טיפול בסרטן פוטותרמי פלזמוני: פנטומים המחקים רקמת גידול משובצים בננו-חלקיקים להמחשת התפלגות טמפרטורה פוטותרמית

מאמר זה מציג את הפרוטוקול להכנת פנטומים של רקמת גידול המשכפלים תכונות אופטיות לטיפול פוטותרמי פלזמוני. הוא מפרט הכנת פנטום, הערכות פוטותרמיות ואימות המודל המספרי שפותח המבוסס על מדידות טמפרטורה פוטותרמיות להערכת פרמטרים טיפוליים, ומציע אלטרנטיבה אתית וחסכונית למחקרי in vivo לבדיקות ראשוניות.

טיפול פוטותרמי פלזמוני (PPTT), טיפול מתפתח בסרטן, כולל העברת ננו-חלקיקים (NPs) לגידול, ואחריו הקרנת אינפרא אדום קרוב (NIR) ליצירת חום מקומי שהורס תאים סרטניים. לפני מתן PPTT, יש להעריך את הפרמטרים הטיפוליים - ריכוז NP, עוצמת הקרנה ומשך הזמן. לשם כך מבוצעות סימולציות מספריות. עם זאת, כדי להבטיח חישוב חזק, יש לאמת סימולציות אלה באמצעות ניסויים פוטותרמיים על פנטומים המחקים רקמת גידול המשכפלים את התכונות האופטיות של רקמת הגידול. עבור PPTT, הפרמטרים הטיפוליים נשלטים על ידי פיזור וספיגה של קרינה על ידי הרקמה וה-NPs. לכן, ניתן לבצע ניסויי תיקוף על פנטומים המחקים את מקדם הפיזור המופחת (μ_s') ומקדם הספיגה (μ_a) של הגידול/רקמת המטרה.

באופן ספציפי, פרוטוקול זה מספק הוראות להכנת פנטומים המחקים μ_s ו-μ _של גידול שד המוזרק עם ננו-מוטות זהב, מוקף ברקמת שד רגילה. הפרוטוקול מפרט גם קרינת NIR, ניטור טמפרטורה ואימות תוצאות מספריות על ידי השוואת טמפרטורות מרחביות-זמניות לאלו שנמדדו באמצעות צמדים תרמיים. הפרוטוקולים שהוצגו במחקר זה אפשרו הכנת פנטומים גליליים של רקמת גידול שד מבוססי הידרוג'ל עם ממדים (φ40 x 12 מ"מ) ואזור גידול מרכזי (φ20 x 6 מ"מ), המורכב מ-1% אגרוז כמטריצת הבסיס ותוך ליפיד כמרכיב הפיזור ואזור הגידול המשובץ בננו-מוטות זהב בריכוז של 25 מיקרוגרם/מ"ל. תוצאות מייצגות ממחקר מקרה ממחישות את היישום של פנטומים מפוברקים לאימות סימולציות מספריות עבור PPTT. המחקר מסכם כי הפרוטוקולים המודגמים הם בעלי ערך לביצוע ניסויים פוטותרמיים שמטרתם לייעל ולתכנן פרמטרים טיפוליים לפני ניסויים in vivo ולאמת סימולציות מספריות עבור PPTT.

טיפול פוטותרמי פלזמוני (PPTT) הוא שיטת טיפול מקומית מתפתחת בסרטן הכוללת העברת ננו-חלקיקים (NPs) לאתר הגידול, ולאחר מכן הקרנה עם קרינה קרובה לאינפרא אדום (NIR). ה-NPs ניתנים בדרך כלל באמצעות נתיבים תוך-גידוליים (IT) או תוך ורידיים (IV)¹. עם הקרנת NIR, האינטראקציה הפלזמונית של הקרינה המתרחשת ו-NPs מובילה ליצירת חום מקומי על פני השטח של ה-NPs, אשר לאחר מכן מתפזר לרקמת הגידול שמסביב ^2,3. חימום מקומי זה מעלה את הטמפרטורה באזור הגידול, מה שמוביל למוות של תאים סרטניים באמצעות אבלציה תרמית ^4,5. ניתן להשיג טיפול יעיל בסרטן על ידי שמירה על טמפרטורות ספציפיות, כגון 46 מעלות צלזיוס למשך שעה^ו-6, 50-52 מעלות צלזיוס למשך 4-6 דקות⁷, או 60 מעלות צלזיוס לנזק מיידי⁸ באמצעות תהליכים ביולוגיים שונים.

חומרים פוטותרמיים שונים נחקרו ודווחו ליישום טיפול פוטותרמי, ויעילותם הטיפולית הוערכה באמצעות מחקרי מבחנה או in vivo . חומרים אלה כוללים חומרים אורגניים⁹ כגון צבעי אינפרא אדום קרוב (למשל, Indocyanine Green, IR780, IR820), חומרים פוטותרמיים מבוססי פולימרים (למשל, פולידופמין), וחומרים אנאורגניים¹⁰, כולל NPs מבוססי מתכת אצילית או NPs פלזמוניים (למשל, NPs זהב)¹¹, גופרית/תחמוצות מתכת מעבר¹² ו-MXenes¹³. בין אלה, NPs פלזמוניים, במיוחד NPs זהב, מציעים מספר יתרונות על פני חומרים פוטותרמיים מסורתיים (למשל, צבעים), כגון יציבות פוטותרמית טובה יותר, יעילות המרה פוטותרמית גבוהה יותר ותגובה פלזמונית ניתנת לכוונון באמצעות וריאציות צורה וגודל¹⁰. תכונות אלה הופכות את ה-NPs הזהב למועמדים אידיאליים לטיפול פוטותרמי, כאשר חלקם עוברים כעת ניסויים קליניים¹⁴.

כדי לייעל את היעילות הטיפולית ולהבטיח נזק תרמי מספיק לגידול במהלך PPTT, חיוני להעריך פרמטרים טיפוליים כגון מינון NP (במונחים של ריכוז) ופרמטרים של קרינת NIR (כולל עוצמת הקרינה ומשך ההקרנה) לפני היישום הפרה-קליני/קליני של PPTT. סימולציות מספריות משמשות בדרך כלל לקביעת פרמטרים אלה. שיטות מספריות שונות פותחו כדי להעריך נזק תרמי בתוך רקמת הגידול, כאשר שיטת בולצמן הסריג היא גישה כזו^15,16. עם זאת, כדי שהסימולציות הללו יהיו אמינות, יש לאמת אותן באמצעות אנלוגים של רקמות הידועים כפאנטומים מחקי רקמות. ניתן להכין פנטומים אלה כדי לשכפל את התכונות האופטיות, התרמיות, הביולוגיות או המכניות של רקמות אמיתיות, ולשמש כתחליפים לביצוע בדיקות ראשוניות, הערכת טיפול ואימות של מכשירים, חומרים או שיטות שפותחו לאחרונה המיועדים ליישומים ביולוגיים^17,18. זה יכול להפחית סבל מיותר של בעלי חיים או נבדקים אנושיים ולטפל בחששות אתיים הקשורים לניסויים כאלה^19,20.

התכנון והייצור של פנטום תלויים ביישום המיועד²¹. לדוגמה, במהלך פוטותרפיה כמו PPTT, מינון הקרינה המתרחשת מושפע מכמות האור הנספגת או מתפזרת על ידי ה-NPs והרקמות^22,23. לכן, פנטומים אופטיים המחקים את התכונות האופטיות, במיוחד מקדם הפיזור המופחת (μ_s^') ומקדם הספיגה (μ_a) של רקמות ביולוגיות, משמשים להערכות PPTT ואימות לאחר מכן של סימולציות מספריות^24,25. פנטומים אופטיים מורכבים בדרך כלל משלושה מרכיבים עיקריים: מטריצת בסיס, חומרי פיזור וחומרי ספיגה^17,26. מטריצת הבסיס מחזיקה את רכיבי הפיזור והקליטה בריכוזים מתאימים כדי לשכפל את התכונות האופטיות הרצויות. ניתן לסווג פנטומים אלה לפנטומים מוצקים, נוזליים וחצי מוצקים (הידרוג'ל), בהתאם לסוג מטריצת הבסיס. עבור מחקרים טיפוליים תרמיים כמו PPTT, פנטומי הידרוג'ל, במיוחד פנטומים מבוססי אגרוז, מועדפים בשל התאימות הביולוגית שלהם, הפיזור והספיגה האינהרנטיים הזניחים, תהליך הייצור הפשוט והגמישות ליציקה לצורות וגדלים רצויים המתאימים לגיאומטריות הגידול^19,22. והכי חשוב, ניתן להשתמש בפנטומים המוכנים על בסיס אגרוז עד ~70-80 מעלות צלזיוס בטמפרטורות בתפזורת, שכן טמפרטורת ההיתוך של פנטומים מסוג אגרוז היא ~80 מעלות צלזיוס¹⁹. עבור PPTT, מכיוון שטווח טמפרטורות של ~50-80 מעלות צלזיוס מספיק, ניתן להשתמש בפאנטומים מבוססי אגרוז כאלה להערכות פוטותרמיות מבוססות PPTT.

פנטומים שונים המחקים רקמות מבוססי הידרוג'ל פותחו ודווחו ליישומים שונים. מוסטרי ועמיתיו פיתחו פנטומים מחקי רקמות מבוססי אגרוז והדגימו את התועלת שלהם באימות מערכת אופטית חדשה^{שתוכננה 18}. במחקר אחר, הוכנו פנטומים תרמוכרומיים המחקים רקמות כדי למדוד את היקף הנזק התרמי במהלך טיפול באולטרסאונד ממוקד בעוצמה גבוהה (HIFU)²⁷. פנטומים מחקי רקמות מבוססי פוליאקרילאמיד הוכנו גם כדי לנתח את אפקט הקוויטציה במהלך טיפול בסרטן מבוסס HIFU²⁸. מטרת מחקר זה היא להדגים שיטה שלב אחר שלב לייצור פנטומים המחקים רקמת גידול יחד עם הפרוטוקול לניסויים פוטותרמיים מבוססי פנטום להערכות PPTT. פרוטוקול מפורט מוצע זה נועד לקדם את האימוץ והשחזור של הכנת הפנטום ושיטות ניסוי פוטותרמיות מבוססות פנטום לאחר מכן לבדיקת הביצועים הפוטותרמיים של ננו-מבנים שפותחו לאחרונה, ובכך לאמת את הסימולציות המספריות ולסייע בתכנון או אופטימיזציה של פרמטרים טיפוליים של PPTT. מאמר זה מתאר פרוטוקול הכנת פנטום שתוכנן במיוחד עבור גידולי שד תת-קרקעיים; עם זאת, ניתן להתאים את אותם שלבים לייצור סוגים שונים של רקמות גידול (בצורות וגדלים שונים) על ידי שינוי הרכב חומרי הספיגה והפיזור האופטיים. כדוגמה, ההערכות הפוטותרמיות המודגמות המחקות רקמות מבוססות פנטום שימשו במחקרים שדווחו בעבר כדי לאמת סימולציות PPTT עבור גידול זרוע תת-קרקעי²⁴, IDC^{תת-קרקעי 25} וגידולי עור²⁹.

מאמר זה מתאר את שלבי ההכנה של פנטום אופטי המחקה את μ של גידול שד תת-קרקעי או תת עורי, במיוחד קרצינומה דוקטלית פולשנית (IDC), הממוקמת 3 מ"מ מתחת לפני העור ומוקפת ברקמת שד רגילה. הפנטום הוא בעל גיאומטריה גלילית שהוכנה באמצעות אגרוז כמטריצת בסיס ותוך ליפיד (IL) כחומר הפיזור שנוסף בריכוזים מתאימים כדי לחקות μ_של רקמת שד תקינה וסרטנית. אגרוז, הידרוג'ל שקוף עם פיזור וספיגה זניחים, הוא מטריצת בסיס אידיאלית עבור פנטומים אופטיים^18,30. יתר על כן, IL, תחליב של 20% שומן המחקה את המבנה הדו-שכבתי של קרומי התאים, נמצא בשימוש נרחב כחומר פיזור^31,32 ונבחר למחקר זה כדי לשכפל את μ של רקמת שד תקינה וסרטנית. הפנטום נועד לחקות גידול שד (IDC) המוזרק עם ננו-מוטות זהב (AuNRs) כ-NPs פלזמוניים, מוקף ברקמת שד רגילה ללא AuNRs. מבין NPs זהב שונים המשמשים ב-PPTT, נבחרו AuNRs למחקר זה בשל התגובה הפלזמונית החזקה שלהם באזור ה-NIR והשימוש הנרחב בהם במחקרי PPTT פרה-קליניים, כולל אלה הכוללים חולי כלבים וחתולים¹⁴. הפרוטוקול מדגים הכנה של שני סוגים של פנטומים: האחד עם גידול עם התפלגות AuNR כפי שניתן לראות בהזרקה לווריד והשני עם גידול המשקף את התפלגות ה-AuNR שהושגה באמצעות הזרקת IT. בעקבות פרוטוקול הכנת הפנטום, מתוארים מערך הניסוי להקרנת NIR והשלבים לביצוע הערכות פוטותרמיות על הפאנטומים. לבסוף, ניתן מדריך שלב אחר שלב לפירוש תוצאות התפלגות הטמפרטורה המתקבלות מהערכות אלו ולהשוואת נתוני ניסוי עם תוצאות סימולציה מספרית. השוואה זו מסייעת לאמת שיטה מספרית מפותחת, המאפשרת כוונון לפרמטרי טיפול אופטימליים המותאמים במיוחד לגידול.

הערה: הפאנטומים הוכנו באמצעות אגרוז ותוך ליפידים על סמך קומפוזיציות שדווחו בספרות כדי להשיג את התכונות האופטיות הרצויות. לא נעשה שימוש ברקמה ביולוגית אמיתית של חולים או גופות. לכן, הכנת הרפאים הללו חפה ממגבלות אתיות ואינה דורשת הסכמה מדעת.

1. בחירה או ייצור של תבנית מתאימה

1. . בחירת תבנית מתאימה
   1. בחרו תבנית התואמת את הצורה והמידות הרצויות לפאנטומים. עבור פנטומים גליליים עם אזור גידול המפוזר באופן אחיד עם NPs ומוקף ברקמה נורמלית, השתמשו בצלחת פטרי מזכוכית ובכוס קטנה כתבנית⁸ (איור 1A).
      הערה: שלבים אלה מיועדים להכנת פנטומים המחקים רקמת גידול בגיאומטריה גלילית. עבור צורות או גדלים אחרים, בחר תבנית מתאימה. אם תבנית מתאימה אינה זמינה, יש לייצר תבנית באמצעות הדפסה תלת מימדית (תלת מימד), כמפורט בשלב 1.2.
2. ייצור עובש על ידי הדפסת תלת מימד
   1. עצב מודל תלת מימד באמצעות תוכנת עיצוב בעזרת מחשב (CAD) (למשל, SolidWorks, Autodesk Inventor או CATIA) בהתאם לצורה ולגודל הרצויים. כדי לעקוב אחר פרוטוקול זה, תכנן גליל חלול אחד (קוטר פנימי 40 מ"מ, עובי 2 מ"מ וגובה 12 מ"מ; ראה משלים file 1) ושתי תבניות מיסוך גליליות מוצקות (מידות φ20 x 6 מ"מ ו-φ14 x 3 מ"מ), כפי שמוצג באיור 1B.
      1. לעיצוב/שרטוט צילינדר חלול, בתוכנת CAD, צור שני עיגולים בקוטר של 40 מ"מ ו-44 מ"מ. לאחר מכן, הוצא את הגיאומטריה למשך 12 מ"מ.
      2. עבור תבניות מיסוך גליליות מוצקות, צור עיגולים בקוטר 20 מ"מ ו-14 מ"מ, ולאחר מכן הוצא ל-6 מ"מ ו-3 מ"מ, בהתאמה (ראה קובץ משלים 2 וקובץ משלים 3). צייר מלבן (צדדים 44 מ"מ ו -5 מ"מ) בצד אחד של הגליל והוציא אותו ל -2 מ"מ.
   2. המר את דגמי התלת מימד לפורמט Gcode באמצעות תוכנה תואמת מדפסת תלת מימד (למשל, Cura) להדפסה.
   3. השתמש ב-Gcode זה כדי להדפיס את התבניות (למשל, כאן, באמצעות חומצה פולילקטית [PLA] φ1.75 מ"מ, 1 ק"ג של eSun) באמצעות מדפסת תלת מימד.
      הערה: המלבן נמשך כדי להשעות את תבניות המיסוך. ניתן לעצב ולייצר תבניות שונות להכנת פנטומים עם צורות רצויות אחרות.

2. הכנת תמיסות פנטום המחקות רקמות גידול²⁵

הערה: במחקר זה, פנטומים אופטיים מבוססי אגרוז בגיאומטריה גלילית המחקים רקמת גידול מוכנים להידמות לגידול שד תת-קרקעי המוזרק עם AuNRs, באמצעות הזרקת IT או IV, כפי שמוצג באיור 2. לפנטום ה-IT יש שני אזורים: אזור גידול מרכזי עם AuNRs ואזור רקמה נורמלי מסביב. לפנטום IV יש שלושה אזורים: אזור גידול עם AuNRs בפריפריה של הגידול, אזור גידול חשוף מרכזי ללא AuNRs ואזור רקמה תקינה מסביב. מכיוון שהתכונות האופטיות (μ_a ו-μ_s') שונות עבור גידול ורקמה נורמלית, מכינים פתרונות פנטום נפרדים לכל אזור בעל הרכבים שונים ונדון בנפרד.

1. הכנת תמיסת פנטום המדמה רקמת שד תקינה (פתרון 1)
   הערה: פתרון זה ישמש הן עבור פנטומים של IT והן עבור IV. שלבי ההכנה של פתרון 1 מוצגים באיור 3A.
   1. חשב את הנפח התיאורטי של התמיסה על סמך מידות התבנית.
      הערה: כאן, עבור התבנית הגלילית של φ40 x 12 מ"מ, הנפח המחושב הוא 15 ס"מ³ או 15 מ"ל לפנטום. מכיוון שצריך להכין שני פנטומים כאלה, הנפח הכולל הוא 15 מ"ל x 2, שהם 30 מ"ל. לכן, הכינו 35 מ"ל מהתמיסה כדי להסביר אידוי או שפיכה בשלב הכנת הפנטום.
   2. חשב את הכמות (משקל/ריכוז/נפח) של כל מרכיבי הפנטום - אגרוז (כחומר בסיס) ו- IL (כמרכיב פיזור) - שיש להוסיף לתמיסה של 35 מ"ל.
      1. הוסף 0.35 גרם אגרוז להכנת 35 מ"ל תמיסה המתאימה לריכוז של 1% w/v.
      2. להעריך את ריכוז IL המתאים μ רצוי של רקמת שד תקינה (כלומר, 10.1 ס"^{מ-1 33}) על סמך ריכוז IL לעומת נתוני μ_s הזמינים בספרות. לאחר מכן, חשב את נפח ה-IL (מלאי תחליב 20%) שיתווסף לתמיסת הפנטום באמצעות משוואה (1):
         (1)
         כאשר C₁ ו-V₁ הם ריכוז מלאי הריאגנטים (כאן 20% מלאי IL) ונפח תמיסת מלאי הריאגנטים שיש להוסיף (כאן יש לחשב), בהתאמה. C₂ הוא הריכוז הנדרש של המגיב (שיתקבל מהספרות) בפתרון העבודה הסופי, ו - V₂ הוא הנפח הכולל של פתרון העבודה הסופי (כאן, 35 מ"ל).
         הערה: כאן, עבור μ_של 10.1 ס"^מ-1, ריכוז ה-IL המוערך מהספרות המדווחת הוא 1.04%^34,35. באמצעות השלבים לעיל, נפח ה-IL (20% מלאי IL) שיתווסף הוא 1.82 מ"ל.
   3. שוקלים 0.35 גרם אגרוז ומוסיפים אותו ל-33.18 מ"ל מים נטולי יונים (DI) בכוס. מכסים את הכוס בנייר אלומיניום כדי למנוע אובדן מים.
   4. מחממים את הכוס המכילה את התמיסה על פלטה חמה בחום של 120 מעלות תוך כדי ערבוב עד שהתמיסה הופכת לשקופה.
   5. הורד את הטמפרטורה של הפלטה החמה ל 60 מעלות צלזיוס. לאחר 15 דקות מוסיפים 1.82 מ"ל IL תוך כדי ערבוב. שמור את התמיסה המתקבלת, תמיסה 1, תחת ערבוב בחום של 60 מעלות צלזיוס עד לשימוש (מוכן למזיגה).
      הערה: יש לשמור את תמיסת הפנטום בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס בתנאי ערבוב. אחרת, זה מוביל להתמצקות הפתרון.
2. הכנת תמיסת פנטום גידול משובצת AuNR (פתרון 2)
   הערה: פתרון זה ישמש הן עבור פנטומים של IT והן עבור IV. שלבי ההכנה של פתרון 2 מוצגים באיור 3B.
   1. חשב את נפח אזור הגידול שיש למלא (φ20 x 6 מ"מ).
      הערה: הנפח המשוער לשני פנטומים גידוליים כאלה הוא 3.8 מ"ל. אז, נפח התמיסה שיש להכין יהיה 4.5 מ"ל.
   2. חשב את כמות מרכיבי פנטום הגידול שיש להוסיף - אגרוז, IL ו- AuNRs - באמצעות שלבים דומים כפי שהוזכר בסעיף 2.1.
      1. הוסף 45 מ"ג להכנת 4.5 מ"ל תמיסה המתאימה לריכוז של 1% משקל/נפח.
      2. IL:μ_s' של גידול השד הוא 4.6 ס"^{מ-1 33} וכדי לחקות את אותו הדבר, ריכוז ה-IL המקביל הנדרש הוא 0.472%^34,35. לכן, הוסף 106.2 מיקרוליטר של IL מ-20% מלאי IL ל-4.5 מ"ל של תמיסת פנטום גידול.
      3. הריכוז הרצוי של AuNRs בפנטום הוא 25 מיקרוגרם/מ"ל. כדי להשיג את אותו הדבר, הוסף 3.21 מ"ל של תמיסת AuNRs (ריכוז מלאי: 35 מיקרוגרם/מ"ל) לתמיסת פנטום הגידול.
   3. מוסיפים 45 מ"ג אגרוז ל-1.18 מ"ל מי DI בכוס ומכסים אותה בנייר אלומיניום.
   4. מניחים את הכוס על צלחת חמה ומערבבים בחום של 120 מעלות צלזיוס עד שהתמיסה הופכת שקופה.
   5. הפחיתו את טמפרטורת הפלטה החמה ל 60 מעלות צלזיוס והשאירו את התמיסה למשך 15 דקות.
   6. הוסף 106.2 מיקרוליטר של IL ו-3.21 מ"ל של תרחיף AuNR (35 מיקרוגרם/מ"ל) בתנאי ערבוב. שמור את התמיסה המתקבלת, תמיסה 2, תחת ערבוב בחום של 60 מעלות צלזיוס עד למזיגה.
3. הכנת תמיסת פנטום של גידול חשוף (ללא AuNRs) (פתרון 3)
   הערה: פתרון זה ישמש לפנטום IV בלבד. שלבי ההכנה של פתרון 2 מוצגים באיור 3C.
   1. חשב את הנפח התיאורטי של התרחיף שיש להוסיף ליצירת אזור גידול חשוף (~ φ20 x 6 מ"מ).
      הערה: הנפח המשוער של פנטומי גידול הוא 1.9 מ"ל. אז, נפח התמיסה שיש להכין יהיה 2.5 מ"ל.
   2. חשב את כמות מרכיבי פנטום הגידול שיש להוסיף - אגרוז ו- IL באמצעות שלבים דומים כפי שהוזכר בסעיף 2.1.
      1. הוסף 25 מ"ג אגרוז להכנת 2.5 מ"ל תמיסה כדי להשיג ריכוז של 1% משקל/נפח.
      2. IL:μ_s' של גידול השד הוא 4.6 ס"^{מ-1 33} וכדי לחקות את אותו הדבר, ריכוז ה-IL המקביל הנדרש הוא 0.472%^34,35. הוסף 59 מיקרוליטר של מלאי 20% IL.
   3. מוסיפים 25 מ"ג אגרוז ל-2.44 מ"ל מי DI בכוס ומכסים אותה בנייר אלומיניום.
   4. מניחים את הכוס על פלטה חמה ומערבבים בחום של 120 מעלות צלזיוס עד שהתמיסה הופכת לשקופה.
   5. הפחיתו את טמפרטורת הפלטה החמה ל 60 מעלות צלזיוס והשאירו את התמיסה למשך 15 דקות.
   6. הוסף 59 מיקרוליטר IL לתמיסה בתנאי ערבוב. שמור את התמיסה המתקבלת, תמיסה 3, בתנאי ערבוב בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס עד למזיגה.

3. הכנת פנטום מחקה רקמת גידול 24,25,36

1. מכינים את התבניות לשלב המזיגה. לשם כך, אטמו את תחתית התבניות הגליליות בעזרת פרפילם והניחו את תבנית המיסוך (φ20 x 6 מ"מ) במרכז.
2. יוצקים את תמיסה 1 לתוך התבניות הגליליות עד לסימון העליון של תבנית המסיכה ומניחים לה להתמצק (איור 4A).
3. לאחר ההתמצקות, הסר את תבנית המיסוך כדי ליצור חלל לאזור הגידול (איור 4B).
   הערה: הפרוטוקול יהיה זהה הן עבור פנטומים של IT והן עבור IV עד לשלב 3.3. התהליך יידון בנפרד עבור פנטומים של IT ו-IV לאחר שלב 3.3.
4. פנטום IT 24,25,36
   1. מלאו את החלל בתמיסה 2 ואפשרו לו להתמצק (איור 4C).
   2. הוסף את פתרון 1 לחלק העליון של הפנטום ואפשר לו להתמצק לחלוטין (איור 4D).
5. פנטום IV^24,25
   1. הכנס תבנית מיסוך קטנה יותר (φ14 x 3 מ"מ) ומלא את החלל סביבה בתמיסה 2 (איור 4E).
   2. לאחר ההתמצקות, הסר את התבנית הקטנה יותר ומלא את החלל שנותר בתמיסה 3 (איור 4F).
   3. הוסף את פתרון 1 למעלה ואפשר התמצקות מלאה (איור 4G).

4. החדרת הצמדים התרמיים בתוך הפנטום 24,25,36

הערה: כדי לנטר את התפלגות הטמפרטורה המרחבית, צמדים תרמיים מסוג K מוכנסים בתוך הפנטום במיקומים רדיאליים (r) וציריים (z) שונים, כפי שמוצג באיור 2. עבור החדרת צמד תרמי במקומות מדויקים, נימי זכוכית משמשים כמדריכים להבטחת דיוק. מיקומי הצמד התרמי מסומנים כ-(r, z), כאשר נקודת האמצע על פני השטח העליונים של הגידול בעומק z = 3 מ"מ משמשת כנקודת ייחוס הן לפנטומים של IT והן ל-IV ומסומנת כ-(0, 3), כפי שמוצג באיור 2A,B. בעת בחירת מיקומים רדיאליים וציריים לכימות נזק תרמי באזור הגידול, המיקומים בפריפריה של הגידול (הן רדיאליים והן ציריים) הם קריטיים. השגת הטמפרטורות הנדרשות בנקודות היקפיות אלו במהלך הקרנת NIR מבטיחה אבלציה מלאה של הגידול. לפיכך, הצמדים התרמיים ממוקמים בנקודות קיצון רדיאליות (של הגידול) ב-z = 3 ו-9 מ"מ, כלומר (10, 3) ו-(10, 9), וצמד תרמי אחד ממוקם בממשק הגידול-רקמה ב-z = 9 מ"מ (מיקום צירי היקפי), כלומר, (0, 9) כפי שמתואר באיור 2A,B. בנוסף, כדי להעריך את התפלגות הטמפרטורה הצירית, מוכנס צמד תרמי בין מיקומים (0, 3) ו-(0, 9), המסומן כ-(0, 6). לבסוף, כדי להעריך את עליית הטמפרטורה באזור הרקמה הבריאה שמסביב, מוחדר צמד תרמי אחד ב-(15, 3).

1. חותכים את נימי הזכוכית לאורכים מתאימים כך שאלו יגיעו למיקומים הרדיאליים והציריים הרצויים בתוך הפנטום.
2. הכנס צמדים תרמיים בתוך נימי הזכוכית הללו ונקב במיקומי פנטום רדיאליים וציריים מוגדרים בזה אחר זה.
3. לאחר שכל הצמדים התרמיים נמצאים במקומם, הנח בזהירות את הפנטום בצלחת פטרי מזכוכית להקרנת NIR לאחר מכן, כפי שמוצג באיור 5A.

5. חשיפה לקרינת קרינה בלתי מייננת ומדידת טמפרטורות פוטותרמיות כתוצאה מכך³⁶

1. הנח את צלחת הפטרי מזכוכית המכילה את הפנטום (מוכנס עם צמדים תרמיים) כך שהאזור המרכזי של המשטח העליון של הפאנטום יהיה מאונך לקצה הסיב האופטי של מקור האור NIR, כפי שמתואר באיור 5A.
   הערה: ניתן לכוונן את קוטר האלומה על משטח הפנטום על ידי שינוי המרחק בין המשטח לקצה הסיב האופטי. כאן, נשמר מרחק של 9 מ"מ כדי להשיג קוטר קרן של 20 מ"מ, המכסה את אזור הגידול המרכזי.
2. חבר את מערכת רכישת הנתונים (DAQ) למחשב ופתח את תוכנת LabVIEW.
3. הפעל את מקור האור NIR (איור 5B) והפעל את כפתור התוכנה בו-זמנית כדי להקליט נתוני טמפרטורה בתחילת ההקרנה.
4. הקרינו את הפנטום למשך 20 דקות, ולאחר מכן כבו את מקור האור NIR והפסקו את ההקלטה.
5. התוויית נתוני הטמפרטורה המוקלטת לעומת נתוני הזמן.

6. השוואת טמפרטורה עם תוצאות סימולציה ^24,25

הערה: ניסויים חוזרים על עצמם בדרך כלל, והטמפרטורות נרשמות במרווחי זמן מוגדרים בכל מיקומי הצמד התרמי. לצורך אימות, השלבים הבאים מתבצעים:

1. חשב את הממוצע וסטיית התקן של טמפרטורות הניסוי בכל מיקומי הצמד התרמי (r, z).
2. חשב טמפרטורות במיקומי צמד תרמי נחשבים מבחינה מספרית.
3. תרשים הטמפרטורה הממוצעת שהתקבלה מהניסויים והטמפרטורה שהושגה על ידי סימולציה בכל מיקומי הצמד התרמי ביחס לזמן, מוצג באיור 6.
4. חשב את השגיאה הריבועית הממוצעת (RMSE) והשגיאה המוחלטת הממוצעת (MAE) עבור כל מיקומי הצמד התרמי כדי לכמת את ההבדל בטמפרטורה כדי להעריך את האימות, כפי שמוצג בטבלה 1.
   הערה: MAE ו-RMSE מחושבים באמצעות משוואות 2 ו-3, בהתאמה.
   (2)
   (3)
   כאשר TE, TS ו-N הם הטמפרטורה המתקבלת בניסוי, הטמפרטורה מחושבת מספרית ומספר נקודות הנתונים (כאן, הטמפרטורות נרשמות בכל שנייה למשך 20 דקות; מכאן, = 1,200), בהתאמה. אני מייצג רגעי זמן.

איור 6 מציג את הטמפרטורות הממוצעות הטמפורליות שהתקבלו במהלך ניסויים עם פנטום רקמת גידול משובץ AuNR בכל מיקומי הצמד התרמי, כפי שמוצג באיור 2, בהשוואה לטמפרטורות שהתקבלו במהלך סימולציות במיקומי צמד תרמי מתאימים. כאן, הניסויים בוצעו פי 4 עבור כל התפלגות, כלומר, התפלגות IT ו-IV של AuNRs. במהלך הניסויים, טמפרטורת החדר הייתה 25 מעלות צלזיוס. לכן, גם עבור סימולציה, הטמפרטורה שמסביב נשמרה על 25 מעלות צלזיוס. איור 6A מציג השוואה בין טמפרטורות ממוצעות ניסיוניות לטמפרטורות מדומות עבור התפלגות ה-IT של AuNR. איור 6B מציג השוואה בין טמפרטורות ממוצעות ניסיוניות לטמפרטורות מדומות עבור התפלגות IV של AuNRs. מאיור 6A,B, ניתן לראות כי התפלגות IV מראה עלייה נמוכה יותר בטמפרטורה מאשר התפלגות ה-IT. זאת בשל העובדה שפיזור הקרינה המתרחשת הוא יותר בחלוקת IV עקב שכבה גדולה ועבה יותר של מדיה מפוזרת (רקמה חשופה + גידול חשוף) לפני שהקרינה המתרחשת נספגת על ידי הגידול המוטבע ב-AuNR.

לאחר מכן, תרשימי הטמפרטורה מראים שבמהלך ניסויי פנטום, העלייה המקסימלית בטמפרטורה הייתה ~11 מעלות צלזיוס ו-~6 מעלות צלזיוס במיקום הצמד התרמי (0, 3) עבור הפצת IT ו-IV, בהתאמה. יש לציין כי הרקמה בטוחה תרמית מתחת ל-43 מעלות צלזיוס ^6,16. בדרך כלל, מכיוון שטמפרטורת הליבה של הגוף היא 37 מעלות צלזיוס, עליית טמפרטורה של >6 מעלות צלזיוס מובילה לנזק תרמי ברקמת הגידול. כאן, ניסויי הפנטום עם 25 מיקרוגרם/מ"ל AuNRs ו-0.25 W/cm² מצביעים על כך שהנזק התרמי נגרם בטווח של 3-4 מ"מ בכיוונים הרדיאליים והציריים של הגידול התת-קרקעי בשני המקרים, ושאר אזור הגידול נותר ללא פגע. ניתן להשתמש בפרוטוקולים כאלה כדי לייעל את עוצמת הקרינה וריכוז ה-AuNR כדי להשיג נזק תרמי מלא של גידול.

יתר על כן, אומרים שהטמפרטורות המדומות מאומתות אם השגיאה היא <15% בהשוואה לטמפרטורות הניסוי³⁷. לשם כך, RMSE ו-MAE מחושבים בכל מיקומי הצמד התרמי עבור שני המקרים ומוצגים בטבלה 1. וריאציה מקסימלית של 2.10 מעלות צלזיוס ו -1.94 מעלות צלזיוס מתקבלת עבור הפצת IT והפצות IV, בהתאמה, התואמת לשגיאות של 5.88% ו -6.09% ביחס לטמפרטורה מדומה. לפיכך, ניתן להסיק כי תוצאות הניסוי והסימולציה נמצאות בהשוואה טובה זו לזו.

לסיכום, המחקר מסכם כי הפרוטוקולים להכנת פנטום וניסויים פוטותרמיים מבוססי פנטום שהודגמו כאן עוזרים לאמת סימולציות מספריות ולהבטיח את החוסן של פרמטרים טיפוליים נגזרים ליישומים הבאים in vivo של PPTT.

איור 1: תבניות לייצור פנטומים המחקים רקמות גידול מבוססות אגרוז. (A) צלחת פטרי וכוס זכוכית ששימשו כתבניות ליצירת פנטומים גליליים של רקמת גידול. (B) תבנית גלילית מודפסת בתלת מימד ותבניות מיסוך המיועדות להכנת פנטומים גליליים של רקמת גידול. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: סכמטי של רקמת גידול מבוססת אגרוז המחקה פנטומים של גיאומטריה גלילית. פנטומים עם מידות כוללות של φ40 x 12 מ"מ עם גידול במרכז (φ20 x 6 מ"מ) הממוקם בעומק של 3 מ"מ מפני העור ומוקף באזור רקמה תקין. (A) פנטום עם אזור גידול בעל התפלגות AuNR כפי שהתקבל בהזרקת IT. (B) פנטום עם אזור גידול בעל פיזור AuNR כפי שהתקבל בהזרקה לווריד. מיקומי צמד תרמי מיוצגים כ- (r, z), כאשר r הוא המיקום הרדיאלי ו- z הוא העומק מפני השטח. קיצורים: AuNRs = ננו-מוטות זהב; IT = תוך-גידולי; IV = תוך ורידי. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: סכמטי המציג הכנה של פתרונות פנטום שונים. שלבים להכנת (א) תמיסת פנטום רקמות רגילה (פתרון 1). (B) תמיסת פנטום גידול משובצת AuNR (פתרון 2). (C) גידול חשוף (ללא AuNRs) תמיסת פנטום (פתרון 3). קיצורים: DI = דה-יוניזציה; IL = תוך-ליפיד; AuNRs = ננו-מוטות זהב. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: הכנת פנטומים המחקים רקמת גידול עם הפצת IT ו-IV. פנטומים בקוטר כולל של 40 מ"מ ועומק של 12 מ"מ, עם אזור גידול תת-קרקעי מרכזי בקוטר 20 מ"מ ובעומק 6 מ"מ, הממוקם 3 מ"מ מתחת לפני השטח של הפנטום/העור. שלבים נפוצים לפנטומים של IT ו-IV: (A) תמיסה 1 נשפכת לתוך התבנית הגלילית (החלק התחתון אטום בפרפילם), עם תבנית מיסוך המונחת במרכז ליצירת חלל לאזור הגידול. (B) אזור רקמה תקין מוצק לאחר הסרת תבנית המיסוך (φ20 x 6 מ"מ), ויוצר חלל לאזור הגידול. שלבים לאחר A ו-B להכנת פנטום ה-IT: (C) תמיסה 2 נשפכה לתוך החלל כדי ליצור את אזור הגידול המרכזי המוטמע ב-AuNRs להפצת IT. (D) תמיסה 1 נשפכה על הפנטום המוצק כדי ליצור לבסוף גידול תת-קרקעי משובץ ב-AuNRs עם התפלגות IT, הממוקם 3 מ"מ מתחת לפני השטח של הפנטום. שלבים אחרי A ו-B להכנת פנטום IV; (E) תבנית מיסוך קטנה (φ14 x 3 מ"מ) המונחת בחלל המרכזי, כאשר תמיסה 2 נשפכת סביבה ליצירת אזור הגידול ההיקפי המוטבע ב-AuNRs להפצת IV. (F) תמיסה 3 נשפכה לתוך החלל הנותר כדי ליצור אזור גידול משובץ ב-AuNRs המחקים התפלגות IV. (G) תמיסה 1 נשפכה על הפנטום המוצק כדי ליצור לבסוף גידול תת-קרקעי משובץ ב-AuNRs עם פיזור IV, הממוקם 3 מ"מ מתחת לפני השטח של הפנטום. (H) פנטומים מנותחים שמראים את ממדי הגידול, התפלגות AuNRs ועומק הגידול מפני השטח של הפנטום. נתון זה נלקח מ-Shaw et ^al.25. קיצורים: IT = תוך-גידולי; IV = תוך ורידי; AuNRs = ננו-מוטות זהב. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 5: הגדרה עבור ניסויים פוטותרמיים על פנטומים. (A) החדרת צמדים תרמיים (סוג K) במיקומים רדיאליים וציריים שונים בתוך הפנטום. (ב) הקרנת NIR של פנטומים וניטור טמפרטורות לאחר מכן באמצעות צמדים תרמיים מוכנסים. נתון זה נלקח מ-Shaw et ^al.25. קיצור: NIR = קרוב לאינפרא אדום. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 6: השוואה בין תוצאות ניסיוניות וסימולציות לאימות סימולציות נומריות. טמפרטורות ממוצעות שהתקבלו במיקומים שונים של צמד תרמי על פנטומים במהלך הניסוי הפוטותרמי בהשוואה לטמפרטורות מדומות תואמות עבור (A) התפלגות IT ו-(B) התפלגות IV. מיקומי הצמד התרמי מיוצגים כ- (r, z), המייצגים רדיוס ועומק, בהתאמה. הגידול המוטבע ב-AuNR הממוקם בעומק של 3 מ"מ בתוך הרקמה מוקרן בעוצמת NIR של 0.25 W/cm². קווים מוצקים ומקווקווים מייצגים טמפרטורות שהושגו בניסוי וטמפרטורות המחושבות באמצעות סימולציה, בהתאמה. נתון זה נלקח מ-Shaw et ^al.25. קיצורים: IT = תוך-גידולי; IV = תוך ורידי; AuNRs = ננו-מוטות זהב; NIR = קרוב לאינפרא אדום; TE = טמפרטורות ניסוי; TS = טמפרטורות מדומות. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

טבלה 1: MAE ו-RMSE מחושבים עבור הפצת IT והפצת IV של AuNRs במיקומים שונים של צמד תרמי. טבלה זו נלקחה מ-Shaw et ^al.25. כל הנתונים הם במעלות צלזיוס (ºC). קיצורים: MAE = שגיאה מוחלטת ממוצעת; RMSE = שגיאה ריבועית ממוצעת שורש; IT = תוך-גידולי; IV = תוך ורידי; AuNRs = ננו-מוטות זהב.

תיק משלים 1: א. STL file לתבנית גלילית בגודל 40 מ"מ על 12 מ"מ. אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

תיק משלים 2: א. STL file לתבנית מיסוך 20 מ"מ על 6 מ"מ. אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

תיק משלים 3: א. STL file לתבנית מיסוך 14 מ"מ על 3 מ"מ. אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

מאמר זה מציג את הפרוטוקול להכנת פנטומים אופטיים המחקים רקמת גידול מבוססת אגרוז. הפאנטומים מתוכננים באופן שמחקה את התכונות האופטיות של גידול ורקמות נורמליות לשימוש בהם במחקרים ל-PPTT. במחקר זה, מודגש היישום של פנטומים אלה לאימות שיטות מספריות במהלך PPTT. השלב הקריטי ביותר בפרוטוקול זה הוא שמירה על הטמפרטורה של תמיסות הפנטום המכילות אגרוז ו-IL בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס תחת ערבוב מתמיד. אם הטמפרטורה עולה על 60 מעלות צלזיוס, הדבר עלול להוביל לדנטורציה של IL, ולשנות את התכונות האופטיות הרצויות של הפנטום המוכן. לעומת זאת, אם הטמפרטורה יורדת מתחת ל-40 מעלות צלזיוס, עלולה להתרחש ג'לציה מוקדמת, וכתוצאה מכך התפלגות לא אחידה של רכיב הפיזור (IL) ו/או מרכיב הספיגה (AuNRs)¹⁸.

היבט קריטי נוסף הוא המיקום המדויק של צמדים תרמיים. אפילו מיקום שגוי קל (בקנה מידה מילימטר) יכול להשפיע באופן משמעותי על עליית הטמפרטורה הנמדדת. כדי למנוע זאת, נקבע השימוש בנימי זכוכית כדי להנחות במדויק את הצמדים התרמיים למיקומים המרחביים הרצויים בתוך הפנטום. בנוסף, כדי לפתור בעיות של שגיאות פוטנציאליות ממיקום לא נכון של צמד תרמי, יש לבצע הערכות פוטותרמיות לפחות במשולש²⁵.

לפנטומים האופטיים מבוססי האגרוז שנדונו במאמר זה יש חיי מדף שמישים קצרים של לא יותר מיום אחד. לכן, יש לערוך ניסויים פוטותרמיים באותו יום שבו מכינים את הרפאים. עם זאת, בנסיבות בלתי נמנעות, כדי להאריך את חיי המדף שלהם, יש להניח את הפאנטומים בצלחת פטרי מיד לאחר ההתמצקות, לאטום בפרפילם ולאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. זה יאריך את השימושיות של פנטומים למשך 2-3 ימים. מגבלה נוספת של הפרוטוקול המודגם היא שמרכיבי הפנטום נוספו בריכוזים על סמך הספרות הזמינה כדי להשיג את μ_s ו-μ _a. הנחנו שהפנטומים בעלי התכונות האופטיות הרצויות הוכנו. עם זאת, התכונות האופטיות של הפאנטומים המוכנים לא נמדדו בטכניקה מתאימה לאחר הכנתם במחקר זה.

הכנת פנטומים אופטיים מבוססי אגרוז היא פשוטה, חסכונית וחסכונית בזמן. ניתן ליצוק בקלות את הפאנטומים המבוססים על אגרוז במגוון צורות וגדלים או שכבות, במידת הצורך באמצעות תבניות מתאימות. רוחות רפאים נוזליות ומוצקות חסרות את הגמישות הזו^19,38. במהלך קרינת NIR, התגובה הפוטותרמית של הפנטומים המשובצים בננו-חלקיקים הוערכה באמצעות ניטור טמפרטורה מבוסס צמד תרמי. שיטה זו מציעה מספר יתרונות על פני טכניקות אחרות, כגון קולורימטריה (מוגבלת להבחנה בין טמפרטורות רק בין ערכי מינימום ומקסימום), תרמוגרפיה אינפרא אדום (מוגבלת לזיהוי טמפרטורה בגובה פני השטח) ותרמומטריית תהודה מגנטית (עלות גבוהה ומורכבות תפעולית, מה שהופך אותה למתאימה בעיקר ליישומי in vivo)²⁶. ניטור מבוסס צמד תרמי מספק רגישות גבוהה (0.1 מעלות צלזיוס) ודיוק, יכולת לזהות טמפרטורות במקומות עמוקים יותר, עלות-תועלת וקלות תפעול, מה שהופך אותו לבחירה מעולה עבור הערכות מבוססות פנטום כאלה. יתרה מכך, אימות הסימולציות המספריות באמצעות ניסויים פוטותרמיים על פנטומים המחקים רקמות גידול מציע יתרונות משמעותיים, כלומר הפחתת הצורך במודלים in vivo כמו עכברים שעלולים לגרום לכאב וסבל מיותרים. יתר על כן, הערכות מבוססות פנטום נמנעות מחששות אתיים.

במחקר זה, השימוש בפנטומים אופטיים מודגש לאימות סימולציות מספריות ב-PPTT. הפנטומים המחקים רקמות הוכנו על סמך הנתונים המדווחים בספרות, והבטיחו שריכוזי המרכיבים תואמים את התכונות האופטיות הרצויות, במיוחד במונחים של מקדם פיזור ומקדם ספיגה מופחתים. בעוד שהתכונות האופטיות לא נמדדו ישירות במחקר זה, סביר להניח שהפנטומים המוכנים מציגים את המאפיינים האופטיים המיועדים. מכיוון שפנטומים אלה נועדו לחקות את התכונות האופטיות של רקמות אמיתיות, הם יכולים לשמש כחומרי ייחוס לחקר הובלת אור ברקמות ביולוגיות, אימות הדיוק של שיטות אופטיות במדידת תכונות אלה, הערכת הביצועים הפוטותרמיים של ננו-מבנים חדשים בתנאים של הדמיית רקמות, והפקת נתונים ראשוניים להנחיית התכנון של ניסויים נוספים in vivo ^{17, 18,26}.

למחברים אין אינטרסים מתחרים לחשוף.

מחקר זה נערך ללא כל תמיכה כספית מגופים ציבוריים, מסחריים או ללא מטרות רווח. המחברים מודים לארגון המכשירים המדעיים המרכזי של CSIR, צ'אנדיגאר, הודו, על התשתית והתמיכה.