Domuz Üreme ve Solunum Sendromu Virüs Ekspresyon Vektör Yapısı için Kesintisiz Bir Klonlama Yaklaşımı

Burada, eklerin 3' ucunda uygun kısıtlama bölgelerini tanıtarak pVAX1-PRRSV ekspresyon vektörünü elde etmek için bir protokol sunuyoruz. Homolog rekombinasyon teknolojisi ile vektörü doğrusallaştırabilir ve DNA parçalarını vektöre tek tek birleştirebiliriz.

Gen ekspresyon vektörlerinin inşası, deneysel biyolojide laboratuvar çalışmalarının önemli bir bileşenidir. Gibson Assembly gibi teknik gelişmelerle vektör yapımı nispeten basit ve verimli hale geliyor. Bununla birlikte, Domuz Üreme ve Solunum Sendromu Virüsünün (PRRSV) tam uzunluktaki genomu, cDNA'dan tek bir polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ile kolayca amplifiye edilemediğinde veya çoklu eklerin homolog rekombinasyonu ile tam uzunlukta bir gen ekspresyon vektörü elde etmek zor olduğunda in vitro, mevcut Gibson Assembly tekniği bu hedefe ulaşmakta başarısız olur.

Sonuç olarak, PRRSV genomunu birkaç fragmana bölmeyi ve PCR ile amplifiye edilmiş fragmanları elde etmek için ters primere uygun kısıtlama bölgelerini sokmayı amaçladık. Önceki DNA fragmanını homolog rekombinasyon teknolojisi ile vektöre kattıktan sonra, yeni vektör kısıtlama enzimi bölünme bölgesini elde etti. Böylece, yeni eklenen enzim bölünme bölgesini kullanarak vektörü doğrusallaştırabilir ve bir sonraki DNA parçasını, yukarı akış DNA parçasının akış aşağısına sokabiliriz.

Yukarı akış DNA fragmanının 3' ucuna eklenen kısıtlama enzimi bölünme bölgesi elimine edilecek ve aşağı akış DNA fragmanının 3' ucuna yeni bir bölünme bölgesi eklenecektir. Bu şekilde DNA parçalarını tek tek vektöre birleştirebiliriz. Bu yöntem, PRRSV ifade vektörünü başarılı bir şekilde oluşturmak için uygulanabilir ve çok sayıda parçayı ifade vektörüne monte etmek için etkili bir yöntemdir.

Prokaryotik ve ökaryotik hücrelerde ekspresyon için DNA tabanlı deneysel araçlar oluşturmak için temel bir teknik olan moleküler klonlama, deneysel biyolojinin çok önemli bir bileşenidir. Moleküler klonlama dört işlemi içerir: insert DNA'nın elde edilmesi, insertin uygun vektöre bağlanması, rekombinant vektörün Escherichia coli'ye (E. coli) dönüştürülmesi ve pozitif klonların tanımlanması¹. Şimdiye kadar, restriksiyon enzimleri ^2,3 ve PCR aracılı rekombinasyon ^4,5,6 kullanılarak DNA moleküllerini birleştirmek için birden fazla yöntem benimsenmiştir. Dikişsiz klonlama teknolojisi olarak bilinen homolog rekombinasyon, bir veya daha fazla DNA parçasının bir vektöre diziden bağımsız ve yara izi bırakmadan yerleştirilmesine izin veren klonlama yöntemleri grubudur. Bu teknoloji, dizi ve ligasyondan bağımsız klonlama (SLIC), Dikişsiz Ligasyon Klonlama Özü (SLiCE), In-Fusion ve Gibson Assembly'yi içerir. Kesici ucun bir zincirini bozmak için bir eksonükleaz ve yapışkan uçlar oluşturmak için bir vektör kullanır ve fosfodiester bağları oluşturarak eki vektöre kovalent olarak birleştirmek için in vivo onarım veya in vitro rekombinasyon kullanır. Herhangi bir dizide herhangi bir sekansta tek bir eki herhangi bir yara izi olmadan bir vektöre birleştirme yeteneği çok çekici. Ayrıca teknoloji, dizi kısıtlaması olmaksızın önceden belirlenmiş bir sırayla 5-10 parçayı birleştirme yeteneğine sahiptir.

Birçok rekombinant DNA tekniğinden biri olarak, şu anda en etkili klonlama yöntemi olan Gibson Assembly tekniği ^7,8, bir veya birden fazla doğrusallaştırılmış DNA parçasını sorunsuz bir şekilde birleştirmek için sağlam ve zarif bir eksonükleaz bazlı yöntemdir. Gibson Assembly reaksiyonu, izotermal koşullar altında, 5' eksonükleaz, yüksek kaliteli polimeraz ve termostabil bir DNA ligaz olmak üzere üç enzimin bir karışımı kullanılarak gerçekleştirilir. 5'-3' eksonükleaz tarafından oluşturulan tek iplikli 3' çıkıntılar, bir uçta tamamlayıcılığı paylaşan parçaların tavlanmasına katkıda bulunur. Yüksek kaliteli polimeraz, dNTP'ler ekleyerek tavlanmış tek sarmallı bölgelerdeki boşlukları etkili bir şekilde doldurur ve termostabil DNA ligaz, eklem DNA molekülleri oluşturmak için çentikleri kapatır⁸. Bu nedenle, bu teknik yöntem, gen ekspresyon vektörlerinin inşası için yaygın olarak kullanılmaktadır.

Domuz üreme ve solunum sendromu (PRRS), herhangi bir⁹ yaşında PRRSV'nin neden olduğu domuzlarda üreme bozukluğuna ve solunum yetmezliğine yol açan viral bir hastalıktır. Sendrom ateş, iştahsızlık, zatürree, uyuşukluk, depresyon ve solunum sıkıntısı ile kendini gösterir. Ayrıca, bazı salgınlarda kulaklarda kırmızı / mavi renk değişikliği de dahil olmak üzere klinik belirtiler gözlenmiştir. Arteriyor ailesinin bir üyesi olan PRRSV, idrar, kolostrum ve tükürük dahil olmak üzere sıvıların doğrudan teması ve değişimi yoluyla domuz eti üreten ülkelere yaygın olarak bulaşır. Amerika Birleşik Devletleri'nde PRRSV'nin yayılması nedeniyle, domuz endüstrisinin toplam ekonomik kayıplarının, 664 milyon domuz ve 5.8 milyon domuzun üreme ölçeğine dayalı olarak yılda yaklaşık 110 milyon dolar olduğu tahmin edilmektedir^10,11. Hayvan ve Bitki Sağlığı Denetim Servisi raporu, aşılanmamış domuzların %49,8'inin serumda^{PRRSV varlığını gösterdiğini 12} ve enfekte domuzlarda düşük PRRSV seviyelerinin tükürük, burun salgıları, idrar ve dışkı yoluyla atıldığını^{göstermektedir 13}. PRRSV yayılımını kontrol etmek için çoklu stratejiler uygulanmıştır 14,15,16. Tamamen virüs negatif popülasyonlar oluşturmak veya biyogüvenlik ve yönetimi iyileştirmek için eliminasyon prosedürlerine ek olarak, aşıların uygulanması PRRS'yi kontrol etmenin etkili bir yoludur.

PRRSV, yaklaşık 15 kilobaz (kb) uzunluğunda, zarflı, tek sarmallı, pozitif anlamlı bir RNA virüsüdür. PRRSV genomu, en az 10 açık okuma çerçevesi (ORF), kısa bir 5' çevrilmemiş bölge (5' UTR) ve 3' terminalinde bir poli(A) kuyruktan oluşur (Şekil 1A)¹⁷. Negatif sarmallı bir RNA virüsünün genomu bulaşıcı değildir, oysa pozitif sarmallı RNA virüslerinin genomu bulaşıcıdır. Virüs döllerini oluşturmak için RNA ve DNA transfeksiyonu için iki ana strateji vardır¹⁸. Bununla birlikte, RNA genomuna karşılık gelen tam uzunluktaki parçanın klonlanması, bulaşıcı klonların inşası için çok önemlidir. PRRSV genomunun uzun ve karmaşık doğası nedeniyle, tam uzunlukta genom bir kerede PCR yoluyla kolayca elde edilemez. Ek olarak, PRRSV genlerinin yapay sentezi etkili bir çözüm olmasına rağmen, uzun parçaların sentezi genellikle pahalıdır. Bu nedenle, PRRSV tam uzunlukta ifade vektörünü elde etmek için, onu çoklu ekler homolog rekombinasyon yöntemi^19,20 ile oluşturmaya çalıştık. Ne yazık ki, tam uzunlukta gen ekspresyon vektörünü elde edemedik. Bu nedenle, bu çalışmada, ters primere uygun kısıtlama bölgeleri ekledik ve birkaç tur homolog rekombinasyon reaksiyonu ile pVAX1-PRRSV ekspresyon vektörünü başarıyla elde ettik. Ayrıca, bu yöntem aynı zamanda hedef genlerin silinmesini veya mutasyona uğratılmasını sağlayabilir ve çok sayıda DNA parçasını ekspresyon vektörüne verimli bir şekilde birleştirebilir.

1. PRRSV geninin şablonunun hazırlanması

1. Virüs stoğunu 1 mL RNA ekstraksiyon reaktifi içinde çözün (bkz. Malzeme Tablosu).
2. 0.2 mL kloroform ekleyin ve iyice karıştırın. 3 dakika inkübe edin.
3. Karışımı 4 ° C'de 12.000 × g'da 15 dakika santrifüjleyin.
   NOT: Karışım, renksiz bir sulu faz, bir interfaz ve bir kırmızı fenol-kloroform faz olmak üzere üç faza ayrılır.
4. Renksiz sulu fazı pipetleyin ve yeni bir tüpe aktarın.
5. Sulu fazı 0,5 mL izopropanol ile iyice karıştırın ve 4 ° C'de 10 dakika inkübe edin.
6. 4 ° C'de 12.000 × g'da 10 dakika santrifüjleyin.
   NOT: Tüpün alt kısmında beyaz bir RNA çökeltisi vardır.
7. Tüpün süpernatantını atmak için bir mikropipet kullanın.
8. Peleti yeniden süspanse etmek ve kısaca girdap yapmak için 1 mL %75 etanol ekleyin.
9. 4 ° C'de 7.500 × g'da 5 dakika santrifüjleyin. Tüpün süpernatantını atmak için bir mikropipet kullanın.
10. RNA'yı 5 dakika kurutun, RNA'yı yeniden süspanse etmek için 20-50 μL RNaz içermeyen su ekleyin ve iyice karıştırın.
11. Ters transkripsiyon yapmaya devam edin; Tablo 1'de gösterildiği gibi ters transkripsiyon gerçekleştirmek için reaksiyonları ayarlayın.
    NOT: Başarılı bir ters transkripsiyon sağlamak için yüksek kaliteli RNA şablonları kullanın.
12. Elde edilen cDNA'yı PCR için kullanın veya -20 °C'de saklayın.

2. PCR astar tasarımı

1. İleri astarın tasarlanması
   1. Yazılımı açın ve Yeni DNA Dosyası'nı seçin.
   2. PRRSV gen dizisini (GenBank: FJ548852.1) NCBI'den yazılıma yapıştırın. Sıra dosyalarını oluşturmak için Tamam'a tıklayın.
   3. Diziyi analiz edin ve parça bağlantılarını işaretleyin. Parçaların ileri spesifik dizi astarını tasarlayın. Çoğu durumda, tercih edilen erime sıcaklığı (Tm) 55 °C ile 62 °C arasındadır ve GC içeriği %40-60'tır.
   4. Primer'lara tıklayın ve Primer Ekle'yi seçin.
   5. Spesifik diziyi yapıştırın ve vektörün örtüşme dizilerini, belirli dizi astarının ilk 5' nükleotidine ekleyin. Her kavşağın yakınında, iki bitişik parça arasındaki örtüşme bölgesi olarak hizmet etmek için 20-40 bp seçin.
   6. Çıkıntıları ve belirli sırayı içeren ön astarı adlandırın (bkz. Ek Şekil S1).
   7. Şablona astar ekle'ye tıklayın.
2. Ters astarın tasarlanması
   1. Sırayı analiz edin ve yazılımdaki parça bağlantılarını işaretleyin. Parçaların ters spesifik dizi astarını tasarlayın.
   2. Primer'lara tıklayın ve Primer Ekle'yi seçin.
   3. Spesifik diziyi yapıştırın ve kısıtlama bölgesini belirli dizi astarının ilk 5' nükleotidine ekleyin.
      NOT: Eklenen kısıtlama bölgeleri, çoklu klonlama siteleri dışında, ekleme parçasında ve vektörde bulunmamalıdır.
   4. Kısıtlama bölgesinin ilk 5' nükleotidine 20-40 bp çıkıntı vektör dizileri ekleyin.
   5. Çıkıntıları ve spesifik sırayı içeren ters astarı adlandırın (bkz. Ek Şekil S1).
   6. Şablona astar ekle'ye tıklayın.

3. Parçaları yükseltmek için PCR

1. Altı ayrı PCR reaksiyonu ayarlayın (Tablo 2): fragman 1 için P1 ve P2 primerlerini kullanın (bkz. Ek Şekil S2); fragman 2 için, P3 ve P4 primerlerini kullanın (bkz. Ek Şekil S2); fragman 3 için, P5 ve P6 primerlerini kullanın (bkz. Ek Şekil S2); fragman 4 için, P7 ve P8 primerlerini kullanın (bkz. Ek Şekil S2); fragman 5 için P9 ve P10 primerlerini kullanın; ve fragman 6'yı büyütmek için P11 ve P12 primerlerini kullanın (bkz. Ek Şekil S2).
   NOT: Kullanmadan önce her bir bileşeni çözdürün, karıştırın ve kısaca santrifüjleyin.
2. Tablo 2'deki üç adımlı protokolü kullanarak PCR'yi çalıştırın.
3. 5 μL PCR ürününe 1 μL 6x DNA yükleme tamponu ekleyin, karıştırın ve içeriği kısaca santrifüjleyin.
4. Numuneleri %1 agaroz jel elektroforezi kullanarak analiz edin.

4. PCR fragmanlarının saflaştırılması

NOT: PCR ürünlerinin bir jel ekstraksiyon kiti (Malzeme Tablosuna bakınız) kullanılarak bir jelden saflaştırılması, vektör yapımı için önemlidir.

1. 45 μL PCR ürününe 9 μL 6x DNA yükleme tamponu ekleyin, karıştırın ve içeriği kısaca santrifüjleyin.
2. DNA parçalarını ayırmak için %1 agaroz jel/goldview elektroforezi gerçekleştirin.
   NOT: pH değeri DNA fragmanı geri kazanımını etkileyeceğinden TAE çalışan tamponu tekrar kullanmayın.
3. Bantların yeterince ayrılmasından sonra, DNA bantlarını dikkatlice çıkarmak için keskin bir neşter kullanın.
   NOT: Fazla agarozu keserek jel diliminin boyutunu en aza indirin.
4. Jel dilimini temiz bir 1.5 mL mikrosantrifüj tüpünde tartın, jel dilimine eşit hacimde bir bağlayıcı tampon ekleyin (ör., 0.3 mL ila 0.3 g'lık bir dilim) ve 60 ° C'de 7 dakika inkübe edin.
5. 2 mL'lik bir toplama tüpüne mini bir sütun yerleştirin. Adım 4.4'ten mini kolona 700 μL DNA/agaroz çözeltisi ekleyin.
6. Oda sıcaklığında 1 dakika boyunca 10.000 × g'da santrifüjleyin. Süzüntüyü atın ve toplama tüpünü tekrar kullanın.
7. 300 μL bağlayıcı tampon ekleyin ve oda sıcaklığında 1 dakika boyunca 13.000 × g'da santrifüjleyin. Süzüntüyü atın ve toplama tüpünü tekrar kullanın.
8. 700 μL yıkama tamponu ekleyin ve oda sıcaklığında 1 dakika boyunca 13.000 × g'da santrifüjleyin. Süzüntüyü atın ve toplama tüpünü tekrar kullanın.
9. Sütun matrisini kurutmak için boş mini sütunu maksimum hızda 2 dakika döndürün. Mini sütunu temiz bir 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin.
10. 20 μL deiyonize suyu doğrudan kolon zarının ortasına ekleyin ve oda sıcaklığında 2 dakika bekletin. 13.000 × g hızında 1 dakika santrifüjleyin.
11. DNA'yı -20 °C'de saklayın.

5. Doğrusallaştırılmış bir vektörün hazırlanması

NOT: Plazmidi hazırladıktan sonra, seçilen enzimler onu kesmek için kullanılabilir. Uzun sindirim veya çift enzimli sindirim, tüm DNA'nın sindirimini sağlamak için çok önemlidir. Bu, sonraki deneylerde yanlış pozitif klonların sayısını azaltacaktır.

1. pVAX1 doğrusallaştırma
   1. Reaksiyon karışımını oda sıcaklığında belirtilen sırayla hazırlayın (Tablo 3).
      NOT: Belirtilen toplam reaksiyon hacmini korumak için su hacmi eklenmelidir. Burada, 1 μg plazmit, reaksiyon karışımındaki enzimlerle sindirildi. Plazmit konsantrasyonuna bağlı olarak, reaksiyon karışımında plazmitin hacmi ayarlanabilir.
   2. Yavaşça karıştırın; Sonra aşağı döndürün. 37 °C'de bir ısı bloğunda veya su termostatında 60 dakika inkübe edin.
   3. Jel ekstraksiyon kitini kullanarak bölüm 4'teki PCR fragmanlarının saflaştırılmasına benzer jel saflaştırması gerçekleştirin (bkz. Malzeme Tablosu).
2. pVAX1-F1 doğrusallaştırma
   NOT: pVAX1-F1, pVAX1'in ilk turundan (NdeI ve HindIII) ve fragman 1 rekombinasyonundan elde edilen vektördür. pVAX1-F2, pVAX1-F1 (NdeI) turundan ve fragman 2 rekombinasyonundan elde edilen vektördür. pVAX1-F3, pVAX1-F2 (NdeI) turundan ve parça 3 rekombinasyonundan elde edilen vektördür. pVAX1-F4, pVAX1-F3 (NdeI) turundan ve fragman 4 rekombinasyonundan elde edilen vektördür. pVAX1-F5, pVAX1-F4 (EcoRV ve NtoI) turundan ve fragman 5 rekombinasyonundan elde edilen vektördür.
   1. Her vektör için, reaksiyon karışımını oda sıcaklığında belirtilen sırayla ayrı ayrı hazırlayın (Tablo 3).
   2. Yavaşça karıştırın; Sonra aşağı döndürün. 37 °C'de bir ısı bloğunda veya su termostatında 60 dakika inkübe edin.
   3. Jel ekstraksiyon kitini kullanarak bölüm 4'teki PCR fragmanlarının saflaştırılmasına benzer jel saflaştırması gerçekleştirin (bkz. Malzeme Tablosu).

6. Yeni bir vektöre alt klonlama

NOT: 50-200 ng vektör ve ekler kullanıldığında iyi klonlama verimliliği elde edilebilir.

1. ExonArt dikişsiz klonlama ve montaj reaksiyonunu ayarlayın (Tablo 4). Sterilize deiyonize H₂O kullanarak toplam reaksiyon hacmini 10 μL'ye ayarlayın ve karıştırın.
2. Reaksiyonu bir termodöngüleyicide 50 ° C'de 15-60 dakika inkübe edin. Numuneleri buz üzerinde saklayın.
   NOT: Kuluçkanın 60 dakikaya kadar uzatılması montaj verimliliğini artırabilir.
3. DH5α kimyasal olarak yetkin hücreleri buz üzerinde çözdürün.
4. Yetkili hücrelere 10 μL montaj ürünü ekleyin; Ardından, yukarı ve aşağı pipetleyerek nazikçe karıştırın.
5. Karışımı 30 dakika buzun üzerine koyun.
6. 45 ° C'de 45 saniye boyunca şok uygulayın ve tüpleri 3 dakika boyunca buzun üzerine aktarın.
7. Tüpe 900 μL SOC ortamı ekleyin.
8. Tüpü 37 ° C çalkalama makinesinde, 1 saat boyunca 225 rpm'de çalkalayın.
9. Dönüşüm reaksiyonunu 6.000 × g'da 2 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve hücreleri 100 μL taze SOC ortamında yeniden süspanse edin.
10. Dönüştürülmüş hücre süspansiyonunu 50 μg/mL kanamisin içeren ayrı bir LB plakasına yayın.
11. Tüm plakaları gece boyunca 37 °C'de inkübe edin. Her deney plakasından ayrı ayrı izole koloniler seçin.

7. Dönüştürücülerin analiz edilmesi

1. 50 μg / mL kanamisin içeren 20 μL LB ortamına sekiz koloni seçin.
2. Koloni PCR reaksiyonunu ayarlayın ve PCR'yi çalıştırın (Tablo 5).
   NOT: Fragman 1 için koloni PCR reaksiyonu için, P1 ve P2 primerlerini kullanın (bkz. Ek Dosya 1); fragman 2 için, P3 ve P4 primerlerini kullanın (Ek Dosya 1'e bakınız); fragman 3 için, P5 ve P6 primerlerini kullanın (Ek Dosya 1'e bakınız); fragman 4 için, P7 ve P8 primerlerini kullanın (bkz. Ek Şekil S2); fragman 5 için P9 ve P10 primerlerini kullanın; ve fragman 6'yı tespit etmek için P11 ve P12 primerlerini kullanın (bkz. Ek Şekil S2).
3. 5 μL PCR ürününe 1 μL 6x DNA yükleme tamponu ekleyin, karıştırın ve içeriği kısaca santrifüjleyin.
4. Sonuçları %1 agaroz jel elektroforezi kullanarak analiz edin.
5. 50 μg/mL kanamisin içeren 5 mL LB ortamına bir pozitif koloni seçin ve gece boyunca 37 °C'de büyütün.
6. Üreticinin talimatlarına göre bir plazmid DNA mini kiti ( Malzeme Tablosuna bakın) kullanarak plazmidi elde edin.
7. %1 agaroz jel elektroforezi kullanarak sonuçları görselleştirin.

Bu yazıda, sürekli olarak eklenen kısıtlama bölgeleri aracılığıyla ters primer kullanarak örtüşen DNA moleküllerini birleştirmek ve onarmak için bir in vitro rekombinasyon sistemi sunuyoruz (Şekil 1B). Bu sistem, doğrusal vektörün ve PCR tarafından getirilen çıkıntıları içeren kesici uç parçalarının, uygun 5' uzatma dizilerine ve kısıtlama bölgelerine sahip primerlerle hazırlanmasını içeren basit ve verimli bir prosedürdür; bir in vitro tek izotermal reaksiyon ve rekombinasyon ürünlerinin uygun konakçı bakterilere standart kimyasal dönüşümü; ve pozitif bir koloninin seçimi ve bir sonraki klonlama turu için rekombinant vektörün elde edilmesi. pVAX1-PRRSV vektörünü adım adım elde etmek için, rekombinant vektörün eklerinde ve çoklu klonlama bölgelerinde kısıtlama bölgeleri bulunmamalıdır.

Tek bir PCR ile tam uzunlukta ve karmaşık gen dizileri elde etmek zor olduğundan, PRRSV'nin insert fragmanları sadece altı PCR reaksiyonu ile amplifiye edilebilir (Şekil 1C). İlk rekombinasyon turu sırasında, PRRSV'nin Fragman 1'i, pVAX1 vektörüne başarıyla yerleştirildi ve tanıtılan kısıtlama bölgeleri (NheI, tek bir enzim bölünme bölgesi) ile yeni rekombinant plazmit, pVAX1-F1 olarak adlandırıldı (Şekil 1D). İkinci rekombinasyon turunda, pVAX1-F1 vektörü, kısıtlama enzimi NheI ile doğrusallaştırıldı. Fragman 2, pVAX1-F1 vektörüne başarıyla yerleştirildi ve rekombinant plazmid pVAX1-F2'yi kısıtlama bölgeleriyle birlikte verdi (NheI, tek bir enzim bölünme bölgesi) (Şekil 1D). Üçüncü rekombinasyon turu için, Şekil 1D'de gösterildiği gibi, fragman 3, kısıtlama bölgeleri (NheI, tek bir enzim bölünme bölgesi) ile pVAX1-F3 elde etmek için pVAX1-F2 vektörüne başarıyla yerleştirildi. Dördüncü rekombinasyon turunda, pVAX1-F4 vektörünü, kısıtlama bölgeleri EcoRV (tek bir enzim bölünme bölgesi) ile fragman 4'ü ekleyerek elde ettik. Daha sonra, pVAX1-F4 vektörü, kısıtlama enzimi EcoRV tarafından doğrusallaştırıldı ve I Değil, Fragman 5, kısıtlama bölgeleri ile pVAX1-F5 elde etmek için pVAX1-F4 vektörüne klonlandı (Ideğil, tek bir enzim bölünme bölgesi). Son rekombinasyon turundan sonra, PRRSV tam uzunlukta aşırı ekspresyon vektörü (pVAX1-PRRSV) başarıyla elde edildi (Ek Dosya 1). Şekil 1D'de gösterildiği gibi, yeni rekombinant plazmit, fragmanların sürekli eklenmesiyle daha da büyür. Bu nedenle, bu sonuçlar, uygun kısıtlama bölgelerinin eklenmesi ve Gibson Assembly tekniğinin kullanılmasının kombinasyonunun, DNA parçalarının vektöre verimli bir şekilde sokulmasını sağlayabileceğini göstermiştir.

Şekil 1: Homolog rekombinasyon ile pVAX1-F6 (pVAX1-PRRSV) vektörlerinin organizasyonu ve yapımı. (A) PRRSV genomunun organizasyonu. ORF1b, RNA'ya bağımlı RNA polimeraz, RNA helikaz ve çok çekirdekli çinko bağlama alanlarını kodlar. Diğer ORF'ler, zarla ilişkili glikoproteinleri (GP2, GP3, GP4 ve GP5), E proteinini, zar zarf proteinini ve nükleokapsid proteinini kodlar. (B) pVAX1-PRRSV vektörünün oluşturulma sürecinin şematik diyagramı. (C) DNA agaroz jeli, hedef fragmanların PCR amplifikasyonunu gösterir. (D) Fragmanların eklenmesiyle, rekombinant vektörün boyutu kademeli olarak artar. Kısaltmalar: PRRSV = Domuz Üreme ve Solunum Sendromu Virüsü; ORF = açık okuma çerçevesi; GP = glikoprotein; E = E proteini; M = zar zarf proteini; N = nükleokapsid proteini. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: Ters transkripsiyon kurulumu ve koşulları.

Tablo 2: PCR reaksiyon kurulumu ve koşulları.

Tablo 3: pVAX1, pVAX1-F1, pVAX1-F2, pVAX1-F3, pVAX1-F4 ve pVAX1-F5'in doğrusallaştırma karışımı.

Tablo 4: ExonArt kesintisiz klonlama ve montaj reaksiyonu kurulumu.

Tablo 5: Koloni PCR kurulumu ve koşulları.

Ek Şekil S1: Astar tasarım sürecinin şeması. P5 ve P6 gibi diğer astar tasarımları da gösterilmektedir. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil S2: Primer dizileri. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 1: DNA dizileme verileri. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Gibson montaj tekniği, DNA fragmanlarının^{birleştirilmesi} için in vitro rekombinasyon tabanlı bir moleküler klonlama yöntemidir 8. Bu yöntem, birden fazla DNA fragmanının, tek tüplü bir izotermal reaksiyonda dairesel bir plazmide birleştirilmesini sağlar. Bununla birlikte, Gibson Assembly tekniğinin önündeki engellerden biri, cDNA'dan uzun parçaların elde edilmesidir. Uzun parçaların birçok nedenden dolayı doğru bir şekilde büyütülmesi zordur. Örneğin, primerlerin uzun uzama süreleri boyunca uyumsuzluğu daha kolaydır, cDNA iyi kalitede olmayabilir veya GC açısından zengin bölgeler DNA polimerizasyonunu durduracaktır. Tam uzunluktaki fragman, PCR kullanılarak cDNA'dan kolayca elde edilemediğinde, tam uzunluktaki fragmanın amplifikasyon için birden fazla fragmana bölünmesi gerekir. Bununla birlikte, eklenen DNA fragmanlarının sayısı ve uzunluğu arttıkça, homolog rekombinasyon testinden elde edilen verimlilik ve pozitif klonlar da önemli ölçüde azalacaktır. Bu nedenle, eklerin 3' ucuna uygun kısıtlama bölgeleri ekleyerek alternatif bir çözüm denedik. Daha sonra, vektörü doğrusallaştırabilir ve homolog rekombinasyon teknolojisi ile DNA parçalarını tek tek vektöre birleştirebilir ve homolog rekombinasyon reaksiyonu yoluyla istenmeyen kısıtlama bölgelerini ortadan kaldırabiliriz.

Küresel pazarlarda ekonomik açıdan en önemli patojenlerden biri olan PRRSV, son 30 yılda her zaman araştırmacıların dikkatini çekmiştir 10,21,22. Yaklaşık 15 kb uzunluğunda pozitif sarmallı bir RNA virüsüdür ve uzun DNA fragmanı cDNA'dan kolayca amplifiye edilemez. Bu nedenle, bu yöntemin uzun parçaların klonlanması için kullanılıp kullanılamayacağını araştırmak için, PRRSV'yi tam uzunlukta genom klonlaması için bir şablon olarak kullandık. Bu çalışmada, tam uzunluktaki diziyi altı fragmana böldük ve ters primere uygun kısıtlama bölgeleri ekledik ve PCR ile altı fragman elde ettik. Daha sonra birkaç tur rekombinasyon reaksiyonu ile tam uzunlukta pVAX1-PRRSV ekspresyon vektörünü başarıyla elde ettik. Ek olarak, yapılandırılmış PRRSV ekspresyon vektörü, transfeksiyon veya mRNA aşı araştırması için kapaklı RNA'lar elde etmek için in vitro transkripsiyon için bir şablon görevi görebilir. Bu arada, yapılandırılmış mRNA virüsü plazmidi, yüzey plazmon rezonansı^23,24 gibi moleküler etkileşim teknikleri yoluyla in vitro olarak antiviral doğal bileşiklerin toplu taraması için kullanılabilir. pVAX1 plazmidi gereksinimleri karşılar çünkü bir in vitro transkripsiyon testi, bir T7 promotörü ile yüksek kopyalı bir plazmit gerektirir. Ayrıca, CMV promotörü içeren pVAX1-PRRSV plazmidi, viral genom ekspresyonu^25,26 için BHK-21 hücrelerine transfekte edilebilir.

Özetle, bu protokolle, uzun tam uzunluktaki genlerin PCR amplifikasyonu ile elde edilen birkaç parçaya bölünebileceğini gösteriyoruz. Tam uzunlukta gen ekspresyon vektörünün birkaç tur rekombinasyon reaksiyonu ile elde edilebilmesi için ters primerlerin uygun kısıtlama bölgelerine sokulması önemlidir. Bu yöntem, tek bir PCR ile doğrudan elde edilemeyen tam uzunluktaki genler için veya çoklu insertlerin homolog rekombinasyonu ile elde edilemeyen tam uzunluktaki genler için kullanılabilir. Bu nedenle, bu yaklaşım Gibson Assembly tekniğinin önemli bir tamamlayıcısıdır, uzun DNA parçalarının klonlanması ve füzyon gen yapımı için yaygın olarak kullanılabileceğini tahmin ediyoruz.

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemektedir.

Bu çalışma, Çin Batı Normal Üniversitesi (No. 20E059) tarafından sağlanan doktora araştırma başlatma fonlarının mali desteği ile desteklenmiştir.