Monocyte-Macrophage Assay를 이용한 적혈구 항체 유의성 예측(Prediction of Red Blood Cell Antibody Significance Using the Monocyte-Macrophage Assay)

당사는 기존 단핵구-단층 분석법(MMA)에 대한 개선 사항을 개발하고 방법을 업데이트했으며, 이 분석에서는 대식세포를 사용하여 수혈 의학 및 면역학에서 적혈구 동종 항체의 임상적 관련성을 더 잘 예측하는 데 도움을 줍니다. 이 분석법은 단핵구-대식세포 분석법(M-MA)이라고 합니다.

골수에 있는 단핵구에서 유래한 대식세포는 죽은 세포, 파편, 종양 세포 및 외부 병원체를 제거하는 데 중요한 역할을 하는 크고 선천적인 면역 세포입니다. 단핵구와 대식세포의 식세포 능력은 잘 이해되지 않은 개념입니다. 여기에서는 확립된 단핵구 단층 분석법(MMA)의 수정 및 업데이트 버전을 사용하여 다양한 옵소니화된 적혈구에 대한 단핵구와 대식세포, 특히 M1/M2 대식세포의 식세포작용의 차이를 조사하는 것을 목표로 합니다. 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)는 기증자의 버피 코트에서 분리되었습니다. 정제된 단핵구를 사용하여 in vitro 배양 및 편광에 의해 염증성 M1 및 항염증성 M2 대식세포를 생성했습니다. M1/M2 세포를 수확하여 다양한 적혈구 항체의 임상적으로 유의한 식세포작용을 해독하기 위해 M-MA라고 하는 MMA와 유사한 분석에 사용했습니다. 식세포 지수(PI) > 5는 단핵구를 사용하여 임상적으로 유의한 식세포작용으로 간주되었습니다. 식세포 지수(PI) > 12는 M1/M2 대식세포를 사용하여 임상적으로 유의한 식세포작용으로 간주되었습니다. M2 대식세포는 단핵구 및 M1에 비해 opsonized RBC를 식세포하는 능력이 증가한 것으로 나타났습니다. 동일한 약한 항체(anti-S)는 M2 대식세포(PI=43)만 발생하지만 M1s(PI=2) 또는 단핵구(PI=0)는 생성하지 않는 유의미한 식세포작용(phagocytosis)을 일으켜 다양한 항체를 사용하여 이를 반복적으로 입증했습니다. 단핵구 대신 M2 대식세포를 사용하면 이러한 세포가 식세포성이 더 높아 분석에 대한 임상적 관련성을 높이기 때문에 보다 정확한 결과를 얻을 수 있습니다. 임상적 중요성이 알려진 항체를 이용한 단핵구-대식세포 분석법(M-MA)의 검증을 포함하여 적혈구에 대한 다양한 항체를 사용한 추가 연구는 M-MA가 임상적으로 유의한 적혈구 동종 항체 및 수혈 반응을 예측하는 데 더 유용하다는 것을 보여줄 수 있습니다. 이 방법은 수혈 의학 및 면역학 분야를 발전시킬 것입니다.

수혈 반응을 예측하는 것은 수혈 의학 분야에서 중요한 과제로 남아 있습니다. 지난 40년 동안 Tong과 Branch ^1,2가 개척한 단핵구-단층 분석법(MMA)은 수혈 환자에서 용혈의 임상 결과를 예측하기 위한 귀중한 체외 세포 분석법^{역할을 했습니다 1}. 실제로, 이 분석법은 임상적으로 유의한 적혈구(RBC) 항체와 유의하지 않은 적혈구(RBC) 항체를 구별하는 데 중요한 역할을 했습니다². 단핵구는 전통적으로 이 분석에 사용되는 표준 백혈구였지만, 본 연구의 목표는 단핵구 유래 대식세포를 대안으로 사용할 때의 잠재적 이점을 탐구하는 것입니다. 이러한 세포는 적혈구 동종 항체의 임상적 관련성을 평가하는 분석의 능력을 향상시킬 수 있습니다.

역사적인 MMA에서는 수혈 부작용 중 적혈구의 제거 및 파괴를 담당하는 면역 세포인 대식세포의 전구체인 단핵구가 적혈구 및 항체와 함께 시험관 내 분석에 도입되었습니다 1,2,3,4,5,6,7 . 그런 다음 단핵구 내에서 식세포작용된 적혈구를 계수하여 식세포작용을 시각적으로 평가합니다. 계산된 단핵구 100개당 < 5개의 식세포작용 적혈구(phagocytosed RBC)의 식세포 지수(PI)는 환자가 수혈 부작용을 경험할 위험이 감소했음을 나타내며 항체는 임상적으로 유의하지 않은 것으로 간주됩니다 4,5,6,7. 예비 실험에 따르면 말초 혈액 유래 단핵구를 사용하는 것은 활성 단핵구 및 특정 대식세포보다 식세포 능력이 낮기 때문에 임상적 유의성을 결정하는 데 적합하지 않을 수 있습니다.

단핵구(monocyte)는 혈액, 비장, 골수에서 발견되는 세포의 하위 집합으로, 인간의 전체 백혈구의 10%를 차지합니다⁸. 이 세포는 일반적으로 1-2일 동안 순환하다가 다른 조직에 의해 모집되어 대식세포로 분화합니다⁸. 이것은 일반적으로 조혈 중에 발생하며, 골수는 순환으로 방출되어 비장과 간에 있는 조직 대식세포가 되는 단핵구를 생성합니다². 외부 병원체에 대한 1차 방어선으로 알려진 대식세포는 적응 면역과 선천성 면역에 중요한 역할을 하는 큰 식세포 단핵 세포입니다⁹. 면역 체계의 복잡하고 복잡한 역할 중에서, 대식세포 표현형을 이해하고 특성화하는 것은 아직 완전히 이해되지 않은 만만치 않은 도전입니다. 지난 20년 동안 대식세포 분극의 개념은 점점 더 많은 인식을 얻었으며, 최근 연구에서는 이러한 대식세포가 존재하는 스펙트럼을 식별하기 위해 단일 세포 RNA 염기서열 분석을 사용합니다.

고전적으로 활성화된 M1 및 M1 유사 대식세포는 톨 유사 수용체(TLR)가 지배하는 염증성 환경에서 발생합니다¹⁰. 이러한 세포는 자가면역 질환 및 동맥경화증에 관여할 수 있으며 MHC-II, CD80 및 CD86과 같은 표면 마커를 나타낼 수 있습니다^11,12. 항염증성 M2 및 M2 유사 대식세포는 Th2 반응이 지배적인 환경에서 발견되며, CD80의 발현이 부족하며, CD209 및 CD206과 같은 표면 마커를 존재합니다^11,12. M1/M2 대식세포는 말초 혈액 단핵 세포에서 체외에서 배양할 수 있으며, GM-CSF 및 IFNγ(M1) 및 M-CSF 및 IL-4(M2)와 같은 리포다당류(LPS) 및 사이토카인은 분극을 자극합니다^10,12.

이 원고 및 관련 연구는 M2 대식세포가 M1 대식세포 및 단핵구에 비해 식세포작용에 대한 민감도가 높다는 것을 입증하는 것을 목표로 합니다. 적혈구 동종항체 및 수혈 의학의 맥락에서 M1/M2 대식세포와 단핵구의 식세포 활성을 조사하는 것은 아직 연구되지 않은 영역입니다. 여기에서는 M1/M2 대식세포 생성을 위해 현재 진행 중인 작업을 설명하고, M-MA라는 약어를 사용하여 이 대식세포 분석을 단핵구 분석법과 구별하여 시험관 대식세포 분석의 예측 값을 개선하기 위해 고전적인 단핵구 단층 분석법(MMA)을 새로운 단핵구-대식세포 분석법과 비교합니다.

이 연구는 인간 피험자와 관련된 윤리적 연구를 수행하기 위한 제도적 지침에 따라 수행되었습니다. 캐나다 혈액 서비스 연구 윤리 위원회(REB)로부터 윤리 승인, CBSREB#2023.008 승인. 이 프로토콜의 모든 단계는 멸균 상태의 생물 안전 캐비닛에서 수행되어야 합니다.

1. PBMC의 절연

1. ACD 튜브의 기증자로부터 인간 혈액 전혈을 얻습니다. 혈액을 실온(18 °C–22 °C)에서 최대 36시간 동안 보관하십시오.
2. 전혈 ACD 튜브를 50mL 원심분리 튜브(ACD 튜브 2개당 50mL 튜브 1개)로 옮깁니다. RPMI-1640 완전 배지를 실온에서 최종 부피 35mL에 첨가합니다.
3. 15mL의 실온 밀도 그라디언트 배지를 새 50mL 튜브에 추가합니다. 밀도 구배 매체 위에 희석된 전혈을 조심스럽게 층을 이루고, 최적의 혈액 분리를 위해 계면에서 혼합을 최소화합니다.
4. 브레이크를 끈 상태에서 700 x g 에서 30분 동안 층을 이룬 혼합물을 원심분리합니다. 밀도 구배 원심분리는 혼합물을 위에서 아래로 플라즈마, 버피 코트(PBMC 포함), 밀도 구배 물질, 과립구 및 적혈구로 분리합니다.
5. 최상층(플라즈마)의 대부분을 흡인하고 버립니다. 전사 피펫을 사용하여 추가 물질을 가져오지 않도록 버피 코트(PBMC) 층을 조심스럽게 회수합니다. 회수한 PBMC를 새 50mL 튜브로 옮깁니다.
6. 완전 브레이크를 켠 상태에서 350 x g 에서 10분 동안 pH 7.4 PBS 용액으로 격리된 버피 코트 층을 1x 세척합니다.
7. PBMC를 15mL 코니컬 튜브로 옮기기 전에 70μM 세포 여과기를 사용하여 PBMC에서 파편이나 원치 않는 물질을 제거합니다. 완전 브레이크를 켠 상태에서 350 x g 에서 10분 동안 pH 7.4 PBS 용액으로 2회 세척합니다.
8. 선택 사항: ACK 용해 버퍼로 이월된 모든 RBC를 용해합니다. 펠릿 크기에 따라 5-10mL의 ACK 용해 완충액을 추가하고 실온에서 최대 3분 동안 배양합니다. 배양 후 pH 7.4 PBS를 보충하고 전체 브레이크를 켠 상태에서 350 x g 에서 10분 동안 원심분리하고 1x 세척합니다. 적혈구 수가 너무 많으면 이 단계를 수행합니다.
   참고: 더 나은 결과를 얻으려면 항상 ACK를 사용하지 않는 것이 좋습니다. 또는 물을 사용하여 15초 이상 물로 배양한 다음 즉시 1X PBS를 추가하여 세척하여 비식세포작용 적혈구를 제거할 수 있습니다.
9. RPMI-1640 완전 배지의 2-3mL(초기 ACD 튜브당 0.5mL 사용)로 PBMC 펠릿을 재구성합니다. trypan blue와 1:1 혼합물을 준비한 후 혈구계로 PBMC를 계수합니다. 트리판 블루로 염색되지 않은 세포만 계산합니다. RPMI-1640 완전 배지에서 PBMC를 2 x 10⁶ cells/mL로 재구성합니다.

2. M1/M2 대식세포의 배양

1. 단핵구의 Day 0 파종
   1. 각 대식세포 집단에 대해 25mL 세포 배양 플라스크를 준비합니다. 폴리-D-라이신 5mL(50mg/500mL)를 각각 넣고 후드에 최소 1시간 동안 그대로 둡니다. 플라스크를 PBS로 헹구어 잔류 폴리-D-라이신을 제거합니다.
   2. 평소와 같이 Buffy coat 또는 환자 샘플에서 PBMC를 분리합니다(1단계 참조). PBMC 펠릿이 생성된 후 예열된 RPMI-1640 완전 배지 10mL에 재현탁합니다.
   3. 세포 수를 확인하고 Monocyte isolation kit로 단핵구 분리를 시작합니다. 키트를 실행하려면 최소 50 x 10⁶ 셀을 사용하십시오.
   4. 분리 배지에서 50 x 10⁶ cells/mL로 세포를 재현탁합니다. 얻은 세포 번호에 따라 단핵구 분리 키트에서 권장하는 자주색(0.25-2 mL) 또는 회색(0.5-8.5 mL) 자석을 사용합니다.
   5. 키트 지침에 따라 샘플을 필요한 프로필렌 튜브(5mL 또는 14mL)에 추가합니다. 50 μL/mL의 시료에 농축 칵테일을 추가합니다.
   6. 피펫을 위아래로 또는 와류로 만들어 샘플을 혼합한 다음 얼음 양동이에서 2-8°C에서 10분 동안 배양합니다. 한편, 30초 동안 소용돌이 자성 입자. 배양 후 시료에 자성 입자를 추가합니다(시료 100μL/ml).
   7. 피펫을 위아래로 또는 와류로 만들어 샘플을 혼합한 다음 2-8°C에서 5분 동안 배양합니다. 등급이 매겨진 피펫을 사용하여 2.5 mL 또는 10 mL의 분리 배지를 보충합니다. 피펫을 위아래로 2x-3x 혼합합니다.
   8. 튜브(뚜껑 없음)를 자석에 넣고 실온에서 2.5분 동안 배양합니다. 자석을 들고 한 번의 연속 동작으로 자석과 튜브를 뒤집어 세포 현탁액을 새 튜브(5mL 또는 14mL)에 붓습니다.
   9. RPMI-1640 배지에 세포를 재현탁하고 계수합니다. 가능한 한 빨리 이 단계를 수행합니다. 1 x 10⁶ – 5 x 10⁶ monocyte를 이전에 poly-D-lysine이 사전 코팅된 각 25mL 플라스크에 파종합니다. 필요한 경우 RPMI-5을 사용하여 부피를 1640mL로 가져옵니다.
   10. 37 ° C, 5 % CO₂에서 최소 2 시간 동안 배양하십시오. 한편, M1 및 M2 분화 매체를 준비합니다. 0일차(10mL) 및 4일차(2mL) 보충을 위해 충분히 준비하십시오.
       참고: M1 분화 매체: RPMI-1640 + 2.5 ng/mL GM-CSF; M2 분화 매체: RPMI-1640 + 50 ng/mL M-CSF.
   11. 배양 시간이 끝나면 각 플라스크를 PBS로 1x, 완전한 RPMI-1640으로 2x 세척합니다. 분화할 세포 유형에 따라 각 플라스크에 10mL의 분화 배지를 추가합니다.
   12. 인큐베이터에서 37 °C, 5 % CO₂에서 6 일 동안 세포를 분화시킵니다. 증발로 인해 4일차에 분화 배지를 보충하십시오.
2. 4일차 - 충전
   1. 각 분화 배지 2mL를 각 플라스크에 추가합니다. 배지를 플라스크에 직접 첨가합니다.
3. 6일차 - 대식세포 분극
   1. M1 및 M2 편광 매체를 준비합니다. M1 편광 매체의 경우 해당 플라스크에 추가할 M1 편광 배지 5mL를 준비합니다. RPMI-1640에서 최종 농도는 50ng/mL IFNγ, 10ng/mL LPS 및 2.5ng/mL GM-CSF여야 합니다. 끝에 있는 플라스크의 총 부피는 15mL(이미 10mL + 5mL 추가)이므로 그에 따라 계산을 수행합니다.
   2. M2 편광 매체의 경우 해당 플라스크에 추가할 M2 편광 배지 5mL를 준비합니다. 최종 농도는 RPMI-1640에서 20ng/mL IL-4 및 50ng/mL M-CSF여야 합니다. 끝에 있는 플라스크의 총 부피는 15mL입니다(이미 10mL + 5mL 추가). 그에 따라 계산을 수행합니다.
   3. 각 플라스크에 5mL의 M1 또는 M2 편광 배지를 추가합니다. 대식 세포를 최소 2 일 동안 4 일 이상 37 ° C, 5 % CO₂의 인큐베이터에서 분극화시킵니다.
4. 8일차 - 채취 및 유세포 분석
   1. M1 또는 M2 대식세포를 채취하기 전에 추가 사용(필요한 경우)을 위해 상등액을 1.5mL 튜브에 수집합니다. 플라스크에 세포 분리 용액 1mL를 추가하고 37°C, 5% CO₂ 의 인큐베이터에 5분 동안 그대로 둡니다.
   2. 반응을 멈추려면 완전한 RPMI-1640 3mL를 첨가합니다. 배지를 15mL 튜브에 모읍니다. 플라스크에 완전한 RPMI-1640 3mL를 추가하고 셀 스크레이퍼를 사용하여 플라스크 바닥에서 세포를 분리합니다.
   3. 15mL 튜브에 세포를 모읍니다. 플라스크를 현미경 아래에 10x로 놓고 세포를 관찰하여 플라스크 바닥에 더 이상 세포가 부착되지 않는지 확인합니다.
   4. PBS 2x에서 세포를 세척합니다. 완전한 RPMI-1640에 재현탁하고 혈구계를 사용하여 계수합니다.
   5. M1/M2 대식세포의 품질과 양을 분석하려면 유세포분석 분석을 실행하십시오. 튜브당 0.5 x 10⁶ 셀을 사용하고 다음과 같이 염색합니다: M1: CD80+ CCR7+ CD209- M2: CD206+ CD209+ CD80-. 이 분석에 사용된 게이팅 전략: #1 전방 산란(FSC-A) 대 측면 산란(SSC-A) 점도표, #2 전방 산란 높이(FSC-H) 대 전방 산란 영역(FSC-A) 도트 플롯, 이중선 변별을 위한 #3 측면 산란(SSC-A) 대 DAPI-A 점도표, #4 측면 산란(SSC-A) 대 단일 매개변수 도트 플롯 또는 히스토그램(즉, SSC-A 대 FITC-A), #5 이중 매개변수 도트 플롯(즉, FITC-A 대 APC-A).

3. M1/M2 대식세포를 사용하는 MMA

1. M1/M2 대식세포를 얻은 후 혈구계를 사용하여 트리판 블루와 1:1 염색 비율로 계수합니다. RPMI-1640 완전 배지에서 M1/M2를 1 x 10⁶ cells/mL로 재구성합니다.
2. 마이크로피펫을 사용하여 400μL(400,000개 세포)의 세포 현탁액을 8웰 챔버 슬라이드의 각 웰에 시딩하고 완전 가습된 조직 배양 인큐베이터에서 최소 1.5시간 동안 37°C, 5%_CO2 에서 배양합니다. 각 테스트는 최소 3개의 우물을 사용하여 수행해야 합니다.
3. 테스트 샘플 및 RhD+ R2R2 적혈구의 옵소니제이션
   1. 350 x g 에서 매번 5분 동안 원심분리하여 pH 7.4 PBS 3x에서 RhD+ R2R2 적혈구를 세척합니다. R2R2 RhD+ 적혈구는 D-항원 밀도가 더 높기 때문에 대조군으로 사용하는 것을 선호하지만 모든 RhD+ 적혈구를 대체할 수 있습니다. 관심 있는 항체를 사용하여 테스트 RBC 샘플(예: 환자 또는 기증자) RBC를 Opsonize합니다. 300μL의 항체 혼합물에 15μL의 패킹된 적혈구를 첨가하여 5% RBC 현탁액을 사용합니다. 300μL의 Anti-D 항체 혼합물(100ng/mL)에 15μL의 패킹된 R2R2 적혈구를 첨가하여 Anti-D로 R2R2 적혈구를 Opsonize합니다.
   2. 37 ° C, 5 % CO₂ 에서 1 시간 동안 배양합니다. 바닥에 가라앉은 적혈구의 간헐적 재구성을 수행합니다(예: 15분마다 와류). pH 7.4 PBS의 옵소니화된 적혈구를 350 x g 에서 매번 5분 동안 원심분리하여 세척합니다.
   3. 적혈구 옵소니제이션을 확인하려면 간접 항글로불린 검사(IAT)를 수행합니다. 1차 옵소니징 항체에 2차 옵소니징 항인간 항체를 추가합니다. 적혈구의 응집(hemugglutination) 또는 응집(clumping)은 30초 이내에 관찰될 수 있으며, 이는 성공적인 옵소니제이션(opsonization)으로 해석될 수 있다¹³.
   4. RPMI-1640 완전 배지를 사용하여 세척된 opsonized RhD+ R2R2 적혈구를 1.25%(v/v)로 재구성합니다. 1,200μL의 중간 - 15μL의 적혈구를 추가하여 웰당 1.25%(v/v)를 달성합니다.
4. Fc 수용체 매개 식세포작용(Fc receptor-mediated phagocytosis)
   1. M1/M2 대식세포를 1.5시간 배양한 후 이러한 세포가 챔버 슬라이드의 웰에 부착될 수 있도록 상층액을 흡인하고 부드러운 기술에 따라 폐기하여 피펫 팁이 웰의 모서리에만 닿도록 합니다. 대식 세포는 우물에 부착되어야합니다. 피펫 팁으로 웰 중앙을 만지지 마십시오.
   2. pH 7.4 PBS로 웰을 1x 부드럽게 세척합니다. 적절한 1.25%(v/v) 옵소니화된 RBC 혼합물 400μL를 삼중의 각 웰에 추가합니다. 37 ° C, 5 % CO₂ 에서 2 시간 동안 방해받지 않고 배양하십시오.
   3. 배양 후 pH 7.4PBS의 100mL를 가진 비커 2개를 준비합니다.
   4. 제조업체의 어댑터를 사용하여 8웰 챔버를 제거합니다. 종이 타월로 여분의 것을 두드리면서 슬라이드를 촉촉하게 유지하십시오.
   5. 버려진 상층액이 담긴 비커에 슬라이드를 담그고 앞뒤로 천천히(20-30스트로크) 움직여 세척하여 남아 있는 비식세포작용 적혈구를 제거합니다.
   6. 그런 다음 슬라이드를 두 번째 비커에 담그고 20-30회 더 천천히 씻습니다. PBS에서 슬라이드를 제거하고 종이 타월로 여분을 두드려 제거합니다. 챔버 전면을 만지지 마십시오. 이 시점에서 슬라이드를 물에 1분 동안 담궈 부착되지 않은 식세포작용 적혈구를 제거하지만, 식세포작용된 적혈구와 부착성 적혈구를 구별할 수 있다면 필요하지 않을 수 있습니다. 자연 건조.
   7. 슬라이드를 100% 메탄올에 45초 동안 담궈 고정한 다음 자연 건조합니다. 사내에서 준비한 장착 매체를 사용하여 슬라이드를 장착하고 커버 슬립(24 x 75mm)을 추가합니다. 정량화하기 전에 밤새 건조시키십시오.
5. phagocytosis의 정량화
   1. 위상차 현미경, 40x 대물 렌즈 및 수동 세포 계수기를 사용하여 식세포작용을 정량화합니다.
   2. 양손에 하나씩 있는 두 개의 수동 세포 계수기를 사용하여 하나의 카운터로 식세포화된 적혈구를 계산하고 다른 카운터로 단핵구/대식세포의 총 수를 계산합니다. 웰당 300개의 단핵구/대식세포를 계산합니다.
   3. 식세포작용된 적혈구의 수를 계수된 총 단핵구의 수로 나누고 100을 곱하여 테스트당(삼중회에 걸쳐) 평균 식세포 지수(PI)를 계산합니다. 데이터를 평균 PI ± SEM(Standard Error of the Mean)으로 표현합니다.
      PI = (식세포작용된 적혈구 / 대식세포 300개) x 100

그림 1의 결과는 문헌과 일치하며 대식세포가 M0 상태에서 후속 M1/M2 상태로 성공적으로 분극되었음을 나타냅니다. M1 및 M2 대식세포를 8일(성장 인자 6일, 편광 2일) 동안 배양하고 anti-D 또는 anti-k opsonized 적혈구를 테스트했습니다(그림 2). M2 대식세포는 M1에 비해 높은 식세포 지수를 보이며, 적혈구는 anti-D(대조군) 또는 anti-k에 의해 oponized됩니다. 이 결과는 M-MA를 사용하여 수행된 다른 예비 테스트와 일치합니다(표 1 참조). M2 대식세포는 강력한 RBC 항체가 있더라도 M1 대식세포 또는 단핵구에 비해 식세포가 매우 높습니다(그림 2B). 표 1은 임상적으로 유의한 것으로 간주되는 특이성을 가진 4개의 서로 다른 RBC 동종항체에 대한 예비 결과를 보여줍니다. 항원 양성 적혈구를 옵소니화하는 데 사용되고 MMA에서 단핵구에 첨가된 항체는 약한 식세포작용을 나타냅니다(PI < 5). M1 대식세포에 첨가된 이와 동일한 항체로 opsonized 적혈구도 약한 식세포작용을 보입니다(PI < 12). M2 대식세포에 동일한 항체를 첨가한 적혈구는 높고 유의한 식세포작용(PI > 12)을 보이며, 이는 단핵구 및 M1에 비해 임상적 유의성을 더 잘 예측할 수 있는 이러한 대식세포의 능력을 보여줍니다.  관찰된 결과를 바탕으로 M2 대식세포의 사용이 수혈 의학에서 적혈구 항체의 임상적 중요성을 더 잘 예측할 수 있다는 결론을 내릴 수 있습니다. 또한 면역학의 현재 방법은 보다 정확한 결과를 제공하고 임상적 관련성으로 해석될 수 있으므로 이 논문에 표시된 방법에 적응하는 것이 유용할 수 있습니다. 그러나 MMA와 M-MA를 비교하여 특이성과 임상적 유의성 또는 유의성을 나타내는 임상 데이터를 가진 RBC 항체를 조사하는 더 많은 연구가 필요합니다.

그림 1: M1/M2 대식세포의 편광 및 특성화. (A) 기증자 버피 코트는 밀도 구배 분리를 사용하여 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 추출하는 데 사용됩니다. 그런 다음 CD16+/CD14+ 단핵구를 PBMC에서 분리하고 두 개의 배양 플라스크에 넣어 37°C에서 6일 동안 분화하고 4일째에 보충합니다. 분화 매체: M1- GM-CSF(2.5ng/mL) 및 M2- M-CSF(50ng/mL). 편광 배지는 144 h에서 각 해당 플라스크에 추가되고, 대식 세포는 37 ° C에서 추가로 48 시간 동안 분극화되도록 남겨 둡니다. 분극 매체: M1 – IFN-gamma (50 ng/mL), LPS (10 ng/mL) 및 GM-CSF (2.5 ng/mL). M2 – IL-4(20ng/mL) 및 M-CSF(50ng/mL). 그런 다음 세포를 수확하고 유세포 분석법으로 특성화를 위해 표시하거나 식세포작용 분석에 사용할 수 있습니다(그림 2). (B) M1 대 M2 대식세포 체외 형태학. 편광 2일 후에 촬영한 이미지. A. M1 대식세포는 원형과 원형 형태를 나타냅니다. B. M2 대식세포는 뚜렷하고 신축성이 있으며 긴 형태를 가지고 있으며, 둘 다 성공적인 분극을 나타냅니다. (C) CD80(M1) 및 CD209(M2)를 특징으로 하는 M1/M2 대식세포의 유세포 분석. M1/M2 대식세포를 8일 동안 배양하고 유세포분석을 사용한 특성화를 위해 CD80-FITC 및 CD209-PECy7로 표지했습니다. A. M1 대식세포는 CD80의 약 86.1%, CD209의 0.17% 발현을 나타냅니다. B. M2 대식세포는 CD209 발현의 97.3%와 CD80 발현의 0.003%를 나타냅니다. (D) M1/M2 대식세포에서 CD80 및 CD209의 형광 신호. M1/M2 대식세포를 8일 동안 배양하고 유세포 분석에 의한 특성 분석을 위해 CD80-FITC 또는 CD209-PECy7로 표지했습니다. A. CD80의 평균 형광 강도(MFI)는 M2보다 M1에서 훨씬 높습니다. CD209의 MFI는 M1보다 M2에서 훨씬 높습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 단핵구-대식세포 분석법(M-MA). (A) M1/M2는 성장 인자로 6일 동안 배양한 다음 사이토카인으로 2일 동안 배양하여 분극화합니다. 그런 다음 M1/M2 대식세포를 챔버 슬라이드에 넣고 37°C에서 2시간 동안 배양합니다. 선택한 항체/혈청을 사용하여 적혈구를 옵소니화하고 15분마다 간헐적으로 혼합하여 1시간 동안 배양합니다. 옵소니즈화된 적혈구를 대식세포가 부착된 챔버 슬라이드에 넣고 37°C에서 방해받지 않고 2시간 동안 배양합니다. 슬라이드는 PBS에서 세척됩니다. 세포는 메탄올을 사용하여 고정되고 플라바놀로 장착됩니다. 세포는 40x에서 위상차 현미경을 사용하여 계수됩니다. 식세포 지수(PI)는 300개의 대식세포와 해당 식세포화된 적혈구를 계수하여 계산됩니다. (B) M-MA는 M1 대 M2 대식세포를 anti-D 및 anti-k와 비교합니다. R2R2는 RhD+ 혈액을 나타냅니다. K+k+는 이형접합 K+k+ 적혈구를 나타냅니다. 오차 막대는 SD를 나타내며 p-값 < 0.05가 유의한 것으로 간주되어 t-검정을 수행했습니다. (C) M1에 의한 anti-k phagocytosed 대 M-MA에 의한 M2 대식세포로 opsonized 적혈구. 사진은 위상차 현미경을 사용하여 40x로 촬영했습니다. a. M1 대식세포는 anti-k로 opsonized 된 적혈구와 함께 거의 식세포 활성을 보이지 않습니다. b. M2 대식세포는 anti-k로 opsonized 적혈구와 함께 높은 식세포 활성을 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

표 1. M2 대식세포의 사용은 단핵구 (MMA)에 비해 M-MA 분석에서 임상적으로 유의할 수 있는 적혈구 항체를 더 잘 예측할 수 있습니다.

이 방법의 성공을 보장하기 위해서는 다음과 같은 중요한 단계를 준수해야 합니다: 1) 성공적인 M1/M2 분극화, 2) 대식세포층 및 RhD+ 제어 생성 3) 식세포 지수의 정량화. 당사의 방법은 세포 배양을 위해 분리된 단핵구를 사용한다고 명시되어 있지만 PBMC를 사용할 수 있지만 정제된 단핵구를 사용하는 것이 좋습니다. PBMC는 다양한 세포 유형을 포함하는 것으로 알려져 있으며, 이러한 세포는 여러 가지 다른 사이토카인과 매개 인자를 분비합니다. 이것은 M1/M2 대식세포의 분화 또는 분극에 영향을 미칠 수 있습니다. 따라서 정제된 단핵구를 사용하면 더 나은 결과를 얻을 수 있습니다.  또한 STEMCELL 단핵구 분리 키트를 사용할 때 약 10%의 단핵구가 원래 양의 PBMC에서 얻어진다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 50 x 10⁶ PBMCs는 약 5 x10⁶ monocyte를 얻기 위한 PBMC의 최소 시작 수임이 관찰되었다. 부착된 단핵구로 플라스크를 세척할 때는 세포가 분리되지 않도록 소용돌이치는 동작으로 부드럽게 세척해야 합니다. 인큐베이터에서 증발이 발생하기 때문에 배양 4일차에 보충 배지 단계가 필요합니다. M1/M2에서 분비되는 사이토카인은 분화에 중요하므로 배지를 버리지 말고 플라스크에 배지를 첨가하십시오. 2일 분극 후 M1/M2 대식세포는 실험에 사용하거나 최대 7일 동안 배양할 수 있습니다. 편광의 길이는 유연하며 관찰된 결과에 따라 조정할 수 있지만 성공적인 편광을 위해서는 최소 2일이 걸립니다. 유세포 분석 단계는 절차를 설정할 때만 필요합니다. 분석이 제대로 실행되고 반복 실행으로 M1/M2 세포를 성공적으로 특성화한 경우 이 단계를 생략하도록 선택합니다. 얻어진 수율은 M1의 약 90%(CD80+ CCR7+ CD209-) 및 M2의 85%(CD206+ CD209+ CD80-) 이상이어야 합니다. M1은 CD209 또는 CD206에 대해 양성일 수 있습니다. 이러한 마커는 M1에서 약하게 발현되지만 여전히 성공적인 분극을 나타내기 때문에 이는 정상입니다. M2 대식세포는 CD80에 대해 항상 음성이어야 합니다.

M-MA에서 대식세포층은 챔버 슬라이드에 조심스럽게 배치해야 합니다. M1/M2의 파종 수는 필요한 경우 웰당 최대 250,000개의 세포까지 낮출 수 있지만 일반적으로 400,000-500,000개 범위여야 합니다. 더 많은 양은 뭉치고 부정확한 판독값을 초래할 수 있습니다. 챔버에 용액을 흡인하거나 추가할 때 부드럽습니다. 피펫의 끝은 약하게 부착된 세포를 피하면서 웰의 모서리에만 닿아야 합니다. 우물이 건조되는 것을 방지하려면 용액을 추가하고 매체를 교환할 때 기술적 삼중으로 작업하십시오. 슬라이드 전면을 만지지 마십시오. 대식세포나 단핵구가 손실될 수 있습니다. RhD+ R2R2 RBC는 활성을 보장하기 위해 FcγR 매개 식세포작용에 대한 양성 대조군으로 사용됩니다. 옵소니제이션(opsonization)을 위해 RhD+ R2R2 적혈구를 사용하고 양성 대조군(positive control)을 위해 anti-D를 사용하지만, 모든 RhD+ 적혈구를 사용할 수 있습니다 ^1,2. 이 분석에서 적혈구를 옵소니징할 때 적절한 농도의 항체를 사용해야 합니다. 너무 많은 양을 섭취하면 적혈구가 응집되어 슬라이드를 읽을 수 없게 됩니다. 마지막으로, 한 명 이상의 실험실 직원이 슬라이드를 세는 것이 좋습니다. 현미경을 사용한 수동 정량화는 주관적이기 때문에 까다로울 수 있으며, 이는 서로 다른 챔버 웰과 실험 간의 계수 간에 높은 변동성을 시사합니다. 세포가 계수되는 시야의 일관성과 더 많은 수의 세포를 계수하면 보다 정확한 결과를 얻을 수 있습니다.

이 방법의 한계는 식세포 지수를 정량화하는 주관적인 특성과 기증자 혈액 간의 가변성을 포함합니다. PBMC는 M1/M2 세포 배양을 확립하기 위해 공여자의 버피 코트에서 추출되며, 실험실의 예비 데이터는 공여자에 따라 M1 및 M2 식세포 활성이 상당한 차이를 보여줍니다. 동일한 항체는 한 기증자의 M2 세포가 다른 기증자의 세포에 비해 더 높은 식세포 지수를 생성할 수 있습니다. 변동성을 줄이고 일관성을 유지하려면 공동 기부자 자원을 만드는 것이 도움이 될 수 있으며, 이는 MMA에서 사용되는 적혈구에도 적용됩니다. 일관된 방법을 유지하더라도 RBC/PBMC 기증자 혈액 간에 약간의 변동은 항상 존재합니다.

MMA와 M-MA에 대한 주요 비판은 단핵구 또는 대식세포와 그에 상응하는 식세포작용 적혈구(RBC)를 계수하는 데 내재된 주관성입니다. 확립된 프로토콜에도 불구하고 현미경 하에서 개별 계수 기술의 변동성은 불가피합니다. 이 문제를 해결하기 위해 실험실 직원이 시야에서 일관된 시작점을 정의하거나 계수를 위한 표본 크기를 늘리는 것과 같은 표준화된 정량화 접근 방식을 확립하는 것이 도움이 될 것입니다. 이러한 측정을 구현하면 세포 계수의 일관성과 정확성이 향상되어 궁극적으로 보다 신뢰할 수 있는 결과와 결론을 얻을 수 있습니다.

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이 연구는 온타리오주 토론토에 있는 캐나다 혈액 서비스 혁신 센터(Canadian Blood Services Centre for Innovation)의 지원과 자금 지원을 받습니다. 연구는 온타리오주 토론토에 있는 세인트 마이클스 병원(St. Michaels Hospital)의 키넌 생물의학 연구 센터(Keenan Research Centre for Biomedical Sciences)에서 수행됩니다.