The authors would like to thank Katrin Bossmann, Anett Neumann and Eike Wolter (German Environment Agency) for their valuable preparatory work.

הערה: פרוטוקול זה מתאר את המכתים העקיף של חלקיקי PM10 עם נוגדנים חד שבטיים (נוגדן IgG1 עכבר חד שבטי, שיבוט MA-3B4) נגד בית V 1, רכיב אנטיגן האבקה הלבנה הגדול, בתוספת Allophycocyanin (APC) -labeled נוגדנים משני (אנטי נוגדן IgG1 -Mouse, שיבוט A85-1) ואת לניתוח שלאחר מכן על cytometer זרימה. עם נוגדנים אחרים מתאימים זמין, ששיטה זו עשויה להתארך עד זיהוי של אנטיגנים אחרים מאוגדים חלקיקים באוויר סביבה. 1. PM10 דגימה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף PM10 מאוויר סביבה על polytetrafluoroethylene (PTFE) מסננים באמצעות סמפלר בנפח נמוכה עם קצב זרימה של 2.3 מ &#39;3 / hr (איור 1). אפיון של סמפלר המשמש בניסויים שתוארו כאן נמצא 16. משך הקרנה תלויה בכמות של PM10 צורך (בדרך כלל בין 1 ל -10 ימים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסוף זמן הדגירה, להסיר את המסנן מן סמפלר ולהקפיא אותו-20 ° C עד השימוש. </li></ol><img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/54721/54721fig1.jpg" /> איור 1. סמפלר PM10 נפח נמוך. דוגמה של סמפלר PM10 בנפח נמוך. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54721/54721fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> הסרת 2. PM10 ו רוזן חלקיקים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בוא ההפשרה המסננת PTFE כ -5 דקות. לאחר מכן, לשים את המסנן בצלחת נקייה polystyrol פטרי (איור 2 א). קח מנה חדשה פטרי עבור כל מסנן, אם יותר מסנן אחד מעובד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בהמשך לכך, כיסוי מסנן PTFE עם פוספט שנאגר מלוח (PBS). פרוטוקול זה הוא הוקם עבור ריכוז PM10 סופי של 8x10 6 חלקיקים לכל מיליליטר (ראה שלב 3.3). כדי להשיג לפחות ריכוז, השתמש הנפח האמפירי הבא של PBS כדי כיסוי מסנן עם: אם זמן איסוף PM10 היה &lt;<html> 2 ימים, להשתמש 2 מ&quot;ל. לקבלת פעמים הדגירה ≥2 ימים, השתמש 4 מ&quot;ל. הערה: על מנת להגדיל את ריכוז החלקיקים של ההשעיה PM10, השעיות מן מסננים שונים ניתן לאחד קבוצות, אם זה מתאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החזק את מסנן PTFE עם פינצטה מברשת עם מברשת שיניים חשמלית עם ראש מברשת רגיש דקות 1 (2B הדמוי, 2C). מעביר את השעית חלקיקים-PBS, כינה להלן השעית PM10, לצינור תגובה נקי. </li></ol><img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/54721/54721fig2.jpg" /> הסרת איור 2. PM10 עם מברשת שיניים חשמלית. מסנן polytetrafluoroethylene עם PM10 שנדגמו מושם בצלחת פטרי polystyrol (א) ו נשכבות עם 4 מ&quot;ל PBS. לאחר מכן, PM10 יוסר עם מברשת שיניים חשמלית (B: לפני צחצוח ו- C: לאחר צחצוח דקות 1).= &quot;Http://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54721/54721fig2large.jpg&quot; target = &quot;_ blank&quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <ol start="4" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדוד את הריכוז של חלקיקי PM10, למשל, על ידי שימוש מונה חלקיקים. לדלל נפח נאות השעית PM10 כגון 50 μl ב 10 מיליליטר חיץ מדידת איזוטוני, למדוד שלוש פעמים ולחשב את המספר כולל ממוצע של חלקיקים לכל מיליליטר. הקפד להשתמש מונה חלקיקים אשר יכול לזהות חלקיקים בגודל הרלוונטי. </li></ol> 3. בית V 1 מכתים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את מספר צינורות תגובה הנדרש לניתוח של המדגם: לפחות שלושה צינורות תגובה נדרשים: (i) צינור אחד עם מדגם בלבד (שליטה מקורית) (ii) צינור אחד עם מדגם בתוספת נוגדנים משני (שליטה שלילית), ו ( iii) צינור אחד עם מדגם בתוספת נוגדנים ראשוניים ומשניים (מדגם מסוים). אם נמדד לראשונה, להכין לפחות שני צינורות תגובה (i) (ii),וכן (iii) יש מספיק חומר כדי להתאים cytometer הגדרות כראוי (ראה שלב 4.1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את כמות ההשעיה PM10 נדרש עבור מספר צינורות התגובה. כל צינור תגובה דורש 50 μl של השעיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את ריכוז החלקיקים הנמדדים בשלב 2.4 עבור הנפח של השעיה מחושבת בשלב 3.2 לריכוז סופי של 8x10 6 חלקיקים לכל מיליליטר ידי הוספת כמות מתאימה של PBS. הערה: השעיית PM10 הנותרים ניתן קפוא ב -20 מעלות צלזיוס במשך בניסויים עתידיים, אם כי עבור פרוטוקול זה מוכן טרי השעית PM10 מומלצת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בלוק מחייב נוקבים ידי להשלים את ההשעיה PM10 עם אלבומין בסרום שור (BSA) בריכוז סופי של 0.02%, באמצעות פתרון המניה כגון 1% BSA מוכן עם PBS. וורטקס בקצרה דגירה במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור כל דגימה להיות מנותחת על ידי cytometry זרימה, להעביר 50 μl של ההשעיה משלב 3.4 ל ACצינור תגובה רזה. הוספת נוגדן מונוקלונאלי כנגד העכבר נ בית 1 בריכוז סופי של 0.02 מיקרוגרם / μl אל צינורות התגובה המיועד מכתים ספציפיים, בקצרה מערבולת דגירה במשך 60 דקות בטמפרטורת החדר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תנו צינורות תגובה עם ההשעיה PM10-BSA המיועדים לשליטה יליד הביקורת השלילית גם להישאר במשך 60 דקות בטמפרטורת החדר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את כל דגימות על ידי הוספת 500 μl PBS בתוספת BSA 0.02% צינור כל תגובה, בקצרה מערבולת ו צנטריפוגות ובהמשך דגימות ב 4,700 XG במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. בטל supernatant בזהירות באמצעות משאבת ואקום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלב 3.6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע את הסכום הכולל של נוגדן IgG1 אנטי עכבר משני שכותרתו APC הדרוש: 1 מיקרוגרם נוגדן מומס 50 μl PBS בתוספת BSA 0.02% לכל צינור התגובה. לדלל את הכמות המתאימה של נוגדן עם נפח בהתאמה של PBS בתוספת 0.02% BSA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 μl של נוגדנים משני מדוללים לכל צינורות התגובה למעט צינור התגובה המיועדים לשליטת הילידים. מוסף האחרון עם 50 μl PBS בתוספת 0.02% BSA. וורטקס כל הדגימות למשך מספר שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה כל הדגימות במשך 30 דקות בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלב 3.6 פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 μl PBS לתגובה כל צינור, מערבולת ולנתח דגימות על cytometer זרימה. </li></ol> ניתוח 4. תזרים Cytometric <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בשלט הילידים, לשנות את ההגדרות הבאות cytometer פרמטרים כדי לייעל ניתוח נתונים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות פיזור קדימה (FSC) בקר סף מוצג על לוח הבקרה של התקן, לקבוע את סף FSC לפי השווי הנמוך ביותר (200) ולהתחיל את הניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות בקר מתח פיזור, להתאים את FSC ולפזר צידה (SSC) ככה שכל חלקיקי PM10 ניתן לאתר שהאוכלוסייה של חלקיקים ממוקמות בערך הבאמצע הדואר של ציר FSC ובמחצית התחתון של ציר SSC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות בקר מתח הקרינה, להתאים את מתח APC ועוד מתח הקרינה כמו isothiocyanate והעמסת (FITC), אשר אינו פולט בבית באותו אורך גל כמו APC, במידת הצורך. ודא, שכל החלקיקים גלויים במחצית התחתונה של שני צירי הקרינה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברצף, לבחון כל דגימה כוללת בקרת היליד ולאחסן את FSC, SSC, APC, ונתוני FITC של לפחות 10,000 חלקיקים לדגימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעריך את הנתונים עם התוכנה המתאימה. תוכן האלרגן adsorbed במדגם הספציפי ניתן לכמת בשתי דרכים: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את עוצמת הקרינה APC של כל החלקיקים (ערך חציוני) כמדד עומס בית V 1 על כל חלקיקי PM10. הערה: אם המדגם המסוים כלול האלרגן, עוצמת קרינת APC צריכה להגדיל את המדגם המסוים לעומת השליטה השלילית. לעומת זאת, פלואוריד אחרעוצמות escence (למשל., FITC עוצמת הקרינה) לא צריך לשנות באופן משמעותי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב אחוזי חלקיקי PM10 עם נוגדן 1 נ אנטי-Bet כבול. ובכך, בבקרה השלילית, להגדיר שער סביב החלקיקים נחשבים APC חיובית, העתק ודבק השער הזה לתוך המדגם המסוים ולחסר אחוז החלקיקים החיוביים APC בבקרה השלילית אחוז החלקיקים החיוביים אפ&quot;ק המדגם המסוים. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Cakmak, S., Dales, R. E., Coates, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Does+air+pollution+increase+the+effect+of+aeroallergens+on+hospitalization+for+asthma?.">Does air pollution increase the effect of aeroallergens on hospitalization for asthma?.</a> J Allergy Clin Immunol. 129 (1), 228-231 (2012).</li><li>Barraza-Villarreal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Air+pollution,+airway+inflammation,+and+lung+function+in+a+cohort+study+of+Mexico+City+schoolchildren.">Air pollution, airway inflammation, and lung function in a cohort study of Mexico City schoolchildren.</a> Environ Health Perspect. 116 (6), 832-838 (2008).</li><li>Chen, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+association+of+ambient+air+pollution+with+airway+inflammation+in+schoolchildren.">The association of ambient air pollution with airway inflammation in schoolchildren.</a> Am J Epidemiol. 175 (8), 764-774 (2012).</li><li>Cyprowski, M., Buczynska, A., Szadkowska-Stanczyk, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Indoor+allergens+in+settled+dust+from+kindergartens+in+city+of+Lodz,+Poland.">Indoor allergens in settled dust from kindergartens in city of Lodz, Poland.</a> Int J Occup Med Environ Health. 26 (6), 890-899 (2013).</li><li>Brough, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+peanut+protein+in+the+home+environment.">Distribution of peanut protein in the home environment.</a> J Allergy Clin Immunol. 132 (3), 623-629 (2013).</li><li>Galli, S. J., Tsai, M., Piliponsky, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+allergic+inflammation.">The development of allergic inflammation.</a> Nature. 454 (7203), 445-454 (2008).</li><li> World Health Organisation, R. O. f. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenology+and+human+health:+allergic+disorders:+report+on+WHO+meeting+Rome,+Italy.">Phenology and human health: allergic disorders: report on WHO meeting Rome, Italy.</a> , 256 (2003).</li><li>Wuthrich, B., Schindler, C., Leuenberger, P., Ackermann-Liebrich, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+of+atopy+and+pollinosis+in+the+adult+population+of+Switzerland+(SAPALDIA+study).+Swiss+Study+on+Air+Pollution+and+Lung+Diseases+in+Adults.">Prevalence of atopy and pollinosis in the adult population of Switzerland (SAPALDIA study). Swiss Study on Air Pollution and Lung Diseases in Adults.</a> Int Arch Allergy Immunol. 106 (2), 149-156 (1995).</li><li>Grote, M., Valenta, R., Reichelt, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abortive+pollen+germination:+a+mechanism+of+allergen+release+in+birch,+alder,+and+hazel+revealed+by+immunogold+electron+microscopy.">Abortive pollen germination: a mechanism of allergen release in birch, alder, and hazel revealed by immunogold electron microscopy.</a> J Allergy Clin Immunol. 111 (5), 1017-1023 (2003).</li><li>Namork, E., Johansen, B. V., Lovik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+allergens+adsorbed+to+ambient+air+particles+collected+in+four+European+cities.">Detection of allergens adsorbed to ambient air particles collected in four European cities.</a> Toxicol Lett. 165 (1), 71-78 (2006).</li><li>S&#252;ring, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PM10+contains+particle-bound+allergens:+Dust+analysis+by+Flow+Cytometry.">PM10 contains particle-bound allergens: Dust analysis by Flow Cytometry.</a> Env Technol Inn. 5, 60-66 (2016).</li><li>Schappi, G. F., Suphioglu, C., Taylor, P. E., Knox, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concentrations+of+the+major+birch+tree+allergen+Bet+v+1+in+pollen+and+respirable+fine+particles+in+the+atmosphere.">Concentrations of the major birch tree allergen Bet v 1 in pollen and respirable fine particles in the atmosphere.</a> J Allergy Clin Immunol. 100 (5), 656-661 (1997).</li><li>Buters, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+allergen+Bet+v+1+in+fractions+of+ambient+air+deviates+from+birch+pollen+counts.">The allergen Bet v 1 in fractions of ambient air deviates from birch pollen counts.</a> Allergy. 65 (7), 850-858 (2010).</li><li>Buters, J. T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Release+of+Bet+v+1+from+birch+pollen+from+5+European+countries.+Results+from+the+HIALINE+study.">Release of Bet v 1 from birch pollen from 5 European countries. Results from the HIALINE study.</a> Atmos Environ. 55, 496-505 (2012).</li><li>Ormstad, H., Johansen, B. V., Gaarder, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Airborne+house+dust+particles+and+diesel+exhaust+particles+as+allergen+carriers.">Airborne house dust particles and diesel exhaust particles as allergen carriers.</a> Clin Exp Allergy. 28 (6), 702-708 (1998).</li><li>Brough, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peanut+protein+in+household+dust+is+related+to+household+peanut+consumption+and+is+biologically+active.">Peanut protein in household dust is related to household peanut consumption and is biologically active.</a> J Allergy Clin Immunol. 132 (3), 630-638 (2013).</li><li>Jochner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seasonal+variation+of+birch+and+grass+pollen+loads+and+allergen+release+at+two+sites+in+the+German+Alps.">Seasonal variation of birch and grass pollen loads and allergen release at two sites in the German Alps.</a> Atmos Env. , (2015).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

שלב קריטי של הפרוטוקול הוא השימוש של מסנן מתאים לאיסוף חלקיקי PM10 מאוויר הסביבה (ראה שלב 1.1). המסנן צריך להיות חזק מספיק כדי לשאת את הצחצוח עם מברשת שיניים חשמלית, ולא כל חומרי הסינון למלא דרישה זו. הפרוטוקול המכתים הוקם עם ריכוז חלקיקי PM10 של 8x10 6 חלקיקים לכל מיליליטר. עם זאת, אם החומר הוא מוגבל ואיגום של דגימות אינו מתאים, השיטה כנראה תתפקד כמו גם, אבל ריכוזי הנוגדנים (רואים צעדים 3.5 ו -3.8) אולי צריך להיות מותאמים. מכתים בית V 1 של חלקיקי PM10 לא לגרום אוכלוסיות נפרדות של חלקיקים מוכתמים לחיוב ולשלילה. זה עלול להיגרם על ידי כמויות משתנות של האלרגן בית V 1 שנספחו כל החלקיקים הנעים בין מעט מאוד עד לסכום גבוה. דבר זה עלול לגרום להרחבת האות APC ובכך להסיט את האוכלוסייה כלפיחיוביות APC. כמו שקשה להפריד את החיובי מן החלקיקים השליליים, שתי שיטות כימות שמשו כדי לקבוע את ההבדלים בתוכן בית V 1 של דגימות PM10&gt; 0.5: (i) כימות יחסית על ידי מדידת עוצמת קרינת APC החציוני של כל החלקיקים , וכן (ii) קביעת אחוז חלקיקים חיוביים APC. לגבי העמסת בית V 1 של חלקיקים מן PM10 עונת אבקה נמוכה וגבוהה&gt; 0.5, שתי השיטות חשפו תוצאות דומות. ובכל זאת, כימות יחסית על ידי עוצמת קרינה החציונית של כל החלקיקים מומלצות כפי שהוא אינו תלוי צבת השער ולכן כנראה פחות מועדות לטעויות. עד כה מחקרים רבים לבדוק את תוכן האלרגן של חומר חלקיקי באוויר הסביבה על ידי לחילוץ האלרגן בהתאמה וכימות הבאים עם ELISA 5,12-14,17. יש הבדל מהותי בין ההליך המתואר כאן ואת quantification עם ELISA: ELISA מכמת את אנטיגן החילוץ המומס, cytometry הזרימה מנתח את אנטיגן מאוגד-החלקיק. באמצעות ELISA העומס בית V 1 של דגימות PM10 נבדק (n = 8) היה מתחת לגבול הגילוי של 1.2 ng / ml (מידע לא מוצג). באופן דומה, Buters ואחרים לא זיהו נ בית 1 PM &lt;2.5 מיקרומטר שבריר ורק כ -7% ב -10 מיקרומטר&gt; PM&gt; 2.5 מיקרומטר שבר, אבל יותר מ -93% ב PM&gt; 10 מיקרומטר שבריר באוויר הסביבה 13. התוצאות המנוגדות של ELISA מחד ועל הניתוח FACS מצד השני, עלולות להיגרם על ידי הבדלי שיטת זיהוי בשיתוף עם רגישות מסתעפת. מחקר נוסף עם זאת יש צורך באופן מלא להבין את ההבדל הזה. שיטה לדמיין אנטיגן חלקיקים נכנסים הוא מיקרוסקופיית אלקטרונים 10,14. על ידי סריקה מיקרוסקופית אלקטרונים, Ormstad et al. בית דמיינו V 1 על פני השטח של מט חלקיקי מרחףחלקיקי פיח r שנדגמו עונת האבקה הגבוהה ובמידה פחותה על חלקיקים שנדגמו עונת האבקה הנמוכה 15. בנוסף, אלרגנים מאבקני, לטקס וגם β-glucans נמצאו שנספחו חלקיקים בעירה באוויר הסביבה 10. שיטה זו, לעומת זאת, אינה מאפשרת כימות של האלרגן כבול-החלקיק. על ידי שימוש cytometry הזרימה, v בית נכנס חלקיקי האלרגן 1 יכול להיות לכימות. לפיכך, cytometry זרימה עשויה להציע דרך חדשה לאפיין 10 עד 0.5 מיקרומטר החלק הביולוגי של PM10 כמו עם נוגדנים מתאימים אחרים על יד, ששיטה זו עשויה להתארך עד זיהוי של אנטיגנים אחרים על חלקיקים באוויר סביבה, למשל, עובש, קרדית האבק אלרגנים או LPS. כחלקיקים PM10 לספוג לא חומר ביולוגי בלבד, אלא גם כימיקלים ומתכות די בקלות, מחייב נוקבים של נוגדנים יכול, לעומת זאת, מהווה בעיה. אם נוגדן חדש נבחן, צעד קריטי הוא להוכיח לאגד ספציפיing. ניתן לעשות זאת על ידי, למשל, חוסמת את קיבולת המחייב של הנוגדן הספציפי עם האנטיגן המקביל לפני מכתים 11. כמו בית V 1 תוכן של אוויר הסביבה יכול להיות שונה ספירת אבקה לבנה 12,13,18, תופעות אלרגיות שאולי לתאם טוב יותר עם רמת האלרגנים מאשר עם אבקה לספור 14,18. לפיכך, השיטה המוצגת בשיתוף עם נתונים קליניים מאפשרת לבחון בניסויים עתידיים אם תגובות אלרגיות ליבנה מתאימות עומס האלרגן בית V 1 של PM10&gt; 0.5.

זיהום אוויר נשקל בתור גורם סביבתי חשוב של השכיחות המוגברת וחומרת האלרגיות של דרך נשימה נצפו בעשורים האחרונים 1-3. כמו כן, חל העניין הגובר בחלוקת אלרגנים נפוצים 4,5 אבק. אבקה ליבנה יכול לעורר קדחת השחת אבל גם יכול להוות טריגר חשוב של אסטמה אלרגית 6-8. אבקה לבנה כולה אינו צפוי להיכנס בדרכי הנשימה התחתונות או להימצא PM10 כתוצאה גודלו (22 מיקרומטר קוטר). עם זאת, אלרגנים אבקה לבנה כמו בית V 1, המרכיב העיקרי ליבנה אבקה האלרגן, יכול להשתחרר אחרי אבקה קרע 9 והוא יכול להיקשר חלקיקים באוויר הסביבה 10, ובכך אולי להיכנס דרכי הנשימה הנשימה התחתונות. ואכן, הוכח כי PM10 עשוי להכיל אלרגנים פעילים ביולוגית כפי שהוכח על ידי במבחנה ההפעלה של basophiles מתוך proband אבקה אלרגיות 11 </sup&gt;. בית V 1 תוכן האלרגן בדגימות PM10 נחקרה על ידי לחילוץ האלרגן בהתאמה וכימות הבאים עם ELISA 12-14. בעזרת טכניקת ELISA, האלרגן המומס נמדד, אבל כמות חלקיקים טעון האלרגן עדיין לא הייתה ידועה. במיקרוסקופ אלקטרונים סורק גילה חלקיקים טעונים האלרגן, אך לא איפשרו כימות 10,15. מחקר זה מעסיק cytometry זרימה לכמת את שיעור v בית 1 טעון חלקיקי PM10 בדגימות אוויר סביבה. בשל גבול הגילוי של cytometer את הזרימה רק חלקיקים גדולים יותר מ -0.5 מיקרומטר יכול להיבחן. &gt; 0.5 מיקרומטר שבריר PM10 יכונה בהמשך כמו PM10&gt; 0.5.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="645">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Teflon filter</td>
			<td style="width:143px;">Pall Life Sciences, USA</td>
			<td style="width:119px;">R2PL047</td>
			<td style="width:167px;">47 mm, 1.0 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">low volume sampler&#160;</td>
			<td>Sven Leckel Ingenieur B&#252;ro GmbH, Germany</td>
			<td style="width:119px;">LVS3</td>
			<td>air flow of 2.3 m3/h</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Phosphate-buffered saline</td>
			<td style="width:143px;">Biochrom, Germany</td>
			<td style="width:119px;">L1825</td>
			<td>without Ca/Mg, low endotoxin</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">electrical toothbrush&#160;</td>
			<td style="width:143px;">Braun, Germany</td>
			<td style="width:119px;">Oral-B Vitality Sensitive</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Casy cell counter&#160;</td>
			<td style="width:143px;">Sch&#228;rfe System GmbH, Germany</td>
			<td style="width:119px;">Model TTC</td>
			<td>range of detectable particle size: 0.7 &#181;m to 45 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">FACSCanto II&#160;</td>
			<td style="width:143px;">Becton Dickinson, USA</td>
			<td style="width:119px;">3-laser, 8-color (4-2-2)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">FACS Diva Software v6.1.3&#160;</td>
			<td style="width:143px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">bovine serum albumin (BSA)&#160;</td>
			<td style="width:143px;">Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td style="width:119px;">A2153-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">monoclonal mouse IgG1 antibody against Bet v 1</td>
			<td style="width:143px;">Indoor Biotechnologies, UK</td>
			<td style="width:119px;">&#160;MA-3B4</td>
			<td style="width:167px;">clone MA-3B4</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">APC (Allophycocyanin)-labeled secondary anti-Mouse IgG1 antibody&#160;</td>
			<td style="width:143px;">Becton Dickinson</td>
			<td align="right" style="width:119px;">560089</td>
			<td>clone A85-1</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">SPSSTM software version 18&#160;</td>
			<td style="width:143px;">PASW Statistics 18, Hongkong, China</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Petri Dish</td>
			<td style="width:143px;">Gosselin, France</td>
			<td style="width:119px;">BP50-02</td>
			<td>D 55mm, H 15mm&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">FACS Tube&#160;</td>
			<td style="width:143px;">Becton Dickinson, USA</td>
			<td style="width:119px;">REF 352054</td>
			<td>5ml Polystyrene</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">CASYton</td>
			<td style="width:143px;">Roche 
			Germany</td>
			<td style="width:119px;">REF 05651808001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Matrix Blank Tubes</td>
			<td style="width:143px;">Thermo Scientific, USA</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4140</td>
			<td>1,4 ml, PP</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:143px;">Heraeus, Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">Megafuge 40R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Vacuum Pump</td>
			<td style="width:143px;">INTEGRA Biosciences AG, Switzerland</td>
			<td style="width:119px;">Model 158 320</td>
			<td>Inetrgra Vacusafe</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">recombinant Bet v 1a antigen&#160;</td>
			<td style="width:143px;">Indoor Biotechnologies, UK</td>
			<td style="width:119px;">LTR-BV1A-1</td>
			<td>Concentration:&#160; 2.0 mg/ml</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flow cytometric analysis of particle-bound bet v 1 allergen in pm10

Cytometry זרימה היא שיטה נפוצה לכמת מוצקים מרחפים כגון תאים או חיידקים במגוון בגודל מ 0.5 עד כמה עשרות מיקרומטר קוטר. בנוסף אפיון של מאפייני פיזור קדימה ולצדדים, היא מאפשרת את שימוש סמנים שכותרתו ניאון כמו נוגדנים לגילוי מבני בהתאמה. באמצעות מכתים נוגדן עקיף, cytometry זרימה מועסק כאן לכמת האלרגן אבקה לבנה (בית בדיוק v 1) -loaded חלקיקים של 0.5 עד 10 מיקרומטר בקוטר של חומר חלקיקי inhalable (PM10, החלקיקים בגודל ≤10 מיקרומטר קוטר). חלקיקי PM10 יכול לשמש נשאים של אלרגנים adsorbed ואולי והובלתם אל דרכי הנשימה התחתונות, שבו יכלו לגרום לאלרגיה. עד כה התוכן האלרגן של PM10 נחקרה באמצעות מבחני immunosorbent מקושר אנזים (ELISAs) במיקרוסקופ אלקטרונים סורק. ELISA מודד את מומס ולא החלקיקהאלרגן -bound. לעומת במיקרוסקופ אלקטרונים סורק, אשר יכול לדמיין חלקיקים טעונים האלרגן, cytometry זרימה ייתכן גם לכמת אותם. כתוכן האלרגן של אוויר הסביבה יכול לסטות ספירת אבקה לבנה, תופעות אלרגיות שאולי לתאם טוב יותר עם החשיפה לאלרגן מאשר עם ספירת אבקה. בשילוב עם נתונים קליניים, השיטה המוצגת מציעה את ההזדמנות כדי לבדוק בניסויים עתידיים אם תגובות אלרגיות ליבנת אנטיגנים אבקה המתקשרות לתוכן האלרגן בית V 1 של חלקיקי PM10&gt; 0.5 מיקרומטר.

בית V 1 ספיחת האלרגן כדי PM10&gt; 0.5 חלקיקים הייתה לכמת ידי מכתים נוגדן עקיף לניתוח שלאחר מכן על cytometer זרימה. מדגם PM10 מהעונה אבקה גבוהה שימש כתבנית. כאמור בשלב 3.1, הביקורת השלילית מורכבת מחלקיקי PM10 מודגרות עם APC שכותרתו נוגדנים משני בלבד (איור 3 א). חלקיקי PM10 מוכתם נוגדן אנטי-Bet V 1 בתוספת נוגדנים משני מוצגים חלקיקים טעונים האלרגן (איור 3 ב). כפי שתואר בשלב 4.3, שתי דרכים לכימות העומס האלרגן שמשו: מצד אחד, הערך החציוני של עוצמת קרינת APC של כל החלקיקים נותח להיות 137 על הבקרה השלילית 904 עבור המדגם המסוים. מצד שני, אחוז חלקיקים עם נוגדן 1 נ אנטי-Bet כבול נקבע: שער נקבע סביב חלקיקים חיוביים APC בבקרה שלילית ובהמשך שיתוףמהמלין ולהדביק לתוך המדגם המסוים. בבקרה השלילית, 3% של חלקיקי PM10&gt; 0.5 נחשבו APC חיובית. אחוז זה של חלקיקי חיובי כוזבים נוכה אחוז החלקיקים החיוביים מדגם המסוים ובכך וכתוצאה מכך PM10 החיובי 77.5% APC&gt; 0.5 חלקיקי המדגם המסוים. כדי להוכיח כי נצפו המחייב של נוגדן V 1-Bet אנטי היה ספציפי, קיבולת מחייב נסתם האנטיגן המקביל לפני מכתים. זה פחתה המחייב של נוגדן anti-Bet נ 1 ב -69%, אם לכמת ידי עוצמת הקרינה APC, ועל ידי 84%, אם לכמת לפי אחוז PM10 חיובי בית V 1&gt; 0.5 חלקיקים (איור 3 ג). <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/54721/54721fig3.jpg" /> איור 3. נכנס חלקיקים בית V 1 האלרגן יכול להיות דמיין ידי cytometry זרימה. עוצמת קרינת APC מדגם PM10 מאת Po הגבוההעונת llen מוכתמת רק עם APC שכותרתו נוגדנים משני (א), מוכתמים נ אנטי-Bet 1 הנוגדן ראשוני ולאחר מכן עם APC שכותרתו נוגדנים משני (ב &#39;), לאחר חסימת הנוגדן הראשוני עם אנטיגן 1 v בית רקומביננטי (C ). הנגמ&quot;ש P השער + נקבע סביב החלקיקים הנחשבים חיובי APC (המוצג באדום) ובאחוזים בהתאמה מקבלים. דמות זו שונתה מעט מ -11. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54721/54721fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> כדי לבדוק אם שיטה זו יכולה להיות מאומצת לחשוף הבדלים בכמות התוכן 1 v בית adsorbed של PM10&gt; 0.5 דגימות גבוהות מעונת אבקה נמוכה, 13 דגימות PM10 מגבוהים ו -6 דגימות PM10 מעונת אבקה נמוכה נותחו. איור 4מתאר הבדלים משמעותיים עוצמת קרינת APC ו בשיעור של בית V 1 PM10 החיובי&gt; 0.5 חלקיקים של דגימות PM10 מעונת אבקה גבוהה לעומת דגימות PM10 מעונת אבקה נמוכה. שיטות כימות שני בזאת הראו תוצאות דומות. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/54721/54721fig4.jpg" /> איור 4. דוגמאות PM10 מעונת אבקה נמוכה וגבוהה נבדלות הסכום שלהם נ בית adsorbed 1. PM10 עונת אבקה הנמוך נדגמה בסתיו / חורף 2013 (n = 6), אבקה גבוהה PM10 עונה מאי 2012 ו 2013 (n = 13). (א) עוצמת קרינת APC של PM10&gt; 0.5 חלקיקים מעונת אבקה גבוהה היו גבוה באופן משמעותי מאשר מהעונה אבקה נמוכה (חציון / min / max עונת אבקה גבוהה: 796/313/1097; חציון / min / max עונת אבקה נמוכה: 197 / 85/277). (ב) PM10 מעונת אבקה גבוהה כלול משמעותיtly יותר Bet נ החיובי 1 PM10&gt; 0.5 חלקיקים מ PM10 מעונת אבקה נמוכה (חציון / min / max עונת אבקה גבוהה: 45.2 / 18.5 / 74.5; חציון / min / max עונת אבקה נמוכה: 11.8 / 4.4 / 19.8). מגרשי Box להראות ערכים החציוני (קו פנימי של הקופסה), 25. ו 75. עשירונים, בהתאמה (תחתונים ועליונים גבולות המסגרת) ואת ערכי מינימום ומקסימום (שפם). *** P &lt;0.001 לעומת עונת אבקה נמוכה, מבחן מאן ויטני U. דמות זו שונתה מעט מ -11. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54721/54721fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometric Analysis of Particle-bound Bet v 1 Allergen in PM10 at JoVE.com

Flow Cytometric Analysis of Particle-bound Bet v 1 Allergen in PM10

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לכמת חלקיקים טעונים האלרגן על ידי cytometry הזרימה. חלקיקי חומר חלקיקי הסביבה עלולים לשמש נשאים של אלרגנים adsorbed. ונביא כאן כי cytometry זרימה, שיטה בשימוש נרחב כדי לאפיין מוצקים מרחפים&gt; 0.5 מיקרומטר קוטר, ניתן להשתמש כדי למדוד חלקיקים אלרגנים טעונות אלו.

ניתוח תזרים Cytometric נ בית נכנס חלקיקים 1 האלרגנים PM10

Flow cytometry is a method widely used to quantify suspended solids such as cells or bacteria in a size range from 0.5 to several tens of micrometers in ...

flow-cytometric-analysis-of-particle-bound-bet-v-1-allergen-in-pm10

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

7.5K Views.  Federal Environment Agency.  כאן, אנו מציגים פרוטוקול לכמת חלקיקים טעונים האלרגן על ידי cytometry הזרימה. חלקיקי חומר חלקיקי הסביבה עלולים לשמש נשאים של אלרגנים adsorbed. ונביא כאן כי cytometry זרימה, שיטה בשימוש נרחב כדי לאפיין מוצקים מרחפים> 0.5 מיקרומטר קוטר, ניתן להשתמש כדי למד?...

Video: Flow Cytometric Analysis of Particle-bound Bet v 1 Allergen in PM10

Murine Model of Allergen Induced Asthma

Asthma is a major cause of morbidity and mortality, affecting some 300 million people throughout the world.1 More than 8% of the US population has asthma, with the prevalence increasing.2 As with other diseases, animal models of allergic airway disease greatly facilitate understanding of the underlying pathophysiology, help identify potential therapeutic targets, and allow preclinical testing of possible new therapies. Models of allergic airway disease have been developed in several animal species, but murine models are particularly attractive due to the low cost, ready availability, and well-characterized immune systems of these animals.3 Availability of a variety of transgenic strains further increases the attractiveness of these models.4 Here we describe two murine models of allergic airway disease, both employing ovalbumin as the antigen. Following initial sensitization by intraperitoneal injection, one model delivers the antigen challenge by nebulization, the other by intratracheal delivery. These two models offer complementary advantages, with each mimicking the major features of human asthma.5
The major features of acute asthma include an exaggerated airway response to stimuli such as methacholine (airway hyperresponsiveness; AHR) and eosinophil-rich airway inflammation. These are also prominent effects of allergen challenge in our murine models,5,6 and we describe techniques for measuring them and thus evaluating the effects of experimental manipulation. Specifically, we describe both invasive7 and non-invasive8 techniques for measuring airway hyperresponsiveness as well as methods for assessing infiltration of inflammatory cells into the airways and the lung. Airway inflammatory cells are collected by bronchoalveolar lavage while lung histopathology is used to assess markers of inflammation throughout the organ. These techniques provide powerful tools for studying asthma in ways that would not be possible in humans.

Experimental mouse models of allergic asthma offer new possibilities for studying disease pathogenesis and developing new therapeutics. These models are well suited to measuring factors governing the allergic immune response, airway inflammation, and pulmonary pathophysiology.

דגם Murine של אסטמה אלרגן מושרה

Asthma is a major cause of morbidity and mortality, affecting some 300 million people throughout the world.1 More than 8% of the US population has asthma, ...

Whole-animal Imaging and Flow Cytometric Techniques for Analysis of Antigen-specific CD8+ T Cell Responses after Nanoparticle Vaccination

Traditional vaccine adjuvants, such as alum, elicit suboptimal CD8+ T cell responses. To address this major challenge in vaccine development, various nanoparticle systems have been engineered to mimic features of pathogens to improve antigen delivery to draining lymph nodes and increase antigen uptake by antigen-presenting cells, leading to new vaccine formulations optimized for induction of antigen-specific CD8+ T cell responses. In this article, we describe the synthesis of a &#8220;pathogen-mimicking&#8221; nanoparticle system, termed interbilayer-crosslinked multilamellar vesicles (ICMVs) that can serve as an effective vaccine carrier for co-delivery of subunit antigens and immunostimulatory agents and elicitation of potent cytotoxic CD8+ T lymphocyte (CTL) responses. We describe methods for characterizing hydrodynamic size and surface charge of vaccine nanoparticles with dynamic light scattering and zeta potential analyzer and present a confocal microscopy-based procedure to analyze nanoparticle-mediated antigen delivery to draining lymph nodes. Furthermore, we show a new bioluminescence whole-animal imaging technique utilizing adoptive transfer of luciferase-expressing, antigen-specific CD8+ T cells into recipient mice, followed by nanoparticle vaccination, which permits non-invasive interrogation of expansion and trafficking patterns of CTLs in real time. We also describe tetramer staining and flow cytometric analysis of peripheral blood mononuclear cells for longitudinal quantification of endogenous T cell responses in mice vaccinated with nanoparticles.

We describe whole-animal imaging and flow cytometry-based techniques for monitoring expansion of antigen-specific CD8+ T cells in response to immunization with nanoparticles in a murine model of vaccination.

טכניקות הדמיה כל-החיה והזרימה Cytometric לתגובות ניתוח של אנטיגן ספציפי CD8 + T תא לאחר Nanoparticle חיסון

Traditional vaccine adjuvants, such as alum, elicit suboptimal CD8+ T cell responses. To address this major challenge in vaccine development, various ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident cells. A key mechanism of this inflammatory response is the migration of circulating immune cells to the ischemic brain facilitated by chemokine release and increased endothelial adhesion molecule expression. Brain-invading leukocytes are well-known contributing to early-stage secondary ischemic injury, but their significance for the termination of inflammation and later brain repair has only recently been noticed.
Here, a simple protocol for the efficient isolation of immune cells from the ischemic mouse brain is provided. After transcardial perfusion, brain hemispheres are dissected and mechanically dissociated. Enzymatic digestion with Liberase&#160;is followed by density gradient (such as Percoll) centrifugation to remove myelin and cell debris. One major advantage of this protocol is the single-layer density gradient procedure which does not require time-consuming preparation of gradients and can be reliably performed. The approach yields highly reproducible cell counts per brain hemisphere and allows for measuring several flow cytometry panels in one biological replicate. Phenotypic characterization and quantification of brain-invading leukocytes after experimental stroke may contribute to a better understanding of their multifaceted roles in ischemic injury and repair.

Inflammation plays a central role in the pathogenesis of ischemic stroke. Increasing evidence suggests that it acts as a double-edged sword which exacerbates early brain injury, but also contributes to later repair. This protocol describes the isolation of immune cells from the ischemic brain and their subsequent flow cytometric phenotyping.

בידוד תזרים Cytometric ניתוח של תאים חיסוניים ממוח עכבר איסכמי

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Glioma-infiltrating Peripheral Blood Mononuclear Cells

Our laboratory has recently demonstrated that natural killer (NK) cells are capable of eradicating orthotopically implanted mouse GL26 and rat CNS-1 malignant gliomas soon after intracranial engraftment if the cancer cells are rendered deficient in their expression of the &#946;-galactoside-binding lectin galectin-1 (gal-1). More recent work now shows that a population of Gr-1+/CD11b+ myeloid cells is critical to this effect. To better understand the mechanisms by which NK and myeloid cells cooperate to confer gal-1-deficient tumor rejection we have developed a comprehensive protocol for the isolation and analysis of glioma-infiltrating peripheral blood mononuclear cells (PBMC). The method is demonstrated here by comparing PBMC infiltration into the tumor microenvironment of gal-1-expressing GL26 gliomas with those rendered gal-1-deficient via shRNA knockdown. The protocol begins with a description of&#160;how to culture and prepare GL26 cells for inoculation into the syngeneic C57BL/6J mouse brain. It then explains the steps involved in the isolation and flow cytometric analysis of glioma-infiltrating PBMCs from the early brain tumor microenvironment. The method is adaptable to a number of in vivo experimental designs in which temporal data on immune infiltration into the brain is required. The method is sensitive and highly reproducible, as glioma-infiltrating PBMCs can be isolated from intracranial tumors as soon as 24 hr post-tumor engraftment with similar cell counts observed from time point matched tumors throughout independent experiments. A single experimentalist can perform the method from brain harvesting to flow cytometric analysis of glioma-infiltrating PBMCs in roughly 4-6 hr depending on the number of samples to be analyzed. Alternative glioma models and/or cell-specific detection antibodies may also be used at the experimentalists&#8217; discretion to assess the infiltration of several other immune cell types of interest without the need for alterations to the overall procedure.

Presented here is a straightforward method for the isolation and flow cytometric analysis of glioma-infiltrating peripheral blood mononuclear cells that yields time-dependent quantitative data on the number and activation status of immune cells entering the early brain tumor microenvironment.

בידוד וניתוח תזרים cytometric של תאי הדם ההיקפיים mononuclear הסתננות-Glioma

Our laboratory has recently demonstrated that natural killer (NK) cells are capable of eradicating orthotopically implanted mouse GL26 and rat CNS-1 ...

Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes

The intestines &#8212; which contain the largest number of immune cells of any organ in the body &#8212; are constantly exposed to foreign antigens, both microbial and dietary. Given an increasing understanding that these luminal antigens help shape the immune response and that education of immune cells within the intestine is critical for a number of systemic diseases, there has been increased interest in characterizing the intestinal immune system. However, many published protocols are arduous and time-consuming. We present here a simplified protocol for the isolation of lymphocytes from the small-intestinal lamina propria, intraepithelial layer, and Peyer&#39;s patches that is rapid, reproducible, and does not require laborious Percoll gradients. Although the protocol focuses on the small intestine, it is also suitable for analysis of the colon. Moreover, we highlight some aspects that may need additional optimization depending on the specific scientific question. This approach results in the isolation of large numbers of viable lymphocytes that can subsequently be used for flow cytometric analysis or alternate means of characterization.

There is growing interest in the quantitative characterization of intestinal lymphocytes owing to increasing recognition that these cells play a critical role in a variety of intestinal and systemic diseases. In this protocol, we describe how to isolate single cell populations from different small-intestinal compartments for subsequent flow cytometric characterization.

אפיון בידוד תזרים Cytometric של Murine קטנים מעיים לימפוציטים

The intestines &#8212; which contain the largest number of immune cells of any organ in the body &#8212; are constantly exposed to foreign antigens, both ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and reproducibility of this assay can be considered unstable, either because of user&#39;s errors or because of the sensitivity of NK cells to experimental manipulation. To eliminate these issues, a workflow that reduces them to a minimum was established and is presented here. To illustrate, we obtained blood samples, at various time points, from runners (n = 4) that were submitted to an intense bout of exercise. First, NK cells are simultaneously identified and isolated through CD56 tagging and magnetic-based sorting, directly from whole blood and from as little as one milliliter. The sorted NK cells are removed of any reagent or capping antibodies. They can be counted in order to establish an accurate NK cell count per milliliter of blood. Secondly, the sorted NK cells (effectors cells or E) can be mixed with 3,3&#39;-Diotadecyloxacarbocyanine Perchlorate (DiO) tagged K562 cells (target cells or T) at an assay-optimal 1:5 T:E ratio, and analyzed using an imaging flow-cytometer that allows for the visualization of each event and the elimination of any false positive or false negatives (such as doublets or effector cells). This workflow can be completed in about 4 h, and allows for very stable results even when working with human samples. When available, research teams can test several experimental interventions in human subjects, and compare measurements across several time points without compromising the data&#39;s integrity.

This work describes an advanced workflow for the accurate and fast determination of NK (Natural Killer) cell count and NK cell cytotoxicity in human blood samples.

ניתוח תזרים Cytometric של תא הטבעי Killer ממס פעילות דם מלא אנוש

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Human Endocervical Gamma Delta T Cells

The female reproductive tract (FRT) mucosal immune system serves as the first line of defense. Better knowledge of the genital mucosa is therefore essential for understanding pathogenicity of different pathogens including HIV. Gamma delta (GD) T cells are the prototype of &#39;unconventional&#39; T cells and represent a relatively small subset of T cells defined by their expression of heterodimeric T-cell receptors (TCRs) composed of gamma and delta chains. This sets them apart from the classical and much better known CD4+ helper T cells and CD8+ cytotoxic T cells that are defined by alpha-beta TCRs. GD T cells often show tissue-specific localization and are enriched in epithelium. GD T cells orchestrate immune responses in inflammation, tumor surveillance, infectious disease, and autoimmunity.
Here, we present a method to reproducibly isolate and analyze human endocervical intraepithelial GD T lymphocytes. We have used endocervical cytobrush samples from women participating in the Women&#39;s Interagency HIV Infection Study (WIHS). Knowledge about GD T cells interactions during conditions in which there is an insult to the vaginal mucosal could be applied to any clinical study in which mucosal vulnerability is addressed, including the development of vaginal microbicides.In addition, knowledge about mucosal GD T cell responses has potential for application of GD T cell-based immune therapy in treating infectious diseases.

We describe here an isolation method to obtain human endocervical intraepithelial lymphocytes for the analysis of intraepithelial gamma delta T cells. This protocol can be extended for the purification of endocervical gamma delta T cells by magnetic beads or by cell sorting.

ניתוח בידוד תזרים Cytometric של האדם תאים האנדוצרוויקאלית גמא דלתא T

The female reproductive tract (FRT) mucosal immune system serves as the first line of defense. Better knowledge of the genital mucosa is therefore ...

Digestion of the Murine Liver for a Flow Cytometric Analysis of Lymphatic Endothelial Cells

Within the liver, lymphatic vessels are found within the portal triad, and their described function is to remove interstitial fluid from the liver to the lymph nodes where cellular debris and antigens can be surveyed. We are very interested in understanding how the lymphatic vasculature might be involved in inflammation and immune cell function within the liver. However, very little has been published establishing digestion protocols for the isolation of lymphatic endothelial cells (LECs) from the liver or specific markers that can be used to evaluate liver LECs on a per cell basis. Therefore, we optimized a method for the digestion and staining of the liver in order to evaluate the LEC population in the liver. We are confident that the method outlined here will be useful for the identification and isolation of LECs from the liver and will strengthen our understanding of how LECs respond to the liver microenvironment.

The goal of this protocol is to identify lymphatic endothelial cell populations within the liver using described markers. We utilize collagenase IV and DNase and a gentle mincing of tissue, combined with flow cytometry, to identify a distinct population of lymphatic endothelial cells.

העיכול של הכבד מאתר של ניתוח Cytometric זרימת הלימפה תאי אנדותל

Within the liver, lymphatic vessels are found within the portal triad, and their described function is to remove interstitial fluid from the liver to the ...

Flow Cytometric Measurement Of ROS Production In Macrophages In Response To Fc&#947;R Cross-linking

The oxidative or respiratory burst is used to describe the rapid consumption of oxygen and generation of reactive oxygen species (ROS) by phagocytes in response to various immune stimuli. ROS generated during immune activation exerts potent antimicrobial activity primarily through the ability of ROS to damage DNA and proteins, causing death of microorganisms. Being able to measure ROS production reproducibly and with ease is necessary in order to assess the contribution of various pathways and molecules to this mechanism of host defense. In this paper, we demonstrate the use of fluorescent probes and flow cytometry to detect ROS production. Although widely used, fluorescent measurement of ROS is notoriously problematic, especially with regards to measurement of ROS induced by specific and not mitogenic stimuli. We present a detailed methodology to detect ROS generated as a result of specific Fc&#947;R stimulation beginning with macrophage generation, priming, staining, Fc&#947;R cross-linking, and ending with flow cytometric analysis.

This study demonstrates the use of flow cytometry to detect reactive oxygen species (ROS) production resulting from activation of the Fc&#947;R. This method can be used to assess changes in the antimicrobial and redox signaling function of phagocytes in response to immune complexes, opsonized microorganisms, or direct Fc&#947;R cross-linking.

מדידת Cytometric ROS הייצור ב מקרופאגים בתגובה FcγR cross-linking

The oxidative or respiratory burst is used to describe the rapid consumption of oxygen and generation of reactive oxygen species (ROS) by phagocytes in ...

Multi-scale Analysis of Bacterial Growth Under Stress Treatments

Analysis of the bacterial ability to grow and survive under stress conditions is essential for a wide range of microbiology studies. It is relevant to characterize the response of bacterial cells to stress-inducing treatments such as exposure to antibiotics or other antimicrobial compounds, irradiation, non-physiological pH, temperature, or salt concentration. Different stress treatments might disturb different cellular processes, including cell division, DNA replication, protein synthesis, membrane integrity, or cell cycle regulation. These effects are usually associated with specific phenotypes at the cellular scale. Therefore, understanding the extent and causality of stress-induced growth or viability deficiencies requires a careful analysis of several parameters, both at the single-cell and at the population levels. The experimental strategy presented here combines traditional optical density monitoring and plating assays with single-cell analysis techniques such as flow cytometry and real time microscopy imaging in live cells. This multiscale framework allows a time-resolved description of the impact of stress conditions on the fate of a bacterial population.

This protocol allows a time-resolved description of bacterial growth under stress conditions at the single-cell and the cell population levels.

רב היקף ניתוח של צמיחה חיידקים תחת טיפולי סטרס

Analysis of the bacterial ability to grow and survive under stress conditions is essential for a wide range of microbiology studies. It is relevant to ...