Authors
Contact Us

Sign In

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

لقد قمنا بتطوير تحسينات وطرق محدثة لمقايسة الخلية الأحادية أحادية الطبقة الحالية (MMA) ، حيث يتم استخدام البلاعم للمساعدة في التنبؤ بشكل أفضل بالأهمية السريرية للأجسام المضادة للخلايا الحمراء في طب نقل الدم وعلم المناعة. يسمى هذا الاختبار مقايسة البلاعم الأحادية (M-MA).

Abstract

مشتقة من الخلايا الوحيدة في نخاع العظام ، البلاعم هي خلايا مناعية فطرية كبيرة تلعب دورا رئيسيا في إزالة الخلايا الميتة والحطام والخلايا السرطانية ومسببات الأمراض الغريبة. القدرة البلعمية للخلايا الوحيدة مقابل الضامة هي مفهوم غير مفهوم جيدا. هنا ، نهدف إلى فحص الاختلاف في البلعمة في الخلايا الوحيدة مقابل الضامة ، وتحديدا الضامة M1 / M2 ، مقابل العديد من الخلايا الحمراء المضادة باستخدام نسخة معدلة ومحدثة من مقايسة أحادية الطبقة أحادية الخلية (MMA). تم عزل خلايا الدم المحيطية أحادية النواة (PBMCs) من معاطف المتبرع. باستخدام الخلايا الوحيدة المنقاة ، تم إنتاج البلاعم M1 الالتهابية وM2 المضادة للالتهابات عن طريق الثقافة في المختبر والاستقطاب. تم حصاد خلايا M1 / M2 واستخدامها في اختبار يشبه MMA ، والذي نشير إليه باسم M-MA ، لفك شفرة البلعمة المهمة سريريا لمختلف الأجسام المضادة للخلايا الحمراء. تم اعتبار مؤشر البلعمة (PI) > 5 بلعمة ذات أهمية سريرية باستخدام الخلايا الوحيدة. تم اعتبار مؤشر البلعمة (PI) > 12 بلعمة ذات أهمية سريرية باستخدام البلاعم M1 / M2. تظهر البلاعم M2 قدرة متزايدة على كرات الدم الحمراء البلعمة مقارنة بالخلايا الوحيدة و M1s. ينتج عن نفس الجسم المضاد الضعيف (anti-S) بلعمة كبيرة مع البلاعم M2 فقط (PI = 43) ولكن ليس M1s (PI = 2) أو الخلايا الوحيدة (PI = 0) ، وقد تم إثبات ذلك مرارا وتكرارا باستخدام أجسام مضادة مختلفة. قد يسمح استخدام البلاعم M2 بدلا من الخلايا الوحيدة بنتائج أكثر دقة لأن هذه الخلايا أكثر بلعمة ، مما يوفر مزيدا من الأهمية السريرية للمقايس. قد تظهر الدراسات الإضافية التي أجريت على أجسام مضادة مختلفة لخلايا الدم الحمراء ، بما في ذلك التحقق من صحة مقايسة الخلية الوحيدة والبلاعم (M-MA) مع الأجسام المضادة ذات الأهمية السريرية المعروفة ، أن M-MA أكثر فائدة للمساعدة في التنبؤ بالأجسام المضادة للخلايا الحمراء المهمة سريريا وتفاعلات نقل الدم. ستعمل هذه الطريقة على تطوير مجال طب نقل الدم وعلم المناعة.

Introduction

لا يزال التنبؤ بتفاعلات نقل الدم يمثل تحديا كبيرا في مجال طب نقل الدم. على مدى العقود الأربعة الماضية ، كان اختبار الخلية الأحادية أحادية الطبقة (MMA) ، الذي ابتكره Tong و Branch1،2 ، بمثابة اختبار خلوي قيم في المختبر للتنبؤ بالنتيجة السريرية لانحلال الدم في مرضى نقل الدم1. في الواقع ، كان لهذا الاختبار مفيدا في التمييز بين الأجسام المضادة لخلايا الدم الحمراء (RBC) المهمة سريريا وغير المهمة2. في حين أن الخلايا الوحيدة كانت تقليديا الكريات البيض القياسية المستخدمة في هذا الاختبار ، يهدف بحثنا إلى استكشاف الفوائد المحتملة لاستخدام البلاعم المشتقة من الخلايا الأحادية كبديل. قد تعزز هذه الخلايا قدرة المقايسات على تقييم الأهمية السريرية للأجسام المضادة للخلايا الحمراء.

في MMA التاريخي ، يتم إدخال الخلايا الوحيدة ، وهي سلائف الضامة ، وهي الخلايا المناعية المسؤولة عن إزالة وتدمير خلايا الدم الحمراء أثناء تفاعل نقل الدم الضار ، في اختبار في المختبر جنبا إلى جنب مع كرات الدم الحمراء والأجسامالمضادة 1،2،3،4،5،6،7. ثم يتم تقييم البلعمة بصريا عن طريق حساب كرات الدم الحمراء البلعمة داخل الخلايا الوحيدة. يشير مؤشر البلعمة (PI) البالغ < 5 كرات الدم الحمراء البلعمية لكل 100 خلية وحيدة تم إحصاؤها إلى أن المريض معرض لخطر أقل للإصابة برد فعل سلبي لنقل الدم ، ويعتبر الجسم المضاد غير مهمسريريا 4،5،6،7. تظهر التجارب الأولية أن استخدام الخلايا الوحيدة المشتقة من الدم المحيطي قد لا يكون مثاليا لتحديد الأهمية السريرية لأن لديها قدرة بلعمية أقل من الخلايا الوحيدة المنشطة وبعض الضامة.

الخلايا الوحيدة هي مجموعة فرعية من الخلايا الموجودة في الدم والطحال ونخاع العظام وتمثل 10٪ من إجمالي الكريات البيض في البشر8. تنتشر هذه الخلايا عادة لمدة 1-2 أيام قبل أن يتم تجنيدها بواسطة أنسجة مختلفة ، حيث تستمر في التمايز إلى البلاعم8. يحدث هذا عادة أثناء تكون الدم ، حيث ينتج نخاع العظم خلايا وحيدة يتم إطلاقها في الدورة الدموية لتصبح ضامة نسيجية موجودة في الطحال والكبد2. تعرف البلاعم باسم خط الدفاع الأول ضد مسببات الأمراض الأجنبية ، وهي خلايا أحادية النواة كبيرة البلعمية تلعب دورا في المناعة التكيفية والفطرية9. من بين الأدوار المعقدة والمعقدة للجهاز المناعي ، يمثل فهم وتوصيف الأنماط الظاهرية للبلاعم تحديا هائلا لم يتم فهمه بالكامل بعد. على مدى العقدين الماضيين ، حظيت فكرة استقطاب البلاعم باعتراف متزايد ، حيث استخدمت الدراسات الحديثة استخدام تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية لتمييز الطيف الذي توجد فيه هذه البلاعم.

تنشأ البلاعم الشبيهة ب M1 و M1 التي يتم تنشيطها كلاسيكيا في البيئات الالتهابية التي تهيمن عليها المستقبلات الشبيهة بالحصيلة (TLRs) 10. قد تشارك هذه الخلايا في أمراض المناعة الذاتية وتصلب الشرايين وتظهر علامات السطح مثل MHC-II و CD80 و CD8611،12. تم العثور على البلاعم الشبيهة ب M2 و M2 المضادة للالتهابات في البيئات التي تهيمن عليها استجابات Th2 ، وتفتقر إلى التعبير عن CD80 ، وعلامات السطح الحالية مثل CD209 و CD20611،12. يمكن زراعة البلاعم M1 / M2 في المختبر من خلايا الدم المحيطية أحادية النواة ، مع عديد السكاريد الدهني (LPS) والسيتوكينات مثل GM-CSF و IFNγ (M1) و M-CSF و IL-4 (M2) تحفز استقطابها10،12.

تهدف هذه المخطوطة والدراسات المرتبطة بها إلى إثبات أن البلاعم M2 تظهر حساسية متزايدة للبلعمة مقارنة بالبلاعم M1 والخلايا الوحيدة. يعد التحقيق في نشاط البلعمة للبلاعم M1 / M2 مقابل الخلايا الوحيدة في سياق الأجسام المضادة للخلايا الحمراء وطب نقل الدم مجالا لم يتم استكشافه بعد. هنا ، نصف العمل الجاري الحالي لتوليد البلاعم M1 / M2 ونقارن مقايسة أحادية الطبقة أحادية الخلية الكلاسيكية (MMA) بمقايسة الخلية الأحادية والبلاعم الجديدة ، باستخدام الاختصار M-MA لتمييز مقايسة البلاعم هذه عن مقايسة الخلايا الأحادية ، لتحسين القيمة التنبؤية لمقايسات البلعمة في المختبر .

Protocol

تم إجراء هذا البحث وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية لإجراء البحوث الأخلاقية التي تشمل البشر. تم منح الموافقة الأخلاقية من مجلس أخلاقيات أبحاث خدمات الدم الكندي (REB) ، بالموافقة CBSREB # 2023.008. يجب تنفيذ جميع خطوات هذا البروتوكول في خزانة السلامة البيولوجية في ظل ظروف معقمة.

1. عزل PBMCs

  1. الحصول على دم بشري كامل من متبرع في أنبوب ACD. يخزن الدم في درجة حرارة الغرفة (18 درجة مئوية - 22 درجة مئوية) لمدة تصل إلى 36 ساعة.
  2. انقل أنابيب ACD الدم الكامل إلى أنابيب الطرد المركزي سعة 50 مل (أنبوب واحد سعة 50 مل لكل أنبوبين من أنابيب ACD). أضف الوسط الكامل RPMI-1640 في درجة حرارة الغرفة إلى الحجم النهائي البالغ 35 مل.
  3. أضف 15 مل من وسط تدرج كثافة درجة حرارة الغرفة إلى أنبوب جديد سعة 50 مل. ضع طبقة من الدم الكامل المخفف بعناية فوق وسط تدرج الكثافة ، مما يقلل من الخلط عند الواجهة لفصل الدم بشكل مثالي.
  4. قم بالطرد المركزي للخليط ذي الطبقات عند 700 × جم لمدة 30 دقيقة مع إيقاف تشغيل الفرامل. سيقوم الطرد المركزي المتدرج بالكثافة بفصل الخليط إلى الطبقات التالية من أعلى إلى أسفل: البلازما ، وطبقة بافي (التي تحتوي على PBMCs) ، ومادة تدرج الكثافة ، والخلايا الحبيبية ، وخلايا الدم الحمراء.
  5. استنشق وتخلص من غالبية الطبقة العليا (البلازما). باستخدام ماصة النقل ، قم باسترداد طبقة الطبقة المصفرية (PBMCs) بعناية ، وتجنب إحضار أي مواد إضافية. انقل PBMCs المستردة إلى أنبوب جديد سعة 50 مل.
  6. اغسل طبقة الطبقة المعزولة 1x بمحلول درجة الحموضة 7.4 PBS لمدة 10 دقائق عند 350 × جم مع تشغيل الفرامل الكاملة.
  7. استخدم مصفاة خلية 70 ميكرومتر للتخلص من الحطام أو المواد غير المرغوب فيها من PBMCs قبل نقلها إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل. اغسل 2x بمحلول درجة الحموضة 7.4 PBS لمدة 10 دقائق عند 350 × جم مع تشغيل الفرامل الكاملة.
  8. اختياري: قم بتحليل أي كرات الدم الحمراء المنقولة باستخدام المخزن المؤقت لتحلل ACK. أضف 5-10 مل من المخزن المؤقت لتحلل ACK, اعتمادا على حجم الحبيبات, واحتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة تصل إلى 3 دقائق. بعد الحضانة ، قم بتعبئة درجة الحموضة 7.4 PBS وجهاز الطرد المركزي لمدة 10 دقائق عند 350 × جم مع تشغيل الفرامل الكاملة واغسلها 1x. قم بتنفيذ هذه الخطوة إذا كان عدد كرات الدم الحمراء مرتفعا جدا.
    ملاحظة: من الأفضل دائما تجنب استخدام ACK للحصول على نتائج أفضل. بدلا من ذلك ، يمكن استخدام الماء للتخلص من كرات الدم الحمراء غير البلعمة عن طريق احتضانها بالماء لمدة لا تزيد عن 15 ثانية ، ثم إضافة 1X PBS على الفور لغسلها.
  9. إعادة تكوين حبيبات PBMC في 2-3 مل (استخدم 0.5 مل لكل أنبوب ACD أولي) من الوسط الكامل RPMI-1640. عد PBMCs بمقياس الدم بعد تحضير خليط 1: 1 مع التريبان الأزرق. يحسب فقط الخلايا غير الملطخة باللون الأزرق التايبان. أعد تكوين PBMCs إلى 2 × 106 خلايا / مل في وسط RPMI-1640 الكامل.

2. ثقافة البلاعم M1 / M2

  1. اليوم 0 بذر الخلايا الوحيدة
    1. قم بإعداد قارورة مزرعة خلية سعة 25 مل لكل مجموعة من البلاعم. أضف 5 مل من بولي د-ليسين (50 ملغ/500 مل) لكل منهما واتركه في الغطاء لمدة ساعة واحدة على الأقل. اشطف القارورة باستخدام PBS للتخلص من بقايا بولي دي ليسين.
    2. عزل PBMCs من معطف بافي أو عينات المريض ، كالمعتاد (انظر الخطوة 1). بعد إنشاء حبيبات من PBMCs ، أعد تعليقها في 10 مل من الوسط الكامل RPMI-1640 الدافئ مسبقا.
    3. حدد رقم الخلية وابدأ عزل الخلية الأحادية باستخدام مجموعة عزل Monocyte. لتشغيل المجموعة، استخدم ما لا يقل عن 50 × 106 خلايا.
    4. أعد تعليق الخلايا عند 50 × 106 خلايا / مل في وسط عزل. وفقا لرقم الخلية التي تم الحصول عليها ، استخدم المغناطيس الأرجواني (0.25-2 مل) أو الرمادي (0.5-8.5 مل) الموصى به في مجموعة عزل الخلايا الأحادية.
    5. اتبع تعليمات المجموعة وأضف العينة إلى أنبوب البروبيلين المطلوب (5 مل أو 14 مل). أضف كوكتيل التخصيب إلى العينة عند 50 ميكرولتر / مل من العينة.
    6. ماصة لأعلى ولأسفل أو دوامة لخلط العينة ثم احتضانها عند 2-8 درجات مئوية لمدة 10 دقائق في دلو ثلج. وفي الوقت نفسه ، الجسيمات المغناطيسية الدوامة لمدة 30 ثانية. بعد الحضانة ، أضف الجسيمات المغناطيسية إلى العينة: 100 ميكرولتر / مل من العينة.
    7. ماصة لأعلى ولأسفل أو دوامة لخلط العينة ثم احتضانها عند 2-8 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. قم بتعبئة متوسط العزل حتى 2.5 مل أو 10 مل، وفقا لذلك باستخدام ماصة متدرجة. الماصة لأعلى ولأسفل 2x-3x للخلط.
    8. ضع الأنبوب (بدون غطاء) في المغناطيس واحتضنه في درجة حرارة الغرفة لمدة 2.5 دقيقة. التقط المغناطيس ، وفي حركة واحدة مستمرة ، اقلب المغناطيس والأنبوب ، وصب تعليق الخلية في أنبوب جديد ، 5 مل أو 14 مل.
    9. أعد تعليق الخلايا في وسط RPMI-1640 وعدادها. قم بهذه الخطوة في أسرع وقت ممكن. البذور بين 1 × 106 - 5 × 106 خلايا أحادية في كل قارورة سعة 25 مل مطلية مسبقا ب poly-D-lysine. ارفع مستوى الصوت إلى 5 مل باستخدام RPMI-1640 إذا لزم الأمر.
    10. احتضان عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 ، لمدة ساعتين على الأقل. وفي الوقت نفسه ، قم بإعداد وسائط التمايز M1 و M2. جهز ما يكفي لتعبئة اليوم 0 (10 مل) واليوم 4 (2 مل).
      ملاحظة: وسيط التمايز M1: RPMI-1640 + 2.5 نانوغرام/مل لتر GM-CSF; وسيط التمايز M2: RPMI-1640 + 50 نانوغرام / مل لتر M-CSF.
    11. بعد وقت الحضانة ، اغسل كل قارورة 1x باستخدام PBS و 2x باستخدام RPMI-1640 الكامل. أضف 10 مل من وسط التمايز إلى كل قارورة وفقا لنوع الخلية للتمايز.
    12. دع الخلايا تتمايز لمدة 6 أيام في الحاضنة عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون2. بسبب التبخر ، قم بتعبئة وسيط التمايز في اليوم 4.
  2. اليوم 4 - تعبئة الرصيد
    1. أضف 2 مل من كل وسط تمايز إلى القارورة المعنية. أضف الوسط مباشرة إلى القارورة.
  3. اليوم 6 - استقطاب البلاعم
    1. قم بإعداد وسائط الاستقطاب M1 و M2. بالنسبة لوسائط الاستقطاب M1 ، قم بإعداد 5 مل من وسط الاستقطاب M1 لإضافته إلى القارورة المقابلة. يجب أن تكون التركيزات النهائية 50 نانوغرام / مل IFNγ ، و 10 نانوغرام / مل LPS ، و 2.5 نانوغرام / مل لتر GM-CSF في RPMI-1640. ستحتوي القارورة في النهاية على 15 مل من الحجم الإجمالي (10 مل بالفعل في + 5 مل لإضافتها) ، قم بإجراء العمليات الحسابية وفقا لذلك.
    2. بالنسبة لوسائط الاستقطاب M2 ، قم بإعداد 5 مل من وسط الاستقطاب M2 لإضافته إلى القارورة المقابلة. يجب أن تكون التركيزات النهائية 20 نانوغرام / مل IL-4 و 50 نانوغرام / مل لتر m-csf في RPMI-1640. لاحظ أن القارورة في النهاية ستحتوي على 15 مل من الحجم الإجمالي (10 مل بالفعل في + 5 مل لإضافتها) ؛ قم بإجراء الحسابات وفقا لذلك.
    3. أضف 5 مل من وسط الاستقطاب M1 أو M2 إلى كل قارورة. دع البلاعم تستقطب لمدة يومين على الأقل وليس أكثر من 4 أيام في الحاضنة عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيدالكربون 2.
  4. اليوم 8 - قياس الحصاد والتدفق الخلوي
    1. قبل حصاد البلاعم M1 أو M2 ، اجمع المادة الطافية في أنابيب سعة 1.5 مل لاستخدامها مرة أخرى (إذا لزم الأمر). أضف 1 مل من محلول انفصال الخلية إلى القارورة واتركها في الحاضنة عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 لمدة 5 دقائق.
    2. لإيقاف التفاعل ، أضف 3 مل من RPMI-1640 الكامل. اجمع الوسائط في أنبوب سعة 15 مل. أضف 3 مل من RPMI-1640 الكامل إلى القارورة واستخدم مكشطة خلية لفصل الخلايا عن قاع القارورة.
    3. اجمع الخلايا في أنبوب سعة 15 مل. ضع القارورة تحت المجهر عند 10x وراقب الخلايا للتأكد من عدم ربط المزيد من الخلايا بأسفل القارورة.
    4. اغسل الخلايا في PBS 2x. أعد تعليقها في RPMI-1640 الكامل وعدها باستخدام مقياس كثافة الدم.
    5. لتحليل جودة وكمية الضامة M1 / M2 ، قم بإجراء مقايسة قياس التدفق الخلوي. استخدم 0.5 × 106 خلايا لكل أنبوب وصمة عار على النحو التالي: M1: CD80 + CCR7 + CD209- M2: CD206 + CD209 + CD80-. استراتيجية البوابات المستخدمة في هذا الفحص: # 1 التشتت الأمامي (FSC-A) مقابل المخطط النقطي للمبعثر الجانبي (SSC-A) ، # 2 ارتفاع التشتت الأمامي (FSC-H) مقابل مخطط نقطة منطقة التشتت الأمامي (FSC-A) للتمييز المزدوج ، # 3 التشتت الجانبي (SSC-A) مقابل مخطط DAPI-A النقطي لتمييز الخلايا الحية / الميتة ، # 4 التشتت الجانبي (SSC-A) مقابل مخطط نقطة المعلمة الفردية أو الرسم البياني (على سبيل المثال ، SSC-A مقابل FITC-A) ، # 5 مخطط نقطي مزدوج المعلمة (على سبيل المثال ، FITC-A مقابل APC-A).

3. MMA باستخدام البلاعم M1 / M2

  1. بعد الحصول على الضامة M1 / M2 ، قم بعدها باستخدام مقياس كثافة الدم بنسبة تلطيخ 1: 1 مع تريبان بلو. أعد تكوين M1 / M2 إلى 1 × 106 خلايا / مل في وسط RPMI-1640 الكامل.
  2. قم بزرع 400 ميكرولتر (400,000 خلية) من معلق الخلية باستخدام ماصة دقيقة في كل بئر من شريحة الغرفة المكونة من 8 آبار وتحتضن عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 لمدة 1.5 ساعة على الأقل في حاضنة زراعة الأنسجة المرطبة بالكامل. يجب إجراء كل اختبار باستخدام ما لا يقل عن ثلاث مرات من الآبار.
  3. مسح عينات الاختبار وخلايا الدم الحمراء RhD + R2R2
    1. اغسل كرات الدم الحمراء RhD + R2R2 بدرجة حموضة 7.4 PBS 3x عن طريق الطرد المركزي عند 350 × جم لمدة 5 دقائق في كل مرة. نحن نفضل استخدام كرات الدم الحمراء R2R2 RhD + كعنصر تحكم لدينا نظرا لاحتوائها على كثافة مستضد D أعلى ، ولكن يمكن استبدال أي كرات الدم الحمراء RhD +. قم بفحص عينة اختبار كرات الدم الحمراء (على سبيل المثال ، المريض أو المتبرع) كرات الدم الحمراء باستخدام الأجسام المضادة ذات الأهمية. استخدم معلق كرات الدم الحمراء بنسبة 5٪ عن طريق إضافة 15 ميكرولتر من كرات الدم الحمراء المعبأة إلى 300 ميكرولتر من خليط الأجسام المضادة. قم بتشغيل كرات الدم الحمراء R2R2 مع Anti-D عن طريق إضافة 15 ميكرولتر من كرات الدم الحمراء R2R2 المعبأة إلى 300 ميكرولتر من خليط الأجسام المضادة المضادة ل D (100 نانوغرام / مل).
    2. احتضان عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 لمدة 1 ساعة. قم بإجراء إعادة تشكيل متقطعة لكرات الدم الحمراء المستقرة في القاع (على سبيل المثال ، الدوامة كل 15 دقيقة). اغسل كرات الدم الحمراء ذات الدرجة الحموضة 7.4 PBS 3x عن طريق الطرد المركزي عند 350 × جم لمدة 5 دقائق في كل مرة.
    3. للتحقق من وجود مثيل كرات الدم الحمراء ، قم بإجراء اختبار مضاد الغلوبولين غير المباشر (IAT). أضف جسما مضادا ثانويا مضادا للإنسان إلى الجسم المضاد المضاد الأولي. يمكن ملاحظة تضخم الدم أو تكتل كرات الدم الحمراء في غضون 30 ثانية وتفسيره على أنه تضخم ناجح13.
    4. أعد تكوين كرات الدم الحمراء المغسولة RhD + R2R2 في 1.25٪ (حجم حجم / حجم) مع وسط RPMI-1640 الكامل. أضف 1,200 ميكرولتر من كرات الدم الحمراء المتوسطة إلى 15 ميكرولتر لتحقيق 1.25٪ (حجم / حجم) لكل بئر.
  4. البلعمة بوساطة مستقبلات Fc
    1. بعد حضانة 1.5 ساعة من الضامة M1 / M2 ، للسماح لهذه الخلايا بالالتصاق بآبار شريحة الغرفة ، استنشاق الوسط الطافي والتخلص منه ، باتباع تقنية لطيفة ، مما يضمن أن طرف الماصة يلامس زاوية الآبار فقط. يجب أن تلتصق البلاعم بالآبار. تجنب لمس منتصف الآبار بطرف الماصة.
    2. اغسل الآبار برفق 1x مع درجة الحموضة 7.4 PBS. أضف 400 ميكرولتر من خليط كرات الدم الحمراء المعاكسة المناسب بنسبة 1.25٪ (حجم / حجم) إلى كل بئر من النسخ الثلاثية. احتضان عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 لمدة ساعتين دون إزعاج.
    3. بعد الحضانة ، قم بإعداد كوبين بمقدار 100 مل من الرقم الهيدروجيني 7.4 PBS في كل واحدة.
    4. قم بإزالة الغرف المكونة من 8 آبار باستخدام محولات الشركة المصنعة. تخلص من الفائض على منشفة ورقية مع الحفاظ على رطوبة الشرائح.
    5. اغمر الشريحة في الدورق باستخدام المواد الطافية المهملة واغسلها عن طريق تحريكها ذهابا وإيابا ببطء (20-30 ضربة) لإزالة أي كرات الدم الحمراء المتبقية غير البلعمة.
    6. ثم اغمر الشريحة في الدورق الثاني واغسلها ببطء لمدة 20-30 ضربة أخرى. قم بإزالة الشريحة من PBS وامسح الفائض على منشفة ورقية. تجنب لمس الجزء الأمامي من الغرف. في هذه المرحلة ، اغمس الشريحة في الماء لمدة 1 دقيقة لإزالة أي كرات الدم الحمراء الملتصقة وغير البلعمة ، ولكن قد لا يكون ذلك ضروريا إذا كان بإمكانك التمييز بين كرات الدم الحمراء الملتصقة عن البلعمة.
    7. اغمر الشرائح في 100٪ ميثانول لمدة 45 ثانية لإصلاحها ، ثم جففها في الهواء. قم بتركيب الشريحة باستخدام وسيط تثبيت معد داخليا وأضف أغطية (24 × 75 مم). اتركه يجف طوال الليل قبل القياس الكمي.
  5. القياس الكمي للبلعمة
    1. باستخدام مجهر تباين الطور ، وعدسة موضوعية 40x ، وعداد خلوي يدوي ، قم بتحديد البلعمة.
    2. بمساعدة عدادين يدويين للخلايا ، أحدهما في كل يد ، قم بحساب كرات الدم الحمراء البلعمية بعداد واحد والعدد الإجمالي للخلايا الوحيدة / الضامة مع الآخر. عد 300 وحيدة / بلاعم لكل بئر.
    3. احسب متوسط مؤشر البلعمة (PI) لكل اختبار (عبر ثلاث نسخ) بقسمة عدد كرات الدم الحمراء البلعمية على عدد إجمالي الخلايا الوحيدة التي تم عدها وضربها في 100. عبر عن البيانات كمتوسط PI ± الخطأ المعياري للمتوسط (SEM).
      PI = (كرات الدم الحمراء البلعمة / 300 بلاعم) × 100

النتائج

تتوافق النتائج الواردة في الشكل 1 مع الأدبيات وتشير إلى استقطاب ناجح للبلاعم من حالتها M0 إلى حالتها اللاحقة M1 / M2. تمت زراعة البلاعم M1 و M2 لمدة 8 أيام (6 أيام مع عوامل النمو و 2 أيام من الاستقطاب) ، وتم اختبار كرات الدم الحمراء المضادة ل D أو المضادة ل K (الشكل 2). تظهر البلاعم M2 مؤشرا بلعميا مرتفعا مقارنة ب M1s مع كرات الدم الحمراء المضادة إما عن طريق مكافحة D (التحكم) أو المضادة ل k. تتوافق هذه النتيجة مع الاختبارات الأولية الأخرى التي أجريت باستخدام M-MA (انظر الجدول 1). البلاعم M2 شديدة البلعمة مقارنة بالضامة M1 أو الخلايا الوحيدة ، حتى مع الأجسام المضادة القوية لكرات الدم الحمراء (الشكل 2 ب). يوضح الجدول 1 النتائج الأولية مع 4 أجسام مضادة مختلفة لكرات الدم الحمراء لها خصائص تعتبر مهمة سريريا. تظهر الأجسام المضادة المستخدمة لمعالجة كرات الدم الحمراء الإيجابية للمستضد وتضاف إلى الخلايا الوحيدة في MMA البلعمة الضعيفة (PI < 5). تظهر كرات الدم الحمراء المضادة نفسها المضافة إلى البلاعم M1 أيضا بلعمة ضعيفة (PI < 12). تظهر كرات الدم الحمراء المضادة مع نفس الأجسام المضادة المضافة إلى البلاعم M2 البلعمة العالية والهامة (PI > 12) ، مما يدل على قدرة هذه البلاعم على التنبؤ بشكل أفضل بالأهمية السريرية مقارنة بالخلايا الوحيدة و M1s.  بناء على النتائج المرصودة ، يمكننا أن نستنتج أن استخدام البلاعم M2 قد يكون أكثر تنبؤا بالأهمية السريرية للأجسام المضادة لكرات الدم الحمراء في طب نقل الدم. أيضا ، قد تجد الأساليب الحالية في علم المناعة أنه من المفيد التكيف مع الأساليب الموضحة في هذه الورقة لأنها تقدم نتائج أكثر دقة وقد تترجم إلى الأهمية السريرية. ومع ذلك ، هناك حاجة إلى مزيد من الدراسات التي تفحص الأجسام المضادة لكرات الدم الحمراء بخصوصيات وبيانات سريرية تشير إلى أهميتها السريرية أو عدم أهميتها ، ومقارنة MMA ب M-MA.

figure-results-1864
الشكل 1: استقطاب وتوصيف البلاعم M1 / M2. (أ) يتم استخدام طبقة من المتبرع لاستخراج خلايا الدم المحيطية أحادية النواة (PBMCs) باستخدام فصل تدرج الكثافة. ثم يتم عزل الخلايا الوحيدة CD16 + / CD14 + عن PBMCs ووضعها في قارورتين للتمييز عند 37 درجة مئوية لمدة 6 أيام ، مع زيادة في اليوم 4. وسائط التمايز: M1- GM-CSF (2.5 نانوغرام / مل) و M2- M-CSF (50 نانوغرام / مل). تتم إضافة وسائط الاستقطاب إلى كل قارورة مقابلة عند 144 ساعة ، وتترك البلاعم للاستقطاب لمدة 48 ساعة إضافية عند 37 درجة مئوية. وسائط الاستقطاب: M1 - IFN-gamma (50 نانوغرام / مل) ، LPS (10 نانوغرام / مل) ، و GM-CSF (2.5 نانوغرام / مل). M2 - IL-4 (20 نانوغرام / مل) و M-CSF (50 نانوغرام / مل). يمكن بعد ذلك حصاد الخلايا وتصنيفها للتوصيف عن طريق قياس التدفق الخلوي أو استخدامها في مقايسة البلعمة (الشكل 2). (ب) M1 مقابل M2 البلاعم في مورفولوجيا المختبر. الصور التي تم التقاطها بعد يومين من الاستقطاب. تقدم البلاعم M1 مورفولوجيا مستديرة ودائرية. ب. M2 البلاعم لها مورفولوجيا مميزة وقابلة للتمدد وطويلة ، وكلاهما يدل على الاستقطاب الناجح. (ج) تحليل قياس التدفق الخلوي للضامة M1 / M2 التي تتميز ب CD80 (M1) و CD209 (M2). تم استزراع الضامة M1 / M2 لمدة 8 أيام ووصفها ب CD80-FITC و CD209-PECy7 للتوصيف باستخدام قياس التدفق الخلوي. أ. تعرض البلاعم M1 حوالي 86.1٪ تعبير عن CD80 و 0.17٪ تعبير عن CD209. ب. تعرض البلاعم M2 97.3٪ من تعبير CD209 و 0.003٪ من تعبير CD80. (د) إشارة الفلورسنت CD80 و CD209 على البلاعم M1 / M2. تم استزراع البلاعم M1 / M2 لمدة 8 أيام وتم تصنيفها إما ب CD80-FITC أو CD209-PECy7 للتوصيف عن طريق قياس التدفق الخلوي. A. متوسط شدة الفلورسنت (MFI) ل CD80 أعلى بكثير في M1s ، من M2s. ب. MFI ل CD209 أعلى بكثير على M2s منه على M1s. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3911
الشكل 2: اختبار الخلايا الأحادية والبلاعم (M-MA). (أ) يتم استزراع M1 / M2s لمدة 6 أيام مع عوامل النمو ثم يومين مع السيتوكينات لاستقطابها. ثم يتم وضع البلاعم M1 / M2 في شرائح الغرفة وتحضنها عند 37 درجة مئوية لمدة ساعتين ، ويتم معالجة كرات الدم الحمراء باستخدام الجسم المضاد / المصل المفضل وتحضنها لمدة ساعة واحدة مع الخلط المتقطع كل 15 دقيقة. يتم وضع كرات الدم الحمراء المنحلة في شرائح الغرفة مع البلاعم المرفقة وتحضنها لمدة ساعتين عند 37 درجة مئوية دون إزعاج. يتم غسل الشرائح في PBS. يتم إصلاح الخلايا باستخدام الميثانول وتركيبها بالفلافانول. يتم حساب الخلايا باستخدام الفحص المجهري لتباين الطور عند 40x. يتم حساب مؤشر البلعمة (PI) عن طريق حساب 300 بلاعم وكرات الدم الحمراء البلعمة المقابلة. (B) M-MA يقارن M1 مقابل M2 الضامة مع مضاد D ومضاد k. R2R2 يشير إلى دم RhD +. تشير أشرطة الخطأ إلى SD وتم إجراء اختبار t بقيمة p < 0.05 تعتبر مهمة. (ج) كرات الدم الحمراء المضادة للبلعمة المضادة ل K بواسطة M1 مقابل البلاعم M2 بواسطة M-MA. تم التقاط الصور بمعدل 40 ضعفا باستخدام الفحص المجهري الطوري. a. تظهر البلاعم M1 نشاطا بلعما ضئيلا مع كرات الدم الحمراء المضادة ل k. b. تظهر البلاعم M2 نشاطا بلعميا مرتفعا مع كرات الدم الحمراء المضادة للبكتيريا. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

مؤشر البلعمة (PI)
جسمIAT^الخلايا الوحيدة*M1**M2 ***
مكافحة Fyأ1-2+3413
مكافحة Jkأ1+0541
مضاد للقوات المسلحة1+0243
مضاد ديب1+0516
^اختبار مضاد الغلوبولين غير المباشر باستخدام مضاد IgG
* اختبار أحادي الطبقة أحادي الخلية (MMA) باستخدام الخلايا الوحيدة ؛ يعتبر PI>5 يحتمل أن يكون مهما سريريا.
** اختبار البلاعم الأحادي (M-MA) باستخدام البلاعم M1 ؛ يعتبر PI>12 ذا أهمية سريرية.
M-MA باستخدام البلاعم M2 ؛ يعتبر PI>12 ذا أهمية سريرية.

الجدول 1. قد يكون استخدام البلاعم M2 أكثر تنبؤا بالأجسام المضادة التي يحتمل أن تكون ذات أهمية سريرية لكرات الدم الحمراء في اختبار M-MA مقارنة بالخلايا الوحيدة (MMA).

Discussion

لضمان نجاح الطريقة ، يجب على المرء الالتزام بالخطوات الحاسمة التالية: 1) استقطاب M1 / M2 الناجح ، 2) توليد طبقة البلاعم والتحكم في RhD + 3) القياس الكمي لمؤشر البلعمة. بينما تنص أساليبنا على استخدام الخلايا الوحيدة المعزولة لزراعة الخلايا ، يمكن استخدام PBMCs ، لكننا نوصي باستخدام الخلايا الوحيدة المنقىة. من المعروف أن PBMCs تحتوي على أنواع مختلفة من الخلايا ، حيث تفرز هذه الخلايا العديد من السيتوكينات المختلفة وعوامل الوساطة. قد يكون لهذا تأثير على تمايز أو استقطاب البلاعم M1 / M2 ؛ لذلك ، فإن استخدام الخلايا الوحيدة المنقاة سيؤدي إلى نتائج أفضل.  أيضا ، من المهم أن تتذكر أنه سيتم الحصول على حوالي 10٪ من الخلايا الوحيدة من الكمية الأصلية من PBMCs عند استخدام مجموعة عزل الخلايا الوحيدة STEMCELL. وقد لوحظ أن 50 × 106 PBMCs هو الحد الأدنى لعدد البداية من PBMCs للحصول على حوالي 5 × 106 خلايا وحيدية. عند غسل القارورة بالخلايا الوحيدة الملتصقة ، تأكد من غسلها برفق باستخدام حركة دوامة لتجنب فصل أي خلايا. نظرا للتبخر الذي يحدث في الحاضنة ، فإن خطوة وسائط التعبئة في اليوم 4 من المزرعة ضرورية. تجنب التخلص من أي وسائط وأضف الوسائط إلى القارورة ، لأن السيتوكينات التي تفرزها M1 / M2s مهمة للتمايز. بعد الاستقطاب لمدة يومين ، يمكن استخدام البلاعم M1 / M2 للتجريب أو الاحتفاظ بها في الثقافة لمدة تصل إلى 7 أيام. طول الاستقطاب مرن ويمكن تعديله بناء على النتائج المرصودة ، ولكن يومين هو الحد الأدنى للاستقطاب الناجح. خطوة قياس التدفق الخلوي مطلوبة فقط عند إعداد الإجراء. بمجرد تشغيل الفحص بشكل صحيح ونجاح عمليات التشغيل المتكررة لتمييز خلايا M1 / M2 ، اختر حذف هذه الخطوة. يجب أن يكون العائد الذي تم الحصول عليه حوالي 90٪ من M1 (CD80 + CCR7 + CD209-) وأكثر من 85٪ من M2 (CD206 + CD209 + CD80-). قد تكون M1s إيجابية ل CD209 أو CD206. هذا أمر طبيعي حيث يتم التعبير عن هذه العلامات بشكل ضعيف على M1s ولكنها لا تزال مؤشرا على الاستقطاب الناجح. يجب أن تكون البلاعم M2 سالبة دائما ل CD80.

في M-MA ، يجب وضع طبقة البلاعم بعناية على شريحة الغرفة. يمكن خفض عدد البذر M1 / M2 بما يصل إلى 250.000 خلية لكل بئر إذا لزم الأمر ولكن يجب أن يتراوح عادة من 400.000-500.000. قد يؤدي الكمية الأعلى إلى تكتل وقراءات غير دقيقة. كن لطيفا عند الشفط أو إضافة المحاليل إلى الغرف ؛ يجب أن يلمس طرف الماصة زاوية من الآبار فقط ، وتجنب الخلايا ضعيفة الالتصاق. لتجنب تجفيف الآبار ، اعمل في ثلاث نسخ فنية عند إضافة المحاليل وتبادل الوسائط. لا تلمس مقدمة الشريحة. يمكن أن يؤدي إلى فقدان البلاعم أو الخلايا الوحيدة. تستخدم كرات الدم الحمراء RhD + R2R2 كتحكم إيجابي في البلعمة بوساطة FcγR لضمان النشاط. على الرغم من أننا نستخدم كرات الدم الحمراء RhD + R2R2 للتضفير مع مضاد D للتحكم الإيجابي ، إلا أنه يمكن استخدام أي كرات الدم الحمراء RhD +1،2. تأكد من استخدام التركيز المناسب للأجسام المضادة عند معالجة كرات الدم الحمراء في هذا الفحص. ستؤدي الكميات الزائدة إلى تكتل كرات الدم الحمراء وعدم القدرة على قراءة الشرائح. أخيرا ، يوصى بأن يقوم أكثر من موظف مختبر بحساب الشرائح. قد يكون القياس الكمي اليدوي باستخدام المجهر أمرا صعبا لأنه شخصي ، مما يشير إلى تباين كبير بين الأعداد بين آبار الغرف المختلفة والتجارب. قد يسمح الاتساق في مجال الرؤية الذي يتم فيه حساب الخلايا وعد عدد أكبر من الخلايا بنتائج أكثر دقة.

تشمل قيود هذه الطريقة الطبيعة الذاتية لقياس مؤشر البلعمة والتباين بين دم المتبرع. يتم استخراج PBMCs من معاطف المتبرع لتأسيس ثقافة الخلايا M1 / M2 ، وتظهر البيانات الأولية من المختبر تباينا كبيرا في نشاط البلعمة M1 و M2 اعتمادا على المتبرع. قد ينتج نفس الجسم المضاد مؤشرا بلعميا أعلى مع خلايا M2 من متبرع مقارنة بتلك الموجودة في متبرع آخر. لتقليل التباين والحفاظ على الاتساق ، سيكون إنشاء مورد مانح مجمع مفيدا ، وهذا ينطبق أيضا على كرات الدم الحمراء المستخدمة في MMA. على الرغم من الحفاظ على طريقة متسقة ، إلا أن هناك دائما تباينا طفيفا بين دم المتبرع ب RBC / PBMC.

أحد النقد الرئيسي لكل من MMA و M-MA هو الذاتية المتأصلة في حساب الخلايا الوحيدة أو الضامة وخلايا الدم الحمراء البلعمة المقابلة لها (RBCs). على الرغم من البروتوكولات المعمول بها ، فإن التباين في تقنيات العد الفردية تحت المجهر أمر لا مفر منه. لمعالجة هذا الأمر ، سيكون من المفيد لموظفي المختبر إنشاء نهج قياس كمي موحد - مثل تحديد نقطة انطلاق متسقة في مجال الرؤية أو زيادة حجم العينة للعد. ومن شأن تنفيذ هذه التدابير أن يعزز اتساق ودقة تعداد الخلايا، مما يؤدي في نهاية المطاف إلى نتائج واستنتاجات أكثر موثوقية.

Disclosures

المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

يتم دعم هذا العمل وتمويله من قبل المركز الكندي لخدمات الدم للابتكار في تورنتو ، أونتاريو ، يتم إجراء البحث في مركز كينان لأبحاث العلوم الطبية الحيوية في مستشفى سانت مايكلز في تورنتو ، أونتاريو.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1X PBS, pH 7.4, without Ca2+/Mg2+Wisent Bioproducts 311-425-CLStore at 4 degrees or room temperauture 
AccutaseTMSTEMCELL Technologies 7920Cell detachment solution
ACK Lysis Buffer STEMCELL Technologies 07850, 07800Store at 4 degrees
Anti-Human GlobulinNOVACLONE, Immunocor. N/ANOVACLONE Anti-igG for IAT testing 
Anti-Rh(D) (WinRho. SDF CDN)Saol Therapeutics 1003092Any commerical source of Rh immune globin will suffice 
Cell ScraperUofT Medstore83.395cell detachement 
Cell Strainer 70uM nylonFalcon352350filter of cells 
Chamber slide Nunc. Lab-TekTM II with Cover, RS Glass Slide Sterile Thermo Fisher Scientific 154534chamber slides for MMA 
Coverslips VWR48393-08124 x 50 mm
Cytiva Ficoll Paque Plus, density 1.077 g/LThermo Fisher Scientific 17-1440-03sepeation of PBMCS from whole blood; density gradient medium
Elvanol Mounting MediumN/AN/ADulbecco’s PBS (D-PBS) without Ca2+/Mg2+, 15% (w/v) polyvinyl resin, and 30% (v/v) glycerine.
Fresh whole blood (ACD tube) or Buffy coatCanadian Blood ServicesMay rest at room tempruatre for up to 36 hours 
Human Recombinant GM-CSFSTEMCELL Technologies 78015.1Cytokine for polarization of M1 macrophages
Human Recombinant IFN-gammaSTEMCELL Technologies 78020Cytokine for polarization of M1 macrophages
Human Recombinant IL-4STEMCELL Technologies 78045.1Cytokine for polarization of M2 macrophages
Human Recombinant M-CSFSTEMCELL Technologies 78057.1Cytokine for polarization of M2 macrophages
ID-CellStabBio-Rad005650 05740RBC cell storage/stabilization solution 
Isolation Medium N/AN/APBS Ca2+ and Mg2+ free + FBS 2% + 1mM EDTA
Lipopolysaaracide (LPS)Sigma AldrichL3024-5MGCytokine for polarization of M1 macrophages
Methanol (100%)N/AN/AFixing of slides 
Monocyte Isolation Kit STEM-cells EasySep Human Monocyte Enrichment Kit without CD16 Depletion STEMCELL Technologies 19058Isolation of monocytes from PBMCs
Poly-D-ysine UofT Medstore P6407Cell attachment solution 
Rh(D) positive R2R2 RBCsCanadian Blood ServicesN/AAlso commerically avaiable
RPMI-1640Wisent Bioproducts 350-000-CLsupplemented with 10% heat-inactivated FBS,1 mM GlutaMAX supplement, 1 mM HEPES, and 1%penicillin/streptomycin. Store at 4 degrees. 
Trypan Blue solution Thermo Fisher Scientific 15250061Cell counting solution 

References

  1. Tong, T. N., Branch, D. R. Use of a monocyte monolayer assay to evaluate Fcγ receptor-mediated phagocytosis. J Vis Exp. (119), e55039 (2017).
  2. Tong, T. N., Cen, S., Branch, D. R. The monocyte monolayer assay: Past, present and future. Transfus Med Rev. 33 (1), 24-28 (2019).
  3. Frias Boligan, K., Sandhu, G., Branch, D. R. Methods to evaluate the potential clinical significance of antibodies to red blood cells. Curr Protoc. 2 (8), e504 (2022).
  4. Lemay, A. S., et al. The first case of severe acute hemolytic transfusion reaction caused by anti-Sc2. Transfusion. 58 (11), 2506-2512 (2018).
  5. Tong, T. N., et al. The utility of a monocyte monolayer assay in the assessment of intravenous immunoglobulin-associated hemolysis. Transfusion. 60 (12), 3010-3018 (2020).
  6. Srivastava, K., et al. SCAR: the high-prevalence antigen 013.008 in the Scianna blood group system. Transfusion. 61 (1), 246-254 (2021).
  7. Branch, D. R., et al. Potentially clinically significant anti-Dib identified by monocyte monolayer assay before transfusion. Transfusion. 61 (1), 331-332 (2021).
  8. Italiani, P., Boraschi, D. From monocytes to M1/M2 macrophages: Phenotypical vs. functional differentiation. Front Immunol. 5, 514 (2014).
  9. Mills, C. M1 and M2 macrophages: Oracles of health and disease. Crit Rev Immunol. 32 (6), 463-488 (2012).
  10. Atri, C., Guerfali, F. Z., Laouini, D. Role of human macrophage polarization in inflammation during infectious diseases. Int J Mol Sci. 19 (6), 1801 (2018).
  11. Bertani, F. R., et al. Classification of M1/M2-polarized human macrophages by label-free hyperspectral reflectance confocal microscopy and multivariate analysis. Sci Rep. 7, 8965 (2017).
  12. Murray, J. Macrophage polarization. Annu Rev Physiol. 79, 541-566 (2017).
  13. Cohn, C., Delaney, M., Johnson, S. T., Katz, L. M., Schwartz, J. . Technical Manual. , (2023).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

M1 M2

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved