Predicción de la importancia de los anticuerpos contra los glóbulos rojos mediante el ensayo de monocitos y macrófagos

Hemos desarrollado mejoras y actualizado métodos para el ensayo monocito-monocapa (MMA) existente, en el que se utilizan macrófagos para ayudar a predecir mejor la relevancia clínica de los aloanticuerpos de glóbulos rojos en medicina transfusional e inmunología. Este ensayo se denomina ensayo de monocitos-macrófagos (M-MA).

Derivados de los monocitos de la médula ósea, los macrófagos son grandes células inmunitarias innatas que desempeñan un papel importante en la eliminación de células muertas, desechos, células tumorales y patógenos extraños. La capacidad fagocítica de los monocitos frente a los macrófagos es un concepto que no se entiende bien. Aquí, nuestro objetivo es examinar una diferencia en la fagocitosis de los monocitos frente a los macrófagos, concretamente los macrófagos M1/M2, frente a varios glóbulos rojos opsonizados utilizando una versión modificada y actualizada del ensayo de monocapa de monocitos (MMA) establecido. Las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) se aislaron de los abrigos leucocitarios de donantes. Utilizando monocitos purificados, se produjeron macrófagos inflamatorios M1 y antiinflamatorios M2 mediante cultivo in vitro y polarización. Las células M1/M2 se recolectaron y se utilizaron en un ensayo similar a MMA, al que nos referimos como M-MA, para descifrar la fagocitosis clínicamente significativa de varios anticuerpos de glóbulos rojos. Un índice fagocítico (IP) > 5 se consideró fagocitosis clínicamente significativa con el uso de monocitos. Un índice fagocítico (IP) > 12 se consideró fagocitosis clínicamente significativa con el uso de macrófagos M1/M2. Los macrófagos M2 demuestran una mayor capacidad para fagocitar los glóbulos rojos opsonizados en comparación con los monocitos y los M1. El mismo anticuerpo débil (anti-S) produce una fagocitosis significativa con solo macrófagos M2 (PI = 43) pero no con M1 (PI = 2) o monocitos (PI = 0), y esto se demostró repetidamente utilizando varios anticuerpos. El uso de macrófagos M2 en lugar de monocitos puede permitir resultados más precisos, ya que estas células son más fagocíticas, lo que ofrece una mayor relevancia clínica al ensayo. Otros estudios con diferentes anticuerpos contra los glóbulos rojos, incluida la validación del ensayo de monocitos y macrófagos (M-MA) con anticuerpos que tienen significado clínico conocido, pueden mostrar que la M-MA es más útil para ayudar a predecir los aloanticuerpos de glóbulos rojos clínicamente significativos y las reacciones a las transfusiones. Este método hará avanzar el campo de la medicina transfusional y la inmunología.

La predicción de las reacciones transfusionales sigue siendo un reto importante en el campo de la medicina transfusional. Durante las últimas 4 décadas, el ensayo monocapa de monocitos (MMA), iniciado por Tong y Branch ^1,2, ha servido como un valioso ensayo celular in vitro para predecir el resultado clínico de la hemólisis en pacientes con transfusiones de sangre¹. De hecho, este ensayo ha sido fundamental para distinguir entre anticuerpos de glóbulos rojos (RBC) clínicamente significativos e insignificantes². Si bien los monocitos han sido tradicionalmente el leucocito estándar utilizado en este ensayo, nuestra investigación tiene como objetivo explorar los beneficios potenciales del uso de macrófagos derivados de monocitos como alternativa. Estas células pueden mejorar la capacidad de los ensayos para evaluar la relevancia clínica de los aloanticuerpos de los glóbulos rojos.

En el MMA histórico, los monocitos, que son los precursores de los macrófagos, las células inmunitarias responsables de la eliminación y destrucción de los glóbulos rojos durante una reacción adversa a la transfusión, se introducen en un ensayo in vitro junto con los glóbulos rojos y los anticuerpos 1,2,3,4,5,6,7 . A continuación, la fagocitosis se evalúa visualmente mediante el recuento de glóbulos rojos fagocitados dentro de los monocitos. Un índice fagocítico (IP) de < 5 glóbulos rojos fagocitados por cada 100 monocitos contados indica que el paciente tiene un riesgo reducido de experimentar una reacción adversa a la transfusión, y el anticuerpo se considera clínicamente insignificante 4,5,6,7. Los experimentos preliminares demuestran que el uso de monocitos derivados de la sangre periférica puede no ser ideal para determinar la importancia clínica, ya que tienen una capacidad fagocítica más baja que los monocitos activados y ciertos macrófagos.

Los monocitos son un subconjunto de células que se encuentran en la sangre, el bazo y la médula ósea y representan el 10% del total de leucocitos^{en los seres} humanos. Estas células suelen circular durante 1-2 días antes de ser reclutadas por diferentes tejidos, donde pasan a diferenciarse en macrófagos⁸. Esto suele ocurrir durante la hematopoyesis, en la que la médula ósea produce monocitos que se liberan a la circulación para convertirse en macrófagos tisulares que residen en el bazo y^{el hígado.} Conocidos como la primera línea de defensa contra patógenos extraños, los macrófagos son grandes células mononucleares fagocíticas que desempeñan un papel en la inmunidad adaptativa e innata⁹. Entre las intrincadas y complejas funciones del sistema inmunitario, la comprensión y caracterización de los fenotipos de los macrófagos presenta un desafío formidable que aún no se comprende completamente. En las últimas dos décadas, la noción de polarización de macrófagos ha obtenido un reconocimiento cada vez mayor, con estudios recientes que emplean el uso de la secuenciación de ARN de una sola célula para discernir el espectro en el que existen estos macrófagos.

Los macrófagos M1 y M1 activados clásicamente surgen en ambientes inflamatorios dominados por receptores tipo Toll (TLRs)¹⁰. Estas células pueden estar implicadas en enfermedades autoinmunes y arteriosclerosis y presentan marcadores de superficie como MHC-II, CD80 y CD86^11,12. Los macrófagos antiinflamatorios M2 y M2 se encuentran en ambientes dominados por respuestas Th2, carecen de expresión de CD80 y presentan marcadores de superficie como CD209 y CD206^11,12. Los macrófagos M1/M2 pueden cultivarse in vitro a partir de células mononucleares de sangre periférica, con lipopolisacáridos (LPS) y citocinas como GM-CSF e IFNγ (M1) y M-CSF e IL-4 (M2) estimulando su polarización^10,12.

Este manuscrito y los estudios asociados tienen como objetivo demostrar que los macrófagos M2 exhiben una mayor sensibilidad a la fagocitosis en comparación con los macrófagos y monocitos M1. La investigación de la actividad fagocítica de los macrófagos M1/M2 frente a los monocitos en el contexto de los aloanticuerpos de glóbulos rojos y la medicina transfusional es un área que aún no se ha explorado. Aquí, describimos el trabajo actual en curso para la generación de macrófagos M1/M2 y comparamos el clásico ensayo de monocitos monocapa (MMA) con el nuevo ensayo de monocitos-macrófagos, utilizando el acrónimo M-MA para distinguir este ensayo de macrófagos del ensayo de monocitos, para mejorar el valor predictivo de los ensayos de fagocitosis in vitro .

Esta investigación se realizó de acuerdo con las directrices institucionales para la realización de investigaciones éticas con seres humanos. La aprobación ética fue otorgada por la Junta de Ética de Investigación de los Servicios Canadienses de Sangre (REB), aprobación CBSREB # 2023.008. Todos los pasos de este protocolo deben llevarse a cabo en una cabina de bioseguridad en condiciones estériles.

1. Aislamiento de las PBMC

1. Obtener sangre humana completa de un donante en un tubo de ACD. Almacene la sangre a temperatura ambiente (18 °C a 22 °C) durante un máximo de 36 h.
2. Transfiera los tubos de ACD de sangre entera a tubos centrífugos de 50 mL (un solo tubo de 50 mL por cada dos tubos de ACD). Agregue el medio completo RPMI-1640 a temperatura ambiente hasta un volumen final de 35 mL.
3. Agregue 15 mL de medio de gradiente de densidad a temperatura ambiente a un nuevo tubo de 50 mL. Coloque cuidadosamente la sangre entera diluida sobre el medio de gradiente de densidad, minimizando la mezcla en la interfaz para una separación óptima de la sangre.
4. Centrifugar la mezcla en capas a 700 x g durante 30 min con los frenos apagados. La centrifugación en gradiente de densidad separará la mezcla en las siguientes capas de arriba a abajo: plasma, capa leucocitaria (que contiene PBMC), material de gradiente de densidad, granulocitos y glóbulos rojos.
5. Aspire y deseche la mayor parte de la capa superior (plasma). Con una pipeta de transferencia, recupere con cuidado la capa de capa leucocitaria (PBMC), evitando traer material adicional. Transfiera las PBMC recuperadas a un nuevo tubo de 50 ml.
6. Lave la capa de capa leucocitaria aislada 1 vez con una solución de PBS de pH 7,4 durante 10 minutos a 350 x g con los frenos completamente activados.
7. Utilice un filtro de células de 70 μM para eliminar los residuos o el material no deseado de las PBMC antes de transferirlas a un tubo cónico de 15 mL. Lavar 2 veces con una solución de PBS de pH 7,4 durante 10 minutos a 350 x g con los frenos completamente activados.
8. Opcional: Lisar los glóbulos rojos arrastrados con el tampón de lisis ACK. Agregue 5-10 mL de tampón de lisis ACK, dependiendo del tamaño del pellet, e incube a temperatura ambiente durante un máximo de 3 minutos. Después de la incubación, rellene con pH 7,4 PBS y centrifugue durante 10 minutos a 350 x g con los frenos completamente activados y lave 1 vez. Realice este paso si el número de glóbulos rojos es demasiado alto.
   NOTA: Siempre es mejor evitar el uso de ACK para obtener mejores resultados. Alternativamente, se puede usar agua para eliminar los glóbulos rojos no fagocitados incubando con agua durante no más de 15 segundos, luego agregue inmediatamente 1X PBS para lavar.
9. Reconstituya el pellet de PBMC en 2-3 mL (use 0.5 mL por tubo ACD inicial) del medio completo RPMI-1640. Cuente las PBMC con un hemocitómetro después de preparar una mezcla 1:1 con azul de tripán. Solo cuenta las células que no están teñidas con azul tripano. Reconstituya las PBMC a 2 x 10⁶ células/mL en medio completo RPMI-1640.

2. Cultivo de macrófagos M1/M2

1. Día 0 siembra de monocitos
   1. Prepare un matraz de cultivo celular de 25 ml para cada población de macrófagos. Agregue 5 mL de poli-D-lisina (50 mg/500 mL) a cada uno y déjelo en la campana durante al menos 1 h. Enjuague el matraz con PBS para eliminar la poli-D-lisina residual.
   2. Aísle las PBMC del pelaje leucocitario o de las muestras de los pacientes, como de costumbre (consulte el paso 1). Después de generar un pellet de PBMCs, resuspenderlo en 10 mL de medio completo RPMI-1640 precalentado.
   3. Determine el número de células y comience el aislamiento de monocitos con el kit de aislamiento de monocitos. Para ejecutar el kit, use al menos 50 x 10⁶ celdas.
   4. Vuelva a suspender las células a 50 x 10⁶ células/mL en un medio de aislamiento. De acuerdo con el número de células obtenido, utilice el imán púrpura (0,25-2 mL) o gris (0,5-8,5 mL) recomendado en el kit de aislamiento de monocitos.
   5. Siga las instrucciones del kit y agregue la muestra al tubo de propileno requerido (5 mL o 14 mL). Añadir cóctel de enriquecimiento a la muestra a 50 μL/mL de muestra.
   6. Pipetear hacia arriba y hacia abajo o en vórtice para mezclar la muestra y luego incubar a 2-8 °C durante 10 min en una cubitera. Mientras tanto, las partículas magnéticas de vórtice durante 30 s. Después de la incubación, añadir partículas magnéticas a la muestra: 100 μL/ml de muestra.
   7. Pipetear hacia arriba y hacia abajo o en vórtice para mezclar la muestra y luego incubar a 2-8 °C durante 5 min. Rellene con medio de aislamiento a 2,5 mL o 10 mL, según corresponda, utilizando una pipeta graduada. Pipetea hacia arriba y hacia abajo 2x-3x para mezclar.
   8. Coloque el tubo (sin tapa) en el imán e incube a temperatura ambiente durante 2,5 minutos. Tome el imán y, en un movimiento continuo, invierta el imán y el tubo, vertiendo la suspensión celular en un nuevo tubo, de 5 ml o 14 ml.
   9. Vuelva a suspender las células en el medio RPMI-1640 y cuéntelas. Realice este paso lo antes posible. Siembre entre 1 x 10⁶ – 5 x 10⁶ monocitos en cada matraz de 25 mL previamente recubierto con poli-D-lisina. Lleve el volumen a 5 mL con RPMI-1640 si es necesario.
   10. Incubar a 37 °C, 5% de CO₂, durante al menos 2 h. Mientras tanto, prepare los medios de diferenciación M1 y M2. Prepárese lo suficiente para la recarga del día 0 (10 ml) y el día 4 (2 ml).
       NOTA: Medio de diferenciación M1: RPMI-1640 + 2,5 ng/mL GM-CSF; Medio de diferenciación M2: RPMI-1640 + 50 ng/mL M-CSF.
   11. Después del tiempo de incubación, lave cada matraz 1 vez con PBS y 2 veces con RPMI-1640 completo. Añadir 10 mL de medio de diferenciación a cada matraz según el tipo de célula a diferenciar.
   12. Deje que las células se diferencien durante 6 días en la incubadora a 37 °C, 5% de CO₂. Debido a la evaporación, rellene con medio de diferenciación el día 4.
2. Día 4 - Recarga
   1. Añada 2 mL de cada medio de diferenciación al matraz correspondiente. Agregue medio directamente al matraz.
3. Día 6 - Polarización de macrófagos
   1. Prepare los medios de polarización M1 y M2. Para el medio de polarización M1, prepare 5 mL de medio de polarización M1 para agregar al matraz correspondiente. Las concentraciones finales deben ser 50 ng/mL de IFNγ, 10 ng/mL de LPS y 2,5 ng/mL DE GM-CSF en RPMI-1640. El matraz al final tendrá 15 mL de volumen total (10 mL ya en + 5 mL a agregar), haga los cálculos en consecuencia.
   2. Para los medios de polarización M2, prepare 5 mL de medio de polarización M2 para agregarlos al matraz correspondiente. Las concentraciones finales deben ser de 20 ng/mL de IL-4 y 50 ng/mL DE M-CSF en RPMI-1640. Tenga en cuenta que el matraz al final tendrá 15 mL de volumen total (10 mL ya en + 5 mL a agregar); Haz los cálculos en consecuencia.
   3. Agregue 5 mL de medio de polarización M1 o M2 a cada matraz. Deje que los macrófagos se polarizen durante al menos 2 días y no más de 4 días en la incubadora a 37 °C, 5% de CO₂.
4. Día 8 - Cosecha y citometría de flujo
   1. Antes de recolectar los macrófagos M1 o M2, recoja el sobrenadante en tubos de 1,5 ml para su uso posterior (si es necesario). Añadir 1 mL de solución de desprendimiento de células al matraz y dejarlo en la incubadora a 37 °C, 5% CO₂ durante 5 min.
   2. Para detener la reacción, agregue 3 mL de RPMI-1640 completo. Recoja los medios en un tubo de 15 ml. Agregue 3 mL de RPMI-1640 completo al matraz y use un raspador de celdas para separar las celdas del fondo del matraz.
   3. Recoja las células en un tubo de 15 ml. Coloque el matraz bajo el microscopio a 10x y observe las células para asegurarse de que no haya más células adheridas al fondo del matraz.
   4. Lave las celdas en PBS 2x. Vuelva a suspenderlos en RPMI-1640 completo y cuente con el hemocitómetro.
   5. Para analizar la calidad y cantidad de macrófagos M1/M2, ejecute un ensayo de citometría de flujo. Utilice 0,5 x 10⁶ células por tubo y tiña de la siguiente manera: M1: CD80+ CCR7+ CD209- M2: CD206+ CD209+ CD80-. Estrategia de compuerta utilizada en este ensayo: #1 Diagrama de puntos de dispersión directa (FSC-A) frente a dispersión lateral (SSC-A), #2 Diagrama de puntos de altura de dispersión directa (FSC-H) frente a área de dispersión directa (FSC-A) para discriminación de dobletes, #3 Diagrama de puntos de dispersión lateral (SSC-A) frente a DAPI-A para la discriminación de celdas vivas/muertas, #4 Diagrama de dispersión lateral (SSC-A) frente a diagrama de puntos o histograma de un solo parámetro (es decir, SSC-A vs. FITC-A), #5 Diagrama de puntos de doble parámetro (es decir, FITC-A vs. APC-A).

3. MMA con macrófagos M1/M2

1. Después de obtener los macrófagos M1/M2, cuéntelos con un hemocitómetro en una proporción de tinción de 1:1 con azul de tripán. Reconstituya M1/M2 a 1 x 10⁶ células/mL en medio completo RPMI-1640.
2. Siembre 400 μL (400.000 células) de suspensión celular utilizando una micropipeta en cada pocillo del portaobjetos de la cámara de 8 pocillos e incube a 37 °C, 5% de CO₂ durante al menos 1,5 h en una incubadora de cultivo de tejidos totalmente humidificada. Cada prueba debe realizarse utilizando un mínimo de pocillos triplicados.
3. Opsonización de muestras de prueba y glóbulos rojos RhD+ R2R2
   1. Lave los glóbulos rojos RhD+ R2R2 a pH 7.4 PBS 3x centrifugando a 350 x g durante 5 min cada vez. Preferimos usar glóbulos rojos R2R2 RhD+ como control debido a que tienen una mayor densidad de antígeno D, pero cualquier glóbulo rojo RhD+ podría ser sustituido. Opsonizar la muestra de glóbulos rojos de la prueba (por ejemplo, paciente o donante) utilizando anticuerpos de interés. Utilice una suspensión de glóbulos rojos al 5% añadiendo 15 μl de glóbulos rojos empaquetados a 300 μl de mezcla de anticuerpos. Opsonice los glóbulos rojos R2R2 con Anti-D añadiendo 15 μl de glóbulos rojos R2R2 empaquetados a 300 μl de mezcla de anticuerpos Anti-D (100 ng/ml).
   2. Incubar a 37 °C, 5% CO₂ durante 1 h. Llevar a cabo la reconstitución intermitente de los glóbulos rojos asentados en el fondo (p. ej., vórtice cada 15 min). Lave los glóbulos rojos opsonizados con pH 7,4 PBS 3x por centrifugación a 350 x g durante 5 min cada vez.
   3. Para comprobar la opsonización de los glóbulos rojos, realice una prueba de antiglobulina indirecta (IAT). Agregue un anticuerpo antihumano opsonizante secundario al anticuerpo opsonizante primario. La hemaglutinación o aglomeración de glóbulos rojos puede observarse a los 30 s y se interpreta como una opsonización exitosa¹³.
   4. Reconstituya los glóbulos rojos RhD+ R2R2 opsonizados lavados al 1,25% (v/v) con el medio completo RPMI-1640. Agregue 1,200 μL de medio a 15 μL de glóbulos rojos para lograr 1.25% (v/v) por pocillo.
4. Fagocitosis mediada por el receptor Fc
   1. Después de la incubación de 1,5 h de los macrófagos M1/M2, para permitir que estas células se adhieran a los pocillos de la cámara, se desliza el medio sobrenadante y se desecha, siguiendo una técnica suave, asegurándote de que la punta de la pipeta solo toque la esquina de los pocillos. Los macrófagos deben adherirse a los pocillos. Evite tocar el centro de los pocillos con la punta de la pipeta.
   2. Lave suavemente los pocillos 1x con pH 7.4 PBS. Añada 400 μL de la mezcla adecuada de glóbulos rojos opsonizados al 1,25% (v/v) a cada pocillo del triplicado. Incubar a 37 °C, 5% de CO₂ durante 2 h sin perturbaciones.
   3. Después de la incubación, prepare dos vasos de precipitados con 100 mL de pH 7.4 PBS en cada uno.
   4. Retire las cámaras de 8 pocillos con los adaptadores del fabricante. Frota el exceso con una toalla de papel mientras mantienes los portaobjetos húmedos.
   5. Sumerja el portaobjetos en el vaso de precipitados con los sobrenadantes desechados y lávelo moviéndolo lentamente hacia adelante y hacia atrás (20-30 pasadas) para eliminar los glóbulos rojos restantes no fagocitados.
   6. A continuación, sumerja el portaobjetos en el segundo vaso de precipitados y lávelo lentamente durante 20-30 pasadas más. Retire el portaobjetos del PBS y frote el exceso con una toalla de papel. Evite tocar la parte delantera de las cámaras. En este punto, sumerja el portaobjetos en agua durante 1 minuto para eliminar cualquier glóbulo rojo adherente no fagocitado, pero puede que no sea necesario si puede distinguir entre los glóbulos rojos fagocitados y adherentes.
   7. Sumerja los portaobjetos en metanol al 100% durante 45 s para fijarlos y luego séquelos al aire. Monte la guía utilizando un medio de montaje preparado internamente y agregue cubreobjetos (24 x 75 mm). Deje que se seque durante la noche antes de la cuantificación.
5. Cuantificación de la fagocitosis
   1. Usando un microscopio de contraste de fase, una lente de objetivo de 40x y un contador manual de células, cuantifique la fagocitosis.
   2. Con la ayuda de dos contadores manuales de células, uno en cada mano, cuente los glóbulos rojos fagocitados con un contador y el número total de monocitos/macrófagos con el otro. Cuente 300 monocitos/macrófagos por pocillo.
   3. Calcule el índice fagocítico (IP) promedio por prueba (por triplicado) dividiendo el número de glóbulos rojos fagocitados por el número de monocitos totales contados y multiplicándolo por 100. Exprese los datos como PI promedio ± error estándar de la media (SEM).
      PI = (glóbulos rojos fagocitados / 300 macrófagos) x 100

Los resultados de la Figura 1 son consistentes con la literatura e indican una polarización exitosa de los macrófagos desde su estado M0 hasta su estado M1/M2 posterior. Los macrófagos M1 y M2 se cultivaron durante 8 días (6 días con factores de crecimiento y 2 días de polarización) y se probaron glóbulos rojos opsonizados anti-D o anti-k (Figura 2). Los macrófagos M2 muestran un alto índice fagocítico en comparación con los M1 con glóbulos rojos opsonizados por anti-D (control) o anti-k. Este resultado es consistente con otras pruebas preliminares realizadas con M-MA (ver Tabla 1). Los macrófagos M2 son altamente fagocíticos en comparación con los macrófagos o monocitos M1, incluso con anticuerpos glóbulos rojos fuertes (Figura 2B). En la Tabla 1 se muestran los resultados preliminares con 4 aloanticuerpos diferentes de glóbulos rojos que tienen especificidades que se consideran clínicamente significativas. Los anticuerpos utilizados para opsonizar glóbulos rojos positivos para antígenos y añadidos a los monocitos en el MMA muestran una fagocitosis débil (PI < 5). Los glóbulos rojos opsonizados con estos mismos anticuerpos añadidos a los macrófagos M1 también muestran una fagocitosis débil (PI < 12). Los glóbulos rojos opsonizados con los mismos anticuerpos añadidos a los macrófagos M2 muestran una fagocitosis alta y significativa (PI > 12), lo que demuestra la capacidad de estos macrófagos para predecir mejor la importancia clínica en comparación con los monocitos y los M1.  Con base en los resultados observados, podemos concluir que el uso de macrófagos M2 puede ser más predictivo de la importancia clínica de los anticuerpos RBC en la medicina transfusional. Además, los métodos actuales en inmunología pueden resultar útiles para adaptarse a los métodos mostrados en este trabajo, ya que ofrecen resultados más precisos y pueden traducirse en relevancia clínica. Sin embargo, se requieren más estudios que examinen los anticuerpos de los glóbulos rojos con especificidades y datos clínicos que indiquen su importancia o insignificancia clínica, comparando el MMA con el M-MA.

Figura 1: Polarización y caracterización de macrófagos M1/M2. (A) Se utiliza un abrigo leucocitario de donante para extraer células mononucleares de sangre periférica (PBMC) mediante separación por gradiente de densidad. A continuación, los monocitos CD16+/CD14+ se aíslan de las PBMC y se colocan en dos matraces de cultivo para diferenciarlos a 37 °C durante 6 días, con una recarga el día 4. Medios de diferenciación: M1-GM-CSF (2,5 ng/mL) y M2- M-CSF (50 ng/mL). Se añade un medio de polarización a cada matraz correspondiente a las 144 h y se deja polarizar a los macrófagos durante 48 h adicionales a 37 °C. Medios de polarización: M1 – IFN-gamma (50 ng/mL), LPS (10 ng/mL) y GM-CSF (2,5 ng/mL). M2 – IL-4 (20 ng/mL) y M-CSF (50 ng/mL). A continuación, las células pueden recogerse y marcarse para su caracterización mediante citometría de flujo o utilizarse en un ensayo de fagocitosis (Figura 2). (B) Morfología in vitro de macrófagos M1 vs M2. Imágenes tomadas 2 días después de la polarización. Los macrófagos M1 presentan una morfología redonda y circular. Los macrófagos M2 tienen una morfología distinta, elástica y larga, ambos indicativos de una polarización exitosa. (C) Análisis de citometría de flujo de macrófagos M1/M2 caracterizados por CD80(M1) y CD209(M2). Los macrófagos M1/M2 se cultivaron durante 8 días y se marcaron con CD80-FITC y CD209-PECy7 para su caracterización mediante citometría de flujo. Los macrófagos M1 muestran una expresión de aproximadamente el 86,1% de CD80 y el 0,17% de CD209. Los macrófagos M2 muestran el 97,3% de la expresión de CD209 y el 0,003% de la expresión de CD80. (D) Señal fluorescente de CD80 y CD209 en macrófagos M1/M2. Los macrófagos M1/M2 se cultivaron durante 8 días y se marcaron con CD80-FITC o CD209-PECy7 para su caracterización por citometría de flujo. Un. La intensidad fluorescente media (MFI) de CD80 es mucho mayor en los M1 que en los M2. El MFI de CD209 es mucho más alto en los M2 que en los M1. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta cifra.

Figura 2: Ensayo monocito-macrófago (M-MA). (A) Los M1/M2 se cultivan durante 6 días con factores de crecimiento y luego 2 días con citocinas para polarizarlos. A continuación, los macrófagos M1/M2 se colocan en portaobjetos de cámara y se incuban a 37 °C durante 2 h. Los glóbulos rojos se opsonizan utilizando el anticuerpo/suero de elección y se incuban durante 1 h con mezcla intermitente cada 15 min. Los glóbulos rojos opsonizados se colocan en portaobjetos de cámara con macrófagos adheridos y se incuban durante 2 h a 37 °C sin perturbaciones. Las diapositivas se lavan en PBS; Las celdas se fijan con metanol y se montan con flavanol. Las células se cuentan mediante microscopía de contraste de fase a 40x. El índice fagocítico (IP) se calcula contando 300 macrófagos y los correspondientes glóbulos rojos fagocitados. (B) M-MA comparando macrófagos M1 vs M2 con anti-D y anti-k. R2R2 se refiere a la sangre RhD+. K+k+ se refiere a los glóbulos rojos heterocigotos K+k+. Las barras de error indican SD y se realizó una prueba t con un valor p < 0,05 considerado significativo. (C) RBCs opsonizados con fagocitos anti-k por M1 frente a macrófagos M2 por M-MA. Las imágenes se tomaron a 40x utilizando microscopía de contraste de fase. un. Los macrófagos M1 muestran poca actividad fagocítica con glóbulos rojos opsonizados con anti-k. b. Los macrófagos M2 muestran una alta actividad fagocítica con glóbulos rojos opsonizados con anti-k. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1. El uso de macrófagos M2 puede ser más predictivo de anticuerpos RBC potencialmente significativos clínicamente en el ensayo M-MA en comparación con los monocitos (MMA).

Para garantizar el éxito del método, se deben seguir los siguientes pasos críticos: 1) polarización M1/M2 exitosa, 2) generación de la capa de macrófagos y control de RhD+ 3) cuantificación del índice fagocítico. Si bien nuestros métodos indican el uso de monocitos aislados para el cultivo celular, se pueden usar PBMC, pero recomendamos usar monocitos purificados. Se sabe que las PBMC contienen varios tipos de células, y estas células secretan múltiples citocinas y factores mediadores diferentes. Esto puede tener un impacto en la diferenciación o polarización de los macrófagos M1/M2; Por lo tanto, el uso de monocitos purificados dará mejores resultados.  Además, es importante recordar que alrededor del 10% de los monocitos se obtendrán de la cantidad original de PBMC cuando se utilice el kit de aislamiento de monocitos STEMCELL. Se ha observado que 50 x 10⁶ PBMCs es el número inicial mínimo de PBMCs para obtener alrededor de 5 x 10⁶ monocitos. Al lavar el matraz con monocitos adheridos, asegúrese de lavar suavemente con un movimiento giratorio para evitar que se desprenda ninguna célula. Debido a la evaporación que se produce en la incubadora, es necesario el paso de medios de recarga en el día 4 del cultivo. Evite descartar cualquier medio y agregue el medio al matraz, ya que las citocinas secretadas por los M1/M2 son importantes para la diferenciación. Después de la polarización de 2 días, los macrófagos M1/M2 pueden utilizarse para la experimentación o mantenerse en cultivo durante un máximo de 7 días. La longitud de la polarización es flexible y se puede ajustar en función de los resultados observados, pero 2 días es el mínimo para una polarización exitosa. El paso de citometría de flujo solo es necesario cuando se configura el procedimiento. Una vez que el ensayo se esté ejecutando correctamente y las ejecuciones repetidas hayan caracterizado con éxito las células M1/M2, elija omitir este paso. El rendimiento obtenido debe estar en torno al 90% de M1 (CD80+, CCR7+, CD209-) y superior al 85% de M2 (CD206+, CD209+, CD80-). Los M1 pueden ser positivos para CD209 o CD206; esto es normal ya que estos marcadores se expresan débilmente en los M1, pero siguen siendo indicativos de una polarización exitosa. Los macrófagos M2 siempre deben ser negativos para CD80.

En el M-MA, la capa de macrófagos debe colocarse cuidadosamente en el portaobjetos de la cámara. El número de siembra de M1/M2 puede reducirse hasta en 250.000 celdas por pocillo si es necesario, pero normalmente debe oscilar entre 400.000 y 500.000. Una cantidad más alta puede resultar en aglomeraciones y lecturas inexactas. Sea cuidadoso al aspirar o agregar soluciones a las cámaras; La punta de la pipeta solo debe tocar una esquina de los pocillos, evitando las células débilmente adheridas. Para evitar que los pozos se sequen, trabaje por triplicado técnico al agregar soluciones e intercambiar medios. Nunca toque la parte delantera de la corredera; Puede resultar en la pérdida de macrófagos o monocitos. Los glóbulos rojos RhD+ R2R2 se utilizan como control positivo de la fagocitosis mediada por FcγR para garantizar la actividad. Aunque utilizamos glóbulos rojos RhD+ R2R2 para la opsonización con anti-D para el control positivo, se^{puede utilizar cualquier} glóbulo rojo RhD+ ^1,2. Asegúrese de utilizar la concentración adecuada de anticuerpos cuando opinece glóbulos rojos en este ensayo. Las cantidades excesivas darán lugar a la aglomeración de glóbulos rojos y a la incapacidad de leer las diapositivas. Por último, se recomienda que más de un miembro del personal del laboratorio cuente los portaobjetos. La cuantificación manual con el microscopio puede ser complicada, ya que es subjetiva, lo que sugiere una gran variabilidad entre los recuentos entre los diferentes pozos de la cámara y los experimentos. La coherencia en el campo de visión en el que se cuentan las celdas y el recuento de un mayor número de celdas pueden permitir resultados más precisos.

Las limitaciones de este método incluyen la naturaleza subjetiva de la cuantificación del índice fagocítico y la variabilidad entre la sangre del donante. Las PBMC se extraen de los abrigos leucitarios del donante para establecer el cultivo celular M1/M2, y los datos preliminares del laboratorio muestran una variabilidad significativa en la actividad fagocítica de M1 y M2 dependiendo del donante. El mismo anticuerpo podría producir un índice fagocítico más alto con las células M2 de un donante en comparación con las de otro. Para reducir la variabilidad y mantener la coherencia, sería beneficioso crear un recurso mancomunado de donantes, y esto también se aplica a los RBC utilizados en el MMA. A pesar de mantener un método consistente, siempre existirá una ligera variabilidad entre la sangre de los donantes de RBC/PBMC.

Una de las principales críticas tanto a la MMA como a la M-MA es la subjetividad inherente al recuento de monocitos o macrófagos y sus correspondientes glóbulos rojos fagocitados (RBC). A pesar de los protocolos establecidos, la variabilidad en las técnicas de recuento individuales bajo el microscopio es inevitable. Para abordar esto, sería beneficioso que el personal del laboratorio estableciera un enfoque de cuantificación estandarizado, como definir un punto de partida coherente en el campo de visión o aumentar el tamaño de la muestra para el recuento. La implementación de tales medidas mejoraría la consistencia y la precisión de los recuentos de células, lo que en última instancia conduciría a resultados y conclusiones más confiables.

Los autores no tienen nada que revelar.

Este trabajo cuenta con el apoyo y la financiación del Centro Canadiense de Servicios de Sangre para la Innovación en Toronto, Ontario. La investigación se lleva a cabo en el Centro de Investigación Keenan para Ciencias Biomédicas en el Hospital St. Michaels en Toronto, Ontario.