Bu çalışma Nörolojik Bozukluklar ve İnme (NIH / NINDS) MGC R01-NS074387, R01-R21-NS057711 ve NS091555 hibe ve / Ulusal Enstitüsü Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklenen; NIH / NINDS PRL için R01-NS061107, R01-NS076991, R01-R21-NS082311 ve NS084275 verir; Leah Mutlu Kalpler gelen hibeler, MGC ve PRL layık Michigan Kapsamlı Kanser Merkezi&#39;nde Üniversitesi; Nöroşirürji Tıp Michigan Okulu Üniversitesi Anabilim Dalı; NIH hibe 2UL1-TR000433 tarafından desteklenen Klinik Michigan Enstitüsü ve Sağlık Araştırması; NIH / NCI (National Cancer Institute) hibe T32-CA009676 tarafından desteklenen Michigan Üniversitesi Kanser Biyolojisi Eğitim Hibe; NIH / NINDS tarafından desteklenen Klinik ve Temel Nörobilim Michigan Eğitim Üniversite T32-NS007222 hibe; ve NIH / NIGMS (Genel Tıp Bilimleri Ulusal Enstitüsü) tarafından desteklenen Michigan Tıp Bilim Adamı Yetiştirme Programı Üniversite T32-GM007863 hibe. YazarlarDr Karin Muraszko ve Nöroşirürji Anabilim alınan akademik liderlik ve destek için müteşekkir yeniden; M. Dahlgren, D. Tomford ve mükemmel idari destek S. Napolitan için; üstün teknik yardım için, M. Dzaman için; ve bir Zeiss 3D Taramalı Elektron Mikroskobu satın alma yönünde cömert destek için Phil F. Jenkins için. Biz de beyin mononükleer hücrelerin izolasyonu için yoğunluk santrifüj medya aracılı stratejinin değiştirilmiş bir versiyonu çizilmiş olan Harvard Tıp Okulu&#39;nda Kuchroo laboratuvar kabul etmiş sayılırsınız.

<ol>
	<li>Bleeker, F. E., Molenaar, R. J., Leenstra, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+the+molecular+understanding+of+glioblastoma.">Recent advances in the molecular understanding of glioblastoma.</a> J Neurooncol. 108, 11-27 (2012).</li><li>Stupp, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiotherapy+plus+concomitant+and+adjuvant+temozolomide+for+glioblastoma.">Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma.</a> N Engl J Med. 352, 987-996 (2005).</li><li>Ostrom, Q. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CBTRUS+statistical+report:+primary+brain+and+central+nervous+system+tumors+diagnosed+in+the+United+States+in+2007-2011.">CBTRUS statistical report: primary brain and central nervous system tumors diagnosed in the United States in 2007-2011.</a> Neuro Oncol. 16, iv1-63 (2014).</li><li>Louveau, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+features+of+central+nervous+system+lymphatic+vessels.">Structural and functional features of central nervous system lymphatic vessels.</a> Nature. 523, 337-341 (2015).</li><li>Kennedy, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-associated+macrophages+in+glioma:+friend+or+foe?.">Tumor-associated macrophages in glioma: friend or foe?.</a> J Oncol.. 2013, 486912 (2013).</li><li>Markovic, D. S., Glass, R., Synowitz, M., Rooijen, N., Kettenmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+stimulate+the+invasiveness+of+glioma+cells+by+increasing+the+activity+of+metalloprotease-2.">Microglia stimulate the invasiveness of glioma cells by increasing the activity of metalloprotease-2.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 64, 754-762 (2005).</li><li>Zhai, H., Heppner, F. L., Tsirka, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia/macrophages+promote+glioma+progression.">Microglia/macrophages promote glioma progression.</a> Glia. 59, 472-485 (2011).</li><li>Kmiecik, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+CD3++and+CD8++tumor-infiltrating+immune+cells+correlate+with+prolonged+survival+in+glioblastoma+patients+despite+integrated+immunosuppressive+mechanisms+in+the+tumor+microenvironment+and+at+the+systemic+level.">Elevated CD3+ and CD8+ tumor-infiltrating immune cells correlate with prolonged survival in glioblastoma patients despite integrated immunosuppressive mechanisms in the tumor microenvironment and at the systemic level.</a> J Neuroimmunol. 264, 71-83 (2013).</li><li>Yang, I., Han, S. J., Sughrue, M. E., Tihan, T., Parsa, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+cell+infiltrate+differences+in+pilocytic+astrocytoma+and+glioblastoma:+evidence+of+distinct+immunological+microenvironments+that+reflect+tumor+biology.">Immune cell infiltrate differences in pilocytic astrocytoma and glioblastoma: evidence of distinct immunological microenvironments that reflect tumor biology.</a> J Neurosurg. 115, 505-511 (2011).</li><li>Wagner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial/macrophage+expression+of+interleukin+10+in+human+glioblastomas.">Microglial/macrophage expression of interleukin 10 in human glioblastomas.</a> Int J Cancer. 82, 12-16 (1999).</li><li>El Andaloussi, A., Lesniak, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+increase+in+CD4+CD25+FOXP3++regulatory+T+cells+in+tumor-infiltrating+lymphocytes+of+human+glioblastoma+multiforme.">An increase in CD4+CD25+FOXP3+ regulatory T cells in tumor-infiltrating lymphocytes of human glioblastoma multiforme.</a> Neuro Oncol. 8, 234-243 (2006).</li><li>Kostianovsky, A. M., Maier, L. M., Anderson, R. C., Bruce, J. N., Anderson, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytic+regulation+of+human+monocytic/microglial+activation.">Astrocytic regulation of human monocytic/microglial activation.</a> J Immunol. 181, 5425-5432 (2008).</li><li>Curtin, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HMGB1+mediates+endogenous+TLR2+activation+and+brain+tumor+regression.">HMGB1 mediates endogenous TLR2 activation and brain tumor regression.</a> PLoS Med. 6, e10 (2009).</li><li>Curtin, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fms-like+tyrosine+kinase+3+ligand+recruits+plasmacytoid+dendritic+cells+to+the+brain.">Fms-like tyrosine kinase 3 ligand recruits plasmacytoid dendritic cells to the brain.</a> J Immunol. 176, 3566-3577 (2006).</li><li>Mineharu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+the+brain+tumor+microenvironment+enhances+the+efficacy+of+dendritic+cell+vaccination:+implications+for+clinical+trial+design.">Engineering the brain tumor microenvironment enhances the efficacy of dendritic cell vaccination: implications for clinical trial design.</a> Clin Cancer Res. 17, 4705-4718 (2011).</li><li>Larocque, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exogenous+fms-like+tyrosine+kinase+3+ligand+overrides+brain+immune+privilege+and+facilitates+recognition+of+a+neo-antigen+without+causing+autoimmune+neuropathology.">Exogenous fms-like tyrosine kinase 3 ligand overrides brain immune privilege and facilitates recognition of a neo-antigen without causing autoimmune neuropathology.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 14443-14448 (2010).</li><li>Curtin, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treg+depletion+inhibits+efficacy+of+cancer+immunotherapy:+implications+for+clinical+trials.">Treg depletion inhibits efficacy of cancer immunotherapy: implications for clinical trials.</a> PLoS One. 3, e1983 (2008).</li><li>Ali, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+immunostimulation+and+conditional+cytotoxic+gene+therapy+provide+long-term+survival+in+a+large+glioma+model.">Combined immunostimulation and conditional cytotoxic gene therapy provide long-term survival in a large glioma model.</a> Cancer Res. 65, 7194-7204 (2005).</li><li>Dewey, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+brain+inflammation+and+persistent+herpes+simplex+virus+1+thymidine+kinase+expression+in+survivors+of+syngeneic+glioma+treated+by+adenovirus-mediated+gene+therapy:+implications+for+clinical+trials.">Chronic brain inflammation and persistent herpes simplex virus 1 thymidine kinase expression in survivors of syngeneic glioma treated by adenovirus-mediated gene therapy: implications for clinical trials.</a> Nat Med. 5, 1256-1263 (1999).</li><li>Baker, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+killer+cells+eradicate+galectin-1-deficient+glioma+in+the+absence+of+adaptive+immunity.">Natural killer cells eradicate galectin-1-deficient glioma in the absence of adaptive immunity.</a> Cancer Res. 74, 5079-5090 (2014).</li><li>Baker, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+glioma+formation:+iterative+perivascular+glioma+growth+and+invasion+leads+to+tumor+progression,+VEGF-independent+vascularization,+and+resistance+to+antiangiogenic+therapy.">Mechanisms of glioma formation: iterative perivascular glioma growth and invasion leads to tumor progression, VEGF-independent vascularization, and resistance to antiangiogenic therapy.</a> Neoplasia. 16, 543-561 (2014).</li><li>Ormerod, M. G., Novo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Flow cytometry : a basic introduction. , (2008).</li><li>Stirling, D. P., Yong, V. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+the+inflammatory+response+after+murine+spinal+cord+injury+revealed+by+flow+cytometry.">Dynamics of the inflammatory response after murine spinal cord injury revealed by flow cytometry.</a> J Neurosci Res. 86, 1944-1958 (2008).</li><li>Hirai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+prevalence+and+phenotype+of+activated+microglia/macrophages+within+the+spinal+cord+of+the+hyperostotic+mouse+(twy/twy)+changes+in+response+to+chronic+progressive+spinal+cord+compression:+implications+for+human+cervical+compressive+myelopathy.">The prevalence and phenotype of activated microglia/macrophages within the spinal cord of the hyperostotic mouse (twy/twy) changes in response to chronic progressive spinal cord compression: implications for human cervical compressive myelopathy.</a> PLoS One. 8, e64528 (2013).</li><li>Fleming, T. J., Fleming, M. L., Malek, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+expression+of+Ly-6G+on+myeloid+lineage+cells+in+mouse+bone+marrow.+RB6-8C5+mAb+to+granulocyte-differentiation+antigen+(Gr-1)+detects+members+of+the+Ly-6+family.">Selective expression of Ly-6G on myeloid lineage cells in mouse bone marrow. RB6-8C5 mAb to granulocyte-differentiation antigen (Gr-1) detects members of the Ly-6 family.</a> J Immunol. 151, 2399-2408 (1993).</li><li>Wiesner, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+novo+induction+of+genetically+engineered+brain+tumors+in+mice+using+plasmid+DNA.">De novo induction of genetically engineered brain tumors in mice using plasmid DNA.</a> Cancer Res. 69, 431-439 (2009).</li><li>Holland, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+activation+of+Ras+and+Akt+in+neural+progenitors+induces+glioblastoma+formation+in+mice.">Combined activation of Ras and Akt in neural progenitors induces glioblastoma formation in mice.</a> Nat Genet. 25, 55-57 (2000).</li><li>Lynes, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentiviral-induced+high-grade+gliomas+in+rats:+the+effects+of+PDGFB,+HRAS-G12V,+AKT,+and+IDH1-R132H.">Lentiviral-induced high-grade gliomas in rats: the effects of PDGFB, HRAS-G12V, AKT, and IDH1-R132H.</a> Neurotherapeutics. 11, 623-635 (2014).</li><li>de Vries, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+robust+transgenic+high-grade+glioma+mouse+models+for+therapy+intervention+studies.">Rapid and robust transgenic high-grade glioma mouse models for therapy intervention studies.</a> Clin Cancer Res. 16, 3431-3441 (2010).</li><li>Uhrbom, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ink4a-Arf+loss+cooperates+with+KRas+activation+in+astrocytes+and+neural+progenitors+to+generate+glioblastomas+of+various+morphologies+depending+on+activated+Akt.">Ink4a-Arf loss cooperates with KRas activation in astrocytes and neural progenitors to generate glioblastomas of various morphologies depending on activated Akt.</a> Cancer Res. 62, 5551-5558 (2002).</li><li>Marumoto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+novel+mouse+glioma+model+using+lentiviral+vectors.">Development of a novel mouse glioma model using lentiviral vectors.</a> Nat Med. 15, 110-116 (2009).</li><li>Assanah, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+progenitors+in+adult+white+matter+are+driven+to+form+malignant+gliomas+by+platelet-derived+growth+factor-expressing+retroviruses.">Glial progenitors in adult white matter are driven to form malignant gliomas by platelet-derived growth factor-expressing retroviruses.</a> J Neurosci. 26, 6781-6790 (2006).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Bu protokol, erken fare beyin tümör mikro sızmış PBMC izole edilmesi ve akış sitometrik analiz için sağlam ve tekrarlanabilir bir yöntem tarif eder. Glioma hücre süspansiyonları stereotaksi fare beyninin striatumu içine aşılanan deneye ile belirtilen bir konsantrasyonda oluşturulur. Fareler daha sonra deney tasarımı ile belirtilmiş önceden belirlenmiş zaman noktalarında itlaf edilmiş ve beyinleri hasat edildi ve florokrom-eşlenik birincil antikor kombinasyonları ile immunolabeled edilir glioma süzücü PBMC izole etmek için işlenir; imüno-Hücreler daha sonra akım sitometrisi ile nicelendirilir. Burada sunulan gösteri, erken zaman noktalarında üzerinde duruluyor olsa da, glioma-sızmakta PBMCler fare can çekişme kadar herhangi bir zaman noktası sonrası tümör melezleme up değerlendirilebilir. Farklı antikor kombinasyonlarının herhangi bir sayıda İlgilenilen bağışıklık hücreleri incelemek için kullanılabilir bir yöntem oldukça modülerdirT hücreleri, B hücreleri, NK hücreleri, monositler ve makrofajlar da ncluding. Protokol dişi C57BL / 6J fareler 8-10 hafta kullanılmak üzere optimize edilmiştir unutmayın. Bu yaş aralığının dışında Fareler burada sunulan verilerin temsilcisi değildir eşdeğer zaman noktalarında hücre sayımları yol açabilir dolaşan PBMC&#39;lerden, yüzdelerini değişmiş olabilir. (Jackson Laboratory,; Fare Phenome veritabanı Jaxpheno6) Alternatif tümör modelleri kullanılır ve B6 arka plan üzerinde dışında farenin nedeni kullanıldığında suşlar da PBMC profilleri farklı olabilir, eğer Karakterizasyon deneyler de gerekli olabilir. Toplumsal Cinsiyet ve çevre koşulları da PBMC frekanslar ve yüzdeler arasındaki eşitsizlik kaynakları olabilir. Bu yöntem, saptanmasını sağlayan dört hücre yüzey antikorların bir kombinasyonu kullanılarak ortaya konmuştur Gr-1 + hücreleri ve miyeloid NK1.1 + NK hücreleri, hücre tipleri ga reddinde rol + / CD11bl-1-eksikliği olan glioma. Hücre içi GzmB antikorların dahil edilmesi, NK hücresi alt kümesi içinde bir sitotoksik potansiyel belirlenmesini sağlar. Örnek sonuçlar nedeniyle ya shRNA aracılı gen demonte seviyeleri azaltmıştır gal-1 normal seviyelerini ifade veya singeneik C57BL / 6J fareler erken GL26-Cit gliomlar bağışık hücre infiltrasyonu verilmiştir. Gösteri glioma-sızmakta PBMC&#39;ler tekrarlanabilir izole ve en kısa sürede 24 saat sonrası tümör engraftment olarak ölçülebilir göstererek tekniğin hassasiyet ve tekrarlanabilirlik sergiler. Kenara tümör infiltre Gr-1 yüksek / CD11b + miyeloid hücrelerin bir nüfusa çalınmasının, gösteri de Gr-1 int nüfusu ortaya kimliği henüz tanımlanmamış / CD11b + hücreleri.; Ek deneyler daha bu hücre popülasyonunun karakteri deşifre etmek için gereklidir. Biz de CD45 bir kolaylıkla ayırt nüfus gözlemlemek olmadığını unutmayın <sup&gt; int / Gr-1 - / CD11b yüksek /NK1.1 - Daha önce başkaları 23,24 tarafından tarif edildiği gibi mikroglia tutarlı hücreleri. Bu sonuç için basit bir açıklama burada kullanılan spesifik izolasyon protokolü 37/70 yoğunluk santrifüj medya arayüzü kendi birikimini engeller olduğunu. Bu 37/70 yoğunluk santrifüj arayüzünden toplanan hücreler glioma hücreleri kendilerini dahil etmek görünmüyor işaret etmek de önemlidir. Bu bulgu, açıkça ortadadır SSC-A 100-200K arasında görünür ve 100K GL26-Cit glioma hücreleri, FSC A Bu tasvirde kullanılan eşdeğer PMT voltajlar kullanılarak (veriler gösterilmemiştir) FSC bulunmaması halinde, A vs SSC-A araziler (5A bkz Şekil, Adım 1). Anti-Gr-1 antikorları Polimorfonükleer sırasıyla 25 mononükleer miyeloid hücrelerin, özgü Ly6G ve LY6C hücre yüzey proteinleri, hem tanır. Anti-Gr-1 Antibod kullanımıler, böylece bu iki hücre popülasyonları arasındaki ayrım engellemektedir. Laboratuarımızda Ön sonuçlar artık gal-1 eksik glioma mikro sızmak erken Gr-1 + / CD11b + hücrelerinin daha doğru bir açıklama ışık tutmaya başlıyor. (: 1A8 klonu) ve anti-Ly6C (klon: AL-21), anti-Ly6G içeren deneyler, anti-CCR2 antikorları ile birlikte antikorların hemen Gr-1 / yüksek CD11b + hücrelerinin erken gal-1-eksikliği olan tümör mikro infiltre göstermektedir Diğer deneyler, bu sonucu teyit etmek için gerekli olmasına rağmen, Ly6C / yüksek CCR2 enflamatuvar monositler ile uyumludur (veriler gösterilmemiştir). Nedeniyle hücreye bu glioma süzücü PBMC izole yer tekrar santrifüjleme ve yeniden süspansiye adımları sırasında oluşabilecek kaybeder, bu hücre sayısı, aslında bozulmamış beyin içinde mevcut ne, alt aslında gözlenenden muhtemeldir. E arasındaki Ancak farklarXperimental grupları 37/70 yoğunluk santrifüj ortam maddesi ara-eşdeğer miktarlar ekstre halinde tutmak ve her bir numunenin tüm hacmi, akış sitometresiyle analiz durumunda. Bu adımlara uyulmaması örnekler arasında haksız karşılaştırmalar neden olur ve tarafsız analiz engel olacaktır. Beyin tümörü mikro giren PBMC&#39;lerin tam sayısını ölçmek için yetersizlik bu protokole bir sınırlama özgü değildir. Böyle immünohistolojik hücre sayımı stratejileri gibi alternatif yöntemler nedeniyle arka plan boyama onların düzeyinde farklılık gösterebilir Stereolojik sayıları ve doku bölümü mikrograflarında eşdeğer görüntü eşikleme gereksinimi dayalı toplam hücre sayıları ekstrapolasyonlardan, potansiyel yanlış giden de hata tabidir -negatif ya da yanlış pozitif sinyaller. Bununla birlikte, farklı analitik yöntemler arasındaki zaman ders analizi bir karşılaştırma benzer genel şekli ile zamana bağlı bağışıklık akını eğrileri ortaya koymalıdır. Birimmünohistokimyasal yöntemlere ek bir sakınca sitometri formalinle sabitlenmiş olan beyin doku kesitlerinin bağlamında denk bir antijenik epitopa bağlanma akışı için geçerli belirli antikorların yetersizliğidir. Kendi metodolojisi ile yabancı olanlar için sınırlamalar olarak hizmet edebilir, bu protokolde birkaç önemli adım vardır. Böyle bir adım, zarar vermeden kafatası gelen beyin hasat olduğunu. Biz önce uygun deneyler çalışan tekniği birkaç kez pratik öneririz. Beyin sonunda toz haline edilecektir Bununla birlikte, beyin yüzeysel tabakalarına küçük bir hasar glioma süzücü PBMC&#39;ler doğru miktar ile ilgisiz muhtemeldir. Deneyimsiz araştırmacılar, başlangıçta zor bulabilir ikinci aşama yoğunluk santrifüj medya degrade dökülen olduğunu. Üstünde% 37 yoğunluğu santrifüj medyanın 2 ml örten ise temiz bir arayüze oluşturmak için deneyselciler yeteneği% 70 katman PBMC&#39;lerin tekrarlanabilir izolasyonu için çok önemlidir. Bu adımı başlangıçta zor kanıtlamak olsa da, büyük ölçüde PBMC&#39;ler için zenginleştirir ve dramatik nerede tüm beyin dokusu sitometrik akış analiz edilecek olursa zaman süresi, aksi takdirde numune analiz için gerekli azalır. PBMC zenginleştirme de böylece .fcs dosya boyutlarını azaltarak ve nadir beyin infiltre bağışıklık hücre popülasyonlarının çözmek için yardımcı akış sitometresi tarafından yakalanan olayların toplam sayısını azaltır. Temiz bir yoğunluk santrifüj arayüzü biz düzgün piston eylemi ile bir P-1000 mikropipet kullanarak% 37 yoğunluk santrifüj medya dökülen öneririz kurulmasında iyi sonuçlar için. 15 ml santrifüj tüp yaklaşık 20-30 ° tezgah üstünde üstünde açısı. % 70 yoğunluk santrifüj medya tabakasının yüzeyi üzerinde boru 3-5 mi işaretlerinin tarafında mikropipet ucu bekletin. Extru o kadar% 37 yoğunluğu santrifüj medyanın açık dışa ivme aza indirmek için yavaş yavaş bu yüzden sürekli dökün vesırayla mikropipet ucundan des yatan% 70 yoğunluğu santrifüj medya rahatsız etmemek için. Son olarak, beyin dokusu mimarisi zorunlu izole etme sürecinde tahrip olması glioma infiltre PBMC ilave farenin zaman noktası eşleşen histolojik verileri elde etmek için gerekli olacağı anlamına gelir. Normal kemirgen beyin içine onkojenik plasmid DNA enjeksiyonu yoluyla üretilen Yeni glioma modelleri son yıllarda 26-32 geliştirilmiştir. Bu &quot;içsel&quot; tümör modelleri stereotaksi ex vivo olarak kanser hücrelerini aşılanması ve daha yakından klinik glioma histolojik işaretlerinden taklit kaynaklanan potansiyel eserler aşmak. Burada tarif edilen yöntem, bu klinik açıdan daha anlamlı model sistemler karakterize bağışıklık infiltrasyon etkinlikleri çalışma için uygundur. Neonatal farelerinde bağışıklık akışı ile ilgili çalışmalar aynı zamanda yenidoğan Mutabakat yoğunluğuna rağmen, bu yöntem kullanılarak gerçekleştirilebilire, beyin, beyin dokusunun sindirimi üzerine önlemek için enzimatik sindirim aşamasında bir optimizasyon gerektirebilir yetişkinler arasında daha azdır. Tekniğin Ek uygulamalar bu deneysel alerjik ensefalomiyelit (EAE) ve viral enfeksiyonlara immun yanıt olarak kenara kötü huylu tümörlerin inflamatuar beyin hastalığı alternatif sınıfları kapsayabilir.

Gliomalar, merkezi sinir sistemi (CNS) dönüştürülmüş glia kaynaklanan nöroepitelyal Beyin kanserlerinin sınıfıdır. Tüm Gliomaların, Dünya Sağlık Örgütü (WHO) Evre IV glioma veya glioblastoma (GBM), en yaygın ve 1 ölümcül olanıdır. GBM temozolomidin 2 ile radyasyon artı eşzamanlı ve adjuvan kemoterapi takiben ölçüde mümkün tümör rezeksiyonu oluşan mevcut standart-bakım son derece dirençli olduğunu. Bu ölümcül kanserler 5 yıl sonra 3 hastalık hayatta kalan hastaların sadece% 5 ile ilk tanı anında hayatta kalma, sadece 15-18 ay kasvetli prognoz taşır. Kan-beyin bariyeri (BBB) ​​varlığı, profesyonel antijen sunan hücreler eksikliği (APC&#39;ler) ve beyin 4 içindeki niyetli lenf yapılarının daha önce tanımlanmamış varlığı ayrıcalıklı immün GBM kavramına yol açmıştır. Ancak, çok sayıda çalışmalar artık shobu beyin kanserleri gerçekten de, monositler, makrofajlar, ve miyeloid türevi bastırıcı hücreler (MDSCs) 5 içerir kökenli ağırlıklı miyeloid periferal bağışıklık hücrelerinin alınmasını doğurmak bu w. GBM de 6,7 yanlısı tümörijenik olmak için beyin ikamet mikroglia aktivitesini etkilemektedir. Örneğin CD8 + T hücrelerinin CD56 + 8 ve doğal öldürücü hücrelerin 9 lenfatik hücreler de tümörün mikro-ortamı içinde mevcut olan, ancak çok daha az sayıda, düşünülen bir gerçektir (nedeniyle tümör bağlantılı makrofajlar üzerinde glioma türetilmiş faktör tarafından teşvik bağışıklık işlevine olduğu TAM) 10. CD4 + T hücreleri GBM de mevcut, ancak bu nüfusun çok da CD25 ve Foxp3, immünosupresif T regülatör (T reg) hücrelerinin 11 yapımcıları ifade eder. GBM genel bağışıklık durumu immünolojik kaçış ve tümör ilerlemesi 12. promosyon sona eriyor. <p class= &quot;jove_content&quot;&gt; GBM immunsupresyonun mekanizmaların daha iyi anlaşılması tümöre karşı bağışıklık sistemini uyarmak için tasarlanmış etkili immunoterapötik stratejilerin geliştirilmesi için kritik öneme sahiptir. Son 15 yılda bizim laboratuvar etkili yeni bir anti-GBM immünoterapötiklerin 13-19 geliştirmek için beyin tümörü immunosuppresson mekanizmalarını aşmak için çalıştı. Bu eserin doruk noktası artık yeni teşhis GBM (: NCT01811992 ClinicalTrials.gov Identifier) ​​olan hastalar için kombine sitotoksik ve bağışıklık uyarıcı terapötik değerlendirmek için tasarlanmış bir klinik çalışmaya yol açmıştır. En son çalışmalar, fare ve sıçan CNS GL26-1 GBM hücreleri β-galaktozid bağlayıcı lektin galektin-1 (gal-1), 20, büyük miktarlarda üretilmesi anti-tümör NK hücre immün gözetim bloke olduğunu göstermektedir. Bu shRNA aracılı gen demonte kullanılarak glioma hücreleri gal-1 ekspresyonunu bastırmak ile gösterilmiştir. İn vitro experiments gal-1 eksikliği glioma hücreleri kültürde normal çoğaldı gösterdi, ancak genetik olarak özdeş C57BL / 6J veya RAG1 içine intrakranial engraftment kısa bir süre sonra hızlı ret uygulandı - / - farelerin, böylece bu formda T veya B hücrelerinin bağımsızlığını kuran tümör rejeksiyon. Anti asiolo GM 1, anti-serum veya gal-1-eksikliği olan glioma reddi NK hücrelerinin rolünün oluşturulması intrakraniyal gal-1-eksikliği olan glioma büyümesinin komple restorasyonuna yol açan monoklonal NK1.1 antikorları ile NK hücre bağışıklık sistemine. Şimdi Gr-1 + / CD11b + miyeloid hücrelerin bu bağışıklık sistemindeki durumu göstermektedir, böylece, NK-aracılı gal yardımında miyeloid hücreleri için bir vazgeçilmez yardımcı bir rol ortaya NK hücrelerin varlığına rağmen gal-1-eksikliği olan gliom reddini önlemek için yeterli olan -1 eksik tümör lizis (yayınlanmamış veriler). Bu beklenmedik sonuç, periferik kan mononükleer hücrelerin izolasyonu ve analiz (PBMC) için kapsamlı bir protokol geliştirmek için yol olduğudaha iyi gal-1 eksik glioma reddini yüklem bağışıklık sızma olayları karakterize böylece yakında intrakranial engraftment sonra beyin tümörü mikro sızmak. Yöntem, GL26-Cit olarak adlandırılan bir şekilde eksprese mCitrine floresan protein, floresan mikroskobu 21 doğrudan tümör hücresi görüntülenmesine izin vereceği şekilde bir fare GL26 glioma hücreleri kullanılarak burada gösterilmiştir. Bu hücreler stereotaksi singeneik C57BL / 6J fareler, beyin içine aşılanan ve önceki fare ötenaziye 24, 48 ya da 72 saat boyunca büyümeye bırakılmıştır. Glioma nüfuz eden PBMC&#39;ler daha sonra anti -CD45 kullanılarak izole edilir ve imüno-edilir, -Gr-1, -CD11b ve granzim B hücre içi immunolabeling birlikte -NK1.1 hücre yüzeyi antikorlar (GzmB). Antikorların Bu özel bileşimi Bu var b tümör-süzücü Gr-1 + / CD11b + miyeloid hücrelerin tanımlanması ve NK1.1 +, NK hücreleri, hücre tipleri için izin verireen gal-1 eksikliği tümör reddi karışmış. Gal-1-eksikliği olan GL26-Cit glioma bağışıklık infiltrasyonu profili, GL26-Cit-gal1i olarak anılacaktır, daha sonra, bir non-içeren gal-1 GL26-Cit-NT adı normal seviyelerini sentezleyen gliomlar ile karşılaştırılır Kontrol ShRNA hairpin hedefleme. Protokol ortotopikal singeneik C57BL / 6J fareler striatumu içine, bu hücrelerin sokmak için nasıl bir açıklama takip eder, in vitro olarak nasıl Kültür GL26-Cit glioma hücreleri üzerinde bir açıklama ile başlar. Daha sonra izolasyon ve akım sitometri analizi için glioma-infiltre PBMC&#39;lerin immunolabeling ilgili adımları saymaya devam eder. Protokol standart veri analizi ve grafik gösterimi bir açıklama ile sona eriyor. Gösteri ortaya koymaktadır hem Gr-1 + / CD11b + miyeloid hücreleri ve NK1.1 + NK hücreleri tercihen 48 içinde gal-1 eksikliği beyin tümörü mikroçevresinin içinde birikirTümör implantasyonu, bu tümörler hızla tam tümör lizis yaklaşık 1 hafta sonrası tümör melezleme 20 geçmesi açıklamaya yardımcı olan bir sonucun hr. Yöntem, beyin içine bağışıklık infiltrasyonu üzerine geçici veri gerekli olduğu in vivo olarak farklı deney tasarımları bir dizi için de uyarlanabilir. Tek bir Deneyciler analiz edilecek numune sayısına bağlı olarak yaklaşık 4-6 saat içinde, glioma süzücü PBMC akım sitometrik beyin hasat protokolü gerçekleştirebilir. Yöntem aynı zamanda, özellikle tümör mikro-ortamı tarafından uyarılan bağışıklık bastırma fenotipleri tespit etmek, böylece beyin sızmaya olanlar ile karşılaştırıldığında tümör taşıyan farelerdeki PBMC&#39;ler dolaşan profilini karakterize etmek için amaçlanmıştır deneyler ile kombine edilebilir. Bu ve benzeri yöntemlerin uygulanması beyin tümörü mikroçevresinin içine periferik bağışıklık hücrelerinin kaçakçılığıyla faktörlerin daha iyi anlaşılmasını kolaylaştıracaktır.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modification of Eagles Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12430-054</td>
			<td>with 4.5g/L D-glucose, L-glutamine, 25mM HEPES and phenol red&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate-buffered Saline&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144&#160;</td>
			<td>without calcium chloride or Magnesium chloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Omega Scientific Inc.</td>
			<td>FB-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>10,000U/ml Penicillin; 10,000&#956;g/ml Streptomycin&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-081</td>
			<td>200mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G418 sulfate&#160;</td>
			<td>Omega Scientific Inc.</td>
			<td>GN-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin dihydrochloride&#160;&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8833</td>
			<td>from Streptomyces alboniger</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone HyQTase non-mammalian trypsin alternative&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SV30030.01</td>
			<td>in DPBS with EDTA&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phase contrast hemocytometer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z359629</td>
			<td>0.1mm deep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue stain</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 0.9% NaCl injection, USP</td>
			<td>Hospira</td>
			<td>NDC: 0409-4888</td>
			<td>10ml vials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.6ml conical polypropylenemi microtubes</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>22-272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atipamezole hydrochloride injection</td>
			<td>Orion Pharma</td>
			<td>NDC: 52483-6298</td>
			<td>5mg/ml solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine hydrochloride injection</td>
			<td>Fort Dodge</td>
			<td>NDC: 0409-2051</td>
			<td>100mg/ml solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexmedetomidine hydrochloride injection</td>
			<td>Zoetis</td>
			<td>NDC: 54771-2805</td>
			<td>0.5mg/ml solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine hydrochloride injection</td>
			<td>Lloyd</td>
			<td>NDC: 61311-481</td>
			<td>100mg/ml solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carprofen injection</td>
			<td>Pfizer</td>
			<td>NDC: 61106-8501</td>
			<td>50mg/ml solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine hydrochloride injection</td>
			<td>Reckitt Benckiser</td>
			<td>NDC: 12496-0757</td>
			<td>0.3mg/ml ampuls</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1ml tuberculin syringes&#160;</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>8881501400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>26G x &#189; (0.45mm x 13mm) syringe needles&#160;</td>
			<td>BD</td>
			<td>305111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical clippers</td>
			<td>3M</td>
			<td>9661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Providone-iodine solution</td>
			<td>Aplicare</td>
			<td>82-217</td>
			<td>NDC: 52380-1905</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile petrolatum ophthalmic ointment&#160;</td>
			<td>Dechra</td>
			<td>NDC: 17033-211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% isopropyl alcohol prep pads</td>
			<td>Kendall</td>
			<td>6818</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile gauze</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>8044</td>
			<td>non-woven, 4&#34; x 4&#34;, 4-ply&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.7ml conical polypropylene microtubes</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>22-281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse stereotactic frame</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>51730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical lamp</td>
			<td>Philips Burton</td>
			<td>CS316W</td>
			<td>Coolspot II Variable Spotlight</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved dissecting forceps</td>
			<td>Ted Pella Inc.</td>
			<td>5431</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colibri retractors&#160;</td>
			<td>FST</td>
			<td>17000-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cordless precision power drill</td>
			<td>Dremel&#160;</td>
			<td>1100-01</td>
			<td>Stylus model; 7.2-Volt Lithium-Ion with Docking Station</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Engraving Cutter</td>
			<td>Dremel</td>
			<td>105</td>
			<td>1/32&#34; or 0.8 mm bit diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microliter syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>75</td>
			<td>Hamilton Microliter&#174; Syringes 700 series; 5&#956;l volume</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microliter syringe needles</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>7762-06</td>
			<td>33G, small hub RN NDL, 1.5 in, point style 3, 6/PK</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethilon 3-0 black monofilament nylon sutures&#160;</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>1663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stir bar</td>
			<td>VWR</td>
			<td>74950-296</td>
			<td>7.9mm diameter x 50mm length (5/16&#34; diameter x 2&#34; length)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1L glass screw-cap storage bottle</td>
			<td>Corning</td>
			<td>1395</td>
			<td>Type 1, Class A borosilicate glass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium&#160;</td>
			<td>Sagent</td>
			<td>NDC: 25021-400</td>
			<td>1,000U/ml solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump</td>
			<td>Cole Parmer Instruments Group</td>
			<td>77200-60</td>
			<td>Master Flex Easy Load II console drive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>compressed carbogen (95% O2 / 5% CO2)</td>
			<td>available from local vendor</td>
			<td>N/A</td>
			<td>A-type, large cylinder&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20G x 1 &#189;&#34; aluminum hub blunt needles</td>
			<td>Kendall</td>
			<td>8881202363</td>
			<td>0.9mm x 38.1mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyurethane ice bucket</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>02-591-45</td>
			<td>Capacity: 0.152 oz. (4.5L)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase (Type I-S)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C1639</td>
			<td>from Clostridium histolyticum&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease I</td>
			<td>Worthington Biochemical Corp.</td>
			<td>LS002007</td>
			<td>&#62;2,000 Kunitz units per mg dry weight</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antistatic polystyrene hexagonal weighing dishes</td>
			<td>Ted Pella Inc.</td>
			<td>20157-3</td>
			<td>top I.D. 115mm, base I.D. 85mm, 203ml volume&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel single edged razor blades&#160;</td>
			<td>Garvey</td>
			<td>40475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bone rongeurs</td>
			<td>FST</td>
			<td>16001-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemostat</td>
			<td>FST</td>
			<td>13014-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large dissection scissors</td>
			<td>Ted Pella Inc.</td>
			<td>1316</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small dissection scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>14094-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt end forceps</td>
			<td>Ted Pella Inc.</td>
			<td>13250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7ml glass Dounce tissue grinder</td>
			<td>Kontes</td>
			<td>KT885300-0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll Density Centrifugation Media&#160;</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>GE17-0891-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL serological pipettes</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>12-104</td>
			<td>single use; sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70&#956;m sterile nylon mesh cell strainers&#160;</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>22363548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 700-conjugated rat anti-mouse CD45 (clone: 30-F11)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC-conjugated mouse anti-mouse NK1.1 (clone: PK136)</td>
			<td>eBiosciences&#160;</td>
			<td>17-5941-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-conjugated rat anti-mouse Gr-1 (clone:RB6-8C5)</td>
			<td>BD Pharmigen</td>
			<td>553128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP/Cy5.5-conjugated rat anti-mouse CD11b (clone: M1/70)&#160;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>101228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 700-conjugated rat IgG2b, &#954; (clone: RTK4530) isotype control&#160;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>400628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC-conjugated mouse IgG2a, &#954; (clone: eBM2a) isotype control&#160;</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>17-4724</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-conjugated rat IgG2b, &#954; (clone: eB149/10H5) isotype control&#160;</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-4031-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP/Cy5.5-conjugated rat IgG2b, &#954; (clone: RTK4530) isotype control</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>400632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pacific Blue-conjugated mouse anti-mouse granzyme B (Clone: GB11)&#160;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>515403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pacific Blue-conjugated mouse IgG1, &#954; (Clone: MOPC-21) isotype control&#160;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>400151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytofix/Cytoperm</td>
			<td>BD</td>
			<td>554714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15ml polypropylene centrifuge tubes</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>21-103</td>
			<td>conical bottom&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50ml polypropylene centrifuge tubes</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>21-108</td>
			<td>conical bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12x75mm round-bottom polypropylene FACS tubes&#160;</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>14-956-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSAria Special Order Research Product flow cytometer/cell sorter</td>
			<td>BD&#160;</td>
			<td>650033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Class II Biological Safety Cabinet</td>
			<td>The Baker Company</td>
			<td>SG603</td>
			<td>model: SterilGARD III Advance</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and flow cytometric analysis of glioma-infiltrating peripheral blood mononuclear cells

Laboratuvar son doğal katil (NK) hücreler, kanser hücrelerinin β-galaktozid bağlayıcı lektin galektin salgılamasında eksiklik kılınmış halinde intrakranial engraftment sonra merkezi sinir sistemi 1 malign gliomalar yakında ortotopikal implante fare ve sıçanı GL26 yok etme kapasitesine sahip olduğunu kanıtlamaktadır -1 (gal-1). Daha yeni iş artık Gr-1 + / CD11b + miyeloid hücrelerin bir popülasyonu bu yönde önemli olduğunu göstermektedir. Daha NK ve miyeloid hücrelerin, izolasyon ve glioma infiltre periferal kan tek-çekirdekli hücreleri (PBMC) analizi için geniş kapsamlı bir protokol geliştirilmiştir gal-1-eksikliği olan tümör reddinin kazandırmak için ortak olarak kullanmaktadırlar mekanizmalarının anlaşılması. Yöntem tümörün mikro içine PBMC sızmasını karşılaştırarak burada gösterilmiştir ShRNA demonte aracılığıyla gal-1 eksikliği hale olanlarla GL26 gliomalarda gal-1 ifade. Protokol bir bilgi ile başlar nasıl kültürü ve GL26 ce hazırlamaksingeneik C57BL / 6J fare beyin aşılama için lls. Daha sonra erken beyin tümörü mikroçevresinin gelen glioma-infiltre PBMC&#39;lerin izolasyon ve akım sitometri analizi yer alan adımları açıklar. Yöntem, beyin içine bağışıklık infiltrasyonu üzerine geçici veri gerekli olduğu in vivo deney tasarımları bir dizi uyarlanabilir. Glioma süzücü PBMC&#39;ler bağımsız deneyler boyunca zaman noktası eşleşen tümörlerden gözlenen benzer hücre sayısı ile 24 saat sonrası tümör melezleme olan en kısa sürede, kafatası tümörlerinden izole edilebilir bir yöntem, hassas ve yüksek ölçüde tekrarlanabilir. Tek bir Deneyciler analiz edilecek numune sayısına bağlı olarak yaklaşık 4-6 saat içinde, glioma süzücü PBMC akım sitometrik beyin hasat yöntemi gerçekleştirebilir. Alternatif glioma modeller ve / veya hücre spesifik saptama antikorları ayrıca birçok Immun süzülmesini değerlendirmek için deneysel çalışan takdirine kullanılabilirGenel prosedüre değişiklikler gerektirmeden ilgi e hücre tipleri.

Aşağıdaki yolluk strateji tipik bir deney için kullanılır: FSC-A SSC-A vs → SSC-H vs SSC-W → FSC-H FSC-W → CD45 vs vs sayım → Gr-1 vs CD11b → saymak vs NK1.1. Kapıları daha sonra GzmB ekspresyonu (Şekil 5A) göre tabakalı Gr-1 + / CD11b + miyeloid hücreleri ve NK1.1 + NK hücreleri yerleştirilir. NK1.1 + NK hücreleri ve Gr-1 + / CD11 b SSC-A NK hücrelerinin küçük lenfoid ve miyeloid hücreler boyutu nispeten büyük boyutu teyit edin FSC A üzerine deneylerde + miyeloid hücreleri (şekilde tanımlanmış olan hücrelerin Backgating Şekil 5B). Ham veri dosyaları (yani., Fcs dosyaları) gibi FlowJo olarak piyasada mevcut akım sitometri veri analizi yazılımı tarafından analiz edilir. 18 C57BL / 6J fareler, toplam bu yöntemi göstermek için kullanılmıştır. Dokuz (9) GL26-Cit-NT ile engrafted ve 9 aynı d GL26-Cit-gal1i ile engrafted edildiay hücreleri (3x10 4) eşdeğer numarasını kullanarak. Her gruptan üçer fare 24, 48 ötenazi ve 72 saat sonrası tümör melezleme edildi. Veri singeneik C57BL / 6J fareler, beyin içine GL26-Cit-gal1i glioma hücreleri melezleşmesi hızlı CD45 + PBMC (Şekil 6A) alımı indüklediğini göstermektedir. Tasvirde kullanılan spesifik antikor kokteyli dayanarak daha Gr-1 + / CD11b + miyeloid hücreleri ve NK1.1 + NK hücrelerinin spesifik olarak tümör melezleme ve 48 saat (Şekil olan gal-1-eksikliği olan tümör mikro butonu olduğu gösterilebilir 6B ve 6C); kadar NK hücreleri bu artışın glioma infiltre miyeloid hücrelerin ancak toplam sayısı. <img alt="figür 1" src="/files/ftp_upload/53676/53676fig1.jpg" /> Şekil 1: İntrakraniyal Aşı için GL26-Cit Hücrelerinin Hazırlanması (A.) Temsilcisi 10X parlak alan ve GL26-Cit-NT (sol görüntüler) ve GL26-Cit-gal1i (sağ görüntüler) kültürde yetişen hücrelerin Epifloresans mikrograflan. (B) GL26-Cit-NT (sol şerit) ve GL26-Cit-gal1i (sağ şerit) bütün hücre lizatının Western blot. Gama tubulin (γ-küvet.) Yükleme kontrolü olarak gösterilir. 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 550 x g&#39;de (maksimum RCF) santrifüj sonrasında yaklaşık% 50 oranında konfluent T75 doku kültür şişesine (C) GL26-Cit hücre topağı. Hücre sayısını ve canlılığını değerlendirmek için Tripan Blue ile 1: (D) GL26-Cit hücreleri (beyaz noktalar) içeren bir hemasitometre Parlak alan görünümü 1 seyreltilmiş. Hücreler tekrarlanabilir tümör büyümesini sağlamak için% 90 yaşayabilir&gt; olmalıdır. 1 ile 5 arasındaki etiketli kareler hücre sayımları ortalama hücre sayısı tahmini doğruluğunu artırmak için önlemler alınmalıdır. Intrakranial impla için un-desteklenmiş DMEM 3 x 10 4 hücre / ul yeniden süspanse (E) GL26-Cit hücrelerntation. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53676/53676fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/53676/53676fig2.jpg" /> Şekil 2:. C57BL / 6J Fare Striatum (A) Gerekli cerrahi aletler ve reaktifler gösteren Cerrahi süit düzeni içine Glioma Hücreler Stereotaktik Aşı. (B) 0,5 mm AP, düzgün iğne yerleştirilmesi ile bir stereotaktik çerçeve içinde harnessed bir C57BL / 6J fare görünümü kadar kapatın 2,5 mm ML ve bregma -3.0 mm DV göreli. Bregma konumunu ve tümör hücre engraftman için hedef siteyi gösteren fare kafatası (C) dorsal görünümü. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53676/53676fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> Şekil 3:. Fare Transcardial Perfüzyon (A) diseksiyon, toz haline ve fare beyin dokusunda enzimatik sindirimi için gerekli reaktifleri. (B) Terminal fare cerrahi işlemler adanmış bir laminer akış kaputu gösterilen oksijenli ve heparinli Tyrodes çözümü ile transcardial perfüzyon fare için gerekli aletler ve reaktiflerin Düzeni. (C) uygun araç ve transcardial perfüzyon için gerekli yerleşimleri gösteren kalp şematik. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53676/53676fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/53676/53676fig4.jpg" /> Şekil 4: Glioma-infiltre izolasyonuPBMC&#39;leri. Erken evre ortotopik glioma implantları içeren fare beyin dokusu diseksiyon için (A) Strateji. Üst panel uzak kontralateral yarımkürede ipsilateral hemisfer sagital ikiye bölme göstermektedir. Alt panel (mor vurgulanan) tümör implantı içeren hedef doku izole etmek için gerekli iki ek koronal kesim göstermektedir. Enzimatik sindiriminden sonra (B) tek hücre beyin dokusu topak (beyaz ok), bir 70 um naylon örgü ve santrifüj ile filtrasyonu. (C) santrifüjtemeden önce düzgün dökülmüş yoğunluk santrifüj ortam gradyan. Beyaz ok iki yoğunluk santrifüj medya katmanları arasında oluşan temiz bir arayüz gösterir. (D)% 37 yoğunluğu santrifüj medya tabakası beyaz ok üstündeki oluşturan lipid tabakasını) ve PBMC bant gösteren santrifüj sonra Yoğunluk santrifüj medya gradyan (th tarafından özetleneniki tabaka arasındaki arayüzde e kesik siyah çizgiler). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53676/53676fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/53676/53676fig5.jpg" /> Şekil 5: Akış Sitometrik Gating Strateji Belirlemek için kullanılır Glioma-infiltre Gr-1 + / CD11b + Myeloid hücreler ve NK Hücreleri (A) 1. Adım: a. Yoğunluk santrifüj medya degrade PBMC bandı izole Toplam imüno hücreler üzerine kapılı hücresel enkaz dışlamak (FSC-A az K 50 ~ den). 2 Adımlar ve 3: Doublet ayrımcılık yolluk hücresel agrega filtrelemek için. Aşama 4: CD45 kapısı glioma nüfuz eden bağışıklık hücreleri tanımlamak için. Izotop kontrol gri siluet olarak gösterilir. Aşama 5: CD45 + hücreleri, Gr-1 ve CD11b göre, tabakalı. Her iki Gr-1 ve CD için izotip kontrol<html> 11b arsa üzerinde üst üste ve altın daire ile çevrelenmiştir. Kırmızı daire Gr-1 + / CD11b + miyeloid hücreleri gösterir. Adım 5 &#39;: GzmB ifadesine dayalı tabakalı Gr-1 + / CD11b + miyeloid hücreleri. Esas olarak, bu hücreler, bir izotip kontrolü (gri siluet) üzerinden anti-GzmB antikorları ile etiket değildir. Adım 6: Gr-1 Adım 5 siyah dikdörtgen ile özetlenen düşük hücreler NK1.1 ifade dayanarak, tabakalı. Izotop kontrol gri siluet olarak gösterilir. Adım 6 &#39;: NK1.1 yüksek hücreler GzmB ifadesine dayalı tabakalı. Bu hücreler, gerçekten de bir izotip kontrolü (gri siluet) yukarıdaki anti-GzmB antikorları ile etiket. NK hücreleri daha küçük bir lenfoid boyutuna sahip olması SSC-A ortaya çıkarılması genel FSC A üzerine Gr-1 + / CD11b + miyeloid hücrelerin (B) daha büyük boyutlu Backgating Gr-1 + / CD11b + miyeloid hücreler ile karşılaştırıldığında.&quot;_blank&quot;&gt; bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız. <img alt="Şekil 6," src="/files/ftp_upload/53676/53676fig6.jpg" /> Şekil 6: İntrakranial Tümör Büyüme İlk Üç Gün boyunca GL26-Cit-gal1i tümör mikro vs GL26-Cit-NT PBMC İnfiltrasyonunun Karşılaştırılması (A) Toplam CD45 + bağışıklık hücreleri.. (B) CD45 + / Gr-1 + / CD11b + miyeloid hücreleri. (C) CD45 + /NK1.1 + NK hücreleri. GL26-Cit-gal1i gliomlar izole PBMC&#39;lerden Veri noktaları düz çizgilerle bağlandığında, whiles GL26-Cit-NT gliomlar izole edilmiş olanlar olduğu kesik çizgilerle bağlanır. Üç fareden alınmış Glioma-süzücü PBMC her bir zaman noktasında, tümör tipine göre analiz edildi. GL26-Cit-gal1i eğrileri üzerinde her veri noktası ile ilişkili Sayılar GL26-Ci üzerinde belirli PBMC Çeşidi kat-indüksiyon temsilt-NT belirtilen saat sonrası tümör implantasyonu de (HPI). Veriler ortalama (SEM) ± standart hata sayılır bağışıklık hücrelerinin ortalama sayısını temsil. İstatistiksel analiz varyans 2 yönlü analizi ile gerçekleştirilmiştir. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53676/53676fig6large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Flow Cytometric Analysis of Glioma-infiltrating Peripheral Blood Mononuclear Cells at JoVE.com

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Glioma-infiltrating Peripheral Blood Mononuclear Cells

Erken beyin tümörü mikro giren bağışıklık hücrelerinin sayısının ve aktivasyon durumu ile ilgili zamana bağlı nicel verileri verir glioma-infiltre periferik kan mononükleer hücrelerinin izolasyonu ve akım sitometri analizi için bir basit bir yöntem burada sunulmuştur.

İzolasyon ve Glioma-sızmakta periferik kan mononükleer hücrelerinin Akışı Sitometrik Analizi

Our laboratory has recently demonstrated that natural killer (NK) cells are capable of eradicating orthotopically implanted mouse GL26 and rat CNS-1 ...

isolation-flow-cytometric-analysis-glioma-infiltrating-peripheral

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

15.7K Görüntüleme.  University of Michigan.  Erken beyin tümörü mikro giren bağışıklık hücrelerinin sayısının ve aktivasyon durumu ile ilgili zamana bağlı nicel verileri verir glioma-infiltre periferik kan mononükleer hücrelerinin izolasyonu ve akım sitometri analizi için bir basit bir yöntem burada sunulmuştur. 

Video: Isolation and Flow Cytometric Analysis of Glioma-infiltrating Peripheral Blood Mononuclear Cells

Isolation of Mouse Peritoneal Cavity Cells

The peritoneal cavity is a membrane-bound and fluid-filled abdominal cavity of mammals, which contains the liver, spleen, most of the gastro-intestinal tract and other viscera. It harbors a number of immune cells including macrophages, B cells and T cells. The presence of a high number of na&iuml;ve macrophages in the peritoneal cavity makes it a preferred site for the collection of na&iuml;ve tissue resident macrophages (1). The peritoneal cavity is also important to the study of B cells because of the presence of a unique peritoneal cavity-resident B cell subset known as B1 cells in addition to conventional B2 cells. B1 cells are subdivided into B1a and B1b cells, which can be distinguished by the surface expression of CD11b and CD5. B1 cells are an important source of natural IgM providing early protection from a variety of pathogens (2-4). These cells are autoreactive in nature (5), but how they are controlled to prevent autoimmunity is still not understood completely. On the contrary, CD5+ B1a cells possess some regulatory properties by virtue of their IL-10 producing capacity (6). Therefore, peritoneal cavity B1 cells are an interesting cell population to study because of their diverse function and many unaddressed questions associated with their development and regulation. The isolation of peritoneal cavity resident immune cells is tricky because of the lack of a defined structure inside the peritoneal cavity. Our protocol will describe a procedure for obtaining viable immune cells from the peritoneal cavity of mice, which then can be used for phenotypic analysis by flow cytometry and for different biochemical and immunological assays.

The peritoneal cavity in mammals contains different immune cell populations crucial for innate immune responses. An efficient isolation method is required for biochemical and functional analyses of these cells. Here we provide a comprehensive method for the isolation of peritoneal cavity cells in the mouse.

Fare Periton Boşluk Hücreleri İzolasyon

The peritoneal cavity is a membrane-bound and fluid-filled abdominal cavity of mammals, which contains the liver, spleen, most of the gastro-intestinal ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Induction of Alloantigen-specific Anergy in Human Peripheral Blood Mononuclear Cells by Alloantigen Stimulation with Co-stimulatory Signal Blockade

Allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (AHSCT) offers the best chance of cure for many patients with congenital and acquired hematologic diseases. Unfortunately, transplantation of alloreactive donor T cells which recognize and damage healthy patient tissues can result in Graft-versus-Host Disease (GvHD)1. One challenge to successful AHSCT is the prevention of GvHD without associated impairment of the beneficial effects of donor T cells, particularly immune reconstitution and prevention of relapse. GvHD can be prevented by non-specific depletion of donor T cells from stem cell grafts or by administration of pharmacological immunosuppression. Unfortunately these approaches increase infection and disease relapse2-4. An alternative strategy is to selectively deplete alloreactive donor T cells after allostimulation by recipient antigen presenting cells (APC) before transplant. Early clinical trials of these allodepletion strategies improved immune reconstitution after HLA-mismatched HSCT without excess GvHD5, 6. However, some allodepletion techniques require specialized recipient APC production6, 7and some approaches may have off-target effects including depletion of donor pathogen-specific T cells8and CD4 T regulatory cells9.One alternative approach is the inactivation of alloreactive donor T cells via induction of alloantigen-specific hyporesponsiveness. This is achieved by stimulating donor cells with recipient APC while providing blockade of CD28-mediated co-stimulation signals10.This "alloanergization" approach reduces alloreactivity by 1-2 logs while preserving pathogen- and tumor-associated antigen T cell responses in vitro11. The strategy has been successfully employed in 2 completed and 1 ongoing clinical pilot studies in which alloanergized donor T cells were infused during or after HLA-mismatched HSCT resulting in rapid immune reconstitution, few infections and less severe acute and chronic GvHD than historical control recipients of unmanipulated HLA-mismatched transplantation12. Here we describe our current protocol for the generation of peripheral blood mononuclear cells (PBMC) which have been alloanergized to HLA-mismatched unrelated stimulator PBMC. Alloanergization is achieved by allostimulation in the presence of monoclonal antibodies to the ligands B7.1 and B7.1 to block CD28-mediated costimulation. This technique does not require the production of specialized stimulator APC and is simple to perform, requiring only a single and relatively brief ex vivo incubation step. As such, the approach can be easily standardized for clinical use to generate donor T cells with reduced alloreactivity but retaining pathogen-specific immunity for adoptive transfer in the setting of AHSCT to improve immune reconstitution without excessive GvHD.

This paper describes a simple technique to induce alloantigen-specific anergy in human peripheral blood mononuclear cells. The technique can be applied clinically to generate non-alloreactive donor cells. Infusion of these cells could improve immune reconstitution and reduce toxicity after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation.

Co-uyarıcı Sinyal Abluka Alloantigen Uyarım İnsan periferik kan mononükleer hücreleri içinde Alloantigen özel anerji indüksiyonu

Allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (AHSCT) offers the best chance of cure for many patients with congenital and acquired hematologic ...

Flow Cytometric Isolation of Primary Murine Type II Alveolar Epithelial Cells for Functional and Molecular Studies

Throughout the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII) to various aspects of immune regulation in the lung has been increasingly recognized. AECII have been shown to participate in cytokine production in inflamed airways and to even act as antigen-presenting cells in both infection and T-cell mediated autoimmunity 1-8. Therefore, they are especially interesting also in clinical contexts such as airway hyper-reactivity to foreign and self-antigens as well as infections that directly or indirectly target AECII. However, our understanding of the detailed immunologic functions served by alveolar type II epithelial cells in the healthy lung as well as in inflammation remains fragmentary. Many studies regarding AECII function are performed using mouse or human alveolar epithelial cell lines 9-12. Working with cell lines certainly offers a range of benefits, such as the availability of large numbers of cells for extensive analyses. However, we believe the use of primary murine AECII allows a better understanding of the role of this cell type in complex processes like infection or autoimmune inflammation. Primary murine AECII can be isolated directly from animals suffering from such respiratory conditions, meaning they have been subject to all additional extrinsic factors playing a role in the analyzed setting. As an example, viable AECII can be isolated from mice intranasally infected with influenza A virus, which primarily targets these cells for replication 13. Importantly, through ex vivo infection of AECII isolated from healthy mice, studies of the cellular responses mounted upon infection can be further extended.
Our protocol for the isolation of primary murine AECII is based on enzymatic digestion of the mouse lung followed by labeling of the resulting cell suspension with antibodies specific for CD11c, CD11b, F4/80, CD19, CD45 and CD16/CD32. Granular AECII are then identified as the unlabeled and sideward scatter high (SSChigh) cell population and are separated by fluorescence activated cell sorting 3.
In comparison to alternative methods of isolating primary epithelial cells from mouse lungs, our protocol for flow cytometric isolation of AECII by negative selection yields untouched, highly viable and pure AECII in relatively short time. Additionally, and in contrast to conventional methods of isolation by panning and depletion of lymphocytes via binding of antibody-coupled magnetic beads 14, 15, flow cytometric cell-sorting allows discrimination by means of cell size and granularity. Given that instrumentation for flow cytometric cell sorting is available, the described procedure can be applied at relatively low costs. Next to standard antibodies and enzymes for lung disintegration, no additional reagents such as magnetic beads are required. The isolated cells are suitable for a wide range of functional and molecular studies, which include in vitro culture and T-cell stimulation assays as well as transcriptome, proteome or secretome analyses 3, 4.

We describe the rapid isolation of primary murine type II alveolar epithelial cells (AECII) by flow cytometric negative selection. These AECII show high viability and purity and are suitable for a wide range of functional and molecular studies regarding their role in respiratory conditions such as autoimmune or infectious diseases.

Fonksiyonel ve Moleküler Çalışmalar Birincil murin Tip II alveol epitel hücrelerinde akım sitometri İzolasyonu

Throughout  the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII)  to various aspects of immune regulation in the lung has been ...

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging from mild infections to life-threatening bronchiolitis. An important part of the pathogenesis of severe disease is an enhanced immune response leading to immunopathology.	Here, we describe a protocol used to investigate the immune response of human immune cells to an HRSV infection. First, we describe methods used for culturing, purification and quantification of HRSV. Subsequently, we describe a human in vitro model in which peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) are stimulated with live HRSV. This model system can be used to study multiple parameters that may contribute to disease severity, including the innate and adaptive immune response. These responses can be measured at the transcriptional and translational level. Moreover, viral infection of cells can easily be measured using flow cytometry. Taken together, stimulation of PBMC with live HRSV provides a fast and reproducible model system to examine mechanisms involved in HRSV-induced disease.

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial virus (HRSV) can cause severe bronchiolitis in young infants. Part of the pathogenesis of severe HRSV disease is caused by the host immune response. Stimulation of primary human immune cells with HRSV provides a fast and reproducible model system to study activation of inflammatory pathways and infection.

Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

Detecting Glycogen in Peripheral Blood Mononuclear Cells with Periodic Acid Schiff Staining

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. Polysaccharides such as glycogen, glycoproteins, and glycolipids stain bright magenta making it easy to enumerate positive and negative cells within the tissue. In muscle cells PAS staining is used to determine the glycogen content in different types of muscle cells, while in blood cell samples PAS staining has been explored as a diagnostic tool for a variety of conditions. Blood contains a proportion of white blood cells that belong to the immune system. The notion that cells of the immune system possess glycogen and use it as an energy source has not been widely explored. Here, we describe an adapted version of the PAS staining protocol that can be applied on peripheral blood mononuclear immune cells from human venous blood. Small cells with PAS-positive granules and larger cells with diffuse PAS staining were observed. Treatment of samples with amylase abrogates these patterns confirming the specificity of the stain. An alternate technique based on enzymatic digestion confirmed the presence and amount of glycogen in the samples. This protocol is useful for hematologists or immunologists studying polysaccharide content in blood-derived lymphocytes.

Periodic acid Schiff staining is a technique that visualizes the polysaccharide content of tissues. This article demonstrates periodic acid Schiff staining protocol adapted for use on peripheral blood mononuclear cells purified from human venous blood. Such samples are enriched for lymphocytes and other white blood cells of the immune system.

Periyodik Asit Schiff Boyama ile periferik kan mononükleer hücreleri glikojen algılama

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident cells. A key mechanism of this inflammatory response is the migration of circulating immune cells to the ischemic brain facilitated by chemokine release and increased endothelial adhesion molecule expression. Brain-invading leukocytes are well-known contributing to early-stage secondary ischemic injury, but their significance for the termination of inflammation and later brain repair has only recently been noticed.
Here, a simple protocol for the efficient isolation of immune cells from the ischemic mouse brain is provided. After transcardial perfusion, brain hemispheres are dissected and mechanically dissociated. Enzymatic digestion with Liberase&#160;is followed by density gradient (such as Percoll) centrifugation to remove myelin and cell debris. One major advantage of this protocol is the single-layer density gradient procedure which does not require time-consuming preparation of gradients and can be reliably performed. The approach yields highly reproducible cell counts per brain hemisphere and allows for measuring several flow cytometry panels in one biological replicate. Phenotypic characterization and quantification of brain-invading leukocytes after experimental stroke may contribute to a better understanding of their multifaceted roles in ischemic injury and repair.

Inflammation plays a central role in the pathogenesis of ischemic stroke. Increasing evidence suggests that it acts as a double-edged sword which exacerbates early brain injury, but also contributes to later repair. This protocol describes the isolation of immune cells from the ischemic brain and their subsequent flow cytometric phenotyping.

İskemik Fare Beyin gelen Bağışıklık Hücreleri İzolasyon ve Akım Sitometrisi Analizi

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...

Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes

The intestines &#8212; which contain the largest number of immune cells of any organ in the body &#8212; are constantly exposed to foreign antigens, both microbial and dietary. Given an increasing understanding that these luminal antigens help shape the immune response and that education of immune cells within the intestine is critical for a number of systemic diseases, there has been increased interest in characterizing the intestinal immune system. However, many published protocols are arduous and time-consuming. We present here a simplified protocol for the isolation of lymphocytes from the small-intestinal lamina propria, intraepithelial layer, and Peyer&#39;s patches that is rapid, reproducible, and does not require laborious Percoll gradients. Although the protocol focuses on the small intestine, it is also suitable for analysis of the colon. Moreover, we highlight some aspects that may need additional optimization depending on the specific scientific question. This approach results in the isolation of large numbers of viable lymphocytes that can subsequently be used for flow cytometric analysis or alternate means of characterization.

There is growing interest in the quantitative characterization of intestinal lymphocytes owing to increasing recognition that these cells play a critical role in a variety of intestinal and systemic diseases. In this protocol, we describe how to isolate single cell populations from different small-intestinal compartments for subsequent flow cytometric characterization.

Fare Küçük Bağırsak Lenfositler izolasyonu ve Akım Sitometrisi Karakterizasyonu

The intestines &#8212; which contain the largest number of immune cells of any organ in the body &#8212; are constantly exposed to foreign antigens, both ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and reproducibility of this assay can be considered unstable, either because of user&#39;s errors or because of the sensitivity of NK cells to experimental manipulation. To eliminate these issues, a workflow that reduces them to a minimum was established and is presented here. To illustrate, we obtained blood samples, at various time points, from runners (n = 4) that were submitted to an intense bout of exercise. First, NK cells are simultaneously identified and isolated through CD56 tagging and magnetic-based sorting, directly from whole blood and from as little as one milliliter. The sorted NK cells are removed of any reagent or capping antibodies. They can be counted in order to establish an accurate NK cell count per milliliter of blood. Secondly, the sorted NK cells (effectors cells or E) can be mixed with 3,3&#39;-Diotadecyloxacarbocyanine Perchlorate (DiO) tagged K562 cells (target cells or T) at an assay-optimal 1:5 T:E ratio, and analyzed using an imaging flow-cytometer that allows for the visualization of each event and the elimination of any false positive or false negatives (such as doublets or effector cells). This workflow can be completed in about 4 h, and allows for very stable results even when working with human samples. When available, research teams can test several experimental interventions in human subjects, and compare measurements across several time points without compromising the data&#39;s integrity.

This work describes an advanced workflow for the accurate and fast determination of NK (Natural Killer) cell count and NK cell cytotoxicity in human blood samples.

İnsan Tüm Kan Natural Killer Hücre Parçalayıcı Faaliyet Akışı Sitometrik Analizi

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Human Endocervical Gamma Delta T Cells

The female reproductive tract (FRT) mucosal immune system serves as the first line of defense. Better knowledge of the genital mucosa is therefore essential for understanding pathogenicity of different pathogens including HIV. Gamma delta (GD) T cells are the prototype of &#39;unconventional&#39; T cells and represent a relatively small subset of T cells defined by their expression of heterodimeric T-cell receptors (TCRs) composed of gamma and delta chains. This sets them apart from the classical and much better known CD4+ helper T cells and CD8+ cytotoxic T cells that are defined by alpha-beta TCRs. GD T cells often show tissue-specific localization and are enriched in epithelium. GD T cells orchestrate immune responses in inflammation, tumor surveillance, infectious disease, and autoimmunity.
Here, we present a method to reproducibly isolate and analyze human endocervical intraepithelial GD T lymphocytes. We have used endocervical cytobrush samples from women participating in the Women&#39;s Interagency HIV Infection Study (WIHS). Knowledge about GD T cells interactions during conditions in which there is an insult to the vaginal mucosal could be applied to any clinical study in which mucosal vulnerability is addressed, including the development of vaginal microbicides.In addition, knowledge about mucosal GD T cell responses has potential for application of GD T cell-based immune therapy in treating infectious diseases.

We describe here an isolation method to obtain human endocervical intraepithelial lymphocytes for the analysis of intraepithelial gamma delta T cells. This protocol can be extended for the purification of endocervical gamma delta T cells by magnetic beads or by cell sorting.

İnsan Endoservikal Gamma Delta T Hücreleri İzolasyon ve Akım Sitometrisi Analizi

The female reproductive tract (FRT) mucosal immune system serves as the first line of defense. Better knowledge of the genital mucosa is therefore ...

Digestion of the Murine Liver for a Flow Cytometric Analysis of Lymphatic Endothelial Cells

Within the liver, lymphatic vessels are found within the portal triad, and their described function is to remove interstitial fluid from the liver to the lymph nodes where cellular debris and antigens can be surveyed. We are very interested in understanding how the lymphatic vasculature might be involved in inflammation and immune cell function within the liver. However, very little has been published establishing digestion protocols for the isolation of lymphatic endothelial cells (LECs) from the liver or specific markers that can be used to evaluate liver LECs on a per cell basis. Therefore, we optimized a method for the digestion and staining of the liver in order to evaluate the LEC population in the liver. We are confident that the method outlined here will be useful for the identification and isolation of LECs from the liver and will strengthen our understanding of how LECs respond to the liver microenvironment.

The goal of this protocol is to identify lymphatic endothelial cell populations within the liver using described markers. We utilize collagenase IV and DNase and a gentle mincing of tissue, combined with flow cytometry, to identify a distinct population of lymphatic endothelial cells.

Lenfatik endotel hücreleri akış sitometrik çözümlenmesi için fare karaciğer sindirim

Within the liver, lymphatic vessels are found within the portal triad, and their described function is to remove interstitial fluid from the liver to the ...