is critical for a number of systemic diseases, there has been increased interest in characterizing the intestinal immune system. However, many published protocols are arduous and time-consuming. We present here a simplified protocol for the isolation of lymphocytes from the small-intestinal lamina propria, intraepithelial layer, and Peyer&#39;s patches that is rapid, reproducible, and does not require laborious Percoll gradients. Although the protocol focuses on the small intestine, it is also suitable for analysis of the colon. Moreover, we highlight some aspects that may need additional optimization depending on the specific scientific question. This approach results in the isolation of large numbers of viable lymphocytes that can subsequently be used for flow cytometric analysis or alternate means of characterization.

There is growing interest in the quantitative characterization of intestinal lymphocytes owing to increasing recognition that these cells play a critical role in a variety of intestinal and systemic diseases. In this protocol, we describe how to isolate single cell populations from different small-intestinal compartments for subsequent flow cytometric characterization.

Isolamento e caratterizzazione citometria a flusso di Murine Piccolo intestinale Linfociti

The intestines &#8212; which contain the largest number of immune cells of any organ in the body &#8212; are constantly exposed to foreign antigens, both ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and reproducibility of this assay can be considered unstable, either because of user&#39;s errors or because of the sensitivity of NK cells to experimental manipulation. To eliminate these issues, a workflow that reduces them to a minimum was established and is presented here. To illustrate, we obtained blood samples, at various time points, from runners (n = 4) that were submitted to an intense bout of exercise. First, NK cells are simultaneously identified and isolated through CD56 tagging and magnetic-based sorting, directly from whole blood and from as little as one milliliter. The sorted NK cells are removed of any reagent or capping antibodies. They can be counted in order to establish an accurate NK cell count per milliliter of blood. Secondly, the sorted NK cells (effectors cells or E) can be mixed with 3,3&#39;-Diotadecyloxacarbocyanine Perchlorate (DiO) tagged K562 cells (target cells or T) at an assay-optimal 1:5 T:E ratio, and analyzed using an imaging flow-cytometer that allows for the visualization of each event and the elimination of any false positive or false negatives (such as doublets or effector cells). This workflow can be completed in about 4 h, and allows for very stable results even when working with human samples. When available, research teams can test several experimental interventions in human subjects, and compare measurements across several time points without compromising the data&#39;s integrity.

This work describes an advanced workflow for the accurate and fast determination of NK (Natural Killer) cell count and NK cell cytotoxicity in human blood samples.

Flusso analisi di citometria di Natural Killer cellulare Lytic attività nel Sangue umano intero

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Human Endocervical Gamma Delta T Cells

The female reproductive tract (FRT) mucosal immune system serves as the first line of defense. Better knowledge of the genital mucosa is therefore essential for understanding pathogenicity of different pathogens including HIV. Gamma delta (GD) T cells are the prototype of &#39;unconventional&#39; T cells and represent a relatively small subset of T cells defined by their expression of heterodimeric T-cell receptors (TCRs) composed of gamma and delta chains. This sets them apart from the classical and much better known CD4+ helper T cells and CD8+ cytotoxic T cells that are defined by alpha-beta TCRs. GD T cells often show tissue-specific localization and are enriched in epithelium. GD T cells orchestrate immune responses in inflammation, tumor surveillance, infectious disease, and autoimmunity.
Here, we present a method to reproducibly isolate and analyze human endocervical intraepithelial GD T lymphocytes. We have used endocervical cytobrush samples from women participating in the Women&#39;s Interagency HIV Infection Study (WIHS). Knowledge about GD T cells interactions during conditions in which there is an insult to the vaginal mucosal could be applied to any clinical study in which mucosal vulnerability is addressed, including the development of vaginal microbicides.In addition, knowledge about mucosal GD T cell responses has potential for application of GD T cell-based immune therapy in treating infectious diseases.

We describe here an isolation method to obtain human endocervical intraepithelial lymphocytes for the analysis of intraepithelial gamma delta T cells. This protocol can be extended for the purification of endocervical gamma delta T cells by magnetic beads or by cell sorting.

L&#39;isolamento e la citometria a flusso Analisi di Human endocervicale Gamma Delta T Cells

The female reproductive tract (FRT) mucosal immune system serves as the first line of defense. Better knowledge of the genital mucosa is therefore ...

Digestion of the Murine Liver for a Flow Cytometric Analysis of Lymphatic Endothelial Cells

Within the liver, lymphatic vessels are found within the portal triad, and their described function is to remove interstitial fluid from the liver to the lymph nodes where cellular debris and antigens can be surveyed. We are very interested in understanding how the lymphatic vasculature might be involved in inflammation and immune cell function within the liver. However, very little has been published establishing digestion protocols for the isolation of lymphatic endothelial cells (LECs) from the liver or specific markers that can be used to evaluate liver LECs on a per cell basis. Therefore, we optimized a method for the digestion and staining of the liver in order to evaluate the LEC population in the liver. We are confident that the method outlined here will be useful for the identification and isolation of LECs from the liver and will strengthen our understanding of how LECs respond to the liver microenvironment.

The goal of this protocol is to identify lymphatic endothelial cell populations within the liver using described markers. We utilize collagenase IV and DNase and a gentle mincing of tissue, combined with flow cytometry, to identify a distinct population of lymphatic endothelial cells.

Digestione del fegato murino per un'analisi citofluorimetrica delle cellule endoteliali linfatiche

Within the liver, lymphatic vessels are found within the portal triad, and their described function is to remove interstitial fluid from the liver to the ...

Flow Cytometric Measurement Of ROS Production In Macrophages In Response To Fc&#947;R Cross-linking

The oxidative or respiratory burst is used to describe the rapid consumption of oxygen and generation of reactive oxygen species (ROS) by phagocytes in response to various immune stimuli. ROS generated during immune activation exerts potent antimicrobial activity primarily through the ability of ROS to damage DNA and proteins, causing death of microorganisms. Being able to measure ROS production reproducibly and with ease is necessary in order to assess the contribution of various pathways and molecules to this mechanism of host defense. In this paper, we demonstrate the use of fluorescent probes and flow cytometry to detect ROS production. Although widely used, fluorescent measurement of ROS is notoriously problematic, especially with regards to measurement of ROS induced by specific and not mitogenic stimuli. We present a detailed methodology to detect ROS generated as a result of specific Fc&#947;R stimulation beginning with macrophage generation, priming, staining, Fc&#947;R cross-linking, and ending with flow cytometric analysis.

This study demonstrates the use of flow cytometry to detect reactive oxygen species (ROS) production resulting from activation of the Fc&#947;R. This method can be used to assess changes in the antimicrobial and redox signaling function of phagocytes in response to immune complexes, opsonized microorganisms, or direct Fc&#947;R cross-linking.

Misurazione del flusso Cytometric di produzione di ROS nei macrofagi In risposta a FcγR cross-linking

The oxidative or respiratory burst is used to describe the rapid consumption of oxygen and generation of reactive oxygen species (ROS) by phagocytes in ...

Multi-scale Analysis of Bacterial Growth Under Stress Treatments

Analysis of the bacterial ability to grow and survive under stress conditions is essential for a wide range of microbiology studies. It is relevant to characterize the response of bacterial cells to stress-inducing treatments such as exposure to antibiotics or other antimicrobial compounds, irradiation, non-physiological pH, temperature, or salt concentration. Different stress treatments might disturb different cellular processes, including cell division, DNA replication, protein synthesis, membrane integrity, or cell cycle regulation. These effects are usually associated with specific phenotypes at the cellular scale. Therefore, understanding the extent and causality of stress-induced growth or viability deficiencies requires a careful analysis of several parameters, both at the single-cell and at the population levels. The experimental strategy presented here combines traditional optical density monitoring and plating assays with single-cell analysis techniques such as flow cytometry and real time microscopy imaging in live cells. This multiscale framework allows a time-resolved description of the impact of stress conditions on the fate of a bacterial population.

This protocol allows a time-resolved description of bacterial growth under stress conditions at the single-cell and the cell population levels.

Analisi multiscala della crescita batterica sotto trattamenti di stress

Analysis of the bacterial ability to grow and survive under stress conditions is essential for a wide range of microbiology studies. It is relevant to ...