Demir Açlığı ve Anaerobik Büyümeyi Takiben Yersinia psödotuberculosis Tip III Sekresyon Sistemi Aktivitesinin Ölçülmesi

Bakteriler, oksijen ve demir biyoyararlanımında farklılık gösteren konakçı dokuları kolonize eder, ancak bakterileri incelemek için çoğu yaklaşım havalandırılmış, zengin ortam kullanır. Bu protokol, insan patojeni Yersinia pseudotuberculosis'in değişen demir konsantrasyonları ve oksijen gerilimi altında kültürlenmesini ve önemli bir virülans faktörü olan Yersinia tip III sekresyon sisteminin aktivitesinin ölçülmesini açıklar.

Birçok Gram-negatif patojen için önemli bir virülans mekanizması, sitotoksik veya immünomodülatör efektör proteinleri konakçı hücrelere translokasyona geçiren iğne benzeri bir uzantı olan tip III sekresyon sistemidir (T3SS). T3SS, hücre dışı olarak erişilebilir olduğu ve patojenik olmayan bakterilerde büyük ölçüde bulunmadığı için antimikrobiyal keşif kampanyaları için bir hedeftir. Son çalışmalar, Yersinia ve Salmonella'nın T3SS'sinin, memeli enfeksiyonu sırasında karşılaşılan önemli nişe özgü sinyaller olan demir ve oksijene yanıt veren faktörler tarafından düzenlendiğini göstermiştir. Burada tarif edilen, Yersinia pseudotuberculosis'in demir açlığı için bir yöntemdir ve daha sonra isteğe bağlı olarak inorganik demir takviyesi vardır. Oksijen mevcudiyetinin etkisini değerlendirmek için, bu demir açlığı süreci hem aerobik hem de anaerobik koşullar altında gösterilmiştir. Son olarak, kültürlerin 37 ° C'lik memeli konak sıcaklığında inkübe edilmesi, T3SS ekspresyonunu indükler ve süpernatan içine salınan efektör proteinleri görselleştirerek Yersinia T3SS aktivitesinin nicelleştirilmesine izin verir. Burada detaylandırılan adımlar, muhtemelen verimli Yersinia demir alımı ve süpürme sistemleri nedeniyle, sağlam demir açlığını indüklemek için yetersiz olan demir açlığının yokluğunda demir şelatörlerin kullanımına göre bir avantaj sunmaktadır. Benzer şekilde, asitle yıkanan laboratuvar cam malzemeleri, sağlam demir açlığını indüklemek için gerekli olan artık demirin uzaklaştırılmasını sağlamak için detaylandırılmıştır. Ek olarak, artık demiri ortamdan uzaklaştırmak için bir kenetleme maddesi kullanılması ve bakteriyel demir depolarını tüketmek için demir yokluğunda bakterilerin birkaç nesil boyunca kültürlenmesi açıklanmaktadır. Trikloroasetik asit kaynaklı protein çökeltme, SDS-PAGE ve gümüş boyamanın standart protokollerini içeren bu prosedür, T3SS aktivitesini ölçmenin erişilebilir yollarını gösterir. Bu prosedür Y. pseudotuberculosis için optimize edilmiş olsa da, benzer sağlam demir alım sistemlerine sahip patojenlerde yapılan çalışmalar için bir çerçeve sunar. Antibiyotik direnci çağında, bu yöntemler, konakçı ile ilgili koşullar altında T3SS'yi hedef alan antimikrobiyal bileşiklerin etkinliğini değerlendirmek için genişletilebilir.

Yersinia, Vibrio, Escherichia, Pseudomonas ve Shigella gibi klinik olarak anlamlı birçok Gram-negatif patojen, efektör proteinleri konakçı hücrelere enjekte etmek için tip III salgı sistemini (T3SS) kodlar¹. Birçok bakteri türünde, T3SS sıkı düzenleyici kontrol altındadır². Örneğin, Yersinia T3SS efektör proteinlerinin hedef konak hücrelere translokasyonu, konak savunma mekanizmalarını bozmak ve konak dokuların bakteriyel kolonizasyonunu sağlamak için kritik öneme sahiptir. Bununla birlikte, Yersinia T3SS aktivitesi metabolik olarak külfetlidir ve konakçı immün reseptörleri tarafından tanınmayı tetikleyebilir³. Buna göre, belirli çevresel ipuçlarını algılayan düzenleyiciler, birçok bakteri türünde T3SS genlerinin ekspresyonunu kontrol eder. Yersinia gibi patojenler, enfeksiyon döngüleri sırasında kritik virülans faktörlerinin ekspresyonunu etkileyen çevresel değişiklikler yaşadığından, bakteriyel patojenler tarafından işgal edilen konakçı nişlerinin göze çarpan özelliklerini taklit eden laboratuvar koşullarının geliştirilmesi önemlidir. Spesifik olarak, oksijen gerginliği ve demir mevcudiyeti, uzay-zamansal bir şekilde çeşitli doku bölgeleri arasında farklılık gösterir ve T3SS ^4,5,6 gibi virülans genlerinin ekspresyonunu etkiler. Bu nedenle, bu yöntemin amacı, oksijen ve demirin Yersinia T3SS'nin ekspresyonunu nasıl etkilediğini değerlendirmektir. Bu, konakçı-patojen etkileşiminin dinamikleri hakkında fikir verecektir.

Burada açıklanan yöntem, Yersinia pseudotuberculosis'in aerobik ve anaerobik olarak nasıl kültürleneceğini ve ayrıca aerobik veya anaerobik büyüme sırasında Yersinia demir depolarının nasıl tüketileceğini detaylandırır. Bu değişken koşullar altında bakterilerin başarılı bir şekilde kültürlenmesiyle ilgili olarak burada vurgulanan birkaç önemli husus vardır. İlk olarak, anaerobik kültürleme, medya tarifinde belirtilen bir değişiklik olan ek glikoz takviyesi gerektirir. İkincisi, Y. pseudotuberculosis, demiri çevreden sağlam bir şekilde temizleyebilen sideroforlar ve diğer demir alım sistemlerini kullandığından, kültür ortamının ve laboratuvar cam malzemelerinin mümkün olduğunca demir içermemesini sağlamaya özel önem verilmektedir⁷. Önceki çalışmalar, demir açlığını taklit etmek için zengin ortamlı bakteri kültürlerinden demiri tüketmek için dipiridil gibi demir şelatörleri kullanmıştır ^8,9. Bununla birlikte, demir açlığına neden olmak için Yersinia demir depolarının tükenmesi, cam eşyalarda ve ortamlarda kalan demirin uzaklaştırılmasını ve ayrıca demir yokluğunda uzun süreli büyümeyi gerektirir. Bu protokol, tam demir açlığını sağlamak için bakterileri birkaç nesil boyunca kültürlemenin yanı sıra, artık demiri uzaklaştırmak için cam eşyaların asitle nasıl yıkanacağını ve ortamın nasıl şelatlanacağını detaylandırır. Demir açlığı, burada yfeA ve bfd ile gösterildiği gibi, koşullar boyunca iyi karakterize edilmiş demire duyarlı genlerin nispi transkript seviyelerinin ölçülmesiyle sağlanabilir.

Bu protokolün doruk noktası, kültür süpernatantını trikloroasetik asit (TCA) ile muamele ederek ve salgılanan proteinleri SDS-PAGE aracılığıyla görselleştirerek bu koşulların her birinden salgılanan T3SS efektör proteinlerinin nasıl çökeltileceğini gösterir. Son olarak, nispi T3SS aktivitesi, salgılanan proteinlerin gümüş boyama yoluyla görselleştirilmesi ve Yersinia dış proteinleri (Yops) ¹⁰ olarak adlandırılan T3SS efektör proteinlerinin nispi seviyelerinin ölçülmesiyle değerlendirilir.

T3SS aktivite testleri genellikle kültür süpernanında T3SS efektör protein seviyelerini tespit etmek için spesifik antikorlar kullanır. Bununla birlikte, T3SS efektör proteinleri için western blotting antikorları genellikle ticari olarak mevcut değildir. Bu nedenle, bu yöntemde T3SS aktivitesinin nihai görselleştirmesinin spesifik antikorlar gerektirmemesini ve bunun yerine salgılanan tüm proteinlerin görselleştirilmesine izin veren gümüş boyamadan yararlanabilmesini sağlamak için özel dikkat gösterilmiştir. Bu yöntem Y. pseudotuberculosis için özel olarak tasarlanmış ve optimize edilmiş olsa da, kesin ortam koşulları ve kuluçka süreleri değişse de diğer bakteri türlerine uyarlanabilir.

Reaktiflerin, ortam bileşiminin, primer dizilerinin ve ekipmanın ayrıntıları Malzeme Tablosunda listelenmiştir. Şekil 1'de genel deneysel iş akışı gösterilmektedir.

1. Asitle yıkanmış cam eşyaların ve şelatlı M9 ortamının hazırlanması

NOT: Başlamadan önce, kullanılacak tam reaktifler ve tarifler için malzeme bölümüne bakın. M9 ortamı ilk olarak Cheng ve ^ark.11'de Yersinia T3SS testleri için kullanıldı.

1. 250 mL'lik bir cam şişeye 100 mL 6 N HCl dökün.
   DİKKAT: HCl son derece tehlikelidir; Bu maddeyi kullanırken uygun önlemlerin alındığından emin olun.
2. Cam kabın ağzını bir cam tıpa ile kapatın ve HCl'yi ara sıra yön değiştirerek iyice dağıtmak için şişeyi 1 dakika dikkatlice döndürün.
3. 6 N HCl'yi uygun şekilde atın.
4. 100 mL deiyonize H₂O ekleyerek, ağzı kapatarak, 20 saniye çalkalayarak ve ardından suyu boşaltarak cam kabı durulayın.
5. Durulama adımını toplam 3 kez tekrarlayın.
6. Havanın kurumasını bekleyin. Sterilize etmek için otoklav.
7. Ortamı şelatlamak için, M9 bileşenlerini şelatlama reaktifi ile karıştırın ve oda sıcaklığında ~ 18 saat boyunca manyetik bir karıştırma çubuğu ile karıştırın. Filtre ile sterilize edin ve 1 mM'lik bir nihai konsantrasyona MgS04 ekleyin.

2. Değişen demir seviyeleri ve oksijen gerilimi altında Y. pseudotuberculosis'in kültürlenmesi

1. Lizojeni Et Suyu (LB) agar plakaları üzerinde çizgi Y. pseudotuberculosis (bu çalışmada IP2666pIB1 suşu kullanılmıştır) ve oda sıcaklığında inkübe edin.
   NOT: Yersinia'nın 37 ° C'de, özellikle düşük kalsiyumlu ortamda inkübe edilmesi, T3SS aktivitesine, büyümenin durmasına yol açar ve sonuçta T3SS^12'yi kodlayan Yersinia virulence (pYV) için plazmit kaybını seçer. Bu nedenle, bu protokol, T3SS aktivitesinin ölçülmesi gerekene kadar Yersinia'nın 26 ° C inkübasyonunu kullanır.
2. 48 saat sonra, görünür koloniler oluştuğunda, %0.2 glikoz, 1 mg / L FeSO_{4.7H 2}O içeren ve kasamino asitlerle (burada M9 ortamı olarak anılacaktır) takviye edilmiş 4 mL M9 ortamını aşılayın tek, izole edilmiş bir koloniden ve gece boyunca 26 ° C'de yaklaşık 18 saat boyunca 250 rpm'de havalandırma ile kültür.
   NOT: Aşağıdaki adımdan başlayarak ve devam ederek asitle yıkanmış cam eşyalar kullanın.
3. Aşağıdaki adımları izleyerek şelatlı M9 ortamına alt kültür.
   NOT: Sonraki tüm adımlar için, standart %0,2 glikoz yerine %0,9 glikoz içeren M9 ortamı kullanılır.
   1. Bir spektrofotometre kullanarak, gece boyunca kültürün optik yoğunluğunu (OD₆₀₀) ölçün.
   2. Gece boyunca kültürü, demir takviyesi içermeyen₂₅₀ mL asitle yıkanmış bir şişede% 0.9 glikoz içeren ve FeSO_{4.7H 2}O içermeyen toplam 14 mL steril şelatlı M9 ortamında 0.1'lik bir OD 600 değerine seyreltin.
   3. 250 rpm'de havalandırma ile 26 °C'de 8 saat inkübe edin.
4. Paralel olarak aerobik ve anaerobik kültürlere alt kültür.
   1. Büyüyen kültürlerin OD_600'ünü ölçün.
   2. Aerobik inkübasyona devam etmek için, büyüyen kültürleri,₂₅₀ mL asitle yıkanmış bir şişede% 0.9 glikoz ve FeSO_{4.7H 2}O içermeyen 14 mL steril şelatlı M9 ortamında 0.1'lik bir OD 600 değerine alt kültür ve demir takviyesi olmadan 12 saat boyunca 26 ° C'de havalandırma ile kültür.
   3. Anaerobik kültürleme için, iki asitle yıkanmış cam tüpe 14 mL steril şelatlı M9 ortamında 0.1'lik bir OD₆₀₀ değerine kadar alt kültür. İlk tüpe, 1 mg / L'lik bir nihai konsantrasyon için ("yüksek demir" olarak anılır) filtre ile sterilize edilmiş (0.22 μm polietersülfon membran kullanılarak) FeSO_{4.7H 2O}ekleyin. İkinci tüpte, 0.01 mg / L'lik bir nihai konsantrasyon için FeSO_{4.7H 2}O ekleyin ("düşük demir" olarak adlandırılır). Bu, 10 mg / mL FeSO_{4.7H 2}O stok çözeltisi kullanılarak yapılabilir. Her iki tüpü de anaerobik bir odada oda sıcaklığında 12 saat anaerobik olarak inkübe edin.
      NOT: 1 mg/L FeSO_{4.7H 2}O, sağlam Yersinia büyümesi için demir dolgun koşullar sağlar. Tersine, anaerobik kültürlere sadece 0.01 mg / L FeSO_{4.7H 2}O eklenmesi, anaerobik koşullar altında yeterli büyümeyi sağlar, ancak yine de demir açlığı tepkilerini mümkün kılarken, aerobik kültürler, T3SS aktivitesinin uyarılmasından önce demir açlığı tepkilerini uyarmak için herhangi bir ilave demir yokluğunda 12 saat boyunca büyütülür.
5. Tip III sekresyon sistemi aktivitesini indükleyin.
   1. Anaerobik kültürleri 37 °C'ye kaydırın ve T3SS'yi indüklemek için anaerobik inkübasyona 4 saat devam edin.
   2. Aerobik olarak büyüyen kültürün OD_600'ünü ölçün.
   3. Asitle yıkanmış iki şişeye, aerobik olarak büyüyen kültürleri, 14 mL steril şelatlı M9 ortamında 0.2'lik bir OD₆₀₀ değerine alt kültürleyin. İlk şişeye, 1 mg / L'lik bir nihai konsantrasyon için filtreyle sterilize edilmiş FeSO_{4.7H 2}O ekleyin. İkinci şişeye, 0.01 mg / L'lik bir son konsantrasyon için FeSO_{4.7H 2}O ekleyin. Her iki şişeyi de 2 saat boyunca 250 rpm'de 26 ° C'de havalandırma ile inkübe edin.
   4. 2 saat sonra, aerobik kültürleri 250 rpm'de havalandırma ile 37 °C'ye kaydırın ve T3SS'yi indüklemek için 4 saat inkübe edin.

3. T3SS efektör proteinlerinin trikloroasetik asit (TCA) çökeltilmesi

1. Anaerobik inkübasyon tamamlandıktan sonra, kültürlerin OD_600'ünü ölçün.
2. Eşit hücre kütlesi elde etmek için tüm anaerobik numuneleri normalleştirin ( Tablo 1'de verilen örneğe bakın). Anaerobik kültürleme için, genellikle demir açlığı çeken kültürlerde ~ 0.5 ve demir içeren kültürler için ~ 1 OD₆₀₀ değeri bekleyin. Bu durumda, 6 mL demir açlığı çeken kültürler ve 3 mL demir içeren kültürler kullanın.
   NOT: Kalan kültür, toplam RNA'nın hasat edilmesi ve hedef mRNA'nın kararlı durum seviyelerini ölçmek için kantitatif PCR kullanılması gibi başka amaçlar için kullanılabilir (burada açıklanmamıştır).
3. Her kültürün normalleştirilmiş hacimlerini 15 mL'lik tüplere aktarın.
4. Salgılanan protein çökeltisinin etkinliğini kontrol etmek için, her tüpe 4 μL 0.5 mg / mL sığır serum albümini (BSA) ekleyin.
5. 4 ° C'de 15 dakika boyunca 3200 x g'da pelet kültürleri.
6. 10 mL'lik bir şırıngaya 0.22 μm'lik bir PVDF filtresi takın ve her peletlenmiş kültürün süpernatantını 15 mL'lik yeni bir tüpe süzün.
   NOT: Bu filtreleme adımı, numunede istenmeyen sitoplazmik proteinlere neden olacak şekilde tüm bakteri hücrelerinin transfer edilme olasılığını en aza indirir.
7. Her numuneye 6.1 N TCA'nın süpernatan hacminin% 10'unu ekleyin.
8. 1 dakika boyunca kuvvetlice girdap. Tüpleri gece boyunca 4 °C soğuk odada buz üzerinde inkübe edin.
   NOT: Kuluçka süresi ihtiyaca göre optimize edilebilir. 1 saatlik bir inkübasyon kadar kısa bir süre, sekresyonun sağlam olduğu koşullar veya suşlar için işe yarayabilir.
9. 4 saatlik inkübasyon tamamlandıktan sonra pelet toplama ve TCA çökeltme adımlarını aerobik kültürlerle tekrarlayın.
   NOT: Eşdeğer hücre kütlesine sahip hacimleri peletleyerek aerobik kültürleri normalleştirin.
10. Her numuneden 2 mL'lik taze 2 mL'lik bir tüpe ekleyin ve 4 °C'de 15 dakika boyunca 21.000 x g'da santrifüjleyin.
11. Bir vakum eki kullanarak süpernatanı aspire edin ve tüpün altına veya yanlarına dokunmamaya dikkat edin.
    NOT: Peletin görselleştirilmesi zor olabilir ve tüpün uzunluğu boyunca bir pus olarak görünebilir.
12. Her çökeltme reaksiyonundan elde edilen tüm içerik tek bir 2 mL'lik tüpe çökeltilene kadar 3.10 ve 3.11 adımlarını tekrarlayın. Bu, üç veya dört ardışık santrifüjleme adımı alabilir, ancak her numuneden salgılanan tüm proteinlerin 2 mL'lik bir tüpe konsantrasyonuna izin verir.
13. Peletleri yıkamak için, her tüpe nazikçe 1 mL buz gibi %100 aseton ekleyin. Numune kaybını önlemek için yeniden askıya almayın ve tüpün kenarlarına dokunmayın.
14. Numuneleri 21.000 x g'da 4 °C'de 15 dakika santrifüjleyin.
15. Süpernatanı aspire edin ve tüpün altına veya yanlarına dokunmamaya dikkat edin.
16. Buz gibi soğuk aseton yıkama adımları 3.13 ve 3.14'ü tekrarlayın.
17. Süpernatanı son kez aspire ettikten sonra, tüpleri açın ve peletin tezgah üzerinde yaklaşık 1 saat tamamen kurumasını bekleyin.
18. Kurutulan her numuneye 50 μL FSB: DTTT çözeltisi ekleyin. Protein kaybını önlemek için tekrar askıya almayın.
19. Her numuneyi 1 dakika boyunca iyice vorteksleyin ve FSB: DTT solüsyonunun tüm tüpün duvarlarını kapladığından emin olun. Bu, aynı anda birden fazla tüpü tutabilen bir girdap ataşmanı kullanılarak optimize edilebilir.
20. Numuneleri 95 °C'de 15 dakika kaynatın.
21. Numuneleri oda sıcaklığında maksimum hızda 30 saniye boyunca kısa bir süre santrifüjleyin.
22. İleride kullanana kadar -80 °C'de saklayın.

4. T3SS efektör proteinlerini görselleştirmek için SDS-PAGE ve gümüş boyama

1. Her anaerobik numuneden 15 μL ve her aerobik numuneden 10 μL'yi, merdiven olarak 3 μL ticari olarak temin edilebilen lekelenmemiş bir standartla birlikte% 12.5'lik bir SDS-PAGE jeline yükleyin.
2. Jeli 100 V'ta yaklaşık 90 dakika çalıştırın. Bu ayarlar kullanılan aparata göre değişiklik gösterebilir.
3. Üreticinin talimatlarını izleyerek gümüş boyama protokolünü takip edin, böylece Şekil 2'de gösterildiği gibi bir jel elde edin.

5. Bağıl T3SS aktivitesinin ölçülmesi

1. Jeli görüntüleme sistemine yerleştirin ve niceleme için amaçlanan tüm bantların görüntü çerçevesinde olduğundan emin olun.
   NOT: BSA'nın moleküler ağırlığı ~66 kDa iken, T3SS efektör proteini YopE'nin moleküler ağırlığı ~23 kDa'dır.
2. Yazılımda, tüm kuyucuklardaki tüm YopE bantlarını seçin.
3. Referans YopE bandını uygun örneğe ayarlayın.
4. Tüm YopE bantları için yazılım tarafından hesaplanan bağıl niceleme değerlerini dışa aktarın.
5. Yazılıma geri döndüğünüzde, tüm kuyulardaki tüm BSA bantlarını seçin.
6. Referans BSA bandını, referans YopE bandıyla aynı örnekten olduğundan emin olacak şekilde ayarlayın.
7. Tüm BSA bantları için yazılım tarafından hesaplanan bağıl niceleme değerlerini dışa aktarın.
8. Göreli YopE ifade düzeylerini hesaplamak için, YopE göreli miktar değerini her numune için BSA göreli miktar değerine bölün.

Bu yöntem, salgılanan Yops'un ilgilenilen bir referans koşuluna göre çeşitli koşullar arasında göreceli olarak karşılaştırılmasına izin verir. Genel deneysel iş akışı Şekil 1'de gösterilmiştir. Tablo 1, hücre kültürü normalizasyonunun tipik olarak her bir kültür koşulu örneğinde nasıl gerçekleşeceğinin ve her bir süpernatana eklenecek TCA hacminin bir temsilini göstermektedir. Burada, wildtype (WT) Y. pseudotuberculosis IP2666pIB1'in yanı sıra iki konjenik mutant, ΔyscNU ve Δ yopE kullanılarak temsili sonuçlar gösterilmiştir. ΔyopE mutantı, YopE'den yoksun bir kontrol olarak kullanılırken, Δ yscNU mutantı, işlevsel bir T3SS^13,14 monte edemediği için tam birT3SS negatif kontrol olarak kullanılır. Salgılanan proteinleri içeren gümüş lekeli% 12.5 SDS-PAGE jelinin temsili bir görüntüsü Şekil 2'de gösterilmektedir. Yukarıda açıklandığı gibi, her numune, protein çökeltme verimliliği için bir kontrol olarak çivili BSA içeriyordu. Verilerin analizinde, anaerobik ve aerobik veri setleri, her biri ayrı ayrı normalleştirildiğinden bağımsız veri setleri olarak ele alınmalıdır. Anaerobik numunelerde, önceki sonuçlarla tutarlı olarak, düşük demir numunelerinde yüksek demir numunelerine göre ~ 38 kat daha fazla YopE mevcuttu^15,16. Aerobik örneklerde, önceki sonuçlarla tutarlı olarak, düşük ve yüksek demir örneklerinde benzer miktarda salgılanan YopE gözlenmiştir¹⁶. Genel olarak, istatistiksel anlamlılık oluşturmak için her koşulun en az üç biyolojik kopyası kullanılır.

Bu protokolün yeterli demir açlığı ile sonuçlandığını doğrulamak için, tüm koşullarda vahşi tip suşta demire duyarlı genler yfeA ve bfd üzerinde qPCR analizi yapıldı. YfeA, demir taşınmasından sorumlu bir ABC taşıma sisteminin periplazmik bağlayıcı proteinidir, Bfd^{ise demir} depolarının mobilizasyonunda yer alan bakteriyoferritin ile ilişkili bir ferredoksindir 17,18,19,20. RNA, daha önce²¹ tarif edildiği gibi izole edildi ve beklendiği gibi, yfeA ve bfd, Şekil 3'te gösterildiği gibi, hem aerobik hem de anaerobik olarak demir içeren koşullara göre demir tükenmiş koşullarda önemli ölçüde yukarı regüle edildi. Ek olarak, protein seviyesinde nispi YopE için gözlemlenen sonuçların yopE transkript seviyeleri ile tutarlı olduğunu doğrulamak için qPCR kullanarak yopE mRNA kararlı durum seviyelerini ölçtük (bkz. Şekil 3).

Son olarak, bakteriler stresli kültür koşullarında parçalanmaya eğilimli olduklarından, bu protokoldeki adımların potansiyel olarak kafa karıştırıcı sonuçlar doğurabilecek bakteri lizisi ile sonuçlanmadığını göstermek önemliydi. Bunu doğrulamak için, TCA ile çökeltilmiş süpernatant numuneleri western blotlamaya tabi tutuldu ve RNA polimerazın bir alt birimi ve bir sitoplazmik protein olan YopE ve RpoA için araştırıldı. Şekil 4'te gösterildiği gibi, YopE ekspresyon modeli Şekil 3'te gösterileni takip ederken, numune süpernatantlarında RpoA'nın bulunduğuna dair bir kanıt yoktu, bu da süpernatana sitoplazmik RpoA salacak gözlemlenebilir bir lizis olmadığını düşündürdü.

Şekil 1: Değişen demir ve oksijen mevcudiyeti altında büyüyen Yersinia pseudotuberculosis için deneysel iş akışı. Kültür adımlarının grafiksel gösterimi. Asitle yıkanmış cam eşyaların 4. günden itibaren kullanılması gerektiğini unutmayın. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Kültür süpernatanlarından elde edilen TCA ile çökeltilmiş proteinin gümüş lekeli %12.5 SDS-PAGE jelinin sonuçları. Çökeltilmiş kültür süpernatantları% 12.5'lik bir SDS-PAGE jel üzerine yüklendi ve gümüş boyandı. (A) Anaerobik olarak yetiştirilen WT, ΔyscNU ve ΔyopE suşlarının sekresyon profili. Anaerobik WT demir dolgulu numuneye normalize edilmiş YopE'nin temsili nispi değerleri. (B) Aerobik olarak yetiştirilen WT, ΔyscNU ve Δ yopE suşlarının sekresyon profili. Aerobik WT demir dolgulu numuneye normalize edilmiş YopE'nin temsili nispi değerleri. Beyaz oklar YopE'yi (~23 kDa) gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Demire duyarlı genlerin nispi mRNA seviyeleri demir açlığını göstermektedir. RNA, Şekil 1'de tarif edilen koşullarda kültürlenen WT Y. pseudotuberculosis'ten izole edildi. qPCR, anaerobik (AC) ve aerobik (DF) koşullarda 16S rRNA'ya normalize edilmiş yfeA, bfd ve yopE seviyelerinin nispi ekspresyonunu ölçmek için kullanıldı. ****p < 0.0001, eşleşmemiş bir t-testi ile belirlendiği gibi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Süpernatant örneklerinde sitoplazmik RpoA eksikliği, kültür koşullarında hücre lizizinin eksikliğini göstermektedir. Şekil 3'ten (A) anaerobik ve (B) aerobik numunelerin 5 μL çökeltilmiş süpernatantları, bir pelet kontrolü ile birlikte% 12.5'lik bir SDS-PAGE jeli üzerinde çalıştırıldı. Proteinler, batı lekeleme için bir PVDF membranına aktarıldı. Membran kesildi ve üst yarısı bir anti-RpoA antikoru kullanılarak RpoA için problandı ve alt yarısı bir anti-YopE antikoru kullanılarak YopE için problandı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: Temsili örnek toplama iş akışı. 5. günde, (A) anaerobik numuneler için 37 ° C'de 4 saatlik inkübasyon tamamlandıktan sonra, en düşük OD₆₀₀ değerine sahip numunenin 6 mL'si toplandı ve numune hacimlerinin geri kalanı buna göre normalize edildi. Süpernatanı filtreledikten sonra 6.1 N TCA eklendi. (B) Aerobik inkübasyonlar (26 ° C'de 2 saat ve 37 ° C'de 4 saat) tamamlandıktan sonra, en düşük OD₆₀₀ değerine sahip numunenin 6 mL'si toplandı ve numune hacimlerinin geri kalanı buna göre normalize edildi. Süpernatanı filtreledikten sonra 6.1 N TCA eklendi.

T3SS, birçok patojenik bakteride önemli bir virülans faktörüdür; Bu nedenle, regülasyonunu incelemek için laboratuvar tekniklerinin geliştirilmesi, patogenezin anlaşılması ve potansiyel terapötiklerin geliştirilmesi için önemlidir¹. Demir ve oksijenin, T3SS ekspresyonunu düzenlemek için bakteriyel patojenler tarafından algılanan önemli konak ipuçları olduğu bilinmektedir⁵; bu nedenle, bu yöntem, anaerobik veya aerobik koşullar altında, demir açlığı veya tükenmesi ile Y. pseudotuberculosis'in kültürlenmesi için bir strateji sunar ve salgılanan YopE T3SS efektör protein seviyelerinin nispi miktarlarını değerlendirerek bu farklı koşullar altında nispi T3SS aktivitesinin nasıl ölçüleceğini gösterir.

Bu deney için iş akışı nispeten basit olsa da, sonuçları optimize etmek için yakından dikkate alınması gereken birkaç nokta vardır. TCA aracılı protein çökeltme adımı sırasında, görülmesi zor olabilen protein peletini aspire etmekten kaçınmak önemlidir. Aspiratör ucunun duvarlara veya borunun altına temas etmemesi için ekstra önlemler almak çok önemlidir. Ek olarak, daha düşük bir T3SS aktivitesi seviyesine sahip mutant suşlarla uğraşırken, işlemek için daha büyük bir numune toplanması tavsiye edilir. Son olarak, şeritler farklı bantlar üretmek yerine numune işleme ve jel boyamadan sonra lekeli görünüyorsa, bunun nedeni ya kültürleme sırasında hücre lizisi ya da bütün bakterilerin peletten süpernatant fraksiyona taşınması olabilir. Bu durumda, deney tekrarlanmalı ve süpernatanı çıkarırken peletin alınmasını önlemek için daha fazla özen gösterilmelidir. Bu protokolün çok düşük miktarlarda salgılanan proteinleri tespit etmek için yeterince hassas olmayabileceğine dikkat etmek önemlidir, bu durumda başka tespit yöntemlerinin kullanılması gerekebilir. Ek olarak, birçok şelatlama maddesi, demir ve magnezyum dışındaki iki değerlikli katyonları ortamdan uzaklaştıracağından, salgı üzerindeki etkilerini belirlemek için şelasyonu takiben ortama başka iki değerlikli katyonlar tekrar eklenebilir.

Bu deneylerde dikkate alınması gereken bir diğer önemli nokta, M9 ortamındaki tuzların çökelme eğilimidir ve bu da deney partileri arasında değişkenliğe neden olur. Bu sorunu azaltmak için, kültürlemeden hemen önce ortama filtre ile sterilize edilmiş MgS04 eklemek mümkündür.

Genel olarak, bu yöntemler, protein seviyelerini ölçerek nispi Yersinia T3SS aktivitesini ölçmek için sağlam bir çerçeve sağlar. T3SS ekspresyonunu değerlendirmeyi amaçlayan paralel yaklaşımların yanı sıra, burada sunulan yöntemler, konakçıyla ilgili çevresel ipuçlarına yanıt olarak T3SS dinamiklerinin kapsamlı bir şekilde anlaşılmasına olanak tanır. Bu protokol aynı zamanda, bir demir kaynağının atlanabileceği tanımlanmış bir ortamda yetiştirilebilen diğer bakterilere ve salgılanan proteinlerin ölçülmesinin bilimsel soruyla ilgili olduğu uygulamalar için de uyarlanabilir.

Yazarlar rekabet eden hiçbir mali çıkar beyan etmemektedir.

BioRender.com kullanılarak oluşturulan Grafik Görüntüler. Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri (www.NIH.gov) hibe R01AI119082 tarafından desteklenmiştir.