単球マクロファージアッセイを用いた赤血球抗体の意義の予測

私たちは、輸血医学および免疫学における赤血球同種抗体の臨床的関連性をより正確に予測するためにマクロファージを使用する既存の単球単層アッセイ(MMA)の機能強化と更新された方法を開発しました。このアッセイは、単球マクロファージアッセイ(M-MA)と呼ばれています。

骨髄の単球に由来するマクロファージは、死んだ細胞、破片、腫瘍細胞、および外来病原体の除去に大きな役割を果たす大きな自然免疫細胞です。単球とマクロファージの食作用能力は、あまり理解されていない概念です。ここでは、確立された単球単層アッセイ(MMA)の修正および更新バージョンを使用して、単球とマクロファージ、特にM1 / M2マクロファージのさまざまなオプソニン化赤血球に対する食作用の違いを調べることを目指しています。末梢血単核細胞(PBMC)は、ドナーのバフィーコートから単離されました。精製された単球を用いて、 in vitro 培養と分極により炎症性M1マクロファージと抗炎症性M2マクロファージを作製しました。M1/M2細胞を採取し、MMA様アッセイ(M-MAと呼ぶ)で使用することで、さまざまな赤血球抗体の臨床的に重要な食作用を解読しました。食作用指数(PI)>5は、単球の使用により臨床的に有意な食作用と見なされました。.食作用指数(PI)>12は、M1/M2マクロファージの使用により臨床的に有意な食作用と見なされました。M2マクロファージは、単球やM1と比較して、オプソニン化された赤血球をファゴサイト化する能力が高いことを示しています。同じ弱い抗体(抗S)は、M2マクロファージ(PI=43)のみで有意な食作用をもたらし、M1(PI=2)または単球(PI=0)では有意な食作用をもたらし、これはさまざまな抗体を用いて繰り返し実証されました。単球の代わりにM2マクロファージを使用すると、これらの細胞はより食作用性が高いため、より正確な結果が得られる可能性があり、アッセイへの臨床的関連性がさらに高まります。臨床的意義が知られている抗体を用いた単球マクロファージアッセイ(M-MA)の検証など、赤血球に対するさまざまな抗体を用いたさらなる研究により、M-MAが臨床的に重要な赤血球同種抗体および輸血反応の予測に役立つことが示される可能性がある。この方法は、輸血医学と免疫学の分野を進歩させます。

輸血医療の現場では、輸血反応の予測が依然として大きな課題となっています。過去40年間にわたり、Tong^{とBranchによって}開拓された単球単層アッセイ(MMA)^1,2は、輸^血患者1の溶血の臨床転帰を予測するための貴重なin vitro細胞アッセイとして機能してきました。実際、このアッセイは、臨床的に重要な赤血球(RBC)抗体と重要でない赤血球(RBC)抗体を区別するのに役立ちました²。このアッセイでは、従来から単球が標準的な白血球を使用してきましたが、私たちの研究は、単球由来のマクロファージを代替として使用することの潜在的な利点を探ることを目的としています。これらの細胞は、赤血球同種抗体の臨床的関連性を評価するアッセイの能力を高める可能性があります。

歴史的なMMAでは、有害な輸血反応中の赤血球のクリアランスと破壊に関与する免疫細胞であるマクロファージの前駆体である単球が、RBCおよび抗体1,2,3,4,5,6,7とともにin vitroアッセイに導入されます。.次に、単球内の食作用赤血球をカウントすることにより、食作用を視覚的に評価します。単球100個あたり<個の食作用赤血球が5個という食作用指数(PI)は、患者が有害な輸血反応を経験するリスクが低いことを示しており、抗体は臨床的に重要ではないと考えられています4,5,6,7。予備実験では、末梢血由来単球を使用することは、活性化された単球や特定のマクロファージよりも食作用能力が低いため、臨床的意義を決定するのに理想的ではない可能性があることが示されています。

単球は、血液、脾臓、骨髄に見られる細胞のサブセットであり、ヒトの全白血球の10%を占めています⁸。これらの細胞は通常、1〜2日間循環した後、さまざまな組織に動員され、そこでマクロ^{ファージ8}に分化します。これは通常、造血中に起こり、骨髄が単球を産生し、それが循環中に放出されて脾臓と肝臓に存在する組織マクロファージになります²。外来病原体に対する防御の最前線として知られるマクロファージは、適応免疫と自然免疫9の役割を果たす大きな食作用性単核細胞^です。免疫系の複雑で複雑な役割の中で、マクロファージの表現型を理解し、特徴づけることは、まだ完全には理解されていない手ごわい課題を提示しています。過去20年間で、マクロファージの分極という概念はますます認識され、最近の研究では、これらのマクロファージが存在するスペクトルを識別するためにシングルセルRNAシーケンシングの使用が採用されています。

古典的に活性化されたM1およびM1様マクロファージは、Toll様受容体(TLR)が優勢な炎症環境で発生します¹⁰。これらの細胞は、自己免疫疾患や動脈硬化に関与している可能性があり、MHC-II、CD80、CD86などの表面マーカーを提示する^11,12。抗炎症性M2およびM2様マクロファージは、Th2応答が優勢で、CD80の発現を欠いており、CD209やCD206などの表面マーカーが存在する環境に見られます^11,12。M1/M2マクロファージは、末梢血単核細胞からin vitroで培養することができ、リポ多糖(LPS)やGM-CSFやIFNγなどのサイトカイン(M1)、M-CSFやIL-4(M2)がそれらの分極を刺激します^10,12。

この原稿および関連する研究は、M2マクロファージがM1マクロファージおよび単球と比較して食作用に対する感度が高いことを実証することを目的としています。赤血球同種抗体および輸血医学の文脈で、M1/M2マクロファージと単球の食作用活性を調査することは、まだ探求されていない分野です。ここでは、M1/M2マクロファージの作製について現在進行中の研究について説明し、従来の単球単層アッセイ(MMA)と新規の単球マクロファージアッセイを比較し、このマクロファージアッセイと単球アッセイを区別し、 in vitro 食作用アッセイの予測値を向上させます。

この研究は、人間を対象とする倫理的研究を実施するための機関ガイドラインに準拠して行われました。倫理承認は、カナダ血液サービス研究倫理委員会 (REB) から付与され、承認 CBSREB#2023.008 されました。このプロトコルのすべてのステップは、無菌条件下でバイオセーフティキャビネット内で実施されます。

1. PBMCの分離

1. ACDチューブでドナーから全ヒトの血液を採取します。血液を室温(18°C〜22°C)で最大36時間保存します。
2. 全血ACDチューブを50 mL遠心分離チューブ(ACDチューブ2本につき50 mLチューブ1本)に移します。RPMI-1640 完全培地を室温で最終容量 35 mL まで加えます。
3. 15 mLの室温密度グラジエント培地を新しい50 mLチューブに加えます。希釈した全血を密度勾配培地の上に慎重に重ね、界面での混合を最小限に抑えて血液を最適に分離します。
4. ブレーキをオフにして、層状混合物を700 x g で30分間遠心分離します。密度勾配遠心分離では、混合物を上から下に、血漿、バフィーコート(PBMCを含む)、密度勾配材料、顆粒球、および赤血球に分離します。
5. 最上層(プラズマ)の大部分を吸引して廃棄します。トランスファーピペットを使用して、バフィーコート(PBMC)層を慎重に回収し、追加の材料を持ち込まないようにします。回収したPBMCを新しい50mLチューブに移します。
6. 分離されたバフィーコート層をpH 7.4 PBS溶液で1x、350 x g で10分間、フルブレーキをオンにして洗浄します。
7. 70 μMセルストレーナーを使用して、PBMCから破片や不要な物質を取り除き、15 mLのコニカルチューブに移します。フルブレーキをオンにした状態で、pH 7.4 PBS溶液を350 x g で10分間2回洗浄します。
8. オプション:キャリーオーバーされたRBCをACK溶解バッファーで溶解します。ペレットのサイズに応じて、5〜10 mLのACK溶解バッファーを添加し、室温で最大3分間インキュベートします。インキュベーション後、pH 7.4 PBSを補充し、フルブレーキをオンにして350 x g で10分間遠心分離し、1回洗浄します。RBC の数が多すぎる場合は、この手順を実行します。
   注:より良い結果を得るには、ACKの使用を避けることをお勧めします。あるいは、水を使用して水と15秒以内にインキュベートすることにより、非食作用赤血球を除去し、その後すぐに1X PBSを洗浄液に加えることもできます。
9. PBMCペレットをRPMI-1640完全培地の2〜3 mL(最初のACDチューブあたり0.5 mLを使用)に再構成します。トリパンブルーと1:1の混合物を調製した後、血球計算盤でPBMCをカウントします。トリパンブルーで染色されていない細胞のみをカウントします。PBMCをRPMI-1640完全培地で2 x 10⁶ 細胞/mLに再構成します。

2. M1/M2マクロファージの培養

1. 単球の0日目播種
   1. 各マクロファージ集団について25 mLの細胞培養フラスコを調製します。それぞれに5 mLのポリ-D-リジン(50 mg / 500 mL)を加え、フードに少なくとも1時間放置します。.フラスコをPBSですすいで、残留ポリ-D-リジンを取り除きます。
   2. 通常どおり、Buffyコートまたは患者サンプルからPBMCを分離します(ステップ1を参照)。PBMCのペレットが生成されたら、予熱したRPMI-1640完全培地10 mLに再懸濁します。
   3. 細胞番号を決定し、単球単離キットで単球単離を開始します。キットを実行するには、少なくとも 50 x 10⁶ セルを使用します。
   4. 細胞を50 x 10⁶ 細胞/mLで単離培地に再懸濁します。得られた細胞数に応じて、単球単離キットで推奨されている紫色(0.25-2mL)または灰色(0.5-8.5mL)の磁石を使用してください。
   5. キットの指示に従って、サンプルを必要なプロピレンチューブ(5 mLまたは14 mL)に加えます。濃縮カクテルを50 μL/mLのサンプルでサンプルに加えます。
   6. ピペで上下させるか、ボルテックスでサンプルを混合し、アイスバケツ内で2〜8°Cで10分間インキュベートします。その間、磁性粒子を30秒間渦巻きます。インキュベーション後、磁性粒子をサンプルに加えます:100 μL/mlのサンプル。
   7. ピペで上下またはボルテックスしてサンプルを混合し、2〜8°Cで5分間インキュベートします。分離培地を2.5 mLまたは10 mLに補充し、それに応じて段階的なピペットを使用します。ピペットを上下に2回〜3回動かして混ぜます。
   8. チューブ(蓋なし)を磁石に入れ、室温で2.5分間インキュベートします。磁石を手に取り、1回の連続動作で磁石とチューブを反転させ、細胞懸濁液を新しいチューブ(5mLまたは14mL)に注ぎます。
   9. 細胞をRPMI-1640培地に再懸濁し、カウントします。この手順はできるだけ早く行ってください。1 x 10⁶ – 5 x 10⁶ 6個の単球を、ポリ-D-リジンで事前にコーティングした各25 mLフラスコに播種します。必要に応じて、RPMI-1640で容量を5mLにします。
   10. 37°C、5%CO₂で少なくとも2時間インキュベートします。その間、M1とM2の分化培地を準備します。0日目(10 mL)と4日目(2 mL)の補充に十分な準備をします。
       注:M1分化媒体:RPMI-1640 + 2.5 ng/mL GM-CSF;M2分化媒体:RPMI-1640 + 50 ng/mL M-CSF。
   11. インキュベーション時間後、各フラスコをPBSで1回、完全なRPMI-1640で2回洗浄します。分化させる細胞の種類に応じて、各フラスコに10mLの分化培地を加えます。
   12. インキュベーター内で37°C、5%CO₂の6日間細胞を分化させます。蒸発のため、4日目に分化培地を補充します。
2. 4 日目 - チャージ
   1. 各分化培地2 mLをそれぞれのフラスコに加えます。 フラスコに直接メディウムを追加します。
3. 6日目 - マクロファージの分極
   1. M1およびM2偏光媒体を準備します。M1分極培地の場合は、対応するフラスコに加えるために5mLのM1分光培地を準備します。RPMI-1640の最終濃度は、50 ng/mL IFNγ、10 ng/mL LPS、および2.5 ng/mL GM-CSFである必要があります。最後のフラスコには15 mLの総容量があります(10 mLはすでに+ 5 mLが追加されます)、それに応じて計算を行います。
   2. M2偏光媒体の場合は、5 mLのM2偏光媒体を調製して、対応するフラスコに加えます。最終濃度は、RPMI-1640 で 20 ng/mL IL-4 および 50 ng/mL M-CSF である必要があります。最後のフラスコには15 mLの総容量があることに注意してください(すでに10 mLが入っています+ 5 mLが追加されます)。それに応じて計算を行います。
   3. 各フラスコに5 mLのM1またはM2偏光培地を加えます。マクロファージをインキュベーター内で37°C、5%CO₂のインキュベーター内で少なくとも2日間、4日以内分極させます。
4. 8 日目 - 収穫とフローサイトメトリー
   1. M1またはM2マクロファージを回収する前に、上清を1.5 mLチューブに集めて、さらに使用します(必要な場合)。1 mLの細胞剥離溶液をフラスコに加え、インキュベーターに37°C、5%CO₂ で5分間放置します。
   2. 反応を停止するには、3 mLの完全RPMI-1640を追加します。培地を15mLのチューブに集めます。3 mLの完全RPMI-1640をフラスコに加え、セルスクレーパーを使用してフラスコの底から細胞を剥離します。
   3. 15mLのチューブに細胞を採取します。フラスコを10倍の顕微鏡下に置き、細胞を観察して、フラスコの底に細胞が付着していないことを確認します。
   4. 細胞をPBS 2xで洗浄します。それらを完全なRPMI-1640に再懸濁し、血球計算盤を使用してカウントします。
   5. M1/M2マクロファージの品質と量を解析するには、フローサイトメトリーアッセイを実施します。チューブあたり0.5 x 10⁶ 細胞を使用し、次のように染色します:M1:CD80 + CCR7 + CD209-M2:CD206 + CD209 + CD80-。このアッセイで使用したゲーティング戦略:#1前方散乱光(FSC-A)対側散乱光(SSC-A)ドットプロット、#2前方散乱高さ(FSC-H)対前方散乱領域(FSC-A)ダブレット識別用のドットプロット、#3側方散乱図(SSC-A)対DAPI-A生細胞/死細胞識別用のドットプロット、#4側方散乱光(SSC-A)対単一パラメータドットプロットまたはヒストグラム(すなわち、 SSC-A 対 FITC-A)、#5 ダブル パラメーター ドット プロット (つまり、FITC-A 対 APC-A)。

3. M1/M2マクロファージを用いたMMA

1. M1/M2マクロファージを取得した後、血球計算盤を用いてトリパンブルーと1:1の染色比でカウントします。M1/M2をRPMI-1640完全培地で1 x 10⁶ 細胞/mLに再構成します。
2. マイクロピペットを使用して細胞懸濁液400 μL(400,000細胞)を8ウェルチャンバースライドの各ウェルに播種し、37°C、5%CO₂ で、完全に加湿した組織培養インキュベーターで少なくとも1.5時間インキュベートします。各テストは、最小限のトリプリケートウェルを使用して実行する必要があります。
3. 試験サンプルとRhD+ R2R2赤血球のオプソナイゼーション
   1. RhD+ R2R2 RBCをpH 7.4 PBSで3回洗浄し、毎回350 x g で5分間遠心分離します。R2R2 RhD+ RBCはD抗原密度が高いため、コントロールとして使用することを好みますが、任意のRhD+ RBCを代用することができます。目的の抗体を使用して、テスト用RBCサンプル(例:患者またはドナー)RBCをオプソナイズします。15 μLの充填RBCを300 μLの抗体混合物に加えて、5% RBC懸濁液を使用してください。15 μL の充填済み R2R2 RBC を 300 μL の Anti-D 抗体混合物 (100 ng/mL) に添加して、R2R2 RBC を Anti-D でオプソナイズします。
   2. 37°C、5%CO₂ で1時間インキュベートします。底部に沈殿した赤血球の断続的な再構成を行います(例:.、15分ごとに渦巻き)。オプソニン化RBCをpH 7.4 PBS 3xで3回、350 x g で毎回5分間遠心分離して洗浄します。
   3. RBCオプソニン化を確認するには、間接的な抗グロブリン試験(IAT)を実行します。一次オプソナイジング抗体に二次オプソナイジング抗ヒト抗体を添加します。赤血球の赤血球凝集または凝集は30秒以内に観察され、成功したオプソニン化と解釈できる¹³。
   4. 洗浄したオプソニン化RhD+ R2R2 RBCを1.25%(v / v)でRPMI-1640完全培地で再構成します。1,200 μL の培地から 15 μL の RBC を添加すると、ウェルあたり 1.25% (v/v) が得られます。
4. Fc受容体介在性食作用
   1. M1/M2マクロファージを1.5時間インキュベートした後、これらの細胞をチャンバースライドのウェルに付着させるために、上清培地を吸引し、ピペットチップがウェルの角にのみ触れるように穏やかな技術に従って廃棄します。マクロファージはウェルに付着する必要があります。ピペットの先端でウェルの中央に触れないでください。
   2. ウェルをpH 7.4 PBSで1回優しく洗浄します。適切な1.25%(v/v)オプソニン化RBC混合物400 μLをトリプリケートの各ウェルに加えます。37°C、5%CO₂ で2時間乱さずにインキュベートします。
   3. インキュベーション後、それぞれに100 mLのpH 7.4 PBSを入れたビーカーを2つ調製します。
   4. メーカーのアダプターを使用して8ウェルチャンバーを取り外します。スライドを湿らせたまま、ペーパータオルで余分なものを軽くたたきます。
   5. スライドを廃棄された上清と一緒にビーカーに沈め、ゆっくりと前後に動かして(20〜30ストローク)、残りの非食作用RBCを取り除きます。
   6. 次に、スライドを2番目のビーカーに沈め、さらに20〜30ストロークゆっくりと洗います。PBSからスライドを取り出し、ペーパータオルで余分な部分を軽くたたきます。チャンバーの前面には触れないでください。この時点で、スライドを水に1分間浸して、付着した非食作用のRBCを除去しますが、食作用のあるRBCと付着したRBCを区別できる場合は、必要ないかもしれません。
   7. スライドを100%メタノールに45秒間浸して固定し、その後風乾します。社内で用意した封入剤を使用してスライドを取り付け、カバースリップ(24 x 75 mm)を追加します。定量する前に一晩乾燥させてください。
5. 食作用の定量化
   1. 位相差顕微鏡、40倍対物レンズ、および手動セルカウンターを使用して、食作用を定量化します。
   2. 各手に1つずつ、2つの手動セルカウンターを使用して、1つのカウンターで貪食されたRBCをカウントし、もう1つのカウンターで単球/マクロファージの総数をカウントします。ウェルあたり300個の単球/マクロファージをカウントします。
   3. 食作用のある RBC の数をカウントされた単球の総数で割り、100 を掛けることにより、テストあたりの平均食作用指数 (PI) を計算します (トリプリケート間)。データを平均の PI ±標準誤差 (SEM) として表します。
      PI = (食作用赤血球 / 300 マクロファージ) x 100

図1の結果は文献と一致しており、マクロファージのM0状態からその後のM1/M2状態への分極が成功したことを示しています。M1およびM2マクロファージを8日間培養し(成長因子を添加して6日間、分極を2日間)、抗Dまたは抗kオプソニン化赤血球を試験しました(図2)。M2マクロファージは、抗D(コントロール)または抗kのいずれかによってオプソニン化されたRBCを持つM1と比較して、高い食作用指数を示します。この結果は、M-MAを使用して実施された他の予備試験と一致しています(表1を参照)。M2マクロファージは、強力なRBC抗体を用いても、M1マクロファージや単球と比較して食作用が強いです(図2B)。 表1は、臨床的に重要であると考えられる特異性を持つ4つの異なるRBC同種抗体の予備的な結果を示しています。抗原陽性赤血球をオプソニン化するために使用され、MMAの単球に添加された抗体は、弱い食作用を示します(PI < 5)。これらの同じ抗体をM1マクロファージに添加してオプソニン化した赤血球も、弱い食作用を示します(PI < 12)。M2マクロファージに同じ抗体を添加してオプソニン化した赤血球は、高い有意な食作用(PI > 12)を示し、これらのマクロファージが単球やM1と比較して臨床的意義をより正確に予測する能力を示しています。 観察された結果に基づいて、M2マクロファージの使用は、輸血医療におけるRBC抗体の臨床的意義をより予測できる可能性があると結論付けることができます。また、免疫学における現在の方法は、より正確な結果を提供し、臨床的関連性に変換される可能性があるため、この論文で示された方法に適応することが有用であると考えるかもしれません。ただし、特異性を持つRBC抗体と、その臨床的意義または非重要性を示す臨床データを用いて、MMAとM-MAを比較する研究がさらに必要です。

図1: M1/M2マクロファージの分極と特性評価。 (A) ドナーバフィーコートは、密度勾配分離を使用して末梢血単核細胞(PBMC)を抽出するために使用されます。次に、CD16+/CD14+単球をPBMCから単離し、2つの培養フラスコに入れて37°Cで6日間分化させ、4日目に補充します。分化培地:M1-GM-CSF(2.5 ng/mL)およびM2-M-CSF(50 ng/mL)。分極培地を144時間で対応する各フラスコに添加し、マクロファージを37°Cでさらに48時間分極させます。 分極媒体:M1 – IFN-γ(50 ng/mL)、LPS(10 ng/mL)、およびGM-CSF(2.5 ng/mL)。M2 – IL-4 (20 ng/mL) および M-CSF (50 ng/mL)。その後、細胞を回収して標識し、フローサイトメトリーによる特性評価を行ったり、食作用アッセイに使用したりできます(図2)。 (B) M1対M2マクロファージのin vitro形態。偏光の2日後に撮影された画像。A. M1マクロファージは、円形で円形の形態を示します。B. M2マクロファージは、明確で伸縮性があり、長い形態を持ち、どちらも分極が成功したことを示しています。 (C) CD80(M1)およびCD209(M2)によって特徴付けられるM1/M2マクロファージのフローサイトメトリー解析。M1/M2マクロファージを8日間培養し、CD80-FITCおよびCD209-PECy7で標識して、フローサイトメトリーを用いた特性評価を行いました。A. M1マクロファージは、CD80の発現が約86.1%、CD209の発現が0.17%です。B. M2マクロファージは、CD209の発現の97.3%、CD80の発現の0.003%を示します。 (D) M1/M2マクロファージ上のCD80およびCD209の蛍光シグナル。M1/M2マクロファージを8日間培養し、CD80-FITCまたはCD209-PECy7で標識して、フローサイトメトリーによる特性評価を行いました。ある。CD80の平均蛍光強度(MFI)は、M2よりもM1ではるかに高いです。CD209のMFIは、M1よりもM2の方がはるかに高くなっています 。この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

図2:単球マクロファージアッセイ(M-MA)(A)M1/M2sを成長因子で6日間培養し、次にサイトカインで2日間培養して分極させます。次に、M1/M2マクロファージをチャンバースライドに入れ、37°Cで2時間インキュベートします。RBCは、選択した抗体/血清を使用してオプソニン化され、15分ごとに断続的に混合しながら1時間インキュベートされます。オプソニン化したRBCをマクロファージが付着したチャンバースライドに入れ、37°Cで2時間インキュベートします。スライドはPBSで洗浄されます。細胞をメタノールを用いて固定し、フラバノールをマウントする。細胞は、位相差顕微鏡を使用して40倍でカウントされます。食作用指数(PI)は、300のマクロファージおよび対応する食作用赤血球を数えることによって計算される(B)M-MAは、抗Dおよび抗kを持つM1マクロファージとM2マクロファージを比較する。R2R2はRhD +血液を指します。K+k+ はヘテロ接合体の K+k+ 赤血球を指し、エラーバーは SD を示し、p 値が 0.05 の有意と見なされる t 検定<実施されました。(C)抗kでオプソニン化された赤血球は、M1によって貪食され、M-MAによってM2マクロファージと比較されます。写真は位相差顕微鏡を用いて40倍で撮影しました。ある。M1マクロファージは、抗kでオプソニン化されたRBCに対して食作用活性をほとんど示しません。b.M2マクロファージは、抗kでオプソニン化されたRBCに対して高い食作用活性を示します。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

テーブル 1.M2マクロファージの使用は、単球(MMA)と比較して、M-MAアッセイにおいて潜在的に臨床的に重要なRBC抗体をより予測できる可能性があります。

このメソッドを確実に成功させるためには、1)M1/M2分極の成功、2)マクロファージ層の生成とRhD+制御、3)食作用指数の定量化という重要なステップを踏む必要があります。私たちの方法では、細胞培養には単離された単球を使用することが定められていますが、PBMCを使用することもできますが、精製された単球を使用することをお勧めします。PBMCには様々な種類の細胞が含まれており、これらの細胞は複数の異なるサイトカインや媒介因子を分泌していることが知られています。これは、M1/M2マクロファージの分化または分極に影響を与える可能性があります。したがって、精製された単球を使用すると、より良い結果が得られます。 また、STEMCELL単球単離キットを使用すると、単球の約10%が元のPBMCの量から得られることを覚えておくことが重要です。50 x 10⁶ PBMCsが、約5 x10⁶ 単球を得るためのPBMCの最小開始数であることが観察されています。付着した単球でフラスコを洗うときは、細胞が剥がれないように、渦巻き状にやさしく洗ってください。インキュベーター内で蒸発が起こるため、培養の4日目に培地の補充ステップが必要です。M1/M2によって分泌されるサイトカインは分化に重要であるため、培地を捨てず、培地をフラスコに加えてください。2日間の分極後、M1/M2マクロファージは実験に使用したり、最大7日間培養しておくことができます。偏光の長さは柔軟性があり、観察された結果に基づいて調整できますが、偏光を成功させるには最短で2日です。フローサイトメトリーのステップは、手順を設定する場合にのみ必要です。アッセイが適切に実行され、反復分析でM1/M2細胞の特性評価が成功したら、このステップを省略することを選択します。得られる収率は、M1の約90%(CD80 + CCR7 + CD209-)およびM2(CD206 + CD209 + CD80-)の85%を超える必要があります。M1はCD209またはCD206に陽性である可能性があります。これらのマーカーはM1で弱く発現しているため、これは正常ですが、それでも分極が成功したことを示しています。M2マクロファージは、常にCD80に対して陰性であるべきです。

M-MAでは、マクロファージ層をチャンバースライド上に慎重に配置する必要があります。M1/M2の播種数は、必要に応じてウェルあたり最大250,000個の細胞に減らすことができますが、通常は400,000〜500,000の範囲である必要があります。量が多いと、凝集して読み取りが不正確になる可能性があります。チャンバーに溶液を吸引または追加するときは優しくしてください。ピペットの先端はウェルの角にのみ触れ、接着が弱い細胞を避けてください。ウェルの乾燥を避けるために、溶液の追加や培地の交換時には、技術的なトリプリケートで作業してください。スライドの前面には絶対に触れないでください。マクロファージや単球が失われる可能性があります。RhD+ R2R2 RBCは、FcγR媒介性食作用のポジティブコントロールとして使用され、活性を確保します。オプソニン化にはRhD+ R2R2 RBCを使用し、ポジティブコントロールには抗Dを使用していますが、任意のRhD+ RBCを使用できます^1,2。このアッセイでRBCをオプソニン処理する場合は、必ず適切な濃度の抗体を使用してください。量が多すぎると、RBCが凝集し、スライドが読み取れなくなります。最後に、複数のラボ担当者がスライドをカウントすることをお勧めします。顕微鏡を使用した手動定量は主観的であり、異なるチャンバーウェルと実験間のカウント間のばらつきが大きいことを示唆しているため、注意が必要な場合があります。細胞をカウントする視野の一貫性と、より多くの細胞をカウントすることで、より正確な結果が得られる可能性があります。

この方法の限界には、食作用指数の定量化の主観的な性質とドナー血液の変動性が含まれます。PBMCは、ドナーのバフィーコートから抽出してM1/M2細胞培養を確立しますが、ラボからの予備データでは、ドナーに応じてM1およびM2の食作用活性に大きなばらつきがあることが示されています。同じ抗体でも、あるドナーのM2細胞では、別のドナーのM2細胞に比べて高い食作用指数を産生する可能性があります。ばらつきを減らし、一貫性を維持するためには、プールされたドナーリソースを作成することが有益であり、これはMMAで使用されるRBCにも当てはまります。一貫した方法を維持しているにもかかわらず、RBC / PBMCドナー血液の間にはわずかなばらつきが常に存在します。

MMAとM-MAの両方に対する主要な批判は、単球またはマクロファージとそれらに対応する食作用赤血球(RBC)を数える際の固有の主観性です。プロトコルが確立されているにもかかわらず、顕微鏡下での個々の計数技術のばらつきは避けられません。これに対処するには、ラボの担当者が、視野内で一貫した開始点を定義したり、カウント用のサンプルサイズを増やしたりするなど、標準化された定量化アプローチを確立することが有益です。このような対策を実施することで、細胞数の一貫性と精度が向上し、最終的にはより信頼性の高い結果と結論が得られます。

著者は何も開示していません。

この研究は、オンタリオ州トロントのカナダ血液サービスイノベーションセンターによって支援され、資金提供されています。