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Les bactéries colonisent les tissus de l’hôte dont la biodisponibilité de l’oxygène et du fer varie, mais la plupart des approches d’étude des bactéries utilisent des milieux riches et aérés. Ce protocole décrit la culture de l’agent pathogène humain Yersinia pseudotuberculosis sous des concentrations de fer et une tension d’oxygène variables, et la quantification de l’activité du système de sécrétion de Yersinia de type III, qui est un facteur de virulence important.
Un mécanisme clé de virulence pour de nombreux agents pathogènes à Gram négatif est le système de sécrétion de type III (T3SS), un appendice en forme d’aiguille qui transfère les protéines effectrices cytotoxiques ou immunomodulatrices dans les cellules hôtes. Le T3SS est une cible pour les campagnes de découverte d’antimicrobiens car il est accessible en dehors des cellules et largement absent des bactéries non pathogènes. Des études récentes ont démontré que les T3SS de Yersinia et de Salmonella sont régulés par des facteurs sensibles au fer et à l’oxygène, qui sont des signaux spécifiques importants rencontrés lors de l’infection des mammifères. La présente invention concerne une méthode de carence en fer chez Yersinia pseudotuberculosis, suivie d’une supplémentation facultative en fer inorganique. Pour évaluer l’impact de la disponibilité de l’oxygène, ce processus de carence en fer est démontré dans des conditions aérobies et anaérobies. Enfin, l’incubation des cultures à la température de l’hôte mammifère de 37 °C induit l’expression de T3SS et permet de quantifier l’activité de Yersinia T3SS en visualisant les protéines effectrices libérées dans le surnageant. Les étapes détaillées ici offrent un avantage par rapport à l’utilisation de chélateurs de fer en l’absence de carence en fer, ce qui est insuffisant pour induire une carence en fer robuste, probablement en raison de l’efficacité des systèmes d’absorption et de piégeage du fer de Yersinia . De même, la verrerie de laboratoire à lavage à l’acide est détaillée pour assurer l’élimination du fer résiduel, ce qui est essentiel pour induire une carence en fer robuste. De plus, l’utilisation d’un agent chélateur est décrite pour éliminer le fer résiduel des milieux et la culture des bactéries pendant plusieurs générations en l’absence de fer pour épuiser les réserves de fer bactériennes. En incorporant des protocoles standard de précipitation des protéines induite par l’acide trichloracétique, SDS-PAGE et coloration à l’argent, cette procédure démontre des moyens accessibles de mesurer l’activité T3SS. Bien que cette procédure soit optimisée pour Y. pseudotuberculosis, elle offre un cadre pour des études sur des agents pathogènes ayant des systèmes d’absorption du fer robustes similaires. À l’ère de la résistance aux antibiotiques, ces méthodes peuvent être étendues pour évaluer l’efficacité des composés antimicrobiens ciblant le T3SS dans des conditions pertinentes pour l’hôte.
De nombreux agents pathogènes à Gram négatif cliniquement pertinents, tels que Yersinia, Vibrio, Escherichia, Pseudomonas et Shigella, codent pour le système de sécrétion de type III (T3SS) pour injecter des protéines effectrices dans les cellules hôtes1. Chez de nombreuses espèces bactériennes, le T3SS est soumis à un contrôle réglementaire strict2. Par exemple, la translocation des protéines effectrices de Yersinia T3SS dans les cellules hôtes cibles est essentielle pour subvertir les mécanismes de défense de l’hôte et permettre la colonisation bactérienne des tissus de l’hôte. Cependant, l’activité de Yersinia T3SS est métaboliquement lourde et peut déclencher la reconnaissance par les récepteurs immunitaires de l’hôte3. En conséquence, les régulateurs qui détectent des signaux environnementaux spécifiques contrôlent l’expression des gènes T3SS chez de nombreuses espèces bactériennes. Étant donné que les agents pathogènes tels que Yersinia subissent des changements environnementaux au cours de leur cycle d’infection qui ont un impact sur l’expression des facteurs de virulence critiques, il est important de développer des conditions de laboratoire qui imitent les caractéristiques saillantes des niches d’hôtes occupées par les agents pathogènes bactériens. Plus précisément, la tension d’oxygène et la disponibilité du fer diffèrent entre les différents sites tissulaires de manière spatio-temporelle et ont un impact sur l’expression des gènes de virulence tels que le T3SS 4,5,6. Par conséquent, l’objectif de cette méthode est d’évaluer l’impact de l’oxygène et du fer sur l’expression de Yersinia T3SS. Cela permettra de mieux comprendre la dynamique de l’interaction hôte-pathogène.
La méthode décrite ici détaille comment cultiver Yersinia pseudotuberculosis en aérobie et en anaérobie, ainsi que comment épuiser les réserves de fer de Yersinia pendant la croissance aérobie ou anaérobie. Quelques considérations importantes sont soulignées ici concernant la culture réussie de bactéries dans ces conditions variables. Tout d’abord, la culture anaérobie nécessite une supplémentation supplémentaire en glucose, une modification qui est notée dans la recette du milieu. Deuxièmement, étant donné que Y. pseudotuberculosis utilise des sidérophores et d’autres systèmes d’absorption du fer qui peuvent extraire vigoureusement le fer de l’environnement, une attention particulière est accordée à ce que les milieux de culture et la verrerie de laboratoire soient aussi exempts de fer que possible7. Des études antérieures ont utilisé des chélateurs de fer tels que le dipyridyle pour épuiser le fer à partir de cultures bactériennes riches en milieux afin d’imiter la carence en fer 8,9. Cependant, l’épuisement des réserves de fer de Yersinia pour induire une carence en fer nécessite l’élimination du fer résiduel dans la verrerie et les médias, ainsi qu’une croissance prolongée en l’absence de fer. Ce protocole détaille comment laver à l’acide la verrerie et les milieux chélatés pour éliminer le fer résiduel, en plus de cultiver les bactéries pendant plusieurs générations pour assurer une privation complète de fer. La carence en fer peut être assurée en mesurant les niveaux relatifs de transcription de gènes sensibles au fer bien caractérisés dans toutes les conditions, comme démontré ici avec yfeA et bfd.
L’aboutissement de ce protocole démontre comment précipiter les protéines effectrices T3SS sécrétées à partir de chacune de ces conditions en traitant le surnageant de culture avec de l’acide trichloracétique (TCA) et en visualisant les protéines sécrétées par SDS-PAGE. Enfin, l’activité relative de T3SS est évaluée en visualisant les protéines sécrétées via la coloration à l’argent et en quantifiant les niveaux relatifs de protéines effectrices de T3SS, appelées protéines externes de Yersinia (Yops)10.
Les dosages de l’activité T3SS utilisent généralement des anticorps spécifiques pour détecter les niveaux de protéines effectrices T3SS dans le surnageant de culture. Cependant, les anticorps Western blot pour les protéines effectrices T3SS ne sont souvent pas disponibles dans le commerce. Par conséquent, une attention particulière a été portée à ce que la visualisation finale de l’activité de T3SS dans cette méthode ne nécessite pas d’anticorps spécifiques, mais puisse plutôt tirer parti de la coloration à l’argent, qui permet de visualiser toutes les protéines sécrétées. Bien que cette méthode soit spécifiquement adaptée et optimisée pour Y. pseudotuberculosis, elle peut être adaptée à d’autres espèces bactériennes, bien que les conditions exactes des milieux et les temps d’incubation varient.
Les détails des réactifs, de la composition des milieux, des séquences d’amorces et de l’équipement sont répertoriés dans la table des matériaux. La figure 1 illustre le flux de travail expérimental global.
1. Préparation de la verrerie lavée à l’acide et des milieux M9 chélatés
REMARQUE : Avant de commencer, reportez-vous à la section des matériaux pour les réactifs et les recettes exacts qui seront utilisés. Le média M9 a été utilisé pour la première fois pour les tests Yersinia T3SS dans Cheng et al.11.
2. Culture de Y. pseudotuberculosis sous des niveaux de fer et une tension d’oxygène variables
3. Précipitation de l’acide trichloracétique (TCA) des protéines effectrices T3SS
4. SDS-PAGE et coloration à l’argent pour visualiser les protéines effectrices T3SS
5. Quantifier l’activité relative des T3SS
Cette méthode permet de comparer relativement les Yops sécrétés dans diverses conditions par rapport à une condition de référence d’intérêt. Le flux de travail expérimental global est illustré à la figure 1. Le tableau 1 présente une représentation de la façon dont la normalisation de la culture cellulaire se produirait généralement dans le cas de chaque condition de culture et du volume de TCA qui serait ajouté à chaque surnageant. Ici, des résultats représentatifs sont présentés en utilisant le type sauvage (WT) Y. pseudotuberculosis IP2666pIB1 ainsi que deux mutants congéniques, ΔyscNU et ΔyopE. Le mutant ΔyopE est utilisé comme contrôle manquant de YopE, tandis que le mutant ΔyscNU est utilisé comme un contrôle négatif complet de T3SS car il est incapable d’assembler un T3SS13,14 fonctionnel. La figure 2 illustre une image représentative d’un gel SDS-PAGE à 12,5 % teinté d’argent contenant les protéines sécrétées. Comme décrit ci-dessus, chaque échantillon contenait de la BSA enrichie comme contrôle de l’efficacité de la précipitation des protéines. Lors de l’analyse des données, les ensembles de données anaérobies et aérobies doivent être traités comme des ensembles de données indépendants, car chacun a été normalisé séparément. Dans les échantillons anaérobies, ~38 fois plus de YopE était présent dans les échantillons à faible teneur en fer par rapport aux échantillons à forte teneur en fer, ce qui correspond aux résultats précédents15,16. Dans les échantillons aérobies, une quantité similaire de YopE sécrétée a été observée dans les échantillons à faible et à forte teneur en fer, ce qui correspond aux résultats précédents16. En général, au moins trois répétitions biologiques de chaque affection sont utilisées pour établir la signification statistique.
Pour confirmer que ce protocole entraîne une carence en fer adéquate, une analyse qPCR a été effectuée sur les gènes sensibles au fer yfeA et bfd dans la souche de type sauvage dans toutes les conditions. YfeA est la protéine de liaison périplasmique d’un système de transport ABC responsable du transport du fer, tandis que Bfd est une ferrédoxine associée à la bactérioferritine impliquée dans la mobilisation des réserves de fer 17,18,19,20. L’ARN a été isolé comme décrit précédemment21 et, comme prévu, yfeA et bfd ont été significativement régulés à la hausse dans des conditions appauvries en fer par rapport à des conditions riches en fer, à la fois aérobies et anaérobies, comme le montre la figure 3. De plus, nous avons quantifié les niveaux d’ARNm de yopE à l’état d’équilibre à l’aide de la qPCR pour confirmer que les résultats observés pour YopE relatif au niveau de la protéine étaient cohérents avec les niveaux de transcrits de yopE (voir Figure 3).
Enfin, comme les bactéries sont sujettes à la lyse dans des conditions de culture stressantes, il était important de montrer que les étapes de ce protocole n’entraînent pas de lyse bactérienne qui pourrait potentiellement fausser les résultats. Pour confirmer cela, des échantillons de surnageant précipités par TCA ont été soumis à un western blot et ont sondé YopE et RpoA, une sous-unité de l’ARN polymérase et une protéine cytoplasmique. Comme le montre la figure 4, bien que le modèle d’expression de YopE suive celui montré à la figure 3, il n’y avait aucune preuve de présence de RpoA dans les surnageants de l’échantillon, suggérant qu’il n’y avait pas de lyse observable qui libérerait du RpoA cytoplasmique dans le surnageant.
Figure 1 : Flux de travail expérimental pour la culture de Yersinia pseudotuberculosis sous une disponibilité variable en fer et en oxygène. Représentation graphique des étapes de culture. Notez que la verrerie lavée à l’acide doit être utilisée à partir du jour 4. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Résultats d’un gel SDS-PAGE à 12,5 % de protéines précipitées par TCA coloré à l’argent à partir de surnageants de culture. Des surnageants de culture précipités ont été chargés sur un gel SDS-PAGE à 12,5 % et colorés à l’argent. (A) Profil de sécrétion des souches WT, ΔyscNU et ΔyopE cultivées en anaérobie. Valeurs relatives représentatives de YopE normalisées par rapport à l’échantillon anaérobie WT rempli de fer. (B) Profil de sécrétion des souches WT, ΔyscNU et ΔyopE cultivées en aérobie. Valeurs relatives représentatives de YopE normalisées par rapport à l’échantillon aérobie WT rempli de fer. Les flèches blanches indiquent YopE (~23 kDa). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Les niveaux relatifs d’ARNm des gènes sensibles au fer démontrent une carence en fer. L’ARN a été isolé à partir de WT Y. pseudotuberculosis cultivé dans les conditions décrites à la figure 1. La qPCR a été utilisée pour mesurer l’expression relative des niveaux d’yfeA, de bfd et de yopE normalisés en ARNr 16S dans des conditions anaérobies (A-C) et aérobies (D-F). ****p < 0,0001 tel que déterminé par un test t non apparié. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : L’absence de RpoA cytoplasmique dans les échantillons de surnageants démontre l’absence de lyse cellulaire dans des conditions de culture. 5 μL de surnageants précipités d’échantillons (A) anaérobies et (B) aérobies de la figure 3 ont été analysés sur un gel SDS-PAGE à 12,5 % avec un témoin de pastilles. Les protéines ont été transférées sur une membrane en PVDF pour le western blot. La membrane a été coupée et la moitié supérieure a sondé la RpoA à l’aide d’un anticorps anti-RpoA, et la moitié inférieure a sondé YopE à l’aide d’un anticorps anti-YopE. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
(A) | |||
ANAÉROBIE | |||
Condition | OD | Volume à collecter (mL) | Volume de 6,1 N TCA ajouté au Sup (mL) |
WT Low Iron | 0.5 | 6 | 0.6 |
WT High Iron | 1 | 3 | 0.3 |
(B) | |||
AÉROBIE | |||
Condition | OD | Volume à collecter (mL) | Volume de TCA 6,1 N ajouté au Sup (mL) |
WT Low Iron | 0.9 | 6 | 0.6 |
WT High Iron | 1.4 | 3.857 | 0.386 |
Tableau 1 : Flux de travail représentatif de collecte d’échantillons. Le jour 5, (A) une fois l’incubation de 4 h à 37 °C terminée pour les échantillons anaérobies, 6 mL de l’échantillon ayant la valeur de DO600 la plus faible ont été prélevés et le reste des volumes d’échantillon a été normalisé en conséquence. Après filtrage du surnageant, 6,1 N TCA a été ajouté. (B) Une fois les incubations aérobies terminées (2 h à 26 °C et 4 h à 37 °C), 6 mL de l’échantillon ayant la valeur de DO600 la plus basse ont été prélevés, et le reste des volumes d’échantillon a été normalisé en conséquence. Après filtrage du surnageant, 6,1 N TCA a été ajouté.
Le T3SS est un facteur de virulence important chez de nombreuses bactéries pathogènes ; Par conséquent, le développement de techniques de laboratoire pour étudier sa régulation est important pour comprendre la pathogenèse et développer des thérapies potentielles1. Le fer et l’oxygène sont connus pour être des signaux d’hôte importants détectés par les agents pathogènes bactériens pour réguler l’expression de T3SS5 ; par conséquent, cette méthode présente une stratégie pour cultiver Y. pseudotuberculosis dans des conditions anaérobies ou aérobies, avec une carence ou une réplétion en fer, et démontre comment quantifier l’activité relative de T3SS dans ces différentes conditions en évaluant les quantités relatives de protéines effectrices YopE T3SS sécrétées.
Bien que le flux de travail de cette expérience soit relativement simple, il y a quelques points qui doivent être pris en compte de près pour optimiser les résultats. Au cours de l’étape de précipitation des protéines médiée par le TCA, il est important d’éviter d’aspirer la pastille de protéines, qui peut être difficile à voir. Il est essentiel de prendre des précautions supplémentaires pour ne pas laisser l’embout de l’aspirateur toucher les parois ou le fond du tube. De plus, lorsqu’il s’agit de souches mutantes avec un niveau plus faible d’activité T3SS, il est conseillé de prélever un échantillon plus grand à traiter. Enfin, si les voies semblent maculées après le traitement de l’échantillon et la coloration sur gel au lieu de produire des bandes distinctes, cela peut être dû soit à la lyse cellulaire pendant la culture, soit au transfert de bactéries entières de la pastille dans la fraction surnageante. Dans ce cas, l’expérience doit être répétée et il faut prendre plus de précautions pour éviter d’emporter la pastille lors du retrait du surnageant. Il est important de noter que ce protocole peut ne pas être assez sensible pour détecter les protéines sécrétées en très faibles quantités, auquel cas d’autres méthodes de détection peuvent devoir être utilisées. De plus, étant donné que de nombreux agents chélateurs éliminent les cations divalents autres que le fer et le magnésium des milieux, d’autres cations divalents peuvent être rajoutés aux milieux après la chélation pour déterminer leur effet sur la sécrétion.
Un autre point important à prendre en compte dans ces expériences est la propension des sels du milieu M9 à précipiter, ce qui entraîne une variabilité entre les lots expérimentaux. Pour atténuer ce problème, il est possible d’ajouter du MgSO4 stérilisé par filtre au milieu immédiatement avant la culture.
Dans l’ensemble, ces méthodes fournissent un cadre solide pour quantifier l’activité relative de Yersinia T3SS en mesurant les niveaux de protéines. Parallèlement aux approches parallèles qui visent à évaluer l’expression de T3SS, les méthodes présentées ici permettent une compréhension complète de la dynamique de T3SS en réponse à des signaux environnementaux pertinents pour l’hôte. Ce protocole peut également être adapté à d’autres bactéries qui peuvent être cultivées dans un milieu défini où une source de fer peut être omise et pour des applications où la mesure des protéines sécrétées est pertinente pour la question scientifique.
Les auteurs ne déclarent aucun intérêt financier concurrent.
Images graphiques créées à l’aide de BioRender.com. Cette étude a été financée par la subvention des National Institutes of Health (www.NIH.gov) R01AI119082.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
10 mL Luer-Lok Tip syringe | BD | 301029 | |
10x SDS Running Buffer | Home made | 0.25 M Tris base, 1.92 M Glycine, 1% SDS in 1 L volume | |
12.5% SDS-Page Gel | Home made | ||
15 mL culture tubes | Falcon | 352059 | For initial overnight |
15 mL Falcon tubes | Falcom | 352196 | For supernatant collection |
250 mL culture flask | Belco | 251000250 | |
500 mL Filter System | Corning | 431097 | |
6 N Hydrochloric acid solution | Fisher Scientific | 7732185 | |
Acetone | Fisher Chemical | A949-4 | 4 L |
Bio Rad ChemiDoc MP Imaging System | Bio Rad | Model Number: Universal Hood III | |
Borosilicate glass culture tubes | Fisherbrand | 14-961-34 | For anaerobic culturing |
Chelex 100 Resin | Bio Rad | 142-1253 | |
Chelex M9 +0.9% Glucose media | Home made | 6 g/L Na2HPO4, 3 g/L KH2PO4, 0.5 g/L NaCl, 1 g/L NH4Cl, 1% casamino acids, 0.9% dextrose, 0.0005% thiamine, 5 g/L Chelex 100 Resin. Stir media for 18 h at room temp, filter using 500 mL Corning filtration unit, then add MgSO4 for 1 mM MgSO4 final solution | |
Final Sample Buffer (FSB) | Home made | 0.1 M Tris-HCl, 4% SDS, 20% glycerol, 0.2% of Bromophenol Blue | |
FSB:DTT solution | Home made | FSB+0.2M DTT | |
Image Lab Software | Bio Rad | https://www.bio-rad.com/en-us/product/image-lab-software?ID=KRE6P5E8Z | Software |
Isotemp Heat Block | Fisher Scientific | 88860021 | |
LB Agar Plates | Home made | 10 g Tryptone, 5 g Yeast extract, 10 g NaCl, 15 g Agar in 1 L total volume. Autoclaved | |
M9+0.2% Glucose Media | Home made | 6 g/L Na2HPO4, 3 g/L KH2PO4, 0.5 g/L NaCl, 1 g/L NH4Cl, 1 mM MgSO4, 1 mg/L FeSO47H2O, 1% casamino acids, 0.2% dextrose, 0.0005% thiamine | |
Millex-GP PES 0.22um filter attachment for syringe | Millipore | SLGPR33RS | For FeSO47H2O filtration |
Millex-GV PVDF 0.22um filter attachment for syringe | Millipore | SLGVR33RS | For supernatant filtration |
Precision Plus Protein Unstained Standard | Bio Rad | 1610363 | |
SDS-PAGE Gel Apparatus | Bio Rad | Model Number: Mini PROTEAN Tetra Cell | |
SilverXpress Silver Staining Kit | Invitrogen | LC6100 | |
The BellyDancer Shaker | IBI Scientific | BDRAA1155 | |
Trichloroacetic acid solution 6.1N | Sigma Aldrich | T0699 | |
Vinyl Anaerobic Chamber | Coy Lab Products | https://coylab.com/products/anaerobic-chambers/vinyl-anaerobic-chambers/#details | |
qPCR Primer sequences | |||
yfeA forward - CAC AGT CAG CAG ACC TTA TCT T | |||
yfeA reverse - GGC AGA CGG GAC ATC TTT AAT A | |||
bfd forward - ccagcatcagccccatacag | |||
bfd reverse - tggcttgtcggatgcacttc | |||
yopE forward - CCATAAACCGGTGGTGAC | |||
yopE reverse - CTTGGCATTGAGTGATACTG |
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