Quantifizierung der Aktivität des Yersinia pseudotuberculosis Typ III Sekretionssystems nach Eisenmangel und anaerobem Wachstum

Bakterien besiedeln Wirtsgewebe, die in der Bioverfügbarkeit von Sauerstoff und Eisen variieren, doch die meisten Ansätze zur Untersuchung von Bakterien verwenden belüftete, reichhaltige Medien. Dieses Protokoll beschreibt die Kultivierung des humanpathogenen Erregers Yersinia pseudotuberculosis unter unterschiedlichen Eisenkonzentrationen und Sauerstoffspannungen und die Quantifizierung der Aktivität des Yersinia Typ III Sekretionssystems, das ein wichtiger Virulenzfaktor ist.

Ein wichtiger Virulenzmechanismus für viele gramnegative Erreger ist das Typ-III-Sekretionssystem (T3SS), ein nadelartiges Anhängsel, das zytotoxische oder immunmodulatorische Effektorproteine in Wirtszellen transloziert. Das T3SS ist ein Ziel für antimikrobielle Entdeckungskampagnen, da es extrazellulär zugänglich ist und bei nicht-pathogenen Bakterien weitgehend nicht vorkommt. Neuere Studien haben gezeigt, dass das T3SS von Yersinien und Salmonellen durch Faktoren reguliert wird, die auf Eisen und Sauerstoff reagieren, die wichtige nischenspezifische Signale sind, die bei einer Säugetierinfektion auftreten. Beschrieben wird hier eine Methode zur Eisenverarmung von Yersinia pseudotuberculosis mit anschließender optionaler Supplementierung von anorganischem Eisen. Um den Einfluss der Sauerstoffverfügbarkeit zu bewerten, wird dieser Eisenmangelprozess sowohl unter aeroben als auch unter anaeroben Bedingungen demonstriert. Schließlich induziert die Inkubation der Kulturen bei einer Wirtstemperatur von 37 °C im Säugetieralter die T3SS-Expression und ermöglicht die Quantifizierung der T3SS-Aktivität von Yersinia durch Visualisierung von Effektorproteinen, die in den Überstand freigesetzt werden. Die hier beschriebenen Schritte bieten einen Vorteil gegenüber der Verwendung von Eisenchelatoren in Abwesenheit von Eisenmangel, der für die Induktion eines robusten Eisenmangels unzureichend ist, vermutlich aufgrund effizienter Yersinien-Eisenaufnahme - und Spülsysteme. Ebenso werden die Säurewaschgläser für Laborgläser detailliert beschrieben, um die Entfernung von Eisenresten zu gewährleisten, die für die Induktion eines robusten Eisenmangels unerlässlich sind. Darüber hinaus wird die Verwendung eines Chelatbildners beschrieben, um Resteisen aus dem Medium zu entfernen, und die Kultivierung der Bakterien über mehrere Generationen in Abwesenheit von Eisen, um die bakteriellen Eisenspeicher zu erschöpfen. Durch die Einbeziehung von Standardprotokollen für Trichloressigsäure-induzierte Proteinfällung, SDS-PAGE und Silberfärbung zeigt dieses Verfahren zugängliche Wege zur Messung der T3SS-Aktivität auf. Während dieses Verfahren für Y. pseudotuberculosis optimiert ist, bietet es einen Rahmen für Studien an Krankheitserregern mit ähnlich robusten Eisenaufnahmesystemen. Im Zeitalter der Antibiotikaresistenz können diese Methoden erweitert werden, um die Wirksamkeit von antimikrobiellen Wirkstoffen, die auf das T3SS abzielen, unter wirtsrelevanten Bedingungen zu bewerten.

Viele klinisch relevante gramnegative Erreger wie Yersinien, Vibrio, Escherichia, Pseudomonas und Shigellen kodieren für das Typ-III-Sekretionssystem (T3SS), um Effektorproteine in Wirtszellen zu injizieren¹. Bei vielen Bakterienarten steht das T3SS unter strenger behördlicher Kontrolle². Zum Beispiel ist die Translokation von Yersinia T3SS-Effektorproteinen in Ziel-Wirtszellen entscheidend, um die Abwehrmechanismen des Wirts zu untergraben und die bakterielle Besiedlung von Wirtsgeweben zu ermöglichen. Die Aktivität von Yersinia T3SS ist jedoch metabolisch belastend und kann die Erkennung durch Immunrezeptoren des Wirts auslösen³. Dementsprechend steuern Regulatoren, die spezifische Umweltreize wahrnehmen, die Expression von T3SS-Genen in vielen Bakterienarten. Da Krankheitserreger wie Yersinien während ihres Infektionszyklus Umweltveränderungen erfahren, die sich auf die Expression kritischer Virulenzfaktoren auswirken, ist es wichtig, Laborbedingungen zu entwickeln, die die hervorstechenden Merkmale der Wirtsnischen nachahmen, die von bakteriellen Krankheitserregern besetzt sind. Insbesondere unterscheiden sich die Sauerstoffspannung und die Eisenverfügbarkeit zwischen verschiedenen Gewebestellen in räumlich-zeitlicher Weise und beeinflussen die Expression von Virulenzgenen wie dem T3SS ^4,5,6. Daher ist das Ziel dieser Methode zu beurteilen, wie Sauerstoff und Eisen die Expression der Yersinia T3SS beeinflussen. Dies wird einen Einblick in die Dynamik der Wirt-Pathogen-Interaktion geben.

Die hier beschriebene Methode beschreibt, wie Yersinia pseudotuberculosis aerob und anaerob kultiviert wird, sowie wie die Eisenspeicher von Yersinia während des aeroben oder anaeroben Wachstums erschöpft werden. Es gibt einige wichtige Überlegungen, die hier hervorgehoben werden, um Bakterien unter diesen variablen Bedingungen erfolgreich zu kultivieren. Erstens erfordert die anaerobe Kultivierung eine zusätzliche Glukoseergänzung, eine Modifikation, die im Medienrezept vermerkt ist. Zweitens, da Y. pseudotuberculosis Siderophore und andere Eisenaufnahmesysteme verwendet, die Eisen robust aus der Umwelt aufnehmen können, wird besonderes Augenmerk darauf gelegt, sicherzustellen, dass die Nährmedien und Laborglasgeräte so eisenfrei wie möglich sind⁷. Frühere Studien haben Eisenchelatoren wie Dipyridyl verwendet, um Eisen aus Bakterienkulturen mit reichhaltigen Medien abzubauen, um Eisenmangel nachzuahmen ^8,9. Die Erschöpfung der Eisenspeicher von Yersinien, um Eisenmangel zu induzieren, erfordert jedoch die Entfernung von Resteisen in Glaswaren und Medien sowie ein anhaltendes Wachstum in Abwesenheit von Eisen. Dieses Protokoll beschreibt, wie Glaswaren und Chelatmedien mit Säure gewaschen werden, um Resteisen zu entfernen, zusätzlich zur Kultivierung der Bakterien über mehrere Generationen, um einen gründlichen Eisenmangel zu gewährleisten. Eisenmangel kann durch die Messung der relativen Transkriptspiegel gut charakterisierter eisenresponsiver Gene unter verschiedenen Bedingungen sichergestellt werden, wie hier mit yfeA und bfd gezeigt.

Der Höhepunkt dieses Protokolls zeigt, wie sekretierte T3SS-Effektorproteine aus jeder dieser Erkrankungen ausgefällt werden können, indem der Kulturüberstand mit Trichloressigsäure (TCA) behandelt und sezernierte Proteine durch SDS-PAGE visualisiert werden. Schließlich wird die relative T3SS-Aktivität durch Visualisierung sezernierter Proteine durch Silberfärbung und Quantifizierung der relativen Konzentrationen von T3SS-Effektorproteinen, den sogenannten Yersinia outer proteins (Yops)¹⁰, bewertet.

T3SS-Aktivitätsassays verwenden im Allgemeinen spezifische Antikörper, um den Gehalt an T3SS-Effektorproteinen im Kulturüberstand nachzuweisen. Western-Blotting-Antikörper für T3SS-Effektorproteine sind jedoch oft nicht kommerziell erhältlich. Daher wurde besonders darauf geachtet, dass für die endgültige Visualisierung der T3SS-Aktivität bei dieser Methode keine spezifischen Antikörper erforderlich sind, sondern die Silberfärbung genutzt werden kann, die die Visualisierung aller sezernierten Proteine ermöglicht. Obwohl diese Methode speziell auf Y. pseudotuberculosis zugeschnitten und optimiert ist, kann sie an andere Bakterienarten angepasst werden, obwohl die genauen Medienbedingungen und Inkubationszeiten variieren können.

Die Details zu den Reagenzien, der Medienzusammensetzung, den Primersequenzen und der Ausrüstung sind in der Materialtabelle aufgeführt. Abbildung 1 veranschaulicht den gesamten experimentellen Arbeitsablauf.

1. Zubereitung von säuregewaschenen Glaswaren und chelatisierten M9-Medien

HINWEIS: Bevor Sie beginnen, lesen Sie im Abschnitt Material nach, welche genauen Reagenzien und Rezepte verwendet werden. M9-Medien wurden erstmals für Yersinia T3SS-Assays in Cheng et ^al.11 verwendet.

1. 100 ml 6 N HCl werden in einen 250 ml Glaskolben gegossen.
   ACHTUNG: HCl ist extrem gefährlich; Stellen Sie sicher, dass beim Umgang mit diesem Stoff geeignete Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden.
2. Verschließen Sie die Öffnung des Glasbehälters mit einem Glasstopfen und schwenken Sie den Kolben vorsichtig 1 Minute lang, um den HCl gründlich zu verteilen, wobei Sie gelegentlich die Richtung wechseln.
3. Entsorgen Sie die 6 N HCl ordnungsgemäß.
4. Spülen Sie den Glasbehälter aus, indem Sie 100 ml deionisiertes H₂O hinzufügen, den Mund verschließen, 20 s lang schütteln und dann das Wasser ablassen.
5. Wiederholen Sie den Spülschritt insgesamt 3 Mal.
6. An der Luft trocknen lassen. Autoklav zum Sterilisieren.
7. Um Medien zu chelatisieren, mischen Sie die M9-Komponenten zusammen mit dem Chelatbildnerreagenz und rühren Sie mit einem magnetischen Rührstab bei Raumtemperatur für ~18 h. MgSO₄ filtrieren und bis zu einer Endkonzentration von 1 mM zugeben.

2. Kultivierung von Y. pseudotuberculosis unter unterschiedlichen Eisenwerten und Sauerstoffspannungen

1. Streak Y. pseudotuberculosis (in dieser Studie wird der Stamm IP2666pIB1 verwendet) auf Lysogeny Broth (LB) Agarplatten und inkubieren bei Raumtemperatur.
   HINWEIS: Die Inkubation von Yersinien bei 37 °C, insbesondere in Medium mit niedrigem Kalziumgehalt, führt zu T3SS-Aktivität, Wachstumsstillstand und letztendlich zum Verlust des Plasmids für Yersinia virulence (pYV), das für T3SS¹² kodiert. Daher wird in diesem Protokoll eine Inkubation von Yersinien bei 26 °C verwendet, bis die T3SS-Aktivität gemessen werden muss.
2. Nach 48 Stunden, sobald sich sichtbare Kolonien gebildet haben, 4 ml M9-Medien mit 0,2 % Glukose, 1 mg/l FeSO_4,7 H₂O inokulieren und mit Casaminosäuren (hier als M9-Medien bezeichnet) aus einer einzelnen, isolierten Kolonie beimpfen und über Nacht bei 26 °C kultivieren und etwa 18 Stunden lang bei 250 U/min belüften.
   HINWEIS: Verwenden Sie säuregewaschene Glaswaren, beginnend mit dem folgenden Schritt und fahren Sie fort.
3. Subkultur in chelatisierte M9-Medien mit den folgenden Schritten.
   HINWEIS: Für alle nachfolgenden Schritte werden M9-Medien mit 0,9 % Glukose anstelle der standardmäßigen 0,2 % Glukose verwendet.
   1. Messen Sie mit einem Spektralphotometer die optische Dichte (OD₆₀₀) der Übernachtkultur.
   2. Verdünnen Sie die Übernachtkultur auf einen OD_600-Wert von 0,1 in insgesamt 14 ml sterilen chelatisierten M9-Medien mit 0,9 % Glukose und ohne FeSO 4,7H₂O in einem säuregewaschenen 250-ml-Kolben ohne Eisenzusatz.
   3. 8 h bei 26 °C inkubieren und bei 250 U/min belüften.
4. Subkultur in aerobe und anaerobe Kulturen parallel.
   1. Messen Sie den OD₆₀₀ der wachsenden Kulturen.
   2. Zur Fortsetzung der aeroben Inkubation werden die wachsenden Kulturen auf einen OD_600-Wert von 0,1 in 14 ml sterilen chelatisierten M9-Medien mit 0,9 % Glucose und ohne FeSO 4,7H₂O in einem säuregewaschenen 250-ml-Kolben subkultiviert und 12 h lang ohne Eisenzugabe bei 26 °C belüftet.
   3. Für die anaerobe Kultivierung wird eine Subkultur mit einem OD_600-Wert von 0,1 in 14 ml sterilem chelatisiertem M9-Medium in zwei säuregewaschene Glasröhrchen durchgeführt. In das erste Röhrchen wird filtersterilisiertes (unter Verwendung einer 0,22 μm Polyethersulfonmembran) FeSO 4,7H₂O für eine Endkonzentration von 1 mg/l (als "hoher Eisengehalt" bezeichnet) gegeben. In das zweite Röhrchen wird FeSO 4,7H₂O für eine Endkonzentration von 0,01 mg/l (als "eisenarm" bezeichnet) gegeben. Dies kann durch die Verwendung einer 10 mg/ml FeSO 4,7H ₂O Stammlösung erfolgen. Beide Röhren werden in einer anaeroben Kammer bei Raumtemperatur 12 h lang anaerob inkubiert.
      HINWEIS: 1 mg/L FeSO_{4,7H 2}O bietet eisenreiche Bedingungen für ein robustes Yersinienwachstum . Umgekehrt gewährleistet die Zugabe von nur 0,01 mg/L FeSO_{4,7H 2}O zu anaeroben Kulturen ein ausreichendes Wachstum unter anaeroben Bedingungen, ermöglicht aber immer noch Eisenmangelreaktionen, während aerobe Kulturen 12 Stunden lang ohne Eisenzusatz gezüchtet werden, um Eisenmangelreaktionen vor der Stimulation der T3SS-Aktivität zu stimulieren.
5. Induktion der Aktivität des Typ-III-Sekretionssystems.
   1. Die anaeroben Kulturen werden auf 37 °C umgestellt und die anaerobe Inkubation 4 Stunden lang fortgesetzt, um das T3SS zu induzieren.
   2. Messen Sie den OD₆₀₀ der aerob wachsenden Kultur.
   3. In zwei säuregewaschenen Kolben werden die aerob wachsenden Kulturen auf einen OD_600-Wert von 0,2 in 14 ml sterilen chelatisierten M9-Medien subkultiviert. In den ersten Kolben wird filtersterilisiertes FeSO 4,7H ₂O für eine Endkonzentration von 1 mg/l gegeben. In den zweiten Kolben wird FeSO 4,7H₂O für eine Endkonzentration von 0,01 mg/l gegeben. Beide Kolben werden 2 h lang bei 26 °C und 250 U/min belüftet.
   4. Nach 2 h werden die aeroben Kulturen auf 37 °C mit Belüftung bei 250 U/min umgestellt und 4 h inkubiert, um das T3SS zu induzieren.

3. Trichloressigsäure (TCA)-Fällung von T3SS-Effektorproteinen

1. Sobald die anaerobe Inkubation abgeschlossen ist, messen Sie den OD₆₀₀ der Kulturen.
2. Normalisieren Sie alle anaeroben Proben, um die gleiche Zellmasse zu erreichen (siehe Beispiel in Tabelle 1). Für die anaerobe Kultivierung ist im Allgemeinen ein OD_{600-Wert von ~0,5} in eisenarmen Kulturen und ~1 für eisenreiche Kulturen zu erwarten. Verwenden Sie in diesem Fall 6 mL der eisenarmen Kulturen und 3 mL der eisenhaltigen Kulturen.
   HINWEIS: Die verbleibende Kultur kann für andere Zwecke verwendet werden, z. B. für die Ernte von Gesamt-RNA und die Verwendung quantitativer PCR zur Messung der Steady-State-Spiegel der Ziel-mRNA (hier nicht beschrieben).
3. Übertragen Sie die normalisierten Volumina jeder Kultur in 15-ml-Röhrchen.
4. Um die Wirksamkeit der sekretierten Proteinfällung zu kontrollieren, geben Sie 4 μl 0,5 mg/ml Rinderserumalbumin (BSA) in jedes Röhrchen.
5. Pelletkulturen bei 3200 x g für 15 min bei 4 °C.
6. Befestigen Sie einen 0,22-μm-PVDF-Filter an einer 10-ml-Spritze und filtrieren Sie den Überstand jeder pelletierten Kultur in ein frisches 15-ml-Röhrchen.
   HINWEIS: Dieser Filtrationsschritt minimiert die Wahrscheinlichkeit, dass ganze Bakterienzellen übertragen werden, was zu unerwünschten zytoplasmatischen Proteinen in der Probe führen würde.
7. 10 % des Überstandsvolumens von 6,1 N TCA werden zu jeder Probe hinzugefügt.
8. 1 Minute lang kräftig vortexen. Die Röhrchen über Nacht in einem 4 °C kalten Raum auf Eis inkubieren.
   HINWEIS: Die Dauer der Inkubation kann je nach Bedarf optimiert werden. Bereits eine Inkubation von 1 Stunde kann für Bedingungen oder Stämme funktionieren, bei denen die Sekretion robust ist.
9. Wiederholen Sie die Schritte zum Sammeln von Pellets und zur TCA-Fällung mit den aeroben Kulturen, sobald die 4-stündige Inkubation abgeschlossen ist.
   HINWEIS: Normalisieren Sie die aeroben Kulturen, indem Sie Volumina mit äquivalenter Zellmasse pelletieren.
10. Geben Sie 2 ml jeder Probe in ein frisches 2-ml-Röhrchen und zentrifugieren Sie sie 15 Minuten lang bei 4 °C bei 21.000 x g .
11. Saugen Sie den Überstand mit einem Vakuumaufsatz ab und achten Sie darauf, den Boden oder die Seiten des Schlauchs nicht zu berühren.
    HINWEIS: Das Pellet kann schwer zu visualisieren sein und als Schleier entlang der Länge des Rohrs erscheinen.
12. Die Schritte 3.10 und 3.11 werden wiederholt, bis der gesamte Inhalt jeder Fällungsreaktion in ein einzelnes 2-ml-Röhrchen ausgefällt ist. Dies kann drei oder vier aufeinanderfolgende Zentrifugationsschritte erfordern, ermöglicht aber die Konzentration aller sekretierten Proteine aus jeder Probe in ein 2-ml-Röhrchen.
13. Um die Pellets zu waschen, geben Sie vorsichtig 1 ml eiskaltes 100%iges Aceton in jedes Röhrchen. Um Probenverluste zu vermeiden, resuspendieren Sie das Röhrchen nicht und berühren Sie nicht die Seiten des Röhrchens.
14. Zentrifugieren Sie die Proben bei 21.000 x g für 15 min bei 4 °C.
15. Saugen Sie den Überstand an und achten Sie darauf, den Boden oder die Seiten des Schlauchs nicht zu berühren.
16. Wiederholen Sie die eiskalten Aceton-Waschschritte 3.13 und 3.14.
17. Nachdem Sie den Überstand ein letztes Mal angesaugt haben, öffnen Sie die Röhrchen und lassen Sie das Pellet ca. 1 h lang vollständig auf der Bank trocknen.
18. 50 μl der FSB: DTT-Lösung werden zu jeder getrockneten Probe gegeben. Um Proteinverlust zu vermeiden, nicht resuspendieren.
19. Jede Probe 1 Minute lang gründlich vortexen, dabei sicherstellen, dass die FSB: DTT-Lösung die Wände des gesamten Röhrchens bedeckt. Dies kann durch die Verwendung eines Wirbelaufsatzes optimiert werden, der in der Lage ist, mehrere Schläuche gleichzeitig zu halten.
20. Kochen Sie die Proben 15 Minuten lang bei 95 °C.
21. Die Proben werden kurz für 30 s bei maximaler Geschwindigkeit bei Raumtemperatur zentrifugiert.
22. Bis zur zukünftigen Verwendung bei -80 °C lagern.

4. SDS-PAGE und Silberfärbung zur Visualisierung von T3SS-Effektorproteinen

1. Laden Sie 15 μl jeder anaeroben Probe und 10 μl jeder aeroben Probe in ein 12,5 % SDS-PAGE-Gel zusammen mit 3 μl eines im Handel erhältlichen ungefärbten Standards als Leiter.
2. Lassen Sie das Gel ca. 90 min bei 100 V laufen. Diese Einstellungen können je nach verwendetem Gerät variieren.
3. Befolgen Sie das Silberfärbeprotokoll gemäß den Anweisungen des Herstellers, was zu einem Gel führt, wie in Abbildung 2 gezeigt.

5. Quantifizierung der relativen T3SS-Aktivität

1. Positionieren Sie das Gel in das Bildgebungssystem und stellen Sie sicher, dass sich alle für die Quantifizierung vorgesehenen Banden im Bildrahmen befinden.
   HINWEIS: Das Molekulargewicht von BSA beträgt ~66 kDa, während das Molekulargewicht des T3SS-Effektorproteins YopE ~23 kDa beträgt.
2. Wählen Sie in der Software alle YopE-Bänder über alle Wells hinweg aus.
3. Stellen Sie das Referenz-YopE-Band auf das entsprechende Sample ein.
4. Exportieren Sie die von der Software berechneten relativen Quantifizierungswerte für alle YopE-Bänder.
5. Gehen Sie zurück in die Software und wählen Sie alle BSA-Bänder in allen Vertiefungen aus.
6. Legen Sie die BSA-Referenzbande so fest, dass sie aus derselben Probe stammt wie die YopE-Referenzbande.
7. Exportieren Sie die von der Software berechneten relativen Quantifizierungswerte für alle BSA-Bänder.
8. Um die relativen YopE-Expressionsniveaus zu berechnen, dividieren Sie den Wert der relativen YopE-Menge durch den relativen BSA-Mengenwert für jede Probe.

Diese Methode ermöglicht den relativen Vergleich von sezernierten Yops unter verschiedenen Bedingungen relativ zu einer Referenzbedingung von Interesse. Der gesamte experimentelle Arbeitsablauf ist in Abbildung 1 dargestellt. Tabelle 1 zeigt eine Darstellung der Art und Weise, wie die Normalisierung von Zellkulturen typischerweise unter jeder Kulturbedingung ablaufen würde, und das Volumen an TCA, das jedem Überstand zugesetzt würde. Hier werden repräsentative Ergebnisse unter Verwendung von Wildtyp (WT) Y. pseudotuberculosis IP2666pIB1 sowie zwei kongenen Mutanten, ΔyscNU und ΔyopE, gezeigt. Die ΔyopE-Mutante wird als Kontrolle ohne YopE verwendet, während die ΔyscNU-Mutante als vollständige T3SS-Negativkontrolle verwendet wird, da sie nicht in der Lage ist, ein funktionsfähiges T3SS^13,14 zusammenzusetzen. In Abbildung 2 ist ein repräsentatives Bild eines silbergefärbten 12,5%igen SDS-PAGE-Gels dargestellt, das die sezernierten Proteine enthält. Wie oben beschrieben, enthielt jede Probe spike-in-BSA als Kontrolle für die Proteinfällungseffizienz. Bei der Analyse der Daten sollten anaerobe und aerobe Datensätze als unabhängige Datensätze behandelt werden, da sie jeweils separat normiert wurden. In den anaeroben Proben war ~38-mal mehr YopE in den Proben mit niedrigem Eisengehalt im Vergleich zu den Proben mit hohem Eisengehalt vorhanden, was mit früheren Ergebnissen^{übereinstimmt 15,16}. In den aeroben Proben wurde eine ähnliche Menge an sezerniertem YopE in Proben mit niedrigem und hohem Eisengehalt beobachtet, was mit früheren Ergebnissen übereinstimmt¹⁶. Im Allgemeinen werden mindestens drei biologische Replikate jeder Bedingung verwendet, um die statistische Signifikanz zu ermitteln.

Um zu bestätigen, dass dieses Protokoll zu einem adäquaten Eisenmangel führt, wurde eine qPCR-Analyse an den eisenresponsiven Genen yfeA und bfd im Wildtyp-Stamm unter allen Bedingungen durchgeführt. YfeA ist das periplasmatische Bindungsprotein eines ABC-Transportsystems, das für den Eisentransport verantwortlich ist, während Bfd ein Bakterioferritin-assoziiertes Ferredoxin ist, das an der Mobilisierung der Eisenspeicher beteiligt ist 17,18,19,20. RNA wurde wie zuvor beschrieben isoliert²¹, und wie erwartet waren yfeA und bfd unter eisenarmen Bedingungen im Vergleich zu eisenreichen Bedingungen sowohl aerob als auch anaerob signifikant hochreguliert, wie in Abbildung 3 gezeigt. Zusätzlich quantifizierten wir die yopE-mRNA-Steady-State-Spiegel mittels qPCR, um zu bestätigen, dass die beobachteten Ergebnisse für relatives YopE auf Proteinebene mit den yopE-Transkriptspiegeln übereinstimmten (siehe Abbildung 3).

Da Bakterien unter stressigen Kultivierungsbedingungen zur Lyse neigen, war es wichtig zu zeigen, dass die Schritte in diesem Protokoll nicht zu einer bakteriellen Lyse führen, die möglicherweise die Ergebnisse verfälschen könnte. Um dies zu bestätigen, wurden TCA-präzipitierte Überstandsproben einem Western Blot unterzogen und auf YopE und RpoA, eine Untereinheit der RNA-Polymerase und ein zytoplasmatisches Protein, untersucht. Wie in Abbildung 4 gezeigt, folgte das YopE-Expressionsmuster zwar dem in Abbildung 3 gezeigten, es gab jedoch keine Hinweise auf RpoA in den Probenüberständen, was darauf hindeutet, dass es keine beobachtbare Lyse gab, die zytoplasmatisches RpoA in den Überstand freisetzen würde.

Abbildung 1: Experimenteller Arbeitsablauf für die Züchtung von Yersinia pseudotuberculosis unter variierender Eisen- und Sauerstoffverfügbarkeit. Grafische Darstellung der Kultivierungsschritte. Beachten Sie, dass säuregewaschene Gläser ab Tag 4 verwendet werden müssen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Ergebnisse von silbergefärbtem 12,5%igem SDS-PAGE-Gel von TCA-präzipitiertem Protein aus Kulturüberständen. Ausgefällte Kulturüberstände wurden auf ein 12,5%iges SDS-PAGE-Gel geladen und mit Silber gefärbt. (A) Sekretionsprofil von anaerob gezüchteten WT-, ΔyscNU- und Δ yopE-Stämmen. Repräsentative relative Werte von YopE, normiert auf die anaerobe WT-Eisen-Probe. (B) Sekretionsprofil von aerob gezüchteten WT-, ΔyscNU- und Δ yopE-Stämmen. Repräsentative relative Werte von YopE, normiert auf die aerobe WT-Eisen-Probe. Weiße Pfeile zeigen YopE (~23 kDa) an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Relative mRNA-Spiegel von eisenresponsiven Genen zeigen Eisenmangel. Die RNA wurde aus WT Y. pseudotuberculosis isoliert, die unter den in Abbildung 1 beschriebenen Bedingungen kultiviert wurde. qPCR wurde verwendet, um die relative Expression von yfeA-, bfd- und yopE-Spiegeln zu messen, die unter anaeroben (A-C) und aeroben (D-F) Bedingungen auf 16S rRNA normalisiert waren. ****p < 0,0001, bestimmt durch einen ungepaarten t-Test. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Das Fehlen von zytoplasmatischem RpoA in überstehenden Proben zeigt das Fehlen einer Zelllyse unter Kulturbedingungen. 5 μl gefällte Überstände von (A) anaeroben und (B) aeroben Proben aus Abbildung 3 wurden auf einem 12,5%igen SDS-PAGE-Gel zusammen mit einer Pelletkontrolle durchgeführt. Die Proteine wurden für das Western Blotting auf eine PVDF-Membran übertragen. Die Membran wurde geschnitten, und die obere Hälfte wurde mit einem Anti-RpoA-Antikörper auf RpoA untersucht, und die untere Hälfte wurde mit einem Anti-YopE-Antikörper auf YopE untersucht. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Tabelle 1: Repräsentativer Arbeitsablauf für die Probenentnahme. An Tag 5 (A) wurden nach Abschluss der 4-stündigen Inkubation bei 37 °C für die anaeroben Proben 6 ml der Probe mit dem niedrigsten OD_600-Wert entnommen und der Rest des Probenvolumens entsprechend normiert. Nach der Filterung des Überstands wurden 6,1 N TCA zugegeben. (B) Nach Abschluss der aeroben Inkubationen (2 Stunden bei 26 °C und 4 Stunden bei 37 °C) wurden 6 ml der Probe mit dem niedrigsten OD_600-Wert entnommen und der Rest des Probenvolumens entsprechend normalisiert. Nach der Filterung des Überstands wurden 6,1 N TCA zugegeben.

Das T3SS ist ein wichtiger Virulenzfaktor bei vielen pathogenen Bakterien; Daher ist die Entwicklung von Labortechniken zur Untersuchung seiner Regulation wichtig für das Verständnis der Pathogenese und die Entwicklung potenzieller Therapeutika¹. Es ist bekannt, dass Eisen und Sauerstoff wichtige Wirtssignale sind, die von bakteriellen Krankheitserregern wahrgenommen werden, um die T3SS-Expression zu regulieren⁵; Daher stellt diese Methode eine Strategie zur Kultivierung von Y. pseudotuberculosis entweder unter anaeroben oder aeroben Bedingungen mit Eisenmangel oder -repletion vor und zeigt, wie die relative T3SS-Aktivität unter diesen verschiedenen Bedingungen quantifiziert werden kann, indem relative Mengen an sezernierten YopE T3SS-Effektorproteinen bewertet werden.

Obwohl der Arbeitsablauf für dieses Experiment relativ einfach ist, gibt es einige Punkte, die genau berücksichtigt werden müssen, um die Ergebnisse zu optimieren. Während des TCA-vermittelten Proteinfällungsschritts ist es wichtig, das Aspirieren des Proteinpellets zu vermeiden, das schwer zu sehen sein kann. Es ist wichtig, zusätzliche Vorsichtsmaßnahmen zu treffen, damit die Absaugspitze nicht die Wände oder den Boden des Rohrs berührt. Darüber hinaus ist es bei mutierten Stämmen mit geringerer T3SS-Aktivität ratsam, eine größere Probe zur Verarbeitung zu entnehmen. Wenn die Lanes nach der Probenverarbeitung und der Gelfärbung verschmiert erscheinen, anstatt deutliche Banden zu erzeugen, kann dies entweder auf die Zelllyse während der Kultivierung oder auf die Verschleppung ganzer Bakterien aus dem Pellet in die Überstandsfraktion zurückzuführen sein. In diesem Fall sollte der Versuch wiederholt werden, und es sollte mehr darauf geachtet werden, dass das Pellet beim Entfernen des Überstands nicht aufgenommen wird. Es ist wichtig zu beachten, dass dieses Protokoll möglicherweise nicht empfindlich genug ist, um Proteine nachzuweisen, die in sehr geringen Mengen sezerniert werden, in diesem Fall müssen möglicherweise andere Nachweismethoden eingesetzt werden. Da viele Chelatbildner andere zweiwertige Kationen als Eisen und Magnesium aus dem Medium entfernen, können dem Medium nach der Chelatbildung andere zweiwertige Kationen wieder zugesetzt werden, um ihre Wirkung auf die Sekretion zu bestimmen.

Ein weiterer wichtiger Punkt, der bei diesen Experimenten zu berücksichtigen ist, ist die Neigung der Salze in den M9-Medien zur Ausfällung, was zu einer Variabilität zwischen den experimentellen Chargen führt. Um dieses Problem zu entschärfen, ist es möglich, dem Medium unmittelbar vor der Kultivierung filtersterilisiertes MgSO₄ zuzusetzen.

Insgesamt bieten diese Methoden einen robusten Rahmen für die Quantifizierung der relativen Yersinia T3SS-Aktivität durch Messung des Proteingehalts. Zusammen mit parallelen Ansätzen, die darauf abzielen, die T3SS-Expression zu bewerten, ermöglichen die hier vorgestellten Methoden ein umfassendes Verständnis der T3SS-Dynamik als Reaktion auf wirtsrelevante Umweltreize. Dieses Protokoll kann auch an andere Bakterien angepasst werden, die in einem definierten Medium gezüchtet werden können, bei dem eine Eisenquelle weggelassen werden kann, und für Anwendungen, bei denen die Messung sezernierter Proteine für die wissenschaftliche Fragestellung relevant ist.

Die Autoren erklären, dass keine konkurrierenden finanziellen Interessen bestehen.

Grafische Bilder, die mit BioRender.com erstellt wurden. Diese Studie wurde durch das Stipendium der National Institutes of Health (www.NIH.gov) R01AI119082 unterstützt.