철분 결핍과 혐기성 성장에 따른 Yersinia pseudotuberculosis Type III 분비 시스템 활동의 정량화

박테리아는 산소와 철의 생체이용률이 다양한 숙주 조직에 서식하지만, 박테리아를 연구하는 대부분의 접근 방식은 공기가 풍부한 공기 매체를 사용합니다. 이 프로토콜은 다양한 철 농도와 산소 장력 하에서 인간 병원균 Yersinia pseudotuberculosis 를 배양하고 중요한 독성 인자인 Yersinia type III 분비 시스템의 활성을 정량화하는 방법을 설명합니다.

많은 그람 음성 병원체의 주요 독성 메커니즘은 세포독성 또는 면역조절 효과기 단백질을 숙주 세포로 전위시키는 바늘 모양의 부속물인 III형 분비 시스템(T3SS)입니다. T3SS는 세포 밖에서 접근할 수 있고 비병원성 박테리아가 거의 없기 때문에 항생제 발견 캠페인의 표적입니다. 최근 연구에 따르면 예르시니아 와 살모넬라균 의 T3SS는 포유류 감염 중에 발생하는 중요한 틈새 특이적 신호인 철과 산소에 반응하는 요인에 의해 조절됩니다. 여기에는 Yersinia pseudotuberculosis의 철 결핍 방법과 후속 무기 철의 선택적 보충이 설명되어 있습니다. 산소 가용성의 영향을 평가하기 위해 이 철분 결핍 과정은 호기성 및 혐기성 조건 모두에서 입증되었습니다. 마지막으로, 37°C의 포유류 숙주 온도에서 배양물을 배양하면 T3SS 발현이 유도되고 상등액으로 방출되는 효과기 단백질을 시각화하여 Yersinia T3SS 활성을 정량화할 수 있습니다. 여기에 자세히 설명된 단계는 철 결핍이 없는 경우 철 킬레이터를 사용하는 것보다 이점을 제공하며, 이는 아마도 효율적인 Yersinia 철 흡수 및 청소 시스템으로 인해 강력한 철 결핍을 유발하기에 충분하지 않습니다. 마찬가지로, 산 세척 실험실 유리 기구는 강력한 철 결핍을 유도하는 데 필수적인 잔류 철을 확실히 제거하기 위해 상세합니다. 또한, 킬레이트제를 사용하여 매체에서 잔류 철을 제거하고, 철이 없는 상태에서 여러 세대 동안 박테리아를 배양하여 박테리아 철 저장소를 고갈시키는 것으로 설명됩니다. 이 절차는 트리클로로아세트산 유도 단백질 침전, SDS-PAGE 및 은 염색의 표준 프로토콜을 통합하여 T3SS 활성을 측정할 수 있는 접근 가능한 방법을 보여줍니다. 이 절차는 Y. pseudotuberculosis에 최적화되어 있지만, 유사한 강력한 철분 흡수 시스템을 가진 병원체 연구를 위한 프레임워크를 제공합니다. 항생제 내성 시대에 이러한 방법은 숙주 관련 조건에서 T3SS를 표적으로 하는 항균 화합물의 효능을 평가하기 위해 확장될 수 있습니다.

Yersinia, Vibrio, Escherichia, Pseudomonas 및 Shigella와 같은 임상적으로 관련된 많은 그람 음성 병원체는 숙주 세포에 효과기 단백질을 주입하기 위해 유형 III 분비 시스템(T3SS)을 암호화합니다¹. 많은 박테리아 종에서 T3SS는 엄격한 규제 통제를 받고 있습니다². 예를 들어, Yersinia T3SS effector 단백질을 표적 숙주 세포로 전좌하는 것은 숙주 방어 메커니즘을 파괴하고 숙주 조직의 박테리아 집락화를 가능하게 하는 데 중요합니다. 그러나 Yersinia T3SS 활성은 대사적으로 부담이 되며 숙주 면역 수용체의 인식을 유발할 수 있습니다³. 따라서 특정 환경 신호를 감지하는 조절자는 많은 박테리아 종에서 T3SS 유전자의 발현을 제어합니다. 예르시니아(Yersinia)와 같은 병원체는 감염 주기 동안 중요한 독성 인자의 발현에 영향을 미치는 환경 변화를 경험하기 때문에 박테리아 병원체가 차지하는 숙주 틈새의 두드러진 특징을 모방하는 실험실 조건을 개발하는 것이 중요합니다. 구체적으로, 산소, 장력 및 철 가용성은 시공간 방식으로 다양한 조직 부위에 따라 다르며 T3SS ^4,5,6과 같은 독성 유전자의 발현에 영향을 미칩니다. 따라서 이 방법의 목표는 산소와 철이 Yersinia T3SS의 발현에 어떤 영향을 미치는지 평가하는 것입니다. 이를 통해 숙주-병원체 상호 작용의 역학에 대한 통찰력을 얻을 수 있습니다.

여기에 설명된 방법은 Yersinia pseudotuberculosis를 호기성 및 혐기성으로 배양하는 방법과 호기성 또는 무산소 성장 중에 Yersinia 철 저장을 고갈시키는 방법을 자세히 설명합니다. 이러한 다양한 조건에서 박테리아를 성공적으로 배양하는 것과 관련하여 여기에서 강조하는 몇 가지 중요한 고려 사항이 있습니다. 첫째, 혐기성 배양에는 추가적인 포도당 보충이 필요하며, 이는 배지 레시피에 명시된 변형입니다. 둘째, Y. pseudotuberculosis는 환경에서 철을 강력하게 제거할 수 있는 시데로포어(siderophores) 및 기타 철 흡수 시스템을 사용하기 때문에 배양 배지와 실험실 유리 기구에 철이 가능한 한 없는지 확인하는 데 특별한 주의를 기울입니다⁷. 이전 연구에서는 디피리딜(dipyridyl)과 같은 철 킬레이트제를 사용하여 철분 결핍을 모방하기 위해 풍부한 배지 박테리아 배양에서 철을 고갈시켰습니다 ^8,9. 그러나 철분 고갈을 유발하기 위해 Yersinia 철 저장고를 고갈시키려면 유리 제품 및 매체에 남아 있는 철을 제거하고 철이 없는 상태에서 장기간 성장해야 합니다. 이 프로토콜은 잔류 철을 제거하기 위해 유리 제품과 킬레이트 매체를 산성 세척하는 방법과 철분 결핍을 보장하기 위해 여러 세대에 걸쳐 박테리아를 배양하는 방법을 자세히 설명합니다. 철 결핍은 yfeA 및 bfd에서 입증된 바와 같이 조건 전반에 걸쳐 잘 특성화된 철 반응 유전자의 상대적 전사 수준을 측정함으로써 보장될 수 있습니다.

이 프로토콜의 정점은 배양 상등액을 트리클로로아세트산(TCA)으로 처리하고 SDS-PAGE를 통해 분비된 단백질을 시각화하여 이러한 각 조건에서 분비된 T3SS effector 단백질을 침전시키는 방법을 보여줍니다. 마지막으로, 은 염색을 통해 분비된 단백질을 시각화하고 Yersinia outer proteins(Yops)라고 하는 T3SS effector 단백질의 상대적 수준을 정량화하여 상대적인 T3SS 활성을 평가합니다¹⁰.

T3SS 활성 분석은 일반적으로 특정 항체를 사용하여 배양 상등액에서 T3SS effector 단백질 수준을 검출합니다. 그러나 T3SS effector 단백질에 대한 웨스턴 블로팅 항체는 상업적으로 이용 가능하지 않은 경우가 많습니다. 따라서 이 방법에서 T3SS 활성의 최종 시각화에는 특정 항체가 필요하지 않고 대신 모든 분비된 단백질을 시각화할 수 있는 은 염색을 활용할 수 있도록 특별한 주의를 기울였습니다. 이 방법은 Y. pseudotuberculosis에 특별히 맞춤화되고 최적화되었지만, 정확한 배지 조건과 배양 시간은 다를 수 있지만 다른 박테리아 종에도 적용할 수 있습니다.

시약, 배지 구성, 프라이머 서열 및 장비에 대한 자세한 내용은 재료 표에 나열되어 있습니다. 그림 1 은 전체 실험 워크플로우를 보여줍니다.

1. 산에 의하여 세척된 유리 그릇 및 킬레이트화된 M9 매체의 준비

알림: 시작하기 전에 사용할 정확한 시약과 레시피에 대한 재료 섹션을 참조하십시오. M9 배지는 Cheng et ^al.11에서 Yersinia T3SS 분석에 처음 사용되었습니다.

1. 100mL의 6N HCl을 250mL 유리 플라스크에 붓습니다.
   주의 : HCl은 매우 위험합니다. 이 물질을 취급할 때 적절한 예방 조치를 취하십시오.
2. 유리 용기의 입구를 유리 마개로 밀봉하고 플라스크를 1분 동안 조심스럽게 휘젓아 HCl을 철저히 분배하고 때때로 방향을 바꿉니다.
3. 6N HCl을 적절하게 폐기하십시오.
4. 탈이온화된 H₁₀₀O를 100 mL 첨가하여 유리 용기를 헹구고 입을 밀봉하고 20초 동안 흔든 다음 물을 버립니다.
5. 헹굼 단계를 총 3회 반복합니다.
6. 공기를 말리십시오. 살균을 위한 오토클레이브.
7. 킬레이트 매체를 만들려면 M9 성분을 킬레이트 시약과 함께 혼합하고 실온에서 ~18시간 동안 자기 교반 막대로 저어줍니다. 필터 멸균 및 MgSO₄ 를 최종 농도 1mM에 첨가합니다.

2. 다양한 철 수치와 산소 장력에서 Y. pseudotuberculosis 배양

1. Lysogeny Broth(LB) 한천 플레이트에 줄무늬 Y. pseudotuberculosis (균주 IP2666pIB1이 사용됨)를 사용하고 실온에서 배양합니다.
   참고: 특히 저칼슘 배지에서 37°C에서 Yersinia를 배양하면 T3SS 활성, 성장 정지가 발생하고 궁극적으로 T3SS¹²를 암호화하는 Yersinia virulence(pYV)에 대한 플라스미드 손실이 선택됩니다. 따라서 이 프로토콜은 T3SS 활성을 측정해야 할 때까지 Yersinia의 26°C 배양을 사용합니다.
2. 48시간 후, 눈에 보이는 집락이 형성되면 0.2% 포도당, 1mg/L FeSO 4.7H_2O를 함유하고 단일의 격리된 집락 및 배양물에서 카사미노산(여기서는 M9 배지라고 함)을 보충한 4mL의 M9 배지를 약 18시간 동안 250rpm에서 폭기하고 하룻밤 동안 접종합니다.
   알림: 다음 단계부터 시작하여 계속 진행하는 산성 세척 유리 제품을 사용하십시오.
3. 아래 단계에 따라 하위 배양을 킬레이트화된 M9 미디어로 변환합니다.
   알림: 모든 후속 단계에서는 표준 0.9% 포도당 대신 0.9% 포도당이 포함된 M0.2 매체가 사용됩니다.
   1. 분광 광도계를 사용하여 야간 배양의 광학 밀도(OD₆₀₀)를 측정합니다.
   2. 철을 보충하지 않은 250mL 산 세척 플라스크에 0.9% 포도당과 FeSO 4.7H2 O가 포함되지 않은 총 14mL의 멸균 킬레이트 M9 배지에서 하룻밤 배양을 OD₆₀₀ 값 0.1로 희석합니다.
   3. 250 rpm에서 폭기로 26 ° C에서 8 시간 동안 배양하십시오.
4. 하위 배양은 병렬로 호기성 및 혐기성 배양으로 이루어집니다.
   1. 성장하는 배양물의 OD₆₀₀ 을 측정합니다.
   2. 지속적인 호기성 배양을 위해 250mL 산 세척 플라스크에서 0.9% 포도당과 FeSO 4.7H_2O가 없는 14mL의 멸균 킬레이트 M9 배지에서 성장 배양을 0.1의 OD₆₀₀ 값으로 계대배양하고 철분 보충 없이 26°C에서 12시간 동안 폭기로 배양합니다.
   3. 혐기성 배양의 경우, 14mL의 멸균 킬레이트 M9 배지에서 OD₆₀₀ 값 0.1로 계대배양을 두 개의 산 세척 유리관에 넣습니다. 첫 번째 튜브에 필터 멸균(0.22μm 폴리에테르설폰 멤브레인 사용) FeSO_{4.7H 2}O를 1mg/L의 최종 농도("고철분"이라고 함)에 추가합니다. 두 번째 튜브에 FeSO_{4.7H 2}O를 추가하여 최종 농도 0.01mg/L("저철분"이라고 함)를 얻습니다. 이는 10mg/mL FeSO_{4.7H 2}O 원액을 사용하여 수행할 수 있습니다. 두 튜브를 실온의 혐기성 챔버에서 12시간 동안 혐기성으로 배양합니다.
      참고: 1 mg/L FeSO_{4.7H 2}O는 견고한 Yersinia 성장을 위한 철분이 풍부한 조건을 제공합니다. 반대로, 혐기성 배양물에 0.01 mg/L FeSO_{4.7H 2}O만 첨가하면 혐기성 조건에서 충분한 성장을 보장하지만 여전히 철 결핍 반응을 가능하게 하는 반면, 호기성 배양물은 T3SS 활성을 자극하기 전에 철 결핍 반응을 자극하기 위해 철이 첨가되지 않은 상태에서 12시간 동안 성장합니다.
5. III형 분비 시스템 활동을 유도합니다.
   1. 혐기성 배양물을 37°C로 옮기고 4시간 동안 혐기성 배양을 계속하여 T3SS를 유도합니다.
   2. 호기적으로 성장하는 배양의 OD₆₀₀ 을 측정합니다.
   3. 두 개의 산 세척 플라스크에 호기성 성장 배양물을 14mL의 멸균 킬레이트 M9 배지에서 0.2의 OD₆₀₀ 값으로 계대 배양합니다. 첫 번째 플라스크에 필터 멸균된 FeSO_{4.7H 2}O를 추가하여 최종 농도 1 mg/L를 달성하고, 두 번째 플라스크에 FeSO 4.7H₂O를 추가하여 최종 농도 0.01 mg/L를 달성합니다. 두 플라스크를 26°C에서 250rpm에서 2시간 동안 폭기로 배양합니다.
   4. 2 시간 후, 호기성 배양을 250 rpm에서 폭기로 37 ° C로 전환하고 4 시간 동안 배양하여 T3SS를 유도합니다.

3. T3SS 효과기 단백질의 트리클로로아세트산(TCA) 침전

1. 혐기성 배양이 완료되면 배양물의 OD₆₀₀ 을 측정합니다.
2. 동일한 세포 질량을 얻기 위해 모든 혐기성 샘플을 정규화합니다( 표 1에 제공된 예 참조). 혐기성 배양의 경우, 일반적으로 철이 부족한 배양에서는 ~0.5, 철이 풍부한 배양에서는 ~1의 OD₆₀₀ 값을 예상합니다. 이 경우 철분이 부족한 배양액 6mL와 철분이 풍부한 배양액 3mL를 사용합니다.
   참고: 나머지 배양액은 총 RNA 수확 및 정량적 PCR을 사용하여 표적 mRNA의 정상 상태 수준을 측정하는 것과 같은 다른 목적으로 사용할 수 있습니다(여기에 설명되지 않음).
3. 각 배양액의 정규화된 부피를 15mL 튜브로 옮깁니다.
4. 분비되는 단백질 침전의 효율성을 제어하기 위해 각 튜브에 4μL의 0.5mg/mL 소 혈청 알부민(BSA)을 추가합니다.
5. 3200 x g 에서 4°C에서 15분 동안 펠렛 배양.
6. 0.22μm PVDF 필터를 10mL 주사기에 부착하고 각 펠릿 배양액의 상층액을 새 15mL 튜브에 여과합니다.
   참고: 이 여과 단계는 샘플에서 원치 않는 세포질 단백질을 초래할 수 있는 전체 박테리아 세포를 전달할 가능성을 최소화합니다.
7. 각 샘플에 6.1N TCA의 상등액 부피의 10%를 추가합니다.
8. 1분 동안 격렬하게 소용돌이칩니다. 4°C의 차가운 방에서 얼음 위에서 튜브를 밤새 배양합니다.
   참고: 배양 기간은 필요에 따라 최적화할 수 있습니다. 1시간 정도의 배양만으로도 분비가 활발한 상태나 균주에 효과가 있을 수 있습니다.
9. 4시간 배양이 완료되면 호기성 배양과 함께 펠릿 수집 및 TCA 침전 단계를 반복합니다.
   참고: 등가 세포 질량으로 부피를 펠릿화하여 호기성 배양을 정규화합니다.
10. 새 2mL 튜브에 각 시료 2mL를 추가하고 4°C에서 15분 동안 21,000 x g 에서 원심분리합니다.
11. 진공 부착물을 사용하여 상층액을 흡입하고 튜브의 바닥이나 측면을 만지지 않도록 주의하십시오.
    알림: 펠릿은 시각화하기 어려울 수 있으며 튜브의 길이를 따라 연무로 나타날 수 있습니다.
12. 각 침전 반응의 모든 내용물이 단일 2mL 튜브에 침전될 때까지 3.10 및 3.11단계를 반복합니다. 이 경우 3-4번의 순차적 원심분리 단계가 필요할 수 있지만 각 샘플에서 분비된 모든 단백질을 2mL 튜브로 농축할 수 있습니다.
13. 펠릿을 세척하려면 각 튜브에 얼음처럼 차가운 100% 아세톤 1mL를 부드럽게 첨가하십시오. 샘플 손실을 방지하려면 다시 현탁하지 말고 튜브의 측면을 만지지 마십시오.
14. 21,000 x g 에서 4°C에서 15분 동안 시료를 원심분리합니다.
15. 상층액을 흡입하고 튜브의 바닥이나 측면을 만지지 않도록 주의하십시오.
16. 얼음처럼 차가운 아세톤 세척 단계 3.13 및 3.14를 반복합니다.
17. 마지막으로 상등액을 흡입한 후 튜브를 열고 펠릿을 벤치에서 약 1시간 동안 완전히 건조시킵니다.
18. 건조된 각 샘플에 FSB: DTT 용액 50μL를 추가합니다. 단백질 손실을 방지하려면 재현탁하지 마십시오.
19. 각 샘플을 1분 동안 철저히 소용돌이치게 하여 FSB: DTT 용액이 전체 튜브의 벽을 코팅하도록 합니다. 이는 한 번에 여러 튜브를 고정할 수 있는 와류 부착물을 사용하여 최적화할 수 있습니다.
20. 샘플을 95°C에서 15분 동안 끓입니다.
21. 실온에서 최대 속도로 30초 동안 샘플을 잠시 원심분리합니다.
22. 나중에 사용할 때까지 -80 °C에서 보관하십시오.

4. T3SS effector 단백질을 시각화하기 위한 SDS-PAGE 및 은 염색

1. 각 혐기성 시료 15 μL와 각 호기성 시료 10 μL를 12.5% SDS-PAGE 겔에 로드하고, 시중에서 판매되는 염색되지 않은 표준물질 3 μL를 래더로 사용합니다.
2. 100V에서 약 90분 동안 젤을 실행합니다. 이러한 설정은 사용하는 장치에 따라 달라질 수 있습니다.
3. 제조업체의 지침에 따라 은 염색 프로토콜을 따르면 그림 2와 같이 겔이 생성됩니다.

5. 상대적 T3SS 활성 정량화

1. 겔을 이미징 시스템에 배치하여 정량화를 위한 모든 밴드가 이미지 프레임에 있는지 확인합니다.
   참고: BSA의 분자량은 ~66kDa인 반면 T3SS 효과기 단백질 YopE의 분자량은 ~23kDa입니다.
2. 소프트웨어에서 모든 웰에 걸쳐 모든 YopE 대역 을 선택합니다.
3. 참조 YopE 밴드를 적절한 샘플로 설정합니다.
4. 모든 YopE 대역에 대해 소프트웨어에서 계산한 상대적 정량화 값을 내보냅니다.
5. 소프트웨어로 돌아가서 모든 웰에서 모든 BSA 대역을 선택합니다.
6. 참조 BSA 밴드를 설정하여 참조 YopE 밴드와 동일한 샘플에서 온 것인지 확인합니다.
7. 모든 BSA 대역에 대해 소프트웨어에서 계산한 상대적 정량화 값을 내보냅니다.
8. 상대적 YopE 발현 수준을 계산하려면 YopE 상대적 수량 값을 각 샘플에 대한 BSA 상대 수량 값으로 나눕니다.

이 방법을 사용하면 관심 있는 참조 조건과 관련된 다양한 조건에서 분비된 Yops를 상대적으로 비교할 수 있습니다. 전체 실험 워크플로우는 그림 1에 나와 있습니다. 표 1은 각 배양 조건의 인스턴스에서 세포 배양 정규화가 일반적으로 어떻게 발생하는지와 각 상층액에 추가되는 TCA의 부피를 나타냅니다. 여기서, 대표적인 결과는 야생형(WT) Y. pseudotuberculosis IP2666pIB1과 두 개의 선천성 돌연변이인 ΔyscNU 및 ΔyopE를 사용하여 표시되었습니다. ΔyopE 돌연변이는 YopE가 결핍된 대조군으로 사용되는 반면, ΔyscNU 돌연변이는 기능적 T3SS^13,14를 조립할 수 없기 때문에 완전한 T3SS 음성 대조군으로 사용됩니다. 분비된 단백질을 포함하는 은염색 12.5% SDS-PAGE 겔의 대표적인 이미지는 그림 2에 나와 있습니다. 위에서 설명한 바와 같이, 각 샘플에는 단백질 침전 효율에 대한 대조군으로 스파이크인 BSA가 포함되어 있습니다. 데이터를 분석할 때, 혐기성 및 호기성 데이터 세트는 각각이 별도로 정규화되었기 때문에 독립적인 데이터 세트로 취급되어야 합니다. 혐기성 샘플에서는 고철 샘플에 비해 저철분 샘플에서 ~38배 더 많은 YopE가 존재했으며, 이는 이전 결과^15,16과 일치합니다. 호기성 샘플에서, 낮은 철분 샘플과 높은 철분 샘플에서 유사한 양의 분비된 YopE가 관찰되었으며, 이는 이전 결과와 일치한다¹⁶. 일반적으로 통계적 유의성을 확립하기 위해 각 조건에 대한 최소 3개의 생물학적 복제가 사용됩니다.

이 프로토콜이 적절한 철분 결핍을 초래하는지 확인하기 위해 모든 조건에서 야생형 균주의 철 반응성 유전자 yfeA 및 bfd에 대해 qPCR 분석을 수행했습니다. YfeA는 철 수송을 담당하는 ABC 수송 시스템의 주위 결합 단백질이며, Bfd는 철 저장^{17 , 18 , 19 , 20} 의 동원에 관여하는 박테리오 페리틴 관련 페레독신입니다. RNA는 앞서 설명한 바와 같이 분리되었으며,²¹ 에서 볼 수 있듯이 예상대로 yfeA 및 bfd는 철이 풍부한 조건에 비해 철이 고갈된 조건에서 호기성 및 혐기성으로 유의하게 상향 조절되었습니다. 또한 qPCR을 사용하여 yopE mRNA 정상 상태 수준을 정량화하여 단백질 수준에서 상대 YopE에 대해 관찰된 결과가 yopE 전사체 수준과 일치하는지 확인했습니다(그림 3 참조).

마지막으로, 박테리아는 스트레스가 많은 배양 조건에서 용해되기 쉽기 때문에 이 프로토콜의 단계가 잠재적으로 결과를 혼동시킬 수 있는 박테리아 용해를 초래하지 않는다는 것을 보여주는 것이 중요했습니다. 이를 확인하기 위해 TCA 침전된 상등액 샘플을 웨스턴 블로팅(western blotting)하고 RNA 중합효소 및 세포질 단백질의 하위 단위체인 YopE 및 RpoA를 조사했습니다. 그림 4에서 볼 수 있듯이 YopE 발현 패턴은 그림 3에 표시된 패턴을 따랐지만 샘플 상등액에 RpoA가 존재한다는 증거는 없었으며, 이는 세포질 RpoA를 상등액으로 방출하는 관찰 가능한 용해가 없음을 시사합니다.

그림 1: 다양한 철분 및 산소 가용성에서 Yersinia pseudotuberculosis가 성장하기 위한 실험 워크플로우. 배양 단계를 그래픽으로 표현합니다. 산성 세척 유리 제품은 4일차부터 사용해야 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 배양 상등액에서 TCA 침전 단백질의 은 염색 12.5% SDS-PAGE 겔의 결과. 침전된 배양 상등액을 12.5% SDS-PAGE 젤 및 은 염색 처리한 용액에 적재하였다. (A) 혐기성으로 성장한 WT, ΔyscNU 및 ΔyopE 균주의 분비 프로필. 혐기성 WT 철이 풍부한 샘플로 정규화된 YopE의 대표적인 상대값. (B) 호기성으로 성장한 WT, ΔyscNU 및 ΔyopE 균주의 분비 프로필. YopE의 대표적인 상대값은 호기성 WT 철이 풍부한 샘플로 정규화되었습니다. 흰색 화살표는 YopE(~23kDa)를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 철에 반응하는 유전자의 상대적 mRNA 수치는 철 결핍을 보여줍니다. RNA는 도 1에 기술된 조건에서 배양된 WT Y. pseudotuberculosis로부터 분리하였다. qPCR은 혐기성(A-C) 및 호기성(D-F) 조건에서 16S rRNA로 정규화된 yfeA, bfd 및 yopE 수준의 상대적 발현을 측정하는 데 사용되었습니다. *p < 0.0001은 짝을 이루지 않은 t-테스트에 의해 결정됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: 상등액 샘플에서 세포질 RpoA가 부족하다는 것은 배양 조건에서 세포 용해가 부족함을 보여줍니다.그림 3의 (A) 혐기성 및 (B) 호기성 샘플의 침전된 상등액 5μL를 펠릿 대조군과 함께 12.5% SDS-PAGE 겔에서 실행했습니다. 단백질은 웨스턴 블로팅(western blotting)을 위해 PVDF 멤브레인으로 옮겨졌습니다. 멤브레인을 절단하고 위쪽 절반은 항-RpoA 항체를 사용하여 RpoA를 조사하고 아래쪽 절반은 항-YopE 항체를 사용하여 YopE를 조사했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

표 1: 대표적인 검체 채취 워크플로우. 5일째, (A) 혐기성 샘플에 대해 37°C에서 4시간 배양이 완료되면 OD₆₀₀ 값이 가장 낮은 샘플 6mL를 수집하고 그에 따라 나머지 샘플 부피를 정규화했습니다. 상등액을 여과한 후, 6.1 N TCA를 첨가하였다. (B) 호기성 배양(26°C에서 2시간, 37°C에서 4시간)이 완료되면 OD₆₀₀ 값이 가장 낮은 샘플 6mL를 수집하고 그에 따라 나머지 샘플 부피를 정규화했습니다. 상등액을 여과한 후, 6.1 N TCA를 첨가하였다.

T3SS는 많은 병원성 박테리아에서 중요한 독성 인자입니다. 따라서 그 조절을 연구하기 위한 실험실 기술을 개발하는 것은 발병 기전을 이해하고 잠재적인 치료법을 개발하는 데 중요합니다¹. 철과 산소는 T3SS 발현을 조절하기 위해 박테리아 병원체가 감지하는 중요한 숙주 신호로 알려져 있습니다⁵; 따라서 이 방법은 철분 결핍 또는 충만과 함께 혐기성 또는 호기성 조건에서 Y. pseudotuberculosis 를 배양하기 위한 전략을 제시하고, 분비된 YopE T3SS effector 단백질 수준의 상대적인 양을 평가하여 이러한 다양한 조건에서 상대적인 T3SS 활성을 정량화하는 방법을 보여줍니다.

이 실험의 워크플로는 비교적 간단하지만 결과를 최적화하기 위해 면밀히 고려해야 할 몇 가지 사항이 있습니다. TCA 매개 단백질 침전 단계에서는 보기 어려울 수 있는 단백질 펠릿을 흡인하지 않는 것이 중요합니다. 흡인기 팁이 튜브의 벽이나 바닥에 닿지 않도록 추가 예방 조치를 취하는 것이 중요합니다. 또한 T3SS 활성 수준이 낮은 돌연변이 균주를 처리할 때는 처리할 더 큰 샘플을 수집하는 것이 좋습니다. 마지막으로, 샘플 처리 및 겔 염색 후 레인이 뚜렷한 띠를 생성하지 않고 번진 것처럼 보이는 경우, 이는 배양 중 세포 용해 또는 펠릿에서 전체 박테리아가 상등액 분획으로 이월되었기 때문일 수 있습니다. 이 경우 실험을 반복해야 하며 상등액을 제거할 때 펠릿을 흡수하지 않도록 더 많은 주의를 기울여야 합니다. 이 프로토콜은 매우 적은 양으로 분비되는 단백질을 검출할 만큼 민감하지 않을 수 있으며, 이 경우 다른 검출 방법을 사용해야 할 수 있다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 또한, 많은 킬레이트제들이 배지에서 철과 마그네슘 이외의 2가 양이온을 제거하기 때문에, 다른 2가 양이온은 킬레이트화 후 배지에 다시 첨가하여 분비에 대한 효과를 확인할 수 있습니다.

이러한 실험에서 고려해야 할 또 다른 중요한 점은 M9 매체의 염이 침전되는 경향으로 인해 실험 배치 간에 변동성이 발생한다는 것입니다. 이 문제를 완화하기 위해 배양 직전에 필터 멸균된 MgSO₄ 를 배지에 추가할 수 있습니다.

전반적으로 이러한 방법은 단백질 수준을 측정하여 상대적인 Yersinia T3SS 활성을 정량화하기 위한 강력한 프레임워크를 제공합니다. T3SS 발현을 평가하기 위한 병렬 접근 방식과 함께 여기에 제시된 방법을 통해 호스트 관련 환경 신호에 대한 응답으로 T3SS 역학을 포괄적으로 이해할 수 있습니다. 이 프로토콜은 철 공급원을 생략할 수 있는 정의된 배지에서 성장할 수 있는 다른 박테리아와 분비된 단백질을 측정하는 것이 과학적 문제와 관련된 응용 분야에도 적용될 수 있습니다.

저자는 경쟁하는 재정적 이해관계가 없다고 선언합니다.

BioRender.com 를 사용하여 만든 그래픽 이미지. 이 연구는 미국 국립보건원(National Institutes of Health, www.NIH.gov) 보조금 R01AI119082의 지원을 받았습니다.