Method Article
تستعمر البكتيريا الأنسجة المضيفة التي تختلف في التوافر البيولوجي للأكسجين والحديد ، ومع ذلك فإن معظم طرق دراسة البكتيريا تستخدم وسائط غنية بالهواء يصف هذا البروتوكول استزراع العامل الممرض البشري Yersinia pseudotuberculosis تحت تركيزات متفاوتة من الحديد وتوتر الأكسجين ، وتحديد نشاط نظام إفراز Yersinia من النوع الثالث ، وهو عامل ضراوة مهم.
آلية الفوعة الرئيسية للعديد من مسببات الأمراض سالبة الجرام هي نظام الإفراز من النوع الثالث (T3SS) ، وهو ملحق يشبه الإبرة ينقل بروتينات المستجيبة السامة للخلايا أو المناعية إلى الخلايا المضيفة. يعد T3SS هدفا لحملات اكتشاف مضادات الميكروبات لأنه يمكن الوصول إليه خارج الخلية وغائب إلى حد كبير عن البكتيريا غير المسببة للأمراض. أظهرت الدراسات الحديثة أن T3SS من يرسينيا والسالمونيلا يتم تنظيمها بواسطة عوامل تستجيب للحديد والأكسجين ، وهي إشارات مهمة خاصة بمتخصصة تتم مواجهتها أثناء عدوى الثدييات. الموصوفة هنا هي طريقة لتجويع الحديد من مرض اليرسينيا الكاذب ، مع مكملات اختيارية لاحقة من الحديد غير العضوي. لتقييم تأثير توافر الأكسجين ، يتم عرض عملية تجويع الحديد هذه في كل من الظروف الهوائية واللاهوائية. أخيرا ، يؤدي احتضان الثقافات عند درجة حرارة مضيف الثدييات البالغة 37 درجة مئوية إلى تحفيز تعبير T3SS ويسمح بالقياس الكمي لنشاط Yersinia T3SS عن طريق تصور بروتينات المستجيب التي يتم إطلاقها في المادة الطافية. تقدم الخطوات المفصلة هنا ميزة على استخدام مخلبات الحديد في حالة عدم وجود تجويع للحديد ، وهو أمر غير كاف لإحداث تجويع قوي للحديد ، ويفترض أن يكون ذلك بسبب أنظمة امتصاص الحديد والكسح الفعالة Yersinia . وبالمثل ، يتم تفصيل الأواني الزجاجية المختبرية لغسل الأحماض لضمان إزالة الحديد المتبقي ، وهو أمر ضروري لإحداث تجويع قوي للحديد. بالإضافة إلى ذلك ، يتم وصف استخدام عامل مخلب لإزالة الحديد المتبقي من الوسائط ، وزراعة البكتيريا لعدة أجيال في حالة عدم وجود الحديد لاستنفاد مخازن الحديد البكتيرية. من خلال دمج البروتوكولات القياسية لترسيب البروتين الناجم عن حمض ثلاثي كلورو أسيتيك ، و SDS-PAGE ، وتلوين الفضة ، يوضح هذا الإجراء طرقا يمكن الوصول إليها لقياس نشاط T3SS. في حين أن هذا الإجراء محسن ل Y. pseudotuberculosis ، فإنه يوفر إطارا للدراسات في مسببات الأمراض ذات أنظمة امتصاص الحديد القوية المماثلة. في عصر مقاومة المضادات الحيوية ، يمكن توسيع هذه الطرق لتقييم فعالية المركبات المضادة للميكروبات التي تستهدف T3SS في ظل الظروف ذات الصلة بالمضيف.
تقوم العديد من مسببات الأمراض سالبة الجرام ذات الصلة سريريا مثل اليرسينيا والفيبريو والإشريكية والسودوموناس والشيغيلا بتشفير نظام إفراز النوع الثالث (T3SS) لحقن بروتينات المستجيب في الخلاياالمضيفة 1. في العديد من الأنواع البكتيرية ، يخضع T3SS لرقابة تنظيمية صارمة2. على سبيل المثال ، يعد نقل بروتينات المستجيب Yersinia T3SS إلى الخلايا المضيفة المستهدفة أمرا بالغ الأهمية لتخريب آليات دفاع المضيف وتمكين الاستعمار البكتيري للأنسجة المضيفة. ومع ذلك ، فإن نشاط Yersinia T3SS مرهق من الناحية الأيضية ويمكن أن يؤدي إلى التعرف على المستقبلات المناعية للمضيف3. وفقا لذلك ، يتحكم المنظمون الذين يستشعرون إشارات بيئية محددة في التعبير عن جينات T3SS في العديد من الأنواع البكتيرية. نظرا لأن مسببات الأمراض مثل يرسينيا تتعرض لتغيرات بيئية خلال دورة العدوى التي تؤثر على التعبير عن عوامل الفوعة الحرجة ، فمن المهم تطوير ظروف معملية تحاكي السمات البارزة لمنافذ المضيف التي تشغلها مسببات الأمراض البكتيرية. على وجه التحديد ، يختلف توتر الأكسجين وتوافر الحديد بين مواقع الأنسجة المختلفة بطريقة زمانية مكانية ويؤثران على التعبير عن جينات الفوعة مثل T3SS4،5،6. لذلك ، فإن الهدف من هذه الطريقة هو تقييم كيفية تأثير الأكسجين والحديد على التعبير عن Yersinia T3SS. سيوفر هذا نظرة ثاقبة لديناميكيات التفاعل بين المضلع والممرض.
توضح الطريقة الموضحة هنا بالتفصيل كيفية استزراع مرض اليرسينيا الكاذب الهوائية واللاهوائية ، بالإضافة إلى كيفية استنفاد مخازن الحديد في اليرسينيا أثناء النمو الهوائي أو اللاهوائي. هناك بعض الاعتبارات المهمة التي تم تسليط الضوء عليها هنا فيما يتعلق بزراعة البكتيريا بنجاح في ظل هذه الظروف المتغيرة. أولا ، تتطلب الزراعة اللاهوائية مكملات إضافية للجلوكوز ، وهو تعديل ملاحظ في وصفة الوسائط. ثانيا ، نظرا لأن Y. pseudotuberculosis يستخدم siderophores وأنظمة امتصاص الحديد الأخرى التي يمكنها استخراج الحديد بقوة من البيئة ، يتم تكريس اهتمام خاص لضمان خلو وسائط الاستزراع والأواني الزجاجية المختبرية من الحديد قدر الإمكان7. استخدمت الدراسات السابقة مخلبات الحديد مثل ديبيريديل لاستنفاد الحديد من المزارع البكتيرية الغنية بالوسائط لتقليد تجويع الحديد8،9. ومع ذلك ، فإن استنفاد مخازن الحديد اليرسينيا للحث على تجويع الحديد يتطلب إزالة الحديد المتبقي في الأواني الزجاجية والوسائط بالإضافة إلى النمو المطول في حالة عدم وجود الحديد. يوضح هذا البروتوكول بالتفصيل كيفية غسل الأواني الزجاجية بالحمض ووسائط المخلب لإزالة الحديد المتبقي ، بالإضافة إلى زراعة البكتيريا لعدة أجيال لضمان تجويع الحديد الشامل. يمكن ضمان تجويع الحديد عن طريق قياس مستويات النسخ النسبية للجينات المستجيبة للحديد المميزة جيدا عبر الظروف ، كما هو موضح هنا مع yfeA و bfd.
يوضح تتويج هذا البروتوكول كيفية ترسيب بروتينات المستجيب T3SS المفرزة من كل حالة من هذه الحالات عن طريق معالجة المادة الطافية المزروعة بحمض ثلاثي كلورو أسيتيك (TCA) وتصور البروتينات المفرزة من خلال SDS-PAGE. أخيرا ، يتم تقييم نشاط T3SS النسبي من خلال تصور البروتينات المفرزة عن طريق تلطيخ الفضة وتحديد المستويات النسبية لبروتينات المستجيب T3SS ، والتي يشار إليها باسم بروتينات Yersinia الخارجية (Yops) 10.
تستخدم فحوصات نشاط T3SS عموما أجساما مضادة محددة للكشف عن مستويات بروتين المستجيب T3SS في المادة الطافية للثقافة. ومع ذلك ، غالبا ما تكون الأجسام المضادة الغربية للنشاف لبروتينات المستجيب T3SS غير متوفرة تجاريا. لذلك ، تم إيلاء اهتمام خاص للتأكد من أن التصور النهائي لنشاط T3SS في هذه الطريقة لا يتطلب أجساما مضادة محددة ، وبدلا من ذلك يمكن الاستفادة من تلطيخ الفضة ، مما يسمح بتصور جميع البروتينات المفرزة. في حين أن هذه الطريقة مصممة خصيصا ومحسنة ل Y. pseudotuberculosis ، إلا أنه يمكن تكييفها مع الأنواع البكتيرية الأخرى ، على الرغم من أن ظروف الوسائط الدقيقة وأوقات الحضانة ستختلف.
يتم سرد تفاصيل الكواشف وتكوين الوسائط وتسلسلات التمهيدي والمعدات في جدول المواد. يوضح الشكل 1 سير العمل التجريبي الشامل.
1. تحضير الأواني الزجاجية المغسولة بالحمض ووسائط M9 المخلبة
ملاحظة: قبل البدء ، راجع قسم المواد للحصول على الكواشف والوصفات الدقيقة التي سيتم استخدامها. تم استخدام وسائط M9 لأول مرة في فحوصات Yersinia T3SS في Cheng et al.11.
2. زراعة Y. الكاذب تحت مستويات متفاوتة من الحديد وتوتر الأكسجين
3. ترسيب حمض ثلاثي كلورو أسيتيك (TCA) لبروتينات المستجيب T3SS
4. SDS-PAGE وتلوين الفضة لتصور بروتينات المستجيب T3SS
5. تحديد نشاط T3SS النسبي
تسمح هذه الطريقة بالمقارنة النسبية ل Yops المفرز عبر ظروف مختلفة بالنسبة للحالة المرجعية ذات الاهتمام. يتم تصوير سير العمل التجريبي العام في الشكل 1. يصور الجدول 1 تمثيلا لكيفية حدوث تطبيع زراعة الخلية عادة في حالة كل حالة مزرعة وحجم TCA الذي سيتم إضافته إلى كل طاف. هنا ، يتم عرض النتائج التمثيلية باستخدام النوع البري (WT) Y. pseudotuberculosis IP2666pIB1 بالإضافة إلى اثنين من الطفرات المنشأة ، ΔyscNU و ΔyopE. يتم استخدام طفرة ΔyopE كعنصر تحكم يفتقر إلى YopE ، بينما يتم استخدام متحولة ΔyscNU كعنصر تحكم سلبي كامل في T3SS لأنه غير قادر على تجميع T3SS وظيفي13،14. تم تصوير صورة تمثيلية لجل SDS-PAGE مصبوغ بالفضة بنسبة 12.5٪ يحتوي على البروتينات المفرزة في الشكل 2. كما هو موضح أعلاه ، احتوت كل عينة على BSA مسنن كعنصر تحكم في كفاءة ترسيب البروتين. عند تحليل البيانات ، يجب التعامل مع مجموعات البيانات اللاهوائية والهوائية كمجموعات بيانات مستقلة حيث تم تطبيع كل منها على حدة. في العينات اللاهوائية ، كان هناك ~ 38 ضعفا أكثر من YopE في عينات الحديد المنخفضة بالنسبة لعينات الحديد العالية ، بما يتفق مع النتائج السابقة15،16. في العينات الهوائية ، لوحظت كمية مماثلة من YopE المفرز في عينات الحديد المنخفضة والعالية ، بما يتفق مع النتائج السابقة16. بشكل عام ، يتم استخدام ما لا يقل عن ثلاثة تكرارات بيولوجية لكل حالة لإثبات الدلالة الإحصائية.
للتأكد من أن هذا البروتوكول يؤدي إلى تجويع الحديد الكافي ، تم إجراء تحليل qPCR على الجينات المستجيبة للحديد yfeA و bfd في سلالة النوع البري في جميع الظروف. YfeA هو بروتين الربط المحيط بالبلازمي لنظام نقل ABC المسؤول عن نقل الحديد ، في حين أن Bfd عبارة عن فيريدوكسين مرتبط بالبكتيريا يشارك في تعبئة مخازن الحديد17،18،19،20. تم عزل الحمض النووي الريبي كما هو موضح سابقا21 ، وكما هو متوقع ، تم تنظيم yfeA و bfd بشكل كبير في الظروف المستنفدة للحديد بالنسبة للظروف المليئة بالحديد ، سواء الهوائية أو اللاهوائية ، كما هو موضح في الشكل 3. بالإضافة إلى ذلك ، قمنا بقياس مستويات الحالة المستقرة yopE mRNA باستخدام qPCR لتأكيد أن النتائج المرصودة ل YopE النسبي على مستوى البروتين كانت متوافقة مع مستويات نسخة yopE (انظر الشكل 3).
أخيرا ، نظرا لأن البكتيريا عرضة للتحلل في ظروف الاستزراع المجهدة ، فقد كان من المهم إظهار أن الخطوات الواردة في هذا البروتوكول لا تؤدي إلى تحلل بكتيري يمكن أن يربك النتائج. لتأكيد ذلك ، خضعت عينات الطاف المترسبة من TCA للنشاف الغربي وتم فحصها من أجل YopE و RpoA ، وهي وحدة فرعية من بوليميراز الحمض النووي الريبي وبروتين سيتوبلازمي. كما هو موضح في الشكل 4 ، بينما اتبع نمط تعبير YopE ما هو موضح في الشكل 3 ، لم يكن هناك دليل على وجود RpoA في عينة الطاف ، مما يشير إلى عدم وجود تحلل ملحوظ من شأنه أن يطلق RpoA السيتوبلازمي في المادة الطافية.
الشكل 1: سير العمل التجريبي لزراعة مرض اليرسينيا الكاذب في ظل توافر الحديد والأكسجين المتفاوت. تمثيل رسومي لخطوات الاستزراع. لاحظ أنه يجب استخدام الأواني الزجاجية المغسولة بالحمض بدءا من اليوم 4. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: نتائج جل SDS-PAGE الملون بالفضة بنسبة 12.5٪ من البروتين المترسب ب TCA من المواد الطفية المزروعة. تم تحميل المواد الطافية المترسبة على جل SDS-PAGE بنسبة 12.5٪ وملطخ بالفضة. (أ) ملف إفراز سلالات WT و ΔyscNU و ΔyopE التي نمت بشكل لاهوائي تم تطبيع القيم النسبية التمثيلية ل YopE إلى عينة WT اللاهوائية المليئة بالحديد. (ب) ملف إفراز سلالات WT و ΔyscNU و ΔyopE التي تنمو بهوائيا. تم تطبيع القيم النسبية التمثيلية ل YopE إلى عينة WT الهوائية المليئة بالحديد. تشير الأسهم البيضاء إلى YopE (~ 23 كيلو دالتون). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: تظهر مستويات mRNA النسبية للجينات المستجيبة للحديد تجويع الحديد. تم عزل الحمض النووي الريبي من WT Y. داء كاذب مزروع في الظروف الموضحة في الشكل 1. تم استخدام qPCR لقياس التعبير النسبي لمستويات yfeA و bfd و yopE التي تم تطبيعها إلى 16S rRNA في الظروف اللاهوائية (A-C) والهوائية (D-F). **** ص < 0.0001 كما هو محدد بواسطة اختبار t غير متزاوج. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: يوضح نقص RpoA السيتوبلازمي في عينات الطاف عدم وجود تحلل الخلايا في ظروف الاستزراع. تم تشغيل 5 ميكرولتر من المواد الطافية المترسبة للعينات اللاهوائية (أ) اللاهوائية و (ب) من الشكل 3 على هلام SDS-PAGE بنسبة 12.5٪ جنبا إلى جنب مع التحكم في الحبيبات. تم نقل البروتينات إلى غشاء PVDF للنشاف الغربي. تم قطع الغشاء ، وتم فحص النصف العلوي بحثا عن RpoA باستخدام جسم مضاد مضاد ل RpoA ، وتم فحص النصف السفلي بحثا عن YopE باستخدام جسم مضاد مضاد ل YopE. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
(أ) | |||
اللاهوائيه | |||
شرط | OD | الحجم المراد جمعه (مل) | تمت إضافة حجم 6.1 N TCA إلى Sup (مل) |
WT منخفض الحديد | 0.5 | 6 | 0.6 |
WT عالية الحديد | 1 | 3 | 0.3 |
(ب) | |||
الهوائيه | |||
شرط | OD | الحجم المراد جمعه (مل) | تمت إضافة حجم 6.1N TCA إلى Sup (مل) |
WT منخفض الحديد | 0.9 | 6 | 0.6 |
WT عالية الحديد | 1.4 | 3.857 | 0.386 |
الجدول 1: سير عمل جمع العينات التمثيلية. في اليوم 5 ، (أ) بمجرد اكتمال الحضانة لمدة 4 ساعات عند 37 درجة مئوية للعينات اللاهوائية ، تم جمع 6 مل من العينة بأقل قيمة OD600 وتم تطبيع باقي أحجام العينة وفقا لذلك. بعد تصفية المادة الطافية ، تمت إضافة 6.1 N TCA. (ب) بمجرد اكتمال الحضانات الهوائية (ساعتان عند 26 درجة مئوية و 4 ساعات عند 37 درجة مئوية) ، تم جمع 6 مل من العينة بأقل قيمة OD600 ، وتم تطبيع باقي أحجام العينة وفقا لذلك. بعد تصفية المادة الطافية ، تمت إضافة 6.1 N TCA.
T3SS هو عامل ضراوة مهم في العديد من البكتيريا المسببة للأمراض. لذلك ، فإن تطوير تقنيات معملية لدراسة تنظيمها مهم لفهم التسبب في المرض وتطوير العلاجاتالمحتملة 1. من المعروف أن الحديد والأكسجين هما إشارات مضيف مهمة تستشعر بها مسببات الأمراض البكتيرية لتنظيم تعبير T3SS5 ؛ لذلك ، تقدم هذه الطريقة استراتيجية لزراعة Y. الكاذب الكاذب في ظل الظروف اللاهوائية أو الهوائية ، مع تجويع الحديد أو امتلائه ، وتوضح كيفية تحديد نشاط T3SS النسبي في ظل هذه الظروف المختلفة من خلال تقييم الكميات النسبية لمستويات بروتين المستجيب YopE T3SS المفرزة.
في حين أن سير العمل لهذه التجربة بسيط نسبيا ، إلا أن هناك بعض النقاط التي يجب مراعاتها عن كثب لتحسين النتائج. أثناء خطوة ترسيب البروتين بوساطة TCA, من المهم تجنب شفط حبيبات البروتين, والتي قد يكون من الصعب رؤيتها. يعد اتخاذ احتياطات إضافية لعدم السماح لطرف الشفاط بلمس الجدران أو قاع الأنبوب أمرا بالغ الأهمية. بالإضافة إلى ذلك ، عند التعامل مع السلالات الطافرة ذات المستوى المنخفض من نشاط T3SS ، ينصح بجمع عينة أكبر للمعالجة. أخيرا ، إذا بدت الممرات ملطخة بعد معالجة العينات وتلطيخ الهلام بدلا من إنتاج أشرطة مميزة ، فقد يكون هذا بسبب تحلل الخلية أثناء الاستزراع أو نقل البكتيريا الكاملة من الحبيبات إلى الجزء الطافي. في هذه الحالة ، يجب تكرار التجربة ، ويجب توخي المزيد من الحذر لتجنب تناول الحبيبات عند إزالة المادة الطافية. من المهم ملاحظة أن هذا البروتوكول قد لا يكون حساسا بما يكفي للكشف عن البروتينات التي تفرز بكميات منخفضة جدا ، وفي هذه الحالة قد يلزم استخدام طرق الكشف الأخرى. بالإضافة إلى ذلك ، نظرا لأن العديد من عوامل المخلبات ستزيل الكاتيونات ثنائية التكافؤ بخلاف الحديد والمغنيسيوم من الوسائط ، فقد تتم إضافة كاتيونات ثنائية التكافؤ الأخرى مرة أخرى إلى الوسائط بعد الخلب لتحديد تأثيرها على الإفراز.
نقطة أخرى مهمة يجب مراعاتها في هذه التجارب هي ميل الأملاح في وسائط M9 إلى الترسيب ، مما يؤدي إلى التباين بين الدفعات التجريبية. للتخفيف من هذه المشكلة ، من الممكن إضافة MgSO4 المعقم بالترشيح إلى الوسائط مباشرة قبل الزراعة.
بشكل عام ، توفر هذه الطرق إطارا قويا لقياس نشاط Yersinia T3SS النسبي عن طريق قياس مستويات البروتين. إلى جانب الأساليب المتوازية التي تهدف إلى تقييم تعبير T3SS ، تسمح الأساليب المعروضة هنا بفهم شامل لديناميكيات T3SS استجابة للإشارات البيئية ذات الصلة بالمضيف. يمكن أيضا تكييف هذا البروتوكول مع البكتيريا الأخرى التي يمكن زراعتها في وسط محدد حيث يمكن حذف مصدر الحديد وللتطبيقات التي يكون فيها قياس البروتينات المفرزة وثيق الصلة بالسؤال العلمي.
ويعلن أصحاب البلاغ عدم وجود مصالح مالية متنافسة.
الصور الرسومية التي تم إنشاؤها باستخدام BioRender.com. تم دعم هذه الدراسة من قبل منحة المعاهد الوطنية للصحة (www.NIH.gov) R01AI119082.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
10 mL Luer-Lok Tip syringe | BD | 301029 | |
10x SDS Running Buffer | Home made | 0.25 M Tris base, 1.92 M Glycine, 1% SDS in 1 L volume | |
12.5% SDS-Page Gel | Home made | ||
15 mL culture tubes | Falcon | 352059 | For initial overnight |
15 mL Falcon tubes | Falcom | 352196 | For supernatant collection |
250 mL culture flask | Belco | 251000250 | |
500 mL Filter System | Corning | 431097 | |
6 N Hydrochloric acid solution | Fisher Scientific | 7732185 | |
Acetone | Fisher Chemical | A949-4 | 4 L |
Bio Rad ChemiDoc MP Imaging System | Bio Rad | Model Number: Universal Hood III | |
Borosilicate glass culture tubes | Fisherbrand | 14-961-34 | For anaerobic culturing |
Chelex 100 Resin | Bio Rad | 142-1253 | |
Chelex M9 +0.9% Glucose media | Home made | 6 g/L Na2HPO4, 3 g/L KH2PO4, 0.5 g/L NaCl, 1 g/L NH4Cl, 1% casamino acids, 0.9% dextrose, 0.0005% thiamine, 5 g/L Chelex 100 Resin. Stir media for 18 h at room temp, filter using 500 mL Corning filtration unit, then add MgSO4 for 1 mM MgSO4 final solution | |
Final Sample Buffer (FSB) | Home made | 0.1 M Tris-HCl, 4% SDS, 20% glycerol, 0.2% of Bromophenol Blue | |
FSB:DTT solution | Home made | FSB+0.2M DTT | |
Image Lab Software | Bio Rad | https://www.bio-rad.com/en-us/product/image-lab-software?ID=KRE6P5E8Z | Software |
Isotemp Heat Block | Fisher Scientific | 88860021 | |
LB Agar Plates | Home made | 10 g Tryptone, 5 g Yeast extract, 10 g NaCl, 15 g Agar in 1 L total volume. Autoclaved | |
M9+0.2% Glucose Media | Home made | 6 g/L Na2HPO4, 3 g/L KH2PO4, 0.5 g/L NaCl, 1 g/L NH4Cl, 1 mM MgSO4, 1 mg/L FeSO47H2O, 1% casamino acids, 0.2% dextrose, 0.0005% thiamine | |
Millex-GP PES 0.22um filter attachment for syringe | Millipore | SLGPR33RS | For FeSO47H2O filtration |
Millex-GV PVDF 0.22um filter attachment for syringe | Millipore | SLGVR33RS | For supernatant filtration |
Precision Plus Protein Unstained Standard | Bio Rad | 1610363 | |
SDS-PAGE Gel Apparatus | Bio Rad | Model Number: Mini PROTEAN Tetra Cell | |
SilverXpress Silver Staining Kit | Invitrogen | LC6100 | |
The BellyDancer Shaker | IBI Scientific | BDRAA1155 | |
Trichloroacetic acid solution 6.1N | Sigma Aldrich | T0699 | |
Vinyl Anaerobic Chamber | Coy Lab Products | https://coylab.com/products/anaerobic-chambers/vinyl-anaerobic-chambers/#details | |
qPCR Primer sequences | |||
yfeA forward - CAC AGT CAG CAG ACC TTA TCT T | |||
yfeA reverse - GGC AGA CGG GAC ATC TTT AAT A | |||
bfd forward - ccagcatcagccccatacag | |||
bfd reverse - tggcttgtcggatgcacttc | |||
yopE forward - CCATAAACCGGTGGTGAC | |||
yopE reverse - CTTGGCATTGAGTGATACTG |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved