Monosit-Makrofaj Testi Kullanılarak Kırmızı Kan Hücresi Antikor Öneminin Tahmini

Transfüzyon tıbbı ve immünolojide kırmızı hücre alloantikorlarının klinik önemini daha iyi tahmin etmeye yardımcı olmak için makrofajların kullanıldığı mevcut monosit-monotabaka testi (MMA) için iyileştirmeler ve güncellenmiş yöntemler geliştirdik. Bu test, monosit-makrofaj testi (M-MA) olarak adlandırılır.

Kemik iliğindeki monositlerden türetilen makrofajlar, ölü hücrelerin, döküntülerin, tümör hücrelerinin ve yabancı patojenlerin temizlenmesinde önemli bir rol oynayan büyük, doğuştan gelen bağışıklık hücreleridir. Monositlerin makrofajlara karşı fagositik kapasitesi iyi anlaşılmamış bir kavramdır. Burada, monositlerin makrofajlara, özellikle M1/M2 makrofajlarına, yerleşik monosit monotabaka testinin (MMA) değiştirilmiş ve güncellenmiş bir versiyonunu kullanarak çeşitli opsonize kırmızı hücrelere karşı fagositozundaki bir farkı incelemeyi amaçlıyoruz. Periferik kan mononükleer hücreleri (PBMC'ler) donör buffy coats'tan izole edildi. Saflaştırılmış monositler kullanılarak, in vitro kültür ve polarizasyon ile inflamatuar M1 ve anti-inflamatuar M2 makrofajları üretildi. M1 / M2 hücreleri hasat edildi ve çeşitli kırmızı hücre antikorlarının klinik olarak anlamlı fagositozunu deşifre etmek için M-MA olarak adlandırdığımız MMA benzeri bir testte kullanıldı. Fagositik indeks (PI) > 5, monosit kullanımı ile klinik olarak anlamlı fagositoz olarak kabul edildi. Fagositik indeks (PI) > 12, M1/M2 makrofajlarının kullanımı ile klinik olarak anlamlı fagositoz olarak kabul edildi. M2 makrofajları, monositler ve M1'lere kıyasla opsonize RBC'leri fagositoz etme yeteneğinin arttığını göstermektedir. Aynı zayıf antikor (anti-S), sadece M2 makrofajları (PI = 43) ile önemli fagositoz verir, ancak M1s (PI = 2) veya monositler (PI = 0) ile değil ve bu, çeşitli antikorlar kullanılarak tekrar tekrar gösterilmiştir. Monositler yerine M2 makrofajlarının kullanılması, bu hücreler daha fagositik olduğundan ve teste daha fazla klinik ilgi sunduğundan daha doğru sonuçlara izin verebilir. Monosit-makrofaj testinin (M-MA) klinik önemi bilinen antikorlarla doğrulanması da dahil olmak üzere, kırmızı kan hücrelerine karşı farklı antikorlarla yapılan daha ileri çalışmalar, M-MA'nın klinik olarak anlamlı kırmızı hücre alloantikorlarını ve transfüzyon reaksiyonlarını tahmin etmeye yardımcı olmak için daha yararlı olduğunu gösterebilir. Bu yöntem transfüzyon tıbbı ve immünoloji alanını ilerletecektir.

Transfüzyon reaksiyonlarını tahmin etmek, transfüzyon tıbbı alanında önemli bir zorluk olmaya devam etmektedir. Son 4 yılda, Tong ve Dal ^1,2'nin öncülük ettiği monosit-monotabaka testi (MMA), kan transfüzyonu hastalarında hemolizin klinik sonucunu tahmin etmek için değerli bir in vitro hücresel test olarak hizmet etmiştir¹. Gerçekten de, bu test klinik olarak anlamlı ve önemsiz kırmızı kan hücresi (RBC) antikorları arasında ayrım yapmada etkili olmuştur². Monositler geleneksel olarak bu testte kullanılan standart lökosit olsa da, araştırmamız monositten türetilmiş makrofajların alternatif olarak kullanılmasının potansiyel faydalarını araştırmayı amaçlamaktadır. Bu hücreler, tahlillerin kırmızı hücre alloantikorlarının klinik önemini değerlendirme yeteneğini artırabilir.

Tarihsel MMA'da, advers bir transfüzyon reaksiyonu sırasında kırmızı kan hücrelerinin temizlenmesinden ve yok edilmesinden sorumlu bağışıklık hücreleri olan makrofajların öncüleri olan monositler, RBC'ler ve^antikorlar 1,2,3,4,5,6,7 ile birlikte in vitro bir testte tanıtılır. Fagositoz daha sonra monositler içindeki fagositozlu RBC'lerin sayılmasıyla görsel olarak değerlendirilir. Sayılan 100 monosit başına < 5 fagositozlu RBC'nin fagositik indeksi (PI), hastanın advers bir transfüzyon reaksiyonu yaşama riskinin düşük olduğunu ve antikorun klinik olarak önemsiz kabul edildiğini gösterir 4,5,6,7. Ön deneyler, periferik kan kaynaklı monositlerin kullanılmasının, aktive edilmiş monositlerden ve bazı makrofajlardan daha düşük fagositik kapasiteye sahip oldukları için klinik önemi belirlemek için ideal olmayabileceğini göstermektedir.

Monositler kanda, dalakta ve kemik iliğinde bulunan hücrelerin bir alt kümesidir ve insanlarda toplam lökositlerin %10'unu oluşturur⁸. Bu hücreler tipik olarak farklı dokular tarafından işe alınmadan önce 1-2 gün boyunca dolaşırlar ve burada makrofajlara^{farklılaşırlar 8}. Bu tipik olarak, kemik iliğinin dalak ve karaciğerde bulunan doku makrofajları haline gelmek üzere dolaşıma salınan monositler ürettiği hematopoez sırasında olur². Yabancı patojenlere karşı ilk savunma hattı olarak bilinen makrofajlar, adaptif ve doğuştan gelen bağışıklıkta rol oynayan büyük fagositik mononükleer hücrelerdir⁹. Bağışıklık sisteminin karmaşık ve karmaşık rolleri arasında, makrofaj fenotiplerini anlamak ve karakterize etmek, henüz tam olarak anlaşılmamış zorlu bir zorluk teşkil etmektedir. Son yirmi yılda, makrofaj polarizasyonu kavramı, bu makrofajların var olduğu spektrumu ayırt etmek için tek hücreli RNA diziliminin kullanımını kullanan son çalışmalarla giderek daha fazla tanınmıştır.

Klasik olarak aktive edilmiş M1 ve M1 benzeri makrofajlar, Toll benzeri reseptörlerin (TLR'ler) hakim olduğu enflamatuar ortamlarda ortaya ^çıkar10. Bu hücreler otoimmün hastalıklarda ve arteriyosklerozda rol oynayabilir ve MHC-II, CD80 ve CD86 gibi yüzey belirteçleri sunabilir^11,12. Anti-inflamatuar M2 ve M2 benzeri makrofajlar, Th2 yanıtlarının hakim olduğu, CD80 ekspresyonunun olmadığı ve CD209 ve CD206 gibi yüzey belirteçlerinin bulunduğu ortamlarda bulunur^11,12. M1/M2 makrofajları, lipopolisakkarit (LPS) ve GM-CSF ve IFNγ (M1) ve M-CSF ve IL-4 (M2) gibi sitokinler ile periferik kan mononükleer hücrelerinden in vitro olarak kültürlenebilir ve polarizasyonlarını uyarır^10,12.

Bu makale ve ilgili çalışmalar, M2 makrofajlarının M1 makrofajları ve monositlerine kıyasla fagositoz için daha yüksek duyarlılık gösterdiğini göstermeyi amaçlamaktadır. M1/M2 makrofajlarının monositlere karşı fagositik aktivitesinin kırmızı hücre alloantikorları ve transfüzyon tıbbı bağlamında araştırılması henüz keşfedilmemiş bir alandır. Burada, M1/M2 makrofajlarının üretilmesi için devam eden mevcut çalışmaları açıklıyoruz ve klasik monosit monotabaka testini (MMA) yeni monosit-makrofaj testi ile karşılaştırıyoruz, bu makrofaj testini monosit testinden ayırt etmek için M-MA kısaltmasını kullanarak, in vitro fagositoz testlerinin prediktif değerini iyileştirmek için.

Bu araştırma, insan denekleri içeren etik araştırmaların yürütülmesi için kurumsal yönergelere uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Kanada Kan Hizmetleri Araştırma Etik Kurulu'ndan (REB) etik onayı alındı, onay CBSREB#2023.008. Bu protokolün tüm adımları steril koşullar altında bir biyogüvenlik kabininde gerçekleştirilecektir.

1. PBMC'lerin İzolasyonu

1. Bir ACD tüpündeki bir donörden tam insan kanı alın. Kanı oda sıcaklığında (18 °C–22 °C) 36 saate kadar saklayın.
2. Tam kan ACD tüplerini 50 mL santrifüj tüplerine aktarın (her iki ACD tüpü için tek bir 50 mL tüp). Oda sıcaklığında RPMI-1640 tam ortamı 35 mL'lik bir nihai hacme ekleyin.
3. Yeni bir 50 mL tüpe 15 mL oda sıcaklığında yoğunluk gradyan ortamı ekleyin. Seyreltilmiş tam kanı, yoğunluk gradyan ortamının üzerine dikkatlice katmanlayın ve kanın en iyi şekilde ayrılması için arayüzdeki karışımı en aza indirin.
4. Katmanlı karışımı frenler KAPALI durumdayken 30 dakika boyunca 700 x g'da santrifüjleyin. Yoğunluk gradyanlı santrifüjleme, karışımı yukarıdan aşağıya aşağıdaki katmanlara ayıracaktır: Plazma, Buffy kaplama (PBMC'ler içeren), yoğunluk gradyanlı malzeme, Granülositler ve kırmızı kan hücreleri.
5. Üst tabakanın (plazma) çoğunu aspire edin ve atın. Bir transfer pipeti kullanarak, herhangi bir ek malzeme getirmekten kaçınarak buffy coat (PBMC'ler) tabakasını dikkatli bir şekilde geri alın. Alınan PBMC'leri 50 mL'lik yeni bir tüpe aktarın.
6. İzole edilmiş buffy coat tabakasını 1x'i pH 7.4 PBS solüsyonu ile tam frenler AÇIK durumdayken 350 x g'da 10 dakika boyunca yıkayın.
7. PBMC'leri 15 mL'lik konik bir tüpe aktarmadan önce kalıntıları veya istenmeyen malzemeleri ortadan kaldırmak için 70 μM'lik bir hücre süzgeci kullanın. 2x'i pH 7.4 PBS solüsyonu ile 10 dakika boyunca 350 x g'da tam frenler AÇIK durumdayken yıkayın.
8. İsteğe bağlı: ACK lizis tamponu ile taşınan herhangi bir RBC'yi parçalayın. Pelet boyutuna bağlı olarak 5-10 mL ACK lizis tamponu ekleyin ve oda sıcaklığında 3 dakikaya kadar inkübe edin. İnkübasyondan sonra, pH 7.4 PBS ile doldurun ve tam frenler AÇIK durumdayken 350 x g'da 10 dakika santrifüjleyin ve 1 kez yıkayın. RBC sayısı çok yüksekse bu adımı gerçekleştirin.
   NOT: Daha iyi sonuçlar için ACK kullanımından kaçınmak her zaman daha iyidir. Alternatif olarak, 15 saniyeden daha uzun süre su ile inkübe ederek fagositozlu olmayan RBC'leri ortadan kaldırmak için su kullanılabilir, ardından yıkamak için hemen 1X PBS ekleyin.
9. PBMC peletini RPMI-1640 tam ortamının 2-3 mL'sinde (ilk ACD tüpü başına 0,5 mL kullanın) sulandırın. Tripan mavisi ile 1: 1 karışım hazırladıktan sonra bir hemositometre ile PBMC'leri sayın. Sadece tripan mavisi ile lekelenmemiş hücreleri sayar. PBMC'leri RPMI-2 tam ortamda^{10 x 6 hücre} / mL'ye yeniden oluşturun.

2. M1/M2 makrofajlarının kültürü

1. Gün 0 monositlerin tohumlanması
   1. Her makrofaj popülasyonu için 25 mL'lik bir hücre kültürü şişesi hazırlayın. Her birine 5 mL poli-D-lizin (50 mg / 500 mL) ekleyin ve en az 1 saat kaputta bırakın. Kalan poli-D-lizinden kurtulmak için şişeyi PBS ile durulayın.
   2. PBMC'leri her zamanki gibi Buffy coat veya hasta örneklerinden izole edin (bkz. adım 1). Bir PBMC peleti üretildikten sonra, 10 mL önceden ısıtılmış RPMI-1640 tam ortamda yeniden süspanse edin.
   3. Hücre sayısını belirleyin ve Monosit izolasyon kiti ile monosit izolasyonuna başlayın. Kiti çalıştırmak için en az 50 x 10⁶ hücre kullanın.
   4. Hücreleri bir izolasyon ortamında 50 x 10⁶ hücre / mL'de yeniden süspanse edin. Elde edilen hücre sayısına göre monosit izolasyon kitinde önerilen mor (0.25-2 mL) veya gri (0.5-8.5 mL) mıknatısı kullanınız.
   5. Kit talimatlarını izleyin ve numuneyi gerekli propilen tüpüne (5 mL veya 14 mL) ekleyin. 50 μL/mL numunede numuneye zenginleştirme kokteyli ekleyin.
   6. Numuneyi karıştırmak için yukarı ve aşağı pipetleyin veya vorteksleyin ve ardından bir buz kovasında 2-8 °C'de 10 dakika inkübe edin. Bu arada, 30 s boyunca manyetik parçacıkları girdaplar. İnkübasyondan sonra, numuneye manyetik parçacıklar ekleyin: 100 μL/ml numune.
   7. Numuneyi karıştırmak için yukarı ve aşağı pipetleyin veya vorteksleyin ve ardından 2-8 °C'de 5 dakika inkübe edin. Buna göre dereceli bir pipet kullanarak 2,5 mL veya 10 mL'ye kadar izolasyon ortamı ile doldurun. Karıştırmak için 2x-3x yukarı ve aşağı pipetleyin.
   8. Tüpü (kapaksız) mıknatısın içine yerleştirin ve oda sıcaklığında 2,5 dakika inkübe edin. Mıknatısı alın ve sürekli bir hareketle mıknatısı ve tüpü ters çevirin, hücre süspansiyonunu 5 mL veya 14 mL'lik yeni bir tüpe dökün.
   9. RPMI-1640 ortamındaki hücreleri yeniden askıya alın ve sayın. Bu adımı mümkün olan en kısa sürede yapın. Daha önce poli-D-lizin ile önceden kaplanmış her 25 mL'lik şişeye 1 x 10⁶ – 5 x^{10 6} monosit tohumlayın. Gerekirse RPMI-5 ile hacmi 1640 mL'ye getirin.
   10. 37 °C'de, %5 CO_2'de en az 2 saat inkübe edin. Bu arada, M1 ve M2 farklılaşma ortamını hazırlayın. Gün 0 (10 mL) ve Gün 4 (2 mL) doldurma için yeterince hazırlanın.
       NOT: M1 farklılaşma ortamı: RPMI-1640 + 2.5 ng/mL GM-CSF; M2 farklılaşma ortamı: RPMI-1640 + 50 ng/mL M-CSF.
   11. Kuluçka süresinden sonra, her bir şişeyi 1x PBS ile ve 2x'i tam RPMI-1640 ile yıkayın. Farklılaştırılacak hücre tipine göre her şişeye 10 mL farklılaşma ortamı ekleyin.
   12. Hücrelerin inkübatörde 6 gün boyunca 37 °C,% 5 CO_2'de farklılaşmasına izin verin. Buharlaşma nedeniyle, 4. günde farklılaşma ortamı ile doldurun.
2. 4. Gün - Yükleme
   1. İlgili şişeye her bir farklılaştırma ortamından 2 mL ekleyin. Ortamı doğrudan şişeye ekleyin.
3. 6. Gün - Makrofaj polarizasyonu
   1. M1 ve M2 polarizasyon ortamını hazırlayın. M1 polarizasyon ortamı için, ilgili şişeye eklemek üzere 5 mL M1 polarizasyon ortamı hazırlayın. Nihai konsantrasyonlar RPMI-1640'ta 50 ng/mL IFNy, 10 ng/mL LPS ve 2.5 ng/mL GM-CSF olmalıdır. Sonunda şişenin toplam hacmi 15 mL olacaktır (10 mL zaten + 5 mL eklenecektir), hesaplamaları buna göre yapın.
   2. M2 polarizasyon ortamı için, ilgili şişeye eklemek üzere 5 mL M2 polarizasyon ortamı hazırlayın. Nihai konsantrasyonlar RPMI-1640'ta 20 ng/mL IL-4 ve 50 ng/mL M-CSF olmalıdır. Sondaki şişenin toplam hacminin 15 mL olacağını unutmayın (10 mL zaten + 5 mL eklenecek); Hesaplamaları buna göre yapın.
   3. Her şişeye 5 mL M1 veya M2 polarizasyon ortamı ekleyin. Makrofajların inkübatörde 37 ° C'de,% 5 CO_2'de en az 2 gün ve en fazla 4 gün polarize olmasına izin verin.
4. 8. Gün - Hasat ve akış sitometrisi
   1. M1 veya M2 makrofajlarını hasat etmeden önce, süpernatanı daha fazla kullanım için (gerekirse) 1,5 mL'lik tüplere toplayın. Şişeye 1 mL hücre ayırma solüsyonu ekleyin ve 37 °C'de,% 5 CO₂ inkübatörde 5 dakika bekletin.
   2. Reaksiyonu durdurmak için 3 mL tam RPMI-1640 ekleyin. Ortamı 15 mL'lik bir tüpe toplayın. Şişeye 3 mL tam RPMI-1640 ekleyin ve hücreleri şişenin altından ayırmak için bir hücre sıyırıcı kullanın.
   3. Hücreleri 15 mL'lik bir tüpte toplayın. Şişeyi mikroskop altında 10x'e yerleştirin ve şişenin dibine daha fazla hücre takılmadığından emin olmak için hücreleri izleyin.
   4. Hücreleri PBS 2x'te yıkayın. Bunları tam RPMI-1640'ta yeniden askıya alın ve hemositometreyi kullanarak sayın.
   5. M1/M2 makrofajlarının kalitesini ve miktarını analiz etmek için bir akış sitometrisi testi yapın. Tüp başına 0,5 x 10⁶ hücre kullanın ve aşağıdaki gibi boyayın: M1: CD80 + CCR7 + CD209- M2: CD206 + CD209 + CD80-. Bu tahlilde kullanılan geçit stratejisi: #1 İleri Dağılım (FSC-A) ve Yan Saçılma (SSC-A) Nokta Grafiği, #2 İleri Dağılım Yüksekliği (FSC-H) ve İleri Saçılma Alanı (FSC-A) Çift Ayrımı için Nokta Grafiği, #3 Yan Dağılım (SSC-A) ve Canlı/Ölü Hücre Ayrımı için DAPI-A Nokta Grafiği, #4 Yan Dağılım (SSC-A) ve Tek Parametreli Nokta Grafiği veya Histogram (yani, SSC-A ve FITC-A), #5 Çift Parametreli Nokta Grafiği (yani, FITC-A ve APC-A).

3. M1 / M2 makrofajlarını kullanan MMA

1. M1 / M2 makrofajlarını elde ettikten sonra, bunları tripan mavisi ile 1: 1 boyama oranında bir hemositometre kullanarak sayın. M1 / M2'yi RPMI-1 tam ortamda 1 x 10⁶ hücre / mL'ye sulandırın.
2. 400 μL (400.000 hücre) hücre süspansiyonunu 8 oyuklu oda slaytının her bir oyuğuna bir mikropipet kullanarak tohumlayın ve tamamen nemlendirilmiş bir doku kültürü inkübatöründe en az 1,5 saat boyunca 37 ° C,% 5 CO_2'de inkübe edin. Her test en az üçlü kuyu kullanılarak yapılmalıdır.
3. Test numunelerinin ve RhD + R2R2 kırmızı kan hücrelerinin opsonizasyonu
   1. RhD + R2R2 RBC'leri her seferinde 5 dakika boyunca 350 x g'de santrifüjleyerek pH 7.4 PBS 3x'te yıkayın. Daha yüksek bir D-antijen yoğunluğuna sahip olması nedeniyle R2R2 RhD + RBC'leri kontrol olarak kullanmayı tercih ediyoruz, ancak herhangi bir RhD + RBC ikame edilebilir. İlgilenilen antikorları kullanarak test edilen RBC örneğini (örneğin, hasta veya donör) RBC'leri opsonize edin. 300 μL antikor karışımına 15 μL paketlenmiş RBC ekleyerek %5'lik bir RBC süspansiyonu kullanın. 300 μL Anti-D antikor karışımına (100 ng/mL) 15 μL paketlenmiş R2R2 RBC ekleyerek R2R2 RBC'leri Anti-D ile opsonize edin.
   2. 37 °C'de, %5 CO_2'de 1 saat inkübe edin. Dibe yerleşmiş RBC'lerin aralıklı olarak sulandırılmasını gerçekleştirin (örneğin, her 15 dakikada bir girdap). pH 7.4 PBS 3x ile opsonize RBC'leri her seferinde 5 dakika boyunca 350 x g'da santrifüjleme ile yıkayın.
   3. RBC opsonizasyonunu kontrol etmek için dolaylı bir antiglobulin testi (IAT) yapın. Birincil opsonize edici antikora ikincil bir opsonize edici anti-insan antikoru ekleyin. RBC'lerin hemaglutinasyonu veya topaklanması 30 saniye içinde gözlenebilir ve başarılı bir opsonizasyon olarak yorumlanabilir¹³.
   4. Yıkanmış opsonize RhD + R2R2 RBC'leri RPMI-1640 tam ortam ile %1,25 (h/h) sulandırın. Kuyucuk başına% 1.25 (h / v) elde etmek için 1.200 μL orta ila 15 μL RBC ekleyin.
4. Fc reseptörü aracılı fagositoz
   1. M1 / M2 makrofajlarının 1,5 saatlik inkübasyonundan sonra, bu hücrelerin oda slaytının oyuklarına yapışmasına izin vermek için, süpernatan ortamı aspire edin ve nazik bir teknik izleyerek, pipet ucunun sadece kuyucukların köşesine temas etmesini sağlayarak atın. Makrofajlar kuyucuklara yapıştırılmalıdır. Pipet ucuyla kuyucukların ortasına dokunmaktan kaçının.
   2. Kuyuları 1x pH 7.4 PBS ile nazikçe yıkayın. Üçlü sıvının her bir oyuğuna 400 μL uygun% 1.25 (h / h) opsonize RBC karışımı ekleyin. 37 ° C'de,% 5 CO₂ 'de 2 saat boyunca rahatsız edilmeden inkübe edin.
   3. Kuluçkadan sonra, her birinde 100 mL pH 7.4 PBS olan iki beher hazırlayın.
   4. Üreticinin adaptörlerini kullanarak 8 kuyulu odaları çıkarın. Slaytları nemli tutarken fazlalığı bir kağıt havluya sürün.
   5. Slaytı, atılan süpernatantlarla birlikte behere daldırın ve kalan fagositozlu olmayan RBC'leri çıkarmak için yavaşça ileri geri hareket ettirerek (20-30 vuruş) yıkayın.
   6. Daha sonra slaytı ikinci behere batırın ve 20-30 vuruş daha yavaşça yıkayın. Slaytı PBS'den çıkarın ve fazlalığı bir kağıt havluya sürün. Odaların ön tarafına dokunmaktan kaçının. Bu noktada, yapışan, fagositozlu olmayan RBC'leri çıkarmak için slaytı 1 dakika suya batırın, ancak fagositozlu RBC'leri yapışık RBC'lerden ayırt edebiliyorsanız gerekli olmayabilir. Havayla kurutun.
   7. Slaytları sabitlemek için 45 saniye boyunca %100 metanole batırın ve ardından havayla kurutun. Sürgüyü şirket içinde hazırlanmış bir montaj ortamı kullanarak monte edin ve lameller (24 x 75 mm) ekleyin. Nicelemeden önce gece boyunca kurumasını bekleyin.
5. Fagositozun miktar tayini
   1. Bir faz kontrast mikroskobu, 40x objektif lens ve bir manuel hücre sayacı kullanarak fagositozu ölçün.
   2. Her iki elde birer tane olmak üzere iki manuel hücre sayacının yardımıyla, bir sayıcı ile fagositozlu RBC'leri ve diğeriyle toplam monosit/makrofaj sayısını sayın. Kuyucuk başına 300 monosit / makrofaj sayın.
   3. Fagositozlu RBC'lerin sayısını sayılan toplam monosit sayısına bölerek ve 100 ile çarparak test başına ortalama fagositik indeksi (PI) hesaplayın (üçlüler arasında). Verileri ortalama PI ± ortalamanın standart hatası (SEM) olarak ifade edin.
      PI = (fagositozlu eritrositler / 300 makrofajlar) x 100

Şekil 1'deki sonuçlar literatür ile tutarlıdır ve makrofajların M0 durumlarından sonraki M1 / M2 durumlarına başarılı bir polarizasyonunu göstermektedir. M1 ve M2 makrofajları 8 gün boyunca (6 gün büyüme faktörleri ve 2 gün polarizasyon) kültüre edildi ve anti-D veya anti-k opsonize eritrositler test edildi (Şekil 2). M2 makrofajları, M1'lere kıyasla yüksek bir fagositik indeks gösterir ve RBC'ler anti-D (kontrol) veya anti-k tarafından opsonize edilir. Bu sonuç, M-MA kullanılarak gerçekleştirilen diğer ön testlerle tutarlıdır (bakınız Tablo 1). M2 makrofajları, güçlü RBC antikorlarına rağmen, M1 makrofajlarına veya monositlerine kıyasla oldukça fagositiktir (Şekil 2B). Tablo 1, klinik olarak anlamlı kabul edilen özgüllüklere sahip 4 farklı RBC alloantikoru ile ön sonuçları göstermektedir. Antijen pozitif RBC'leri opsonize etmek için kullanılan ve MMA'daki monositlere eklenen antikorlar zayıf fagositoz gösterir (PI < 5). M1 makrofajlarına eklenen aynı antikorlarla opsonize edilen eritrositler de zayıf fagositoz gösterir (PI < 12). M2 makrofajlarına eklenen aynı antikorlarla opsonize edilen RBC'ler, bu makrofajların monositlere ve M1'lere kıyasla klinik önemi belki de daha iyi tahmin etme yeteneğini gösteren yüksek, anlamlı fagositoz (PI > 12) gösterir.  Gözlemlenen sonuçlara dayanarak, M2 makrofajlarının kullanımının, transfüzyon tıbbında RBC antikorunun klinik önemini daha fazla öngörebileceği sonucuna varabiliriz. Ayrıca, immünolojideki mevcut yöntemler, daha doğru sonuçlar sundukları ve klinik uygunluğa dönüşebilecekleri için bu yazıda gösterilen yöntemlere uyum sağlamayı yararlı bulabilir. Bununla birlikte, RBC antikorlarını, MMA'yı M-MA ile karşılaştırarak, klinik önemliliklerini veya önemsizliklerini gösteren özgüllükler ve klinik verilerle inceleyen daha fazla çalışmaya ihtiyaç vardır.

Şekil 1: M1/M2 makrofajlarının polarizasyonu ve karakterizasyonu. (A) Yoğunluk gradyan ayrımı kullanılarak periferik kan mononükleer hücrelerini (PBMC'ler) çıkarmak için bir donör buffy coat kullanılır. CD16 + / CD14 + monositleri daha sonra PBMC'lerden izole edilir ve 6 gün boyunca 37 ° C'de farklılaşmak için iki kültür şişesine yerleştirilir ve 4. günde bir ekleme yapılır. Farklılaşma ortamı: M1- GM-CSF (2.5 ng/mL) ve M2- M-CSF (50 ng/mL). Polarizasyon ortamı, karşılık gelen her bir şişeye 144 saatte eklenir ve makrofajlar, 37 ° C'de 48 saat daha polarize olmaya bırakılır. Polarizasyon ortamı: M1 – IFN-gama (50 ng/mL), LPS (10 ng/mL) ve GM-CSF (2.5 ng/mL). M2 – IL-4 (20 ng/mL) ve M-CSF (50 ng/mL). Hücreler daha sonra akış sitometrisi ile karakterizasyon için hasat edilebilir ve etiketlenebilir veya bir fagositoz testinde kullanılabilir (Şekil 2). (B) M1 ve M2 makrofaj in vitro morfolojisi. Polarizasyondan 2 gün sonra çekilen görüntüler. A. M1 makrofajları yuvarlak ve dairesel bir morfoloji sunar. B. M2 makrofajları, her ikisi de başarılı polarizasyonun göstergesi olan belirgin, esnek, uzun bir morfolojiye sahiptir. (C) CD80 (M1) ve CD209 (M2) ile karakterize edilen M1 / M2 makrofajlarının Akış Sitometrik Analizi. M1/M2 makrofajları 8 gün süreyle kültüre edildi ve akış sitometrisi kullanılarak karakterizasyon için CD80-FITC ve CD209-PECy7 ile etiketlendi. A. M1 makrofajları yaklaşık %86.1 oranında CD80 ekspresyonu ve %0.17 oranında CD209 ekspresyonu gösterir. B. M2 makrofajları, CD209 ekspresyonunun %97.3'ünü ve CD80 ekspresyonunun %0.003'ünü gösterir. (D) M1 / M2 makrofajlarında CD80 ve CD209'un floresan sinyali. M1/M2 makrofajları 8 gün süreyle kültürlendi ve akış sitometrisi ile karakterizasyon için CD80-FITC veya CD209-PECy7 ile etiketlendi. A. CD80'in Ortalama Floresan Yoğunluğu (MFI), M1'lerde M2'lerden çok daha yüksektir. CD209'un MFI'si M2'lerde M1'lerden çok daha yüksektir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Monosit-makrofaj deneyi (M-MA). (A) M1 / M2'ler 6 gün boyunca büyüme faktörleri ile kültürlenir ve daha sonra polarize etmek için 2 gün sitokinlerle kültürlenir. M1 / M2 makrofajları daha sonra oda slaytlarına yerleştirilir ve 37 ° C'de 2 saat inkübe edilir. RBC'ler, tercih edilen antikor / serum kullanılarak opsonize edilir ve her 15 dakikada bir aralıklı karıştırma ile 1 saat inkübe edilir. Opsonize edilmiş RBC'ler, bağlı makrofajlarla birlikte oda slaytlarına yerleştirilir ve 37 ° C'de 2 saat boyunca rahatsız edilmeden inkübe edilir. Slaytlar PBS'de yıkanır; Hücreler metanol kullanılarak sabitlenir ve flavanol ile monte edilir. Hücreler, 40x'te faz kontrast mikroskobu kullanılarak sayılır. Fagositik indeks (PI), 300 makrofaj ve karşılık gelen fagositozlu RBC'ler sayılarak hesaplanır. (B) M1 ve M2 makrofajlarını anti-D ve anti-k ile karşılaştıran M-MA. R2R2, RhD + kanı ifade eder. K+k+, heterozigot K+k+ RBC'leri ifade eder. Hata çubukları SD'yi gösterir ve p-değeri < 0.05 olan bir t-testi yapıldı. (C) M-MA tarafından M2 makrofajlarına karşı M1 tarafından anti-k fagosite edilen RBC'ler. Resimler faz kontrast mikroskobu kullanılarak 40x'te çekildi. a. M1 makrofajları, anti-k ile opsonize edilmiş RBC'ler ile çok az fagositik aktivite gösterir. b. M2 makrofajları, anti-k ile opsonize edilmiş RBC'ler ile yüksek fagositik aktivite gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1. M2 makrofajlarının kullanımı, monositlere (MMA) kıyasla M-MA testinde potansiyel olarak klinik olarak anlamlı RBC antikorları için daha öngörücü olabilir.

Yöntemin başarısını sağlamak için aşağıdaki kritik adımlara uyulmalıdır: 1) başarılı M1/M2 polarizasyonu, 2) makrofaj tabakasının oluşturulması ve RhD+ kontrolü 3) fagositik indeksin miktarının belirlenmesi. Yöntemlerimiz hücre kültürü için izole edilmiş monositlerin kullanılmasını belirtirken, PBMC'ler kullanılabilir, ancak saflaştırılmış monositlerin kullanılmasını öneririz. PBMC'lerin çeşitli hücre tipleri içerdiği ve bu hücrelerin birden fazla farklı sitokin ve aracı faktör salgıladığı bilinmektedir. Bu, M1 / M2 makrofajlarının farklılaşması veya polarizasyonu üzerinde bir etkiye sahip olabilir; Bu nedenle saflaştırılmış monositlerin kullanılması daha iyi sonuçlar verecektir.  Ayrıca, STEMCELL monosit izolasyon kiti kullanılırken monositlerin yaklaşık% 10'unun orijinal PBMC miktarından elde edileceğini hatırlamak önemlidir. 50 x 10⁶ PBMC'nin, yaklaşık 5 x10⁶ monosit elde etmek için minimum başlangıç sayısı olduğu görülmüştür. Şişeyi yapışmış monositlerle yıkarken, herhangi bir hücrenin ayrılmasını önlemek için dönme hareketi kullanarak nazikçe yıkadığınızdan emin olun. İnkübatörde meydana gelen buharlaşma nedeniyle, kültürün 4. gününde doldurma ortamı adımı gereklidir. M1/M2'ler tarafından salgılanan sitokinler farklılaşma için önemli olduğundan, herhangi bir ortamı atmaktan kaçının ve ortamı şişeye ekleyin. 2 günlük polarizasyondan sonra, M1 / M2 makrofajları deney için kullanılabilir veya 7 güne kadar kültürde tutulabilir. Polarizasyonun uzunluğu esnektir ve gözlemlenen sonuçlara göre ayarlanabilir, ancak başarılı polarizasyon için minimum 2 gündür. Akış sitometrisi adımı yalnızca prosedür ayarlanırken gereklidir. Test düzgün bir şekilde çalıştığında ve tekrarlanan çalıştırmalar M1/M2 hücrelerini başarıyla karakterize ettiğinde, bu adımı atlamayı seçin. Elde edilen verim M1'in yaklaşık %90'ı (CD80+ CCR7+ CD209-) ve M2'nin %85'inin üzerinde (CD206+ CD209+, CD80-) olmalıdır. M1'ler CD209 veya CD206 için pozitif olabilir; bu normaldir, çünkü bu belirteçler M1'lerde zayıf bir şekilde ifade edilir, ancak yine de başarılı polarizasyonun göstergesidir. M2 makrofajları CD80 için her zaman negatif olmalıdır.

M-MA'da, makrofaj tabakası hazne kızağı üzerine dikkatlice yerleştirilmelidir. M1 / M2'nin tohumlama sayısı, gerekirse kuyu başına 250.000 hücre kadar azaltılabilir, ancak tipik olarak 400.000-500.000 arasında olmalıdır. Daha yüksek bir miktar, topaklanmaya ve yanlış okumalara neden olabilir. Odalara aspirasyon yaparken veya çözelti eklerken nazik olun; Pipetin ucu, zayıf yapışmış hücrelerden kaçınarak kuyucukların yalnızca bir köşesine temas etmelidir. Kuyuların kurumasını önlemek için, çözelti eklerken ve ortam alışverişi yaparken teknik üçlü olarak çalışın. Sürgünün ön tarafına asla dokunmayın; Makrofaj veya monosit kaybına neden olabilir. RhD + R2R2 RBC'ler, aktiviteyi sağlamak için FcyR aracılı fagositoz için pozitif bir kontrol olarak kullanılır. Pozitif kontrol için anti-D ile opsonizasyon için RhD + R2R2 RBC'leri kullanmamıza rağmen, herhangi bir RhD + RBC^{kullanılabilir 1,2}. Bu testte RBC'leri opsonize ederken uygun antikor konsantrasyonunu kullandığınızdan emin olun. Aşırı miktarlar, RBC topaklanmasına ve slaytların okunamamasına neden olur. Son olarak, slaytları birden fazla laboratuvar personelinin sayması önerilir. Mikroskop kullanılarak manuel niceleme, öznel olduğu için yanıltıcı olabilir, bu da farklı oda kuyuları ve deneyler arasındaki sayımlar arasında yüksek değişkenlik olduğunu düşündürür. Hücrelerin sayıldığı görüş alanındaki tutarlılık ve daha fazla sayıda hücrenin sayılması daha doğru sonuçlar elde edilmesini sağlayabilir.

Bu yöntemin sınırlamaları, fagositik indeksin ölçülmesinin öznel doğasını ve donör kanı arasındaki değişkenliği içerir. PBMC'ler, M1/M2 hücre kültürünü oluşturmak için donör buffy coats'larından ekstrakte edilir ve laboratuvardan elde edilen ön veriler, donöre bağlı olarak M1 ve M2 fagositik aktivitesinde önemli değişkenlik gösterir. Aynı antikor, bir donörden alınan M2 hücreleri ile diğerinden gelenlere kıyasla daha yüksek bir fagositik indeks üretebilir. Değişkenliği azaltmak ve tutarlılığı korumak için, havuzlanmış bir donör kaynağı oluşturmak faydalı olacaktır ve bu aynı zamanda MMA'da kullanılan RBC'ler için de geçerlidir. Tutarlı bir yöntemin sürdürülmesine rağmen, RBC/PBMC donör kanı arasında hafif bir değişkenlik her zaman var olacaktır.

Hem MMA hem de M-MA'nın önemli bir eleştirisi, monositlerin veya makrofajların ve bunlara karşılık gelen fagositozlu kırmızı kan hücrelerinin (RBC'ler) sayımındaki doğal öznelliktir. Yerleşik protokollere rağmen, mikroskop altında bireysel sayma tekniklerinde değişkenlik kaçınılmazdır. Bunu ele almak için, laboratuvar personelinin görüş alanında tutarlı bir başlangıç noktası tanımlamak veya sayım için numune boyutunu artırmak gibi standartlaştırılmış bir niceleme yaklaşımı oluşturması faydalı olacaktır. Bu tür önlemlerin uygulanması, hücre sayımlarının tutarlılığını ve doğruluğunu artıracak ve sonuçta daha güvenilir sonuçlara ve sonuçlara yol açacaktır.

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.

Bu çalışma, Toronto, ON'daki Kanada Kan Hizmetleri İnovasyon Merkezi tarafından desteklenmekte ve finanse edilmektedir. Araştırma, Toronto, ON'daki St. Michaels Hastanesi'ndeki Keenan Biyomedikal Bilimler Araştırma Merkezi'nde gerçekleştirilmektedir.