Previsione del significato degli anticorpi dei globuli rossi utilizzando il test dei monociti-macrofagi

Abbiamo sviluppato miglioramenti e metodi aggiornati per l'attuale test monocita-monostrato (MMA), in cui i macrofagi vengono utilizzati per aiutare a prevedere meglio la rilevanza clinica degli alloanticorpi dei globuli rossi nella medicina trasfusionale e nell'immunologia. Questo test è chiamato test dei monociti-macrofagi (M-MA).

Derivati dai monociti nel midollo osseo, i macrofagi sono grandi cellule immunitarie innate che svolgono un ruolo importante nell'eliminazione delle cellule morte, dei detriti, delle cellule tumorali e dei patogeni estranei. La capacità fagocitaria dei monociti rispetto ai macrofagi è un concetto che non è ben compreso. Qui, miriamo a esaminare una differenza nella fagocitosi dei monociti rispetto ai macrofagi, in particolare dei macrofagi M1/M2, rispetto a vari globuli rossi opsonizzati utilizzando una versione modificata e aggiornata del test monostrato dei monociti (MMA). Le cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) sono state isolate dai buffy coat del donatore. Utilizzando monociti purificati, i macrofagi M1 infiammatori e M2 antinfiammatori sono stati prodotti mediante coltura e polarizzazione in vitro . Le cellule M1/M2 sono state raccolte e utilizzate in un test simile all'MMA, che chiamiamo M-MA, per decifrare la fagocitosi clinicamente significativa di vari anticorpi dei globuli rossi. Un indice fagocitario (PI) > 5 è stato ritenuto clinicamente significativo per la fagocitosi con l'uso di monociti. Un indice fagocitario (PI) > 12 è stato ritenuto clinicamente significativo per la fagocitosi con l'uso di macrofagi M1/M2. I macrofagi M2 dimostrano una maggiore capacità di fagocitare i globuli rossi opsonizzati rispetto ai monociti e agli M1. Lo stesso anticorpo debole (anti-S) produce una fagocitosi significativa con solo macrofagi M2 (PI=43) ma non M1 (PI=2) o monociti (PI=0), e questo è stato dimostrato ripetutamente utilizzando vari anticorpi. L'uso di macrofagi M2 al posto dei monociti può consentire risultati più accurati poiché queste cellule sono più fagocitiche, offrendo ulteriore rilevanza clinica al test. Ulteriori studi con diversi anticorpi contro i globuli rossi, inclusa la convalida del test dei monociti-macrofagi (M-MA) con anticorpi di significato clinico noto, potrebbero dimostrare che l'M-MA è più utile per aiutare a prevedere gli alloanticorpi dei globuli rossi clinicamente significativi e le reazioni trasfusionali. Questo metodo farà progredire il campo della medicina trasfusionale e dell'immunologia.

La previsione delle reazioni trasfusionali rimane una sfida significativa nel campo della medicina trasfusionale. Negli ultimi 4 decenni, il test monocita-monostrato (MMA), introdotto da Tong e Branch ^1,2, è stato un prezioso test cellulare in vitro per prevedere l'esito clinico dell'emolisi nei pazienti con trasfusione di sangue¹. In effetti, questo test è stato determinante per distinguere tra anticorpi dei globuli rossi (RBC) clinicamente significativi e insignificanti². Sebbene i monociti siano stati tradizionalmente i leucociti standard utilizzati in questo test, la nostra ricerca mira a esplorare i potenziali benefici dell'utilizzo di macrofagi derivati dai monociti come alternativa. Queste cellule possono migliorare la capacità dei saggi di valutare la rilevanza clinica degli alloanticorpi dei globuli rossi.

Nell'MMA storico, i monociti, che sono i precursori dei macrofagi, le cellule immunitarie responsabili della clearance e della distruzione dei globuli rossi durante una reazione trasfusionale avversa, vengono introdotti in un test in vitro insieme ai globuli rossi e agli anticorpi ^{1,2,3,4,5,6,7}. La fagocitosi viene quindi valutata visivamente contando i globuli rossi fagocitati all'interno dei monociti. Un indice fagocitario (PI) di < 5 globuli rossi fagocitati per 100 monociti contati indica che il paziente è a ridotto rischio di manifestare una reazione trasfusionale avversa e che l'anticorpo è considerato clinicamente insignificante 4,5,6,7. Esperimenti preliminari dimostrano che l'uso di monociti derivati dal sangue periferico potrebbe non essere l'ideale per determinare il significato clinico, in quanto hanno una capacità fagocitaria inferiore rispetto ai monociti attivati e ad alcuni macrofagi.

I monociti sono un sottoinsieme di cellule presenti nel sangue, nella milza e nel midollo osseo e rappresentano il 10% del totale dei leucociti nell'uomo⁸. Queste cellule in genere circolano per 1-2 giorni prima di essere reclutate da diversi tessuti, dove vanno a differenziarsi in macrofagi⁸. Questo accade tipicamente durante l'emopoiesi, in cui il midollo osseo produce monociti che vengono rilasciati in circolo per diventare macrofagi tissutali che risiedono nella milza e nel fegato². Conosciuti come la prima linea di difesa contro i patogeni estranei, i macrofagi sono grandi cellule mononucleate fagocitiche che svolgono un ruolo nell'immunità adattativa e innata⁹. Tra i ruoli intricati e complessi del sistema immunitario, la comprensione e la caratterizzazione dei fenotipi dei macrofagi rappresenta una sfida formidabile che deve ancora essere pienamente compresa. Negli ultimi due decenni, la nozione di polarizzazione dei macrofagi ha ottenuto un crescente riconoscimento, con studi recenti che impiegano l'uso del sequenziamento dell'RNA a singola cellula per discernere lo spettro in cui esistono questi macrofagi.

I macrofagi M1 e M1-like classicamente attivati insorgono in ambienti infiammatori dominati da recettori Toll-like (TLR)¹⁰. Queste cellule possono essere coinvolte nelle malattie autoimmuni e nell'arteriosclerosi e presentano marcatori di superficie come MHC-II, CD80 e CD86^11,12. I macrofagi antinfiammatori M2 e M2-like si trovano in ambienti dominati da risposte Th2, mancanza di espressione di CD80 e marcatori di superficie come CD209 e CD206^11,12. I macrofagi M1/M2 possono essere coltivati in vitro da cellule mononucleate del sangue periferico, con lipopolisaccaridi (LPS) e citochine come GM-CSF e IFNγ (M1) e M-CSF e IL-4 (M2) che ne stimolano la polarizzazione^10,12.

Questo manoscritto e gli studi associati mirano a dimostrare che i macrofagi M2 mostrano una maggiore sensibilità alla fagocitosi rispetto ai macrofagi M1 e ai monociti. Lo studio dell'attività fagocitaria dei macrofagi M1/M2 rispetto ai monociti nel contesto degli alloanticorpi dei globuli rossi e della medicina trasfusionale è un'area che deve ancora essere esplorata. Qui, descriviamo l'attuale lavoro in corso per la generazione di macrofagi M1/M2 e confrontiamo il classico saggio monostrato di monociti (MMA) con il nuovo saggio monocita-macrofagi, utilizzando l'acronimo M-MA per distinguere questo saggio di macrofagi dal saggio di monociti, per migliorare il valore predittivo dei saggi di fagocitosi in vitro .

Questa ricerca è stata condotta nel rispetto delle linee guida istituzionali per la conduzione di ricerche etiche che coinvolgono soggetti umani. L'approvazione etica è stata concessa dal Canadian Blood Services Research Ethics Board (REB), approvazione CBSREB#2023.008. Tutte le fasi di questo protocollo devono essere eseguite in una cabina di biosicurezza in condizioni sterili.

1. Isolamento delle PBMC

1. Ottenere sangue umano intero da un donatore in una provetta ACD. Conservare il sangue a temperatura ambiente (18 °C–22 °C) per un massimo di 36 ore.
2. Trasferire le provette ACD per sangue intero in provette da centrifuga da 50 mL (una singola provetta da 50 mL ogni due provette ACD). Aggiungere il terreno completo RPMI-1640 a temperatura ambiente a un volume finale di 35 mL.
3. Aggiungere 15 mL di terreno a gradiente di densità a temperatura ambiente a una nuova provetta da 50 mL. Sovrapporre con cura il sangue intero diluito sopra il mezzo del gradiente di densità, riducendo al minimo la miscelazione all'interfaccia per una separazione ottimale del sangue.
4. Centrifugare la miscela stratificata a 700 x g per 30 minuti con i freni spenti. La centrifugazione in gradiente di densità separerà la miscela nei seguenti strati dall'alto verso il basso: plasma, Buffy coat (contenente PBMC), materiale a gradiente di densità, granulociti e globuli rossi.
5. Aspirare e scartare la maggior parte dello strato superiore (plasma). Utilizzando una pipetta di trasferimento, recuperare con cura lo strato di buffy coat (PBMC), evitando di portare materiale aggiuntivo. Trasferire le PBMC recuperate in una nuova provetta da 50 mL.
6. Lavare lo strato isolato di buffy coat 1 volta con una soluzione di pH 7,4 PBS per 10 minuti a 350 x g con freni completamente attivi.
7. Utilizzare un filtro cellulare da 70 μM per eliminare detriti o materiale indesiderato dalle PBMC prima di trasferirle in una provetta conica da 15 mL. Lavare 2 volte con una soluzione di pH 7,4 PBS per 10 minuti a 350 x g con freni completamente attivi.
8. Opzionale: lisare i globuli rossi trasportati con il tampone di lisi ACK. Aggiungere 5-10 mL di tampone di lisi ACK, a seconda delle dimensioni del pellet, e incubare a temperatura ambiente per un massimo di 3 minuti. Dopo l'incubazione, rabboccare con pH 7,4 PBS e centrifugare per 10 minuti a 350 x g con freni completamente accesi e lavare 1 volta. Eseguire questo passaggio se il numero di globuli rossi è troppo elevato.
   NOTA: È sempre meglio evitare l'uso di ACK per ottenere risultati migliori. In alternativa, l'acqua può essere utilizzata per eliminare i globuli rossi non fagocitati incubando con acqua per non più di 15 secondi, quindi aggiungere immediatamente 1X PBS per il lavaggio.
9. Ricostituire il pellet PBMC in 2-3 mL (utilizzare 0,5 mL per provetta ACD iniziale) di terreno completo RPMI-1640. Contare le PBMC con un emocitometro dopo aver preparato una miscela 1:1 con blu di tripano. Conta solo le cellule non colorate con blu di tripano. Ricostituire le PBMC in 2 x 10⁶ cellule/mL in terreno completo RPMI-1640.

2. Coltura dei macrofagi M1/M2

1. Giorno 0 semina dei monociti
   1. Preparare un pallone di coltura cellulare da 25 ml per ciascuna popolazione di macrofagi. Aggiungere 5 mL di poli-D-lisina (50 mg/500 mL) a ciascuno e lasciarlo nella cappa per almeno 1 ora. Sciacquare il pallone con PBS per eliminare la poli-D-lisina residua.
   2. Isolare le PBMC dal Buffy coat o dai campioni dei pazienti, come di consueto (vedere il passaggio 1). Dopo aver generato un pellet di PBMC, risospenderlo in 10 mL di terreno completo RPMI-1640 preriscaldato.
   3. Determina il numero di cellule e inizia l'isolamento dei monociti con il kit di isolamento dei monociti. Per eseguire il kit, utilizzare almeno 50 x 10⁶ celle.
   4. Risospendere le cellule a 50 x 10⁶ cellule/mL in un mezzo di isolamento. A seconda del numero di cellule ottenuto, utilizzare il magnete viola (0,25-2 mL) o grigio (0,5-8,5 mL) consigliato nel kit di isolamento dei monociti.
   5. Seguire le istruzioni del kit e aggiungere il campione alla provetta di propilene richiesta (5 mL o 14 mL). Aggiungere il cocktail di arricchimento al campione a 50 μL/mL di campione.
   6. Pipettare su e giù o vortice per mescolare il campione e quindi incubare a 2-8 °C per 10 minuti in un secchiello per il ghiaccio. Nel frattempo, vortice particelle magnetiche per 30 s. Dopo l'incubazione, aggiungere particelle magnetiche al campione: 100 μL/ml di campione.
   7. Pipettare su e giù o vortice per mescolare il campione e quindi incubare a 2-8 °C per 5 minuti. Rabboccare con il mezzo isolante a 2,5 mL o 10 mL, utilizzando una pipetta graduata. Pipettare su e giù 2x-3x per mescolare.
   8. Posizionare la provetta (senza coperchio) nel magnete e incubare a temperatura ambiente per 2,5 minuti. Sollevare il magnete e, con un movimento continuo, capovolgere il magnete e il tubo, versando la sospensione cellulare in un nuovo tubo, da 5 mL o 14 mL.
   9. Risospendere le celle nel terreno RPMI-1640 e contarle. Esegui questo passaggio il prima possibile. Seminare tra 1 x 10⁶ – 5 x 10⁶ monociti in ogni pallone da 25 ml precedentemente prerivestito con poli-D-lisina. Portare il volume a 5 mL con RPMI-1640, se necessario.
   10. Incubare a 37 °C, 5% CO₂, per almeno 2 ore. Nel frattempo, preparare i mezzi di differenziazione M1 e M2. Preparare a sufficienza per il rabbocco del Giorno 0 (10 ml) e del Giorno 4 (2 ml).
       NOTA: Mezzo di differenziazione M1: RPMI-1640 + 2,5 ng/mL GM-CSF; Mezzo di differenziazione M2: RPMI-1640 + 50 ng/mL M-CSF.
   11. Trascorso il tempo di incubazione, lavare ogni pallone 1 volta con PBS e 2 volte con RPMI-1640 completo. Aggiungere 10 mL di terreno di differenziazione a ciascun pallone in base al tipo di cellula da differenziare.
   12. Lasciare differenziare le cellule per 6 giorni nell'incubatore a 37 °C, 5% CO₂. A causa dell'evaporazione, rabboccare con mezzo di differenziazione il giorno 4.
2. Giorno 4 - Ricarica
   1. Aggiungere 2 mL di ciascun mezzo di differenziazione al rispettivo pallone. Aggiungere il terreno direttamente al pallone.
3. Giorno 6 - Polarizzazione dei macrofagi
   1. Preparare i mezzi di polarizzazione M1 e M2. Per i mezzi di polarizzazione M1, preparare 5 mL di mezzo di polarizzazione M1 da aggiungere al pallone corrispondente. Le concentrazioni finali dovrebbero essere di 50 ng/mL di IFNγ, 10 ng/mL di LPS e 2,5 ng/mL GM-CSF in RPMI-1640. Il pallone alla fine avrà 15 mL di volume totale (10 mL già in + 5 mL da aggiungere), fare i calcoli di conseguenza.
   2. Per i mezzi di polarizzazione M2, preparare 5 mL di mezzo di polarizzazione M2 da aggiungere al pallone corrispondente. Le concentrazioni finali dovrebbero essere di 20 ng/mL di IL-4 e 50 ng/mL M-CSF in RPMI-1640. Si noti che il pallone alla fine avrà 15 mL di volume totale (10 mL già in + 5 mL da aggiungere); Esegui i calcoli di conseguenza.
   3. Aggiungere 5 mL di terreno di polarizzazione M1 o M2 a ciascun pallone. Lasciare polarizzare i macrofagi per almeno 2 giorni e non più di 4 giorni nell'incubatore a 37 °C, 5% CO₂.
4. Giorno 8 - Prelievo e citometria a flusso
   1. Prima di raccogliere i macrofagi M1 o M2, raccogliere il surnatante in provette da 1,5 mL per un ulteriore utilizzo (se necessario). Aggiungere 1 mL di soluzione per il distacco cellulare al pallone e lasciarlo nell'incubatore a 37 °C, 5% CO₂ per 5 min.
   2. Per fermare la reazione, aggiungere 3 ml di RPMI-1640 completo. Raccogliere il terreno in una provetta da 15 mL. Aggiungere 3 mL di RPMI-1640 completo al pallone e utilizzare un raschietto per staccare le cellule dal fondo del pallone.
   3. Raccogliere le cellule in una provetta da 15 mL. Posizionare il pallone sotto il microscopio a 10x e osservare le cellule per assicurarsi che non ci siano altre cellule attaccate al fondo del pallone.
   4. Lavare le celle in PBS 2x. Risospenderli in RPMI-1640 completo e contare utilizzando l'emocitometro.
   5. Per analizzare la qualità e la quantità dei macrofagi M1/M2, eseguire un test di citometria a flusso. Utilizzare 0,5 x 10⁶ cellule per provetta e colorare come segue: M1: CD80+ CCR7+ CD209- M2: CD206+ CD209+ CD80-. Strategia di gating utilizzata in questo saggio: #1 Forward Scatter (FSC-A) vs. Side Scatter (SSC-A) Dot Plot, #2 Forward Scatter Height (FSC-H) vs. Forward Scatter Area (FSC-A) Dot Plot per la discriminazione del doppietto, #3 Side Scatter (SSC-A) vs. DAPI-A Dot Plot per la discriminazione delle cellule vive/morte, #4 Side Scatter (SSC-A) vs. Dot Plot o istogramma a parametro singolo (ad es. SSC-A vs. FITC-A), #5 Dot Plot a doppio parametro (ad esempio, FITC-A vs. APC-A).

3. MMA con macrofagi M1/M2

1. Dopo aver ottenuto i macrofagi M1/M2, contarli utilizzando un emocitometro in un rapporto di colorazione 1:1 con blu di tripano. Ricostituire M1/M2 in 1 x 10⁶ cellule/mL in terreno completo RPMI-1640.
2. Seminare 400 μl (400.000 cellule) di sospensione cellulare utilizzando una micropipetta in ciascun pozzetto del vetrino della camera a 8 pozzetti e incubare a 37 °C, 5% CO₂ per almeno 1,5 ore in un incubatore per colture tissutali completamente umidificato. Ogni test deve essere eseguito utilizzando un minimo di pozzetti triplicati.
3. Opsonizzazione di campioni di analisi e globuli rossi RhD+ R2R2
   1. Lavare i globuli rossi RhD+ R2R2 a pH 7,4 PBS 3 volte centrifugando a 350 x g per 5 minuti ogni volta. Preferiamo utilizzare i globrossi R2R2 RhD+ come controllo a causa della maggiore densità dell'antigene D, ma qualsiasi batteriocarburo RhD+ potrebbe essere sostituito. Opsonizzare il campione di globuli rossi in esame (ad esempio, paziente o donatore) utilizzando gli anticorpi di interesse. Utilizzare una sospensione di globuli rossi al 5% aggiungendo 15 μl di globuli rossi impaccati a 300 μl di miscela di anticorpi. Opsonizzare i globuli rossi R2R2 con Anti-D aggiungendo 15 μL di globuli rossi R2R2 impaccati a 300 μL di miscela di anticorpi Anti-D (100 ng/mL).
   2. Incubare a 37 °C, 5% CO₂ per 1 ora. Effettuare la ricostituzione intermittente dei globuli rossi depositati sul fondo (ad esempio, vortice ogni 15 minuti). Lavare i globuli rossi opsonizzati con pH 7,4 PBS 3x mediante centrifugazione a 350 x g per 5 minuti ogni volta.
   3. Per verificare l'opsonizzazione dei globuli rossi, eseguire un test indiretto dell'antiglobulina (IAT). Aggiungere un anticorpo anti-umano opsonante secondario all'anticorpo opsonante primario. L'emoagglutinazione o l'aggregazione dei globuli rossi può essere osservata entro 30 s e interpretata come un'opsonizzazione riuscita¹³.
   4. Ricostituire i globuli rossi RhD+ R2R2 opsonizzati lavati all'1,25% (v/v) con terreno completo RPMI-1640. Aggiungere 1.200 μl di terreno a 15 μl di globuli rossi per ottenere l'1,25% (v/v) per pozzetto.
4. Fagocitosi mediata dal recettore Fc
   1. Dopo l'incubazione di 1,5 ore dei macrofagi M1/M2, per consentire a queste cellule di aderire ai pozzetti del vetrino della camera, aspirare il terreno surnatante e gettarlo, seguendo una tecnica delicata, assicurandosi che la punta della pipetta tocchi solo l'angolo dei pozzetti. I macrofagi devono essere fatti aderire ai pozzetti. Evitare di toccare il centro dei pozzetti con la punta della pipetta.
   2. Lavare delicatamente i pozzetti 1 volta con pH 7,4 PBS. Aggiungere 400 μl della miscela appropriata di globuli rossi opsonizzati all'1,25% (v/v) in ciascun pozzetto del triplicato. Incubare a 37 °C, 5% CO₂ per 2 ore indisturbato.
   3. Dopo l'incubazione, preparare due becher con 100 mL di pH 7,4 PBS ciascuno.
   4. Rimuovere le camere a 8 pozzetti utilizzando gli adattatori del produttore. Tamponare l'eccesso su un tovagliolo di carta mantenendo umidi i vetrini.
   5. Immergere il vetrino nel becher con i surnatanti scartati e lavarlo muovendolo avanti e indietro lentamente (20-30 colpi) per rimuovere eventuali globuli rossi non fagocitati.
   6. Quindi immergere il vetrino nel secondo bicchiere e lavare lentamente per altri 20-30 colpi. Rimuovere il vetrino dal PBS e tamponare l'eccesso su un tovagliolo di carta. Evitare di toccare la parte anteriore delle camere. A questo punto, immergere il vetrino in acqua per 1 minuto per rimuovere eventuali globuli rossi aderenti e non fagocitati, ma potrebbe non essere necessario se si riesce a distinguere i globuli rossi fagocitati da quelli aderenti. Asciugare all'aria.
   7. Immergere i vetrini in metanolo al 100% per 45 s per fissarli, quindi asciugare all'aria. Montare la slitta utilizzando un mezzo di montaggio preparato internamente e aggiungere i vetrini coprioggetti (24 x 75 mm). Lasciarlo asciugare per una notte prima della quantificazione.
5. Quantificazione della fagocitosi
   1. Utilizzando un microscopio a contrasto di fase, una lente obiettivo 40x e un contatore di cellule manuale, quantificare la fagocitosi.
   2. Con l'aiuto di due contatori di cellule manuali, uno per mano, contare i globuli rossi fagocitati con un contatore e il numero totale di monociti/macrofagi con l'altro. Contare 300 monociti/macrofagi per pozzetto.
   3. Calcolare l'indice fagocitario medio (PI) per test (in triplicati) dividendo il numero di globuli rossi fagocitati per il numero di monociti totali contati e moltiplicando per 100. Esprimere i dati come PI medio ± errore standard della media (SEM).
      PI = (globuli rossi fagocitati / 300 macrofagi) x 100

I risultati della Figura 1 sono coerenti con la letteratura e indicano una polarizzazione riuscita dei macrofagi dal loro stato M0 al loro successivo stato M1/M2. I macrofagi M1 e M2 sono stati coltivati per 8 giorni (6 giorni con fattori di crescita e 2 giorni di polarizzazione) e sono stati testati globuli rossi opsonizzati anti-D o anti-k (Figura 2). I macrofagi M2 dimostrano un alto indice fagocitario rispetto agli M1 con globuli rossi opsonizzati da anti-D (controllo) o anti-k. Questo risultato è coerente con altri test preliminari eseguiti utilizzando M-MA (vedi Tabella 1). I macrofagi M2 sono altamente fagocitici rispetto ai macrofagi M1 o ai monociti, anche con forti anticorpi RBC (Figura 2B). La Tabella 1 mostra i risultati preliminari con 4 diversi alloanticorpi dei globuli rossi aventi specificità considerate clinicamente significative. Gli anticorpi utilizzati per opsonizzare i globuli rossi antigene-positivi e aggiunti ai monociti nell'MMA mostrano una debole fagocitosi (PI < 5). I globuli rossi opsonizzati con questi stessi anticorpi aggiunti ai macrofagi M1 mostrano anche una debole fagocitosi (PI < 12). I globuli rossi opsonizzati con gli stessi anticorpi aggiunti ai macrofagi M2 mostrano un'elevata e significativa fagocitosi (PI > 12), dimostrando la capacità di questi macrofagi di prevedere forse meglio il significato clinico rispetto ai monociti e agli M1.  Sulla base dei risultati osservati, possiamo concludere che l'uso dei macrofagi M2 può essere più predittivo del significato clinico degli anticorpi dei globuli rossi nella medicina trasfusionale. Inoltre, gli attuali metodi in immunologia possono trovare utile adattarsi ai metodi mostrati in questo documento in quanto offrono risultati più accurati e possono tradursi in rilevanza clinica. Tuttavia, sono necessari ulteriori studi che esaminino gli anticorpi dei globuli rossi con specificità e dati clinici che indichino il loro significato clinico o insignificante, confrontando l'MMA con l'M-MA.

Figura 1: Polarizzazione e caratterizzazione dei macrofagi M1/M2. (A) Un buffy coat del donatore viene utilizzato per estrarre le cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) utilizzando la separazione a gradiente di densità. I monociti CD16+/CD14+ vengono quindi isolati dalle PBMC e posti in due fiasche di coltura per differenziare a 37 °C per 6 giorni, con un rabbocco il giorno 4. Mezzi di differenziazione: M1- GM-CSF (2,5 ng/mL) e M2- M-CSF (50 ng/mL). Il mezzo di polarizzazione viene aggiunto a ciascun pallone corrispondente a 144 ore e i macrofagi vengono lasciati polarizzare per altre 48 ore a 37 °C. Mezzi di polarizzazione: M1 – IFN-gamma (50 ng/mL), LPS (10 ng/mL) e GM-CSF (2,5 ng/mL). M2 – IL-4 (20 ng/mL) e M-CSF (50 ng/mL). Le cellule possono quindi essere raccolte ed etichettate per la caratterizzazione mediante citometria a flusso o utilizzate in un test di fagocitosi (Figura 2). (B) Morfologia dei macrofagi M1 vs M2 in vitro. Immagini scattate 2 giorni dopo la polarizzazione. A. I macrofagi M1 presentano una morfologia rotonda e circolare. B. I macrofagi M2 hanno una morfologia distinta, elastica e lunga, entrambi indicativi di una polarizzazione riuscita. (C) Analisi citofluorimetrica di macrofagi M1/M2 caratterizzati da CD80(M1) e CD209(M2). I macrofagi M1/M2 sono stati coltivati per 8 giorni e marcati con CD80-FITC e CD209-PECy7 per la caratterizzazione mediante citometria a flusso. A. I macrofagi M1 mostrano circa l'86,1% di espressione di CD80 e lo 0,17% di espressione di CD209. B. I macrofagi M2 mostrano il 97,3% dell'espressione di CD209 e lo 0,003% dell'espressione di CD80. (D) Segnale fluorescente di CD80 e CD209 su macrofagi M1/M2. I macrofagi M1/M2 sono stati coltivati per 8 giorni e marcati con CD80-FITC o CD209-PECy7 per la caratterizzazione mediante citometria a flusso. Un. L'intensità media della fluorescenza (MFI) di CD80 è molto più alta su M1s, rispetto a M2s. B. L'MFI di CD209 è molto più alto su M2s che su M1s. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Saggio dei monociti-macrofagi (M-MA). (A) Gli M1/M2 vengono coltivati per 6 giorni con fattori di crescita e poi 2 giorni con citochine per polarizzarli. I macrofagi M1/M2 vengono quindi posti in vetrini da camera e incubati a 37 °C per 2 ore. I globuli rossi vengono opsonizzati utilizzando l'anticorpo/siero di scelta e incubati per 1 ora con miscelazione intermittente ogni 15 minuti. I globuli rossi opsonizzati vengono posti in vetrini da camera con macrofagi attaccati e incubati indisturbati per 2 ore a 37 °C. Le diapositive vengono lavate in PBS; Le cellule sono fissate utilizzando metanolo e montate con flavanolo. Le cellule vengono contate utilizzando la microscopia a contrasto di fase a 40x. L'indice fagocitario (PI) è calcolato contando 300 macrofagi e i corrispondenti globuli rossi fagocitati. (B) M-MA confrontando i macrofagi M1 vs M2 con anti-D e anti-k. R2R2 si riferisce al sangue RhD+. K+k+ si riferisce ai globuli rossi eterozigoti K+k+. Le barre di errore indicano SD ed è stato eseguito un test t con un valore p < 0,05 ritenuto significativo. (C) Globuli rossi opsonizzati con anti-k fagocitati da M1 rispetto ai macrofagi M2 da M-MA. Le immagini sono state scattate a 40x utilizzando la microscopia a contrasto di fase. un. I macrofagi M1 mostrano poca attività fagocitaria con globuli rossi opsonizzati con anti-k. b. I macrofagi M2 mostrano un'elevata attività fagocitaria con globuli rossi opsonizzati con anti-k. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 1. L'uso di macrofagi M2 può essere più predittivo di anticorpi globuli rossi potenzialmente clinicamente significativi nel test M-MA rispetto ai monociti (MMA).

Per garantire il successo del metodo, è necessario attenersi ai seguenti passaggi critici: 1) polarizzazione M1/M2 riuscita, 2) generazione dello strato macrofagico e controllo RhD+ 3) quantificazione dell'indice fagocitico. Mentre i nostri metodi dichiarano di utilizzare monociti isolati per la coltura cellulare, le PBMC possono essere utilizzate, ma si consiglia di utilizzare monociti purificati. È noto che le PBMC contengono vari tipi di cellule, con queste cellule che secernono più citochine diverse e fattori mediatori. Ciò può avere un impatto sulla differenziazione o polarizzazione dei macrofagi M1/M2; Pertanto, l'uso di monociti purificati produrrà risultati migliori.  Inoltre, è importante ricordare che circa il 10% dei monociti sarà ottenuto dalla quantità originale di PBMC quando si utilizza il kit di isolamento dei monociti STEMCELL. È stato osservato che 50 x 10⁶ PBMC è il numero minimo di PBMC per ottenere circa 5 x10⁶ monociti. Quando si lava il matraccio con i monociti aderiti, assicurarsi di lavare delicatamente con un movimento vorticoso per evitare il distacco delle cellule. A causa dell'evaporazione che si verifica nell'incubatore, è necessario eseguire la fase di rabbocco del terreno il giorno 4 della coltura. Evitare di scartare qualsiasi terreno e aggiungere il terreno al pallone, poiché le citochine secrete dalle M1/M2 sono importanti per la differenziazione. Dopo la polarizzazione di 2 giorni, i macrofagi M1/M2 possono essere utilizzati per la sperimentazione o conservati in coltura per un massimo di 7 giorni. La lunghezza della polarizzazione è flessibile e può essere regolata in base ai risultati osservati, ma 2 giorni è il minimo per una polarizzazione di successo. La fase di citometria a flusso è necessaria solo durante l'impostazione della procedura. Una volta che il test è stato eseguito correttamente e le ripetute esecuzioni hanno caratterizzato con successo le cellule M1/M2, scegliere di omettere questo passaggio. La resa ottenuta dovrebbe essere intorno al 90% di M1 (CD80+, CCR7+, CD209-) e superiore all'85% di M2 (CD206+, CD209+, CD80-). M1s può essere positivo per CD209 o CD206; questo è normale in quanto questi marcatori sono debolmente espressi su M1 ma sono comunque indicativi di una polarizzazione riuscita. I macrofagi M2 dovrebbero essere sempre negativi per CD80.

Nell'M-MA, lo strato di macrofagi deve essere posizionato con cura sul vetrino della camera. Il numero di semina di M1/M2 può essere ridotto fino a 250.000 cellule per pozzetto, se necessario, ma in genere dovrebbe variare da 400.000 a 500.000. Una quantità maggiore può causare aggregazione e letture imprecise. Essere delicati quando si aspira o si aggiungono soluzioni alle camere; La punta della pipetta deve toccare solo un angolo dei pozzetti, evitando le cellule debolmente aderenti. Per evitare di asciugare i pozzetti, lavorare in triplice copia tecnica quando si aggiungono soluzioni e si scambiano i mezzi. Non toccare mai la parte anteriore del carrello; Può provocare la perdita di macrofagi o monociti. I globuli rossi RhD+ R2R2 sono utilizzati come controllo positivo per la fagocitosi mediata da FcγR per garantire l'attività. Sebbene utilizziamo i globuli rossi RhD+ R2R2 per l'opsonizzazione con anti-D per il controllo positivo, qualsiasi reparti rossi RhD+ può essere utilizzato ^1,2. Assicurarsi di utilizzare la concentrazione appropriata di anticorpi quando si opsonizzano i globuli rossi in questo test. Quantità eccessive provocheranno l'aggregazione di globuli rossi e l'impossibilità di leggere i vetrini. Infine, si raccomanda che più di un membro del personale di laboratorio conti i vetrini. La quantificazione manuale con il microscopio può essere complicata in quanto è soggettiva, suggerendo un'elevata variabilità tra i conteggi tra i diversi pozzetti della camera e gli esperimenti. La coerenza nel campo visivo in cui vengono contate le celle e il conteggio di un numero maggiore di celle possono consentire risultati più accurati.

I limiti di questo metodo includono la natura soggettiva della quantificazione dell'indice fagocitario e la variabilità tra il sangue del donatore. Le PBMC vengono estratte dai buffy coat del donatore per stabilire la coltura cellulare M1/M2 e i dati preliminari del laboratorio mostrano una significativa variabilità nell'attività fagocitaria M1 e M2 a seconda del donatore. Lo stesso anticorpo potrebbe produrre un indice fagocitario più elevato con le cellule M2 di un donatore rispetto a quelle di un altro. Per ridurre la variabilità e mantenere la coerenza, la creazione di una risorsa di donatori aggregata sarebbe vantaggiosa, e questo vale anche per i globuli rossi utilizzati nell'MMA. Nonostante mantenga un metodo coerente, esisterà sempre una leggera variabilità tra il sangue del donatore di globuli rossi e PBMC.

Una delle principali critiche sia all'MMA che all'M-MA è la soggettività intrinseca nel conteggio dei monociti o dei macrofagi e dei loro corrispondenti globuli rossi fagocitati (RBC). Nonostante i protocolli stabiliti, la variabilità delle singole tecniche di conteggio al microscopio è inevitabile. Per risolvere questo problema, sarebbe utile per il personale di laboratorio stabilire un approccio di quantificazione standardizzato, come la definizione di un punto di partenza coerente nel campo visivo o l'aumento della dimensione del campione per il conteggio. L'attuazione di tali misure migliorerebbe la coerenza e l'accuratezza della conta cellulare, portando in ultima analisi a risultati e conclusioni più affidabili.

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Questo lavoro è supportato e finanziato dal Canadian Blood Services Centre for Innovation di Toronto, ON. La ricerca viene eseguita presso il Keenan Research Centre for Biomedical Sciences presso il St. Michaels Hospital di Toronto, ON.