Plazmonik Fototermal Kanser Tedavisi: Fototermal Sıcaklık Dağılımını Görselleştirmek için Nanopartikül Gömülü Tümör Dokusu Taklit Eden Fantomlar

Bu makale, plazmonik fototermal tedavi için optik özellikleri çoğaltan tümör dokusu fantomlarının hazırlanmasına yönelik protokolü sunmaktadır. Fantom hazırlama, fototermal değerlendirmeler ve terapötik parametreleri değerlendirmek için fototermal sıcaklık ölçümlerine dayalı geliştirilen sayısal modelin doğrulanmasını detaylandırır ve ön test için in vivo çalışmalara etik, uygun maliyetli bir alternatif sunar.

Gelişmekte olan bir kanser tedavisi olan plazmonik fototermal tedavi (PPTT), bir tümöre nanopartiküllerin (NP'ler) verilmesini ve ardından kanser hücrelerini yok eden lokalize ısı üretmek için yakın kızılötesi (NIR) ışınlamayı içerir. PPTT'yi uygulamadan önce, terapötik parametrelerin - NP konsantrasyonu, ışınlama yoğunluğu ve süresi - tahmin edilmesi gerekir. Bunun için sayısal simülasyonlar yapılır. Bununla birlikte, sağlam hesaplamayı sağlamak için, bu simülasyonlar, tümör dokusunun optik özelliklerini kopyalayan tümör dokusunu taklit eden fantomlar üzerinde fototermal deneyler yoluyla doğrulanmalıdır. PPTT için terapötik parametreler, gelen radyasyonun doku ve NP'ler tarafından saçılması ve emilmesi ile yönetilir. Bu nedenle, hedef tümörün/dokunun azaltılmış saçılma katsayısını (μ_s') ve absorpsiyon katsayısını (μ_a) taklit eden fantomlar üzerinde doğrulama deneyleri yapılabilir.

Spesifik olarak, bu protokol, normal meme dokusu ile çevrili, altın nanoçubuklarla enjekte edilen meme tümörünün μ_s' ve μ a'sını taklit eden fantomların hazırlanması için talimatlar sağlar. Protokol ayrıca, uzay-zamansal sıcaklıkları termokupllar kullanılarak ölçülenlerle karşılaştırarak NIR ışınlamasını, sıcaklık izlemeyi ve sayısal sonuçların doğrulanmasını da detaylandırır. Bu çalışmada sunulan protokoller, boyutları (φ40 x 12 mm) ve merkezi tümör bölgesi (φ20 x 6 mm) olan, baz matriks olarak %1 agaroz ve saçılma bileşeni olarak intralipid ve 25 μg/mL konsantrasyonda altın nanoçubuklarla gömülü tümör bölgesi içeren hidrojel bazlı silindirik meme tümör dokusu fantomlarının hazırlanmasını kolaylaştırmıştır. Bir vaka çalışmasından elde edilen temsili sonuçlar, PPTT için sayısal simülasyonları doğrulamak için fabrikasyon fantomların uygulanmasını göstermektedir. Çalışma, gösterilen protokollerin, in vivo deneylerden önce terapötik parametreleri optimize etmeyi ve planlamayı ve PPTT için sayısal simülasyonları doğrulamayı amaçlayan fototermal deneylerin yürütülmesi için değerli olduğu sonucuna varmıştır.

Plazmonik fototermal tedavi (PPTT), tümör bölgesine nanopartiküllerin (NP'ler) verilmesini ve ardından yakın kızılötesi (NIR) radyasyonla ışınlanmayı içeren, gelişmekte olan lokalize bir kanser tedavi yöntemidir. NP'ler tipik olarak intratümöral (IT) veya intravenöz (IV) yollar¹ yoluyla uygulanır. NIR ışınlaması üzerine, gelen radyasyonun ve NP'lerin plazmonik etkileşimi, NP'lerin yüzeyinde lokalize ısı oluşumuna yol açar ve bu daha sonra çevredeki tümör dokusuna^{dağılır 2,3}. Bu lokalize ısıtma, tümör bölgesindeki sıcaklığı yükseltir ve termal ablasyon yoluyla kanser hücresi ölümüne^{yol açar 4,5}. Etkili kanser tedavisi, çeşitli biyolojik süreçlerle 1 saat⁶ boyunca 46 ºC, 4-6 dakika⁷ boyunca 50-52 ºC veya anlık hasar için 60 ºC gibi belirli sıcaklıkların korunmasıyla^{sağlanabilir 8}.

Fototermal tedavi uygulaması için çeşitli fototermal ajanlar araştırılmış ve raporlanmıştır ve terapötik etkinlikleri in vitro veya in vivo çalışmalarla değerlendirilmiştir. Bu ajanlar, yakın kızılötesi boyalar (örneğin, İndosiyanin Yeşili, IR780, IR820), polimer bazlı fototermal maddeler (örneğin, polidopamin^{) gibi organik} malzemeleri 9 ve asil metal bazlı NP'ler veya plazmonik NP'ler (örneğin, altın NP'ler) dahil olmak üzere inorganik malzemeleri^{10 içerir.11}, geçiş metali kükürt/oksitler¹² ve MXenes¹³. Bunlar arasında, plazmonik NP'ler, özellikle altın NP'ler, geleneksel fototermal ajanlara (örneğin boyalar) göre daha iyi fototermal stabilite, daha yüksek fototermal dönüşüm verimliliği ve şekil ve boyut varyasyonları yoluyla ayarlanabilir plazmonik tepki gibi çeşitli avantajlar sunar¹⁰. Bu özellikler, altın NP'leri fototermal tedavi için ideal adaylar haline getirir ve bazıları şu anda klinik deneylerden geçmektedir¹⁴.

PPTT sırasında terapötik etkinliği optimize etmek ve yeterli tümör termal hasarını sağlamak için, PPTT'nin klinik öncesi / klinik uygulamasından önce NP dozu (konsantrasyon açısından) ve NIR radyasyon parametreleri (ışınlama yoğunluğu ve süresi dahil) gibi tedavi parametrelerinin tahmin edilmesi önemlidir. Bu parametreleri oluşturmak için tipik olarak sayısal simülasyonlar kullanılır. Tümör dokusu içindeki termal hasarı değerlendirmek için çeşitli sayısal yöntemler geliştirilmiştir ve kafes Boltzmann yöntemi böyle bir yaklaşımdır^15,16. Bununla birlikte, bu simülasyonların güvenilir olması için, doku taklit eden fantomlar olarak bilinen doku analogları kullanılarak doğrulanmaları gerekir. Bu fantomlar, gerçek dokuların optik, termal, biyolojik veya mekanik özelliklerini çoğaltmak için hazırlanabilir ve biyolojik uygulamalara yönelik yeni geliştirilen cihazların, malzemelerin veya yöntemlerin ön testini, tedavi değerlendirmesini ve doğrulanmasını sağlamak için ikame görevi görebilir^17,18. Bu, hayvanların veya insan deneklerin gereksiz yere acı çekmesini azaltabilir ve bu tür deneylerle ilişkili etik kaygıları ele alabilir^19,20.

Bir fantomun tasarımı ve üretimi, amaçlanan uygulamaya^{bağlıdır 21}. Örneğin, PPTT gibi fototerapiler sırasında, gelen radyasyonun dozu, NP'ler ve dokular tarafından emilen veya saçılan ışık miktarından etkilenir^22,23. Bu nedenle, optik özellikleri, özellikle biyolojik dokuların azaltılmış saçılma katsayısını (μ_s^') ve absorpsiyon katsayısını (μ_a) taklit eden optik fantomlar, PPTT değerlendirmeleri ve ardından sayısal simülasyonların doğrulanması için kullanılır^24,25. Optik fantomlar tipik olarak üç ana bileşenden oluşur: bir baz matrisi, saçılma maddeleri ve absorpsiyon maddeleri^17,26. Baz matris, istenen optik özellikleri çoğaltmak için saçılma ve absorpsiyon bileşenlerini uygun konsantrasyonlarda tutar. Bu fantomlar, baz matrisin tipine bağlı olarak katı, sıvı ve yarı katı (hidrojel) fantomlar olarak sınıflandırılabilir. PPTT gibi termal terapötik çalışmalar için, hidrojel fantomlar, özellikle agaroz bazlı fantomlar, biyouyumlulukları, ihmal edilebilir doğal saçılma ve absorpsiyonları, basit üretim süreçleri ve tümör geometrilerine karşılık gelen istenen şekil ve boyutlarda dökülebilme esneklikleri nedeniyle tercih edilir^19,22. En önemlisi, agaroz tipi fantomların erime sıcaklığı ~80 ºC¹⁹ olduğundan, hazırlanan agaroz bazlı fantomlar ~70-80 ºC yığın sıcaklıklarına kadar kullanılabilir. PPTT için ~ 50-80 ºC'lik bir sıcaklık aralığı yeterli olduğundan, bu tür agaroz bazlı fantomlar PPTT tabanlı fototermal değerlendirmeler için kullanılabilir.

Çeşitli uygulamalar için çeşitli hidrojel bazlı doku taklit eden fantomlar geliştirilmiş ve rapor edilmiştir. Mustari ve ark. agaroz bazlı doku taklit eden fantomlar geliştirdi ve yeni tasarlanmış bir optik sistemi doğrulamada faydalarını gösterdi¹⁸. Başka bir çalışmada, yüksek yoğunluklu odaklanmış ultrason (HIFU) tedavisi sırasında termal hasarın derecesini ölçmek için dokuyu taklit eden termokromik fantomlar hazırlandı²⁷. Poliakrilamid bazlı doku taklit eden fantomlar da HIFU bazlı kanser tedavisi sırasında kavitasyon etkisini analiz etmek için hazırlanmıştır²⁸. Bu çalışmanın amacı, PPTT değerlendirmeleri için fantom tabanlı fototermal deneyler için protokol ile birlikte tümör dokusunu taklit eden fantomları üretmek için adım adım bir yöntem göstermektir. Önerilen bu ayrıntılı protokol, yeni geliştirilen nanoyapıların fototermal performansını test etmek için fantom preparatının ve müteakip fantom tabanlı fototermal deney yöntemlerinin benimsenmesini ve tekrarlanabilirliğini teşvik etmeyi, böylece sayısal simülasyonları doğrulamayı ve PPTT'nin terapötik parametrelerinin ön işlem planlamasına veya optimizasyonuna yardımcı olmayı amaçlamaktadır. Bu makale, yüzey altı meme tümörleri için özel olarak tasarlanmış bir fantom hazırlama protokolünü açıklamaktadır; Bununla birlikte, aynı adımlar, optik absorpsiyon ve saçılma ajanlarının bileşimini değiştirerek çeşitli tümör dokusu tiplerinin (çeşitli şekil ve boyutlarda) üretilmesi için uyarlanabilir. Örnek olarak, gösterilen dokuyu taklit eden fantom tabanlı fototermal değerlendirmeler, alt yüzey önkol tümörü²⁴, alt yüzey IDC²⁵ ve cilt tümörleri²⁹ için PPTT simülasyonlarını doğrulamak için daha önce bildirilen çalışmalarda kullanılmıştır.

Bu yazıda, cilt yüzeyinin 3 mm altında yer alan ve normal meme dokusu ile çevrili, özellikle invaziv duktal karsinom (IDC) olmak üzere bir alt yüzey veya deri altı meme tümörünün μ_s'lerini taklit eden bir optik fantomun hazırlık aşamaları anlatılmaktadır. Fantom, normal ve kanserli meme dokusunun μ_s'sini taklit etmek için uygun konsantrasyonlarda eklenen baz matriks olarak agaroz ve saçılma ajanı olarak intralipid (IL) kullanılarak hazırlanan silindirik geometriye sahiptir. İhmal edilebilir saçılma ve absorpsiyona sahip şeffaf bir hidrojel olan agaroz, optik fantomlar^18,30 için ideal bir temel matristir. Ayrıca, hücre zarlarının iki katmanlı yapısını taklit eden %20'lik bir yağ emülsiyonu olan IL, bir saçılma ajanı^31,32 olarak yaygın olarak kullanılmaktadır ve bu çalışma için normal ve kanserli meme dokusunun μ_s'sini çoğaltmak için seçilmiştir. Fantom, plazmonik NP'ler olarak altın nanoçubuklar (AuNR'ler) enjekte edilen meme tümörünü (IDC) taklit etmek için tasarlanmıştır ve AuNR'ler olmadan normal meme dokusu ile çevrilidir. PPTT'de kullanılan çeşitli altın NP'ler arasında, NIR bölgesindeki güçlü plazmonik yanıtları ve köpek ve kedi hastalarını içerenler de dahil olmak üzere klinik öncesi PPTT çalışmalarında yaygın kullanımları nedeniyle AuNR'ler bu çalışma için seçilmiştir¹⁴. Protokol, iki tip fantomun hazırlanmasını göstermektedir: biri IV enjeksiyonunda görüldüğü gibi AuNR dağılımına sahip bir tümör ve diğeri IT enjeksiyonu ile elde edilen AuNR dağılımını yansıtan bir tümör ile. Fantom hazırlama protokolünü takiben, NIR ışınlaması için deney düzeneği ve fantomlar üzerinde fototermal değerlendirmeler yapma adımları açıklanmaktadır. Son olarak, bu değerlendirmelerden elde edilen sıcaklık dağılımı sonuçlarının yorumlanması ve deneysel verilerin sayısal simülasyon sonuçlarıyla karşılaştırılması için adım adım bir kılavuz sağlanmıştır. Bu karşılaştırma, gelişmiş bir sayısal yöntemin doğrulanmasına yardımcı olur ve bir tümöre özel olarak uyarlanmış optimal tedavi parametrelerinin ayarlanmasını sağlar.

NOT: Fantomlar, istenen optik özellikleri elde etmek için literatürde bildirilen bileşimlere dayalı olarak agaroz ve intralipid kullanılarak hazırlandı. Hastalardan veya kadavralardan alınan gerçek bir biyolojik doku kullanılmadı. Bu nedenle, bu fantomların hazırlanması etik kısıtlamalardan muaftır ve bilgilendirilmiş onam gerektirmez.

1. Uygun bir kalıbın seçimi veya imalatı

1. . Uygun bir kalıp seçimi
   1. Fantomlar için istenen şekil ve boyutlara uygun bir kalıp seçin. NP'lerle eşit olarak dağılmış ve normal doku ile çevrili bir tümör bölgesine sahip silindirik fantomlar için, kalıp⁸ olarak bir cam Petri kabı ve küçük bir beher kullanın (Şekil 1A).
      NOT: Bu adımlar, silindirik geometride tümör dokusunu taklit eden fantomları hazırlamak içindir. Diğer şekiller veya boyutlar için uygun bir kalıp seçin. Uygun bir kalıp mevcut değilse, adım 1.2'de ayrıntılı olarak açıklandığı gibi üç boyutlu (3D) baskı kullanarak bir kalıp üretin.
2. 3D baskı ile kalıp imalatı
   1. İstenilen şekil ve boyuta göre Bilgisayar Destekli Tasarım (CAD) yazılımını (ör. SolidWorks, Autodesk Inventor veya CATIA) kullanarak bir 3B model tasarlayın. Bu protokolü takip etmek için, Şekil 1B'de gösterildiği gibi bir içi boş silindir (iç çap 40 mm, kalınlık 2 mm ve yükseklik 12 mm; Ek Dosya 1'e bakın) ve iki katı silindirik maskeleme kalıbı (boyutlar φ20 x 6 mm ve φ14 x 3 mm) tasarlayın.
      1. İçi boş silindir tasarımı/çizimi için, CAD yazılımında 40 mm ve 44 mm çapında iki daire oluşturun. Ardından, geometriyi 12 mm sıkın.
      2. Katı silindirik maskeleme kalıpları için, 20 mm ve 14 mm çapında daireler oluşturun, ardından sırasıyla 6 mm ve 3 mm ekstrüzyon yapın (bkz. Ek Dosya 2 ve Ek Dosya 3). Silindirin bir tarafına bir dikdörtgen (kenarlar 44 mm ve 5 mm) çizin ve 2 mm sıkın.
   2. Yazdırmak için 3B yazıcı uyumlu yazılım (ör. Cura) kullanarak 3B modelleri Gcode formatına dönüştürün.
   3. Bir 3D yazıcı kullanarak kalıpları yazdırmak için bu Gcode'u kullanın (örneğin, burada polilaktik asit [PLA] φ1.75 mm, 1 kg eSun kullanarak).
      NOT: Dikdörtgen, maskeleme kalıplarını askıya almak için çizilir. İstenilen diğer şekillere sahip fantomlar hazırlamak için farklı kalıplar tasarlanabilir ve üretilebilir.

2. Tümör dokusunu taklit eden fantom solüsyonlarının hazırlanması²⁵

NOT: Bu çalışmada, tümör dokusunu taklit eden silindirik geometriye sahip agaroz bazlı optik fantomlar, Şekil 2'de gösterildiği gibi, IT veya IV enjeksiyon yoluyla AuNR'ler enjekte edilen bir alt yüzey meme tümörüne benzeyecek şekilde hazırlanmıştır. IT fantomunun iki bölgesi vardır: AuNR'leri olan merkezi bir tümör bölgesi ve çevreleyen normal doku bölgesi. IV fantomun üç bölgesi vardır: tümör çevresinde AuNR'leri olan bir tümör bölgesi, AuNR'leri olmayan merkezi çıplak bir tümör bölgesi ve çevreleyen normal doku bölgesi. Optik özellikler (μ_a ve μ_s') tümör ve normal doku için farklılık gösterdiğinden, farklı bileşimlere sahip her bölge için ayrı fantom solüsyonları hazırlanır ve ayrı ayrı tartışılacaktır.

1. Normal meme dokusunu taklit eden fantom solüsyonunun hazırlanması (Solüsyon 1)
   NOT: Bu çözüm hem IT hem de IV fantomları için kullanılacaktır. Çözelti 1'in hazırlık adımları Şekil 3A'da gösterilmiştir.
   1. Kalıbın boyutlarına göre çözümün teorik hacmini hesaplayın.
      NOT: Burada, φ40 x 12 mm'lik silindirik kalıp için hesaplanan hacim, fantom başına 15^cm3 veya 15 mL'dir. Bu tür iki fantomun hazırlanması gerektiğinden, toplam hacim 15 mL x 2'dir, bu da 30 mL'dir. Bu nedenle, fantom hazırlama adımı sırasında buharlaşmayı veya dökülmeyi hesaba katmak için 35 mL çözelti hazırlayın.
   2. 35 mL çözeltiye eklenecek tüm fantom bileşenlerinin - agaroz (temel malzeme olarak) ve IL (saçılma bileşeni olarak) miktarını (ağırlık / konsantrasyon / hacim) hesaplayın.
      1. % 1 w / v konsantrasyonuna karşılık gelen 35 mL çözelti hazırlamak için 0.35 g agaroz ekleyin.
      2. Literatürde bulunan μ s' verilerine karşı IL konsantrasyonuna dayalı olarak istenen μ_s' normal meme dokusuna (ör., 10.1 ^{cm-1 33}) karşılık gelen IL konsantrasyonunu tahmin _edin. Ardından, denklem (1)'i kullanarak fantom çözeltisine eklenecek IL hacmini (%20 emülsiyon stoğu) hesaplayın:
         (1)
         Burada _C1 ve V₁, sırasıyla reaktif stoğunun konsantrasyonu (burada %20 IL stoğu) ve eklenecek reaktif stok çözeltisinin hacmidir (burada hesaplanacaktır). C₂, nihai çalışma çözeltisinde reaktifin (literatürden elde edilecek) gerekli konsantrasyonudur ve V₂, son çalışma çözeltisinin toplam hacmidir (burada, 35 mL).
         NOT: Burada, 10.1 cm-1'lik μ_için, bildirilen literatürden tahmin edilen IL konsantrasyonu %1.04'tür34,35. Yukarıdaki adımları kullanarak, eklenecek IL hacmi (%20 IL stoğu) 1.82 mL'dir.
   3. 0.35 g agarozu tartın ve bir beherde 33.18 mL deiyonize (DI) suya ekleyin. Su kaybını önlemek için kabı alüminyum folyo ile örtün.
   4. Çözeltiyi içeren kabı sıcak bir plaka üzerinde 120 °C'de ısıtın ve çözelti şeffaf hale gelene kadar karıştırın.
   5. Sıcak plakanın sıcaklığını 60 ºC'ye düşürün. 15 dakika sonra, karıştırırken 1.82 mL IL ekleyin. Elde edilen çözeltiyi, Çözelti 1'i, kullanıma kadar (dökülmeye hazır) 60 ºC'de karıştırarak tutun.
      NOT: 60 ºC'deki fantom çözeltisinin karıştırma koşulları altında tutulması gerekir. Aksi takdirde, çözeltinin katılaşmasına yol açar.
2. AuNR gömülü tümör fantom çözeltisinin hazırlanması (Çözelti 2)
   NOT: Bu çözüm hem IT hem de IV fantomları için kullanılacaktır. Çözelti 2'nin hazırlık adımları Şekil 3B'de gösterilmiştir.
   1. Doldurulacak tümör bölgesinin hacmini hesaplayın (φ20 x 6 mm).
      NOT: Bu tür iki tümör fantomu için yaklaşık hacim 3.8 mL'dir. Bu nedenle, hazırlanacak çözelti hacmi 4.5 mL olacaktır.
   2. Bölüm 2.1'de belirtildiği gibi benzer adımları kullanarak eklenecek tümör fantom bileşenlerinin miktarını (agaroz, IL ve AuNR'ler) hesaplayın.
      1. % 1 w / v konsantrasyonuna karşılık gelen 4.5 mL çözelti hazırlamak için 45 mg ekleyin.
      2. Meme tümörünün IL:μ_s' değeri 4.6 ^{cm-1 33'tür} ve aynı şeyi taklit etmek için gereken karşılık gelen IL konsantrasyonu %0.472'dir34,35. Bu nedenle,% 20 IL stoğundan 4.5 mL tümör fantom çözeltisine 106.2 μL IL ekleyin.
      3. Fantomda istenen AuNR konsantrasyonu 25 μg/mL'dir. Aynısını elde etmek için, tümör fantom çözeltisine 3.21 mL AuNRs çözeltisi (stok konsantrasyonu: 35 μg / mL) ekleyin.
   3. Bir beherdeki 1.18 mL DI suya 45 mg agaroz ekleyin ve bir alüminyum folyo ile kaplayın.
   4. Beheri sıcak bir tabağa koyun ve çözelti şeffaf hale gelene kadar 120 ºC'de karıştırın.
   5. Sıcak plakanın sıcaklığını 60 ºC'ye düşürün ve çözeltiyi 15 dakika bekletin.
   6. Karıştırma koşulları altında 106.2 μL IL ve 3.21 mL AuNR süspansiyonu (35 μg/mL) ekleyin. Elde edilen çözeltiyi, Çözelti 2'yi, dökülene kadar 60 ºC'de karıştırarak tutun.
3. Çıplak tümörün hazırlanması (AuNR'ler olmadan) fantom çözeltisi (Çözüm 3)
   NOT: Bu çözüm yalnızca IV fantom için kullanılacaktır. Çözelti 2'nin hazırlık adımları Şekil 3C'de gösterilmiştir.
   1. Çıplak bir tümör bölgesi (~ φ20 x 6 mm) oluşturmak için eklenecek süspansiyonun teorik hacmini hesaplayın.
      NOT: Tümör fantomları için yaklaşık hacim 1.9 mL'dir. Bu nedenle, hazırlanacak çözelti hacmi 2.5 mL olacaktır.
   2. Bölüm 2.1'de belirtildiği gibi benzer adımları kullanarak eklenecek tümör fantom bileşenlerinin miktarını hesaplayın-agaroz ve IL.
      1. % 1 w / v konsantrasyon elde etmek için 2.5 mL çözelti hazırlamak için 25 mg agaroz ekleyin.
      2. Meme tümörünün IL:μ_s' değeri 4.6 ^{cm-1 33'tür} ve aynı şeyi taklit etmek için gereken karşılık gelen IL konsantrasyonu %0.472'dir34,35. 59 μL %20 IL stoğu ekleyin.
   3. Bir beherde 2.44 mL DI suya 25 mg agaroz ekleyin ve bir alüminyum folyo ile kaplayın.
   4. Beheri sıcak bir tabağa koyun ve çözelti şeffaf hale gelene kadar 120 ºC'de karıştırın.
   5. Sıcak plakanın sıcaklığını 60 ºC'ye düşürün ve çözeltiyi 15 dakika bekletin.
   6. Karıştırma koşulları altında çözeltiye 59 μL IL ekleyin. Elde edilen çözeltiyi, Çözelti 3'ü, dökülene kadar 60 ºC'de karıştırma koşulları altında tutun.

3. Tümör dokusunu taklit eden fantomun hazırlanması 24,25,36

1. Dökme aşaması için kalıpları hazırlayın. Bunun için silindirik kalıpların altını parafilm ile kapatın ve maskeleme kalıbını (φ20 x 6 mm) merkeze yerleştirin.
2. Çözelti 1'i maskeleme kalıbının üst işaretine kadar silindirik kalıplara dökün ve katılaşmasına izin verin (Şekil 4A).
3. Katılaşmadan sonra, tümör bölgesi için bir boşluk oluşturmak için maskeleme kalıbını çıkarın (Şekil 4B).
   NOT: Protokol, adım 3.3'e kadar hem IT hem de IV fantomları için aynı olacaktır. İşlem, adım 3.3'ten sonra BT ve IV fantomları için ayrı ayrı ele alınacaktır.
4. BT hayaleti 24,25,36
   1. Boşluğu Çözelti 2 ile doldurun ve katılaşmasına izin verin (Şekil 4C).
   2. Fantomun üstüne Çözelti 1'i ekleyin ve tamamen katılaşmasına izin verin (Şekil 4D).
5. IV hayalet^24,25
   1. Daha küçük bir maskeleme kalıbı (φ14 x 3 mm) yerleştirin ve etrafındaki boşluğu Çözelti 2 ile doldurun (Şekil 4E).
   2. Katılaştıktan sonra, daha küçük kalıbı çıkarın ve kalan boşluğu Çözelti 3 ile doldurun (Şekil 4F).
   3. Çözelti 1'i en üste ekleyin ve tam katılaşmaya izin verin (Şekil 4G).

4. Termokuplların fantom ^24,25,36 içine yerleştirilmesi

NOT: Uzamsal sıcaklık dağılımını izlemek için, Şekil 2'de gösterildiği gibi, fantom içine çeşitli radyal (r) ve eksenel (z) konumlarda K tipi termokupllar yerleştirilir. Termokuplların doğru yerlere yerleştirilmesi için, hassasiyeti sağlamak için cam kılcal damarlar kılavuz olarak kullanılır. Termokupl konumları (r, z) olarak gösterilir, burada z = 3 mm derinlikteki tümörün üst yüzeyindeki orta nokta hem IT hem de IV fantomlar için referans noktası görevi görür ve Şekil 2A, B'de gösterildiği gibi (0, 3) olarak adlandırılır. Tümör bölgesindeki termal hasarı ölçmek için radyal ve eksenel konumlar seçilirken, tümör çevresindeki konumlar (hem radyal hem de eksenel) kritiktir. NIR ışınlaması sırasında bu periferik noktalarda gerekli sıcaklıklara ulaşılması, tam tümör ablasyonunu sağlar. Böylece, termokupllar z = 3 ve 9 mm'de, yani (10, 3) ve (10, 9) 'da radyal uç noktalara (tümörün) yerleştirilir ve bir termokupl, tümör-doku arayüzüne z = 9 mm'de (periferik eksenel konum), yani (0, 9) Şekil 2A, B'de gösterildiği gibi yerleştirilir. Ek olarak, eksenel sıcaklık dağılımını değerlendirmek için, (0, 3) ve (0, 9) konumları arasına (0, 6) olarak gösterilen bir termokupl yerleştirilir. Son olarak, çevredeki sağlıklı doku bölgesindeki sıcaklık artışını değerlendirmek için (15, 3) noktasına bir termokupl yerleştirilir.

1. Cam kılcal damarları, fantom içinde istenen radyal ve eksenel konumlara ulaşacak şekilde uygun uzunluklarda kesin.
2. Bu cam kılcal damarların içine termokupllar yerleştirin ve belirtilen radyal ve eksenel fantom konumlarında tek tek delin.
3. Tüm termokupllar yerleştirildikten sonra, Şekil 5A'da gösterildiği gibi, sonraki NIR ışınlaması için fantomu dikkatlice bir cam Petri kabına yerleştirin.

5. NIR ışınlamasına maruz kalma ve elde edilen fototermal sıcaklıkların ölçümü³⁶

1. Fantomu içeren cam Petri kabını (termokupllarla yerleştirilmiş), fantomun üst yüzeyinin merkezi bölgesi, Şekil 5A'da gösterildiği gibi NIR ışık kaynağının optik fiberinin ucuna dik olacak şekilde yerleştirin.
   NOT: Fantom yüzeyindeki ışın çapı, yüzey ile fiber optik uç arasındaki mesafe değiştirilerek ayarlanabilir. Burada, merkezi tümör bölgesini kaplayan 20 mm'lik bir ışın çapı elde etmek için 9 mm'lik bir mesafe tutulur.
2. Veri Toplama (DAQ) sistemini bilgisayara bağlayın ve LabVIEW yazılımını açın.
3. Işınlamanın başlangıcında sıcaklık verilerini kaydetmek için NIR ışık kaynağını (Şekil 5B) ve yazılımdaki oynat düğmesini aynı anda açın.
4. Fantomu 20 dakika boyunca ışınlayın, ardından NIR ışık kaynağını kapatın ve kaydı durdurun.
5. Kaydedilen sıcaklık ve zaman verilerini çizin.

6. Simülasyon sonuçları ile sıcaklık karşılaştırması^24,25

NOT: Deneyler genellikle tekrarlanır ve tüm termokupl konumlarında sıcaklıklar belirlenen zaman aralıklarında kaydedilir. Doğrulama için aşağıdaki adımlar gerçekleştirilir:

1. Tüm termokupl konumlarında (r, z) deneysel sıcaklıkların ortalama ve standart sapmasını hesaplayın.
2. Dikkate alınan termokupl konumlarındaki sıcaklıkları sayısal olarak hesaplayın.
3. Şekil 6'da gösterilen, deneylerden elde edilen ortalama sıcaklık ve zamana göre tüm termokupl konumlarında simülasyon yoluyla elde edilen sıcaklık grafiği.
4. Tablo 1'de gösterildiği gibi, doğrulamayı değerlendirmek için sıcaklık farkını ölçmek için tüm termokupl konumları için kök ortalama kare hatası (RMSE) ve ortalama mutlak hatayı (MAE) hesaplayın.
   NOT: MAE ve RMSE, sırasıyla Denklem 2 ve 3 kullanılarak hesaplanır.
   (2)
   (3)
   Burada TE, TS ve N deneysel olarak elde edilen sıcaklık, sayısal olarak hesaplanan sıcaklık ve veri noktalarının sayısıdır (burada, sıcaklıklar sırasıyla 20 dakika boyunca her saniye kaydedilir; dolayısıyla = 1.200). I, zaman anlarını temsil eder.

Şekil 6, Şekil 2'de gösterildiği gibi, tüm termokupl konumlarında AuNR'ye gömülü bir tümör dokusu fantomu ile yapılan deneyler sırasında elde edilen zamansal ortalama sıcaklıkları, ilgili termokupl konumlarında simülasyonlar sırasında elde edilen sıcaklıklarla karşılaştırıldığında göstermektedir. Burada, deneyler her bir dağılım için, yani AuNR'lerin IT ve IV dağılımları için 4x olarak gerçekleştirildi. Deneyler sırasında oda sıcaklığı 25 ºC idi. Bu nedenle, simülasyon için de çevre sıcaklığı 25 ºC'de tutuldu. Şekil 6A, AuNR'lerin IT dağılımı için deneysel ortalama sıcaklıklar ile simüle edilmiş sıcaklıklar arasında bir karşılaştırmayı göstermektedir. Şekil 6B, AuNR'lerin IV dağılımı için deneysel ortalama sıcaklıklar ile simüle edilmiş sıcaklıklar arasında bir karşılaştırmayı göstermektedir. Şekil 6A,B'den, IV dağılımının IT dağılımından daha düşük bir sıcaklık artışı gösterdiği görülmektedir. Bunun nedeni, olay radyasyonu AuNR'ye gömülü tümör tarafından emilmeden önce daha büyük, daha kalın bir dağınık ortam tabakası (çıplak doku + çıplak tümör) nedeniyle gelen radyasyonun saçılımının IV dağılımında daha fazla olmasıdır.

Daha sonra, sıcaklık grafikleri, fantom deneyleri sırasında, sıcaklıktaki maksimum artışın, IT ve IV dağılımı için (0, 3) termokupl konumunda sırasıyla ~ 11 ºC ve ~ 6 ºC olduğunu göstermektedir. Dokunun 43 ºC'nin altında termal olarak güvenli olduğuna dikkat edilmelidir ^6,16. Genel olarak, çekirdek vücut sıcaklığı 37 ºC olduğundan, >6 ºC'lik bir sıcaklık artışı tümör dokusunda termal hasara yol açar. Burada, 25 μg/mL AuNR'ler ve 0.25 W/^cm2 ile yapılan fantom deneyleri, her iki durumda da termal hasarın subsurface tümörün radyal ve eksenel yönlerinde 3-4 mm içinde indüklendiğini ve tümör bölgesinin geri kalanının hasarsız kaldığını göstermektedir. Bu tür protokoller, bir tümörün tam termal hasarını elde etmek için ışınlama yoğunluğunu ve AuNR konsantrasyonunu optimize etmek için kullanılabilir.

Ayrıca, deneysel sıcaklıklara^{kıyasla hatanın %15 < olması} durumunda simüle edilen sıcaklıkların 37 doğrulandığı söylenir. Bunun için, RMSE ve MAE, her iki durum için de tüm termokupl konumlarında hesaplanır ve Tablo 1'de gösterilir. IT dağıtımı ve IV dağıtımları için sırasıyla 2,10 ºC ve 1,94 ºC'lik bir maksimum varyasyon elde edilir, bu da simüle edilen sıcaklığa göre %5,88 ve %6,09'luk hatalara karşılık gelir. Bu nedenle, deneysel ve simüle edilmiş sonuçların birbiriyle iyi bir şekilde karşılaştırıldığı sonucuna varılabilir.

Özetle, çalışma, burada gösterilen fantom hazırlama protokollerinin ve müteakip fantom tabanlı fototermal deneylerin, sayısal simülasyonları doğrulamaya ve PPTT'nin sonraki in vivo uygulamaları için türetilmiş terapötik parametrelerin sağlamlığını sağlamaya yardımcı olduğu sonucuna varmıştır.

Şekil 1: Agaroz bazlı tümör dokusunu taklit eden fantomların üretimi için kalıplar. (A) Silindirik tümör dokusu fantomları oluşturmak için kalıp olarak kullanılan cam Petri kabı ve beher. (B) Silindirik tümör dokusu fantomlarının hazırlanması için tasarlanmış 3D baskılı silindirik kalıp ve maskeleme kalıpları. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Silindirik geometriye sahip fantomları taklit eden agaroz bazlı tümör dokusunun şeması. Genel boyutları φ40 x 12 mm olan, merkezinde tümör bulunan (φ20 x 6 mm), cilt yüzeyinden 3 mm derinlikte yer alan ve normal doku bölgesi ile çevrili fantomlar. (A) IT enjeksiyonu ile elde edilen AuNR dağılımına sahip tümör bölgesi olan fantom. (B) IV enjeksiyonunda elde edildiği gibi AuNR dağılımına sahip tümör bölgesi ile fantom. Termokupl konumları (r, z) olarak temsil edilir, burada r radyal konum ve z yüzeyden derinliktir. Kısaltmalar: AuNRs = Altın nanoçubuklar; IT = İntratümöral; IV = İntravenöz. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Çeşitli fantom çözeltilerinin hazırlanışını gösteren şematik. (A) Normal doku fantom çözeltisinin (Çözelti 1) hazırlanması için adımlar. (B) AuNR gömülü tümör fantom çözeltisi (Çözüm 2). (C) Çıplak tümör (AuNR'ler olmadan) fantom çözeltisi (Çözüm 3). Kısaltmalar: DI = Deiyonize edilmiş; IL = İntralipid; AuNR'ler = Altın nanoçubuklar. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: IT ve IV dağılımı ile tümör dokusunu taklit eden fantomların hazırlanması. Toplam çapı 40 mm ve derinliği 12 mm olan, merkezi alt yüzey tümör bölgesi 20 mm çapında ve 6 mm derinliğinde, fantom/cilt yüzeyinin 3 mm altında yer alan fantomlar. IT ve IV fantomlar için ortak adımlar: (A) Çözelti 1, tümör bölgesi için bir boşluk oluşturmak üzere merkeze yerleştirilen bir maskeleme kalıbı ile silindirik kalıba (alt kısım parafilm ile kapatılmış) dökülür. (B) Maskeleme kalıbını (φ20 x 6 mm) çıkardıktan sonra katılaşmış normal doku bölgesi, tümör bölgesi için bir boşluk oluşturur. IT fantomunun hazırlanması için A ve B'den sonraki adımlar: (C) Solüsyon 2, IT dağıtımı için AuNR'lerle gömülü merkezi tümör bölgesini oluşturmak üzere boşluğa döküldü. (D) Çözelti 1, katılaşmış fantomun üzerine döküldü ve sonunda fantom yüzeyinin 3 mm altında yer alan, IT dağıtımına sahip AuNR'lerle gömülü bir alt yüzey tümörü oluşturdu. IV fantomun hazırlanması için A ve B'den sonraki adımlar; (E) Merkezi boşluğa yerleştirilen küçük maskeleme kalıbı (φ14 x 3 mm), IV dağılımı için AuNR'lerle gömülü periferik tümör bölgesini oluşturmak için etrafına Çözelti 2 döküldü. (F) Çözelti 3, IV dağılımını taklit eden AuNR'lerle gömülü bir tümör bölgesi oluşturmak için kalan boşluğa döküldü. (G) Çözelti 1, katılaşmış fantomun üzerine döküldü ve sonunda fantom yüzeyinin 3 mm altında yer alan, IV dağılımlı AuNR'lerle gömülü bir alt yüzey tümörü oluşturdu. (H) Fantom yüzeyinden tümör boyutlarını, AuNR dağılımını ve tümör derinliğini gösteren disseke edilmiş fantomlar. Bu rakam Shaw ve ^ark.25 adlı eserden alınmıştır. Kısaltmalar: IT = intratümöral; IV = İntravenöz; AuNR'ler = Altın nanoçubuklar. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: Fantomlar üzerinde fototermal deneyler için kurulum. (A) Fantom içindeki çeşitli radyal ve eksenel konumlara termokupllar (K tipi) yerleştirme. (B) Fantomların NIR ışınlaması ve ardından yerleştirilmiş termokupllar kullanılarak sıcaklıkların izlenmesi. Bu rakam Shaw ve ^ark.25 adlı eserden alınmıştır. Kısaltma: NIR = Yakın kızılötesi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 6: Sayısal simülasyonların doğrulanması için deneysel ve simüle edilmiş sonuçların karşılaştırılması. Fototermal deney sırasında fantomlar üzerindeki çeşitli termokupl konumlarında elde edilen ortalama sıcaklıklar, (A) IT dağılımı ve (B) IV dağılımı için karşılık gelen simüle edilmiş sıcaklıklarla karşılaştırılmıştır. Termokupl konumları, sırasıyla yarıçap ve derinliği temsil eden (r, z) olarak temsil edilir. Doku içinde 3 mm derinlikte bulunan AuNR gömülü tümör, NIR yoğunluğu 0.25 W/^cm2 ile ışınlanır. Düz ve kesikli çizgiler, sırasıyla deneysel olarak elde edilen sıcaklıkları ve simülasyon yoluyla hesaplanan sıcaklıkları temsil eder. Bu rakam Shaw ve ^ark.25 adlı eserden alınmıştır. Kısaltmalar: IT = intratümöral; IV = İntravenöz; AuNR'ler = Altın nanoçubuklar; NIR = Yakın kızılötesi; TE = Deneysel sıcaklıklar; TS = Simüle edilmiş sıcaklıklar. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: MAE ve RMSE, çeşitli termokupl konumlarında AuNR'lerin BT dağıtımı ve IV dağılımı için hesaplanmıştır. Bu tablo Shaw ve ^ark.25 adlı eserden alınmıştır. Tüm veriler Santigrat derece (ºC) cinsindendir. Kısaltmalar: MAE = Ortalama mutlak hata; RMSE = Kök-ortalama kare hatası; IT = İntratümöral; IV = İntravenöz; AuNR'ler = Altın nanoçubuklar.

Ek Dosya 1: A . 40 mm x 12 mm silindirik kalıp için STL dosyası. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 2: A . 20 mm x 6 mm maskeleme kalıbı için STL dosyası. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 3: A . 14 mm x 3 mm maskeleme kalıbı için STL dosyası. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Bu makale, optik fantomları taklit eden agaroz bazlı tümör dokusunun hazırlanması için protokolü sunmaktadır. Fantomlar, PPTT çalışmalarında kullanılmak üzere tümör ve normal dokuların optik özelliklerini taklit edecek şekilde tasarlanmıştır. Bu çalışmada, PPTT sırasında sayısal yöntemlerin doğrulanması için bu fantomların uygulaması vurgulanmaktadır. Bu protokoldeki en kritik adım, agaroz ve IL içeren fantom çözeltilerinin sıcaklığının sürekli karıştırma altında 60 ºC'de tutulmasıdır. Sıcaklık 60 ºC'yi aşarsa, hazırlanan fantomun istenen optik özelliklerini değiştirerek IL denatürasyonuna yol açabilir. Tersine, sıcaklık 40 ºC'nin altına düşerse, erken jelleşme meydana gelebilir ve bu da saçılma bileşeninin (IL) ve/veya absorpsiyon bileşeninin (AuNRs)¹⁸ eşit olmayan dağılımına neden olabilir.

Bir diğer kritik husus, termokuplların hassas bir şekilde yerleştirilmesidir. Küçük bir yanlış yerleştirme bile (milimetre ölçeğinde) ölçülen sıcaklık artışını önemli ölçüde etkileyebilir. Bunu önlemek için, termokuplları fantom içinde istenen uzamsal konumlara doğru bir şekilde yönlendirmek için cam kılcal damarların kullanılması reçete edilir. Ek olarak, yanlış termokupl yerleştirmeden kaynaklanan olası hataları gidermek için, fototermal değerlendirmeler en az üç nüsha²⁵ halinde yapılmalıdır.

Bu makalede tartışılan agaroz bazlı optik fantomlar, 1 günden fazla olmayan kısa bir kullanılabilir raf ömrüne sahiptir. Bu nedenle, fototermal deneyler, fantomların hazırlandığı gün yapılmalıdır. Bununla birlikte, kaçınılmaz durumlarda, raf ömürlerini uzatmak için, fantomlar katılaşmadan hemen sonra bir Petri kabına yerleştirilmeli, parafilm ile kapatılmalı ve 4 ºC'de saklanmalıdır. Bu, fantomların kullanılabilirliğini 2-3 gün uzatacaktır. Gösterilen protokolün bir başka sınırlaması, istenen μ s' ve μ_a'yı elde etmek için fantom bileşenlerinin mevcut literatüre dayalı _{konsantrasyonlarda} eklenmesidir. İstenilen optik özelliklere sahip fantomların hazırlandığını varsaydık. Ancak bu çalışmada hazırlanan fantomların optik özellikleri, hazırlandıktan sonra uygun bir teknik kullanılarak ölçülmemiştir.

Agaroz bazlı optik fantomların hazırlanması basit, uygun maliyetli ve zaman açısından verimlidir. Bu agaroz bazlı fantomlar, gerekirse uygun kalıplar kullanılarak çeşitli şekil ve boyutlarda veya katmanlarda kolayca dökülebilir. Sıvı ve katı fantomlar bu esneklikten yoksundur^19,38. NIR ışınlaması sırasında, nanopartiküllere gömülü fantomların fototermal tepkisi, termokupl tabanlı sıcaklık izleme kullanılarak değerlendirildi. Bu yöntem, kolorimetri (yalnızca minimum ve maksimum değerler arasındaki sıcaklıkları ayırt etmekle sınırlıdır), kızılötesi termografi (yüzey düzeyinde sıcaklık algılama ile sınırlıdır) ve manyetik rezonans termometrisi (yüksek maliyet ve operasyonel karmaşıklık, öncelikle in vivo uygulamalar için uygun hale getirir) gibi diğer tekniklere göre çeşitli avantajlar ^sunar26. Termokupl tabanlı izleme, yüksek hassasiyet (0,1 °C) ve doğruluk, daha derin konumlardaki sıcaklıkları algılama yeteneği, maliyet etkinliği ve kullanım kolaylığı sağlayarak bu tür fantom tabanlı değerlendirmeler için üstün bir seçim haline getirir. Ayrıca, tümör dokusunu taklit eden fantomlar üzerinde fototermal deneyler yoluyla sayısal simülasyonların doğrulanması, yani gereksiz ağrı ve ıstıraba neden olabilecek fareler gibi in vivo modellere olan ihtiyacı azaltmak gibi önemli avantajlar sunar. Ayrıca, fantom temelli değerlendirmeler etik kaygılardan kaçınır.

Bu çalışmada, PPTT'de sayısal simülasyonların doğrulanması için optik fantomların kullanımı üzerinde durulmuştur. Dokuyu taklit eden fantomlar, literatürde bildirilen verilere dayalı olarak hazırlandı ve bileşenlerin konsantrasyonlarının, özellikle azaltılmış saçılma katsayısı ve absorpsiyon katsayısı açısından istenen optik özelliklere karşılık gelmesi sağlandı. Bu çalışmada optik özellikler doğrudan ölçülmemiş olsa da, hazırlanan fantomların amaçlanan optik özellikleri sergilediğini varsaymak mantıklıdır. Bu fantomlar, gerçek dokuların optik özelliklerini taklit etmek üzere tasarlandığından, biyolojik dokularda ışık taşınmasını incelemek, bu özelliklerin ölçülmesinde optik yöntemlerin doğruluğunu doğrulamak, doku simülasyon koşulları altında yeni nanoyapıların fototermal performansını değerlendirmek ve daha ileri in vivo deneylerin tasarımına rehberlik etmek için ön veriler oluşturmak için referans materyaller olarak hizmet edebilirler^{17, 18,26}.

Yazarların ifşa etmek için rekabet eden çıkarları yoktur.

Bu çalışma, herhangi bir kamu, ticari veya kar amacı gütmeyen finansman kuruluşundan herhangi bir mali destek almadan gerçekleştirilmiştir. Yazarlar, altyapı ve destek için CSIR-Central Scientific Instruments Organization, Chandigarh, Hindistan'a teşekkür eder.