Ein nahtloser Klonierungsansatz für die Konstruktion von Expressionsvektoren für das porzine reproduktive und respiratorische Syndrom

In dieser Arbeit stellen wir ein Protokoll vor, um den pVAX1-PRRSV-Expressionsvektor durch Einführung geeigneter Restriktionsstellen am 3'-Ende der Inserts zu erhalten. Wir können den Vektor linearisieren und DNA-Fragmente durch homologe Rekombinationstechnologie nacheinander mit dem Vektor verbinden.

Die Konstruktion von Genexpressionsvektoren ist ein wichtiger Bestandteil der Laborarbeit in der experimentellen Biologie. Mit technischen Fortschritten wie Gibson Assembly wird die Vektorkonstruktion relativ einfach und effizient. Wenn jedoch das Genom des Porcinen Reproduktiven und Respiratorischen Syndroms Virus (PRRSV) nicht einfach durch eine einzelne Polymerase-Kettenreaktion (PCR) aus cDNA amplifiziert werden kann oder es schwierig ist, einen Genexpressionsvektor in voller Länge durch homologe Rekombination mehrerer Inserts in vitro zu erhalten, kann die derzeitige Gibson-Assemblierungstechnik dieses Ziel nicht erreichen.

Daher zielten wir darauf ab, das PRRSV-Genom in mehrere Fragmente zu zerlegen und geeignete Restriktionsstellen in den reversen Primer einzuführen, um PCR-amplifizierte Fragmente zu erhalten. Nach dem Verbinden des vorherigen DNA-Fragments mit dem Vektor durch homologe Rekombinationstechnologie erhielt der neue Vektor die Spaltstelle des Restriktionsenzyms. So können wir den Vektor linearisieren, indem wir die neu hinzugefügte Enzymspaltstelle verwenden und das nächste DNA-Fragment stromabwärts des stromaufwärts gelegenen DNA-Fragments einführen.

Die eingeführte Spaltstelle des Restriktionsenzyms am 3'-Ende des stromabwärts gelegenen DNA-Fragments wird eliminiert, und eine neue Spaltstelle wird in das 3'-Ende des stromabwärts gelegenen DNA-Fragments eingeführt. Auf diese Weise können wir DNA-Fragmente nacheinander mit dem Vektor verbinden. Diese Methode ist anwendbar, um den PRRSV-Expressionsvektor erfolgreich zu konstruieren, und ist eine effektive Methode zum Assemblieren einer großen Anzahl von Fragmenten in den Expressionsvektor.

Als wesentliche Technik zur Konstruktion von DNA-basierten experimentellen Werkzeugen für die Expression in prokaryotischen und eukaryotischen Zellen ist die molekulare Klonierung ein sehr wichtiger Bestandteil der experimentellen Biologie. Die molekulare Klonierung umfasst vier Prozesse: die Gewinnung von Insert-DNA, die Ligation des Inserts in den entsprechenden Vektor, die Umwandlung des rekombinanten Vektors in Escherichia coli (E. coli) und die Identifizierung der positiven Klone¹. Bisher wurden mehrere Methoden zur Verbindung von DNA-Molekülen unter Verwendung der Restriktionsenzyme ^2,3 und der PCR-vermittelten Rekombination ^4,5,6 angewendet. Die homologe Rekombination, bekannt als Seamless Cloning Technology, ist die Gruppe von Klonierungsmethoden, die das sequenzunabhängige und narbenfreie Einfügen eines oder mehrerer DNA-Fragmente in einen Vektor ermöglicht. Diese Technologie umfasst sequenz- und ligationsunabhängige Klonierung (SLIC), Seamless Ligation Cloning Extract (SLiCE), In-Fusion und Gibson Assemblierung. Es verwendet eine Exonuklease, um einen Strang des Inserts abzubauen, und einen Vektor, um kohäsive Enden zu erzeugen, und entweder in vivo-Reparatur oder in vitro-Rekombination, um das Insert durch Bildung von Phosphodiesterbindungen kovalent mit dem Vektor zu verbinden. Die Möglichkeit, einen einzelnen Insert in beliebiger Sequenz ohne Narben mit einem Vektor zu verbinden, ist sehr ansprechend. Darüber hinaus ist die Technologie in der Lage, 5-10 Fragmente in einer vorgegebenen Reihenfolge ohne Sequenzbeschränkungen zu verbinden.

Als eine von vielen rekombinanten DNA-Techniken ist die Gibson-Assemblierungstechnik, derzeit die effektivste Klonierungsmethode ^7,8, eine robuste und elegante Exonuklease-basierte Methode, um ein oder mehrere linearisierte DNA-Fragmente nahtlos zusammenzusetzen. Die Gibson-Assemblierungsreaktion wird unter isothermen Bedingungen unter Verwendung einer Mischung aus drei Enzymen durchgeführt, nämlich 5'-Exonuklease, High-Fidelity-Polymerase und einer thermostabilen DNA-Ligase. Einzelstrangige 3'-Überhänge, die durch die 5'-3'-Exonuklease erzeugt werden, tragen zum Glühen von Fragmenten bei, die an einem Ende Komplementarität aufweisen. Die High-Fidelity-Polymerase füllt effektiv die Lücken in den geglühten Einzelstrangbereichen durch Zugabe von dNTPs, und die thermostabile DNA-Ligase dichtet die Kerben ab, um gemeinsame DNA-Moleküle^{zu bilden 8}. Daher ist diese technische Methode für die Konstruktion von Genexpressionsvektoren weit verbreitet.

Das porzine reproduktive und respiratorische Syndrom (PRRS) ist eine Viruserkrankung, die bei Schweinen ab einem Alter von⁹ Jahren zu Fortpflanzungsstörungen und Atemversagen führt, die durch PRRSV verursacht werden. Das Syndrom manifestiert sich in Form von Fieber, Magersucht, Lungenentzündung, Lethargie, Depression und Atemnot. Darüber hinaus wurden bei einigen Epidemien klinische Symptome, einschließlich roter/blauer Verfärbung der Ohren, beobachtet. Als Mitglied der Familie der Arteriviren wird PRRSV in großem Umfang durch direkten Kontakt und Austausch von Flüssigkeiten, einschließlich Urin, Kolostrum und Speichel, in die schweinefleischproduzierenden Länder übertragen. Aufgrund der Ausbreitung von PRRSV in den Vereinigten Staaten werden die wirtschaftlichen Gesamtverluste der Schweinefleischindustrie auf etwa 664 Millionen US-Dollar pro Jahr geschätzt, basierend auf dem Zuchtmaßstab von 5,8 Millionen Sauen und 110 Millionen Schweinen^10,11. Der Bericht des Tier- und Pflanzengesundheitsinspektionsdienstes zeigt, dass 49,8 % der ungeimpften Schweine das Vorhandensein von PRRSV im Serum¹² aufweisen und geringe PRRSV-Konzentrationen bei infizierten Schweinen über Speichel, Nasensekret, Urin und Kot ausgeschieden werden¹³. Es wurden mehrere Strategien implementiert, um die Ausbreitung von PRRSV zu kontrollieren 14,15,16. Neben Eliminierungsverfahren zur Schaffung vollständig virusnegativer Populationen oder zur Verbesserung der Biosicherheit und des Managements ist die Verabreichung von Impfstoffen ein wirksames Mittel zur Kontrolle von PRRS.

PRRSV ist ein behülltes, einzelsträngiges RNA-Virus mit positivem Sinn und einer Länge von etwa 15 Kilobasen (kb). Das PRRSV-Genom besteht aus mindestens 10 offenen Leserahmen (ORFs), einer kurzen 5'-untranslatierten Region (5' UTR) und einem Poly(A)-Schwanz am 3'-Ende (Abbildung 1A)¹⁷. Das Genom eines negativsträngigen RNA-Virus ist nicht infektiös, während das Genom von positivsträngigen RNA-Viren infektiös ist. Es gibt zwei Hauptstrategien für die RNA- und DNA-Transfektion zur Erzeugung von Virusnachkommen¹⁸. Die Klonierung des Fragments in voller Länge, das dem RNA-Genom entspricht, ist jedoch entscheidend für die Konstruktion infektiöser Klone. Aufgrund der langen und komplexen Natur des PRRSV-Genoms kann das Genom in voller Länge nicht einfach auf einmal durch PCR gewonnen werden. Obwohl die künstliche Synthese von PRRSV-Genen eine effektive Lösung ist, ist die Synthese langer Fragmente oft teuer. Um den PRRSV-Expressionsvektor in voller Länge zu erhalten, haben wir daher versucht, ihn mit der homologen Rekombinationsmethode^19,20 mit mehreren Inserts zu erzeugen. Leider war es uns nicht möglich, den Genexpressionsvektor in voller Länge zu erhalten. Daher fügten wir in dieser Studie dem reversen Primer geeignete Restriktionsstellen hinzu und erhielten den pVAX1-PRRSV-Expressionsvektor erfolgreich durch mehrere Runden homologe Rekombinationsreaktionen. Darüber hinaus kann mit dieser Methode auch eine Deletion oder Mutation von Zielgenen erreicht und eine große Anzahl von DNA-Fragmenten effizient an den Expressionsvektor gebunden werden.

1. Vorbereitung des Templates des PRRSV-Gens

1. Tauen Sie den Virusbestand in 1 ml RNA-Extraktionsreagenz auf (siehe Materialtabelle).
2. 0,2 mL Chloroform zugeben und gründlich mischen. 3 Min. inkubieren.
3. Die Mischung 15 min bei 12.000 × g bei 4 °C zentrifugieren.
   HINWEIS: Das Gemisch ist in drei Phasen unterteilt, nämlich eine farblose wässrige Phase, eine Interphase und eine rote Phenol-Chloroform-Phase.
4. Pipettieren Sie die farblose wässrige Phase heraus und übertragen Sie sie in ein neues Röhrchen.
5. Die wässrige Phase gründlich mit 0,5 mL Isopropanol mischen und 10 min bei 4 °C inkubieren.
6. 10 min bei 12.000 × g bei 4 °C zentrifugieren.
   HINWEIS: Am Boden des Röhrchens befindet sich ein weißer RNA-Niederschlag.
7. Verwenden Sie eine Mikropipette, um den Überstand des Röhrchens zu entsorgen.
8. Fügen Sie 1 mL 75%iges Ethanol hinzu, um das Pellet zu resuspendieren und kurz zu wirbeln.
9. 5 min bei 7.500 × g bei 4 °C zentrifugieren. Verwenden Sie eine Mikropipette, um den Überstand des Röhrchens zu entsorgen.
10. Trocknen Sie die RNA 5 Minuten lang, fügen Sie 20-50 μl RNase-freies Wasser hinzu, um die RNA zu resuspendieren, und mischen Sie sie gründlich.
11. Fahren Sie mit der Durchführung der reversen Transkription fort. Richten Sie die Reaktionen ein, um eine reverse Transkription durchzuführen, wie in Tabelle 1 gezeigt.
    HINWEIS: Um eine erfolgreiche reverse Transkription zu gewährleisten, verwenden Sie hochwertige RNA-Vorlagen.
12. Verwenden Sie die resultierende cDNA für die PCR oder lagern Sie sie bei -20 °C.

2. Design des PCR-Primers

1. Entwerfen der vorderen Grundierung
   1. Öffnen Sie die Software und wählen Sie Neue DNA-Datei.
   2. Fügen Sie die PRRSV-Gensequenz (GenBank: FJ548852.1) aus NCBI in die Software ein. Klicken Sie auf OK , um die Sequenzdateien zu generieren.
   3. Analysieren Sie die Sequenz, und markieren Sie die Fragmentknoten. Entwerfen Sie den vorwärtsspezifischen Sequenzprimer der Fragmente. In den meisten Fällen liegt die bevorzugte Schmelztemperatur (Tm) zwischen 55 °C und 62 °C, und der GC-Gehalt liegt bei 40-60 %.
   4. Klicken Sie auf Primer und wählen Sie Add Primer.
   5. Fügen Sie die spezifische Sequenz ein und fügen Sie Überlappungssequenzen des Vektors zu den ersten 5'-Nukleotiden des spezifischen Sequenzprimers hinzu. Wählen Sie in der Nähe jedes Knotens 20-40 bp aus, um als Überlappungsbereich zwischen den beiden benachbarten Fragmenten zu dienen.
   6. Benennen Sie den vorderen Primer, der die Überhänge und die spezifische Sequenz enthält (siehe Ergänzende Abbildung S1).
   7. Klicken Sie auf Primer zur Vorlage hinzufügen.
2. Gestaltung der Rückseitengrundierung
   1. Analysieren Sie die Sequenz und markieren Sie die Fragmentverbindungen in der Software. Entwerfen Sie den umgekehrten spezifischen Sequenzprimer der Fragmente.
   2. Klicken Sie auf Primer und wählen Sie Add Primer.
   3. Fügen Sie die spezifische Sequenz ein und fügen Sie die Restriktionsstelle zum ersten 5'-Nukleotid des spezifischen Sequenzprimers hinzu.
      HINWEIS: Die hinzugefügten Einschränkungsstellen dürfen im Einfügefragment und im Vektor nicht vorhanden sein, mit Ausnahme der mehreren Klonierungsstellen.
   4. Fügen Sie 20-40 bp Überhangsequenzen von Vektoren zum ersten 5'-Nukleotid der Restriktionsstelle hinzu.
   5. Benennen Sie den umgekehrten Primer, der die Überhänge und die spezifische Sequenz enthält (siehe Ergänzende Abbildung S1).
   6. Klicken Sie auf Primer zur Vorlage hinzufügen.

3. PCR zur Amplifikation von Fragmenten

1. Richten Sie sechs einzelne PCR-Reaktionen ein (Tabelle 2): Für Fragment 1 verwenden Sie die Primer P1 und P2 (siehe Ergänzende Abbildung S2); für Fragment 2 sind die Primer P3 und P4 zu verwenden (siehe Ergänzende Abbildung S2); für Fragment 3 sind die Primer P5 und P6 zu verwenden (siehe Ergänzende Abbildung S2); für Fragment 4 sind die Primer P7 und P8 zu verwenden (siehe Ergänzende Abbildung S2); für Fragment 5 die Primer P9 und P10 verwenden; und verwenden Sie die Primer P11 und P12, um Fragment 6 zu amplifizieren (siehe Ergänzende Abbildung S2).
   HINWEIS: Tauen Sie jede Komponente vor der Verwendung auf, mischen Sie sie und zentrifugieren Sie sie kurz.
2. Führen Sie die PCR mit dem dreistufigen Protokoll in Tabelle 2 durch.
3. 1 μl 6x DNA-Ladepuffer zu 5 μl PCR-Produkt geben, mischen und den Inhalt kurz zentrifugieren.
4. Analysieren Sie die Proben mit 1 % Agarose-Gelelektrophorese.

4. Aufreinigung der PCR-Fragmente

HINWEIS: Die Aufreinigung der PCR-Produkte aus einem Gel mit einem Gel-Extraktionskit (siehe Materialtabelle) ist wichtig für die Vektorkonstruktion.

1. 9 μl 6x DNA-Ladepuffer zu 45 μl PCR-Produkten geben, mischen und den Inhalt kurz zentrifugieren.
2. Führen Sie eine 1%ige Agarose-Gel/Goldview-Elektrophorese durch, um die DNA-Fragmente zu trennen.
   HINWEIS: Verwenden Sie TAE-Laufpuffer nicht wieder, da sein pH-Wert die Rückgewinnung von DNA-Fragmenten beeinflusst.
3. Verwenden Sie nach ausreichender Trennung der Banden ein scharfes Skalpell, um die DNA-Banden vorsichtig zu entfernen.
   HINWEIS: Minimieren Sie die Größe der Gelscheibe, indem Sie überschüssige Agarose abschneiden.
4. Wiegen Sie die Gelscheibe in einem sauberen 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen, geben Sie ein gleiches Volumen an Bindungspuffer in die Gelscheibe (z. B. 0,3 mL auf eine 0,3-g-Scheibe) und inkubieren Sie sie 7 Minuten lang bei 60 °C.
5. Setzen Sie eine Minisäule in ein 2-ml-Entnahmeröhrchen ein. 700 μl DNA/Agarose-Lösung aus Schritt 4.4 in die Mini-Säule geben.
6. Bei 10.000 × g 1 min bei Raumtemperatur zentrifugieren. Entsorgen Sie das Filtrat und verwenden Sie das Auffangröhrchen wieder.
7. 300 μl Bindungspuffer zugeben und bei 13.000 × g 1 min bei Raumtemperatur zentrifugieren. Entsorgen Sie das Filtrat und verwenden Sie das Auffangröhrchen wieder.
8. 700 μl Waschpuffer zugeben und bei 13.000 × g 1 min bei Raumtemperatur zentrifugieren. Entsorgen Sie das Filtrat und verwenden Sie das Auffangröhrchen wieder.
9. Drehen Sie die leere Mini-Säule 2 Minuten lang mit maximaler Geschwindigkeit, um die Säulenmatrix zu trocknen. Legen Sie die Minisäule in ein sauberes 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen.
10. Geben Sie 20 μl deionisiertes Wasser direkt in die Mitte der Säulenmembran und lassen Sie es 2 Minuten bei Raumtemperatur stehen. Bei 13.000 × g Geschwindigkeit 1 min zentrifugieren.
11. Lagern Sie die DNA bei -20 °C.

5. Vorbereitung eines linearisierten Vektors

HINWEIS: Nach der Vorbereitung des Plasmids können die ausgewählten Enzyme zum Schneiden verwendet werden. Ein langer Verdau oder Dual-Enzym-Verdau ist entscheidend, um die Verdauung der gesamten DNA zu gewährleisten. Dadurch wird die Anzahl der falsch positiven Klone in nachfolgenden Experimenten reduziert.

1. pVAX1-Linearisierung
   1. Das Reaktionsgemisch wird bei Raumtemperatur in der angegebenen Reihenfolge hergestellt (Tabelle 3).
      HINWEIS: Das Volumen Wasser sollte hinzugefügt werden, um das angegebene Gesamtreaktionsvolumen beizubehalten. Hier wurde 1 μg des Plasmids mit Enzymen im Reaktionsgemisch verdaut. Abhängig von der Plasmidkonzentration kann das Volumen des Plasmids im Reaktionsgemisch eingestellt werden.
   2. Vorsichtig mischen; dann nach unten drehen. Bei 37 °C in einem Heizblock oder Wasserthermostat 60 min inkubieren.
   3. Führen Sie eine Gelaufreinigung durch, die der Aufreinigung der PCR-Fragmente in Abschnitt 4 mit dem Gelextraktionskit ähnelt (siehe Materialtabelle).
2. pVAX1-F1 Linearisierung
   HINWEIS: pVAX1-F1 ist der Vektor, der aus der ersten Runde der Rekombination von pVAX1 (NdeI und HindIII) und Fragment 1 erhalten wurde. pVAX1-F2 ist der Vektor, der aus der Rekombination von pVAX1-F1 (NdeI) und Fragment 2 erhalten wird. pVAX1-F3 ist der Vektor, der aus der Rekombination von pVAX1-F2 (NdeI) und Fragment 3 erhalten wird. pVAX1-F4 ist der Vektor, der aus der Rekombination von pVAX1-F3 (NdeI) und Fragment 4 erhalten wird. pVAX1-F5 ist der Vektor, der aus der Rekombination von pVAX1-F4 (EcoRV und NtoI) und Fragment 5 erhalten wurde.
   1. Für jeden Vektor wird das Reaktionsgemisch separat bei Raumtemperatur in der angegebenen Reihenfolge hergestellt (Tabelle 3).
   2. Vorsichtig mischen; dann nach unten drehen. Bei 37 °C in einem Heizblock oder Wasserthermostat 60 min inkubieren.
   3. Führen Sie eine Gelaufreinigung durch, die der Aufreinigung der PCR-Fragmente in Abschnitt 4 mit dem Gelextraktionskit ähnelt (siehe Materialtabelle).

6. Subklonierung auf einen neuen Vektor

HINWEIS: Eine gute Klonierungseffizienz kann erreicht werden, wenn 50-200 ng Vektor und Inserts verwendet werden.

1. Richten Sie die nahtlose Klonierungs- und Assemblierungsreaktion von ExonArt ein (Tabelle 4). Das Gesamtreaktionsvolumen wird mit sterilisiertem deionisiertem H₂O auf 10 μl eingestellt und gemischt.
2. Inkubieren Sie die Reaktion in einem Thermocycler für 15-60 min bei 50 °C. Lagern Sie die Proben auf Eis.
   HINWEIS: Eine Verlängerung der Inkubation auf bis zu 60 Minuten kann die Montageeffizienz verbessern.
3. Tauen Sie DH5α chemisch kompetente Zellen auf Eis auf.
4. 10 μl des Assemblierungsprodukts werden in die zuständigen Zellen gegeben; Mischen Sie dann vorsichtig, indem Sie auf und ab pipettieren.
5. Die Mischung für 30 min auf Eis legen.
6. Hitzeschock bei 45 °C für 45 s und die Schläuche für 3 min auf Eis übertragen.
7. Geben Sie 900 μl SOC-Medium in das Röhrchen.
8. Schütteln Sie das Röhrchen bei 225 U/min für 1 h in einem 37 °C Schüttelinkubator.
9. Die Umwandlungsreaktion bei 6.000 × g für 2 min zentrifugieren. Den Überstand verwerfen und die Zellen in 100 μl frischem SOC-Medium resuspendieren.
10. Verteilen Sie die transformierte Zellsuspension auf einer separaten LB-Platte mit 50 μg/ml Kanamycin.
11. Alle Platten über Nacht bei 37 °C inkubieren. Wählen Sie einzelne isolierte Kolonien aus jeder Versuchsplatte aus.

7. Analyse der Transformatoren

1. Entnehmen Sie acht Kolonien in 20 μl LB-Medium mit 50 μg/ml Kanamycin.
2. Richten Sie die Kolonie-PCR-Reaktion ein und führen Sie die PCR durch (Tabelle 5).
   HINWEIS: Für die Kolonie-PCR-Reaktion für Fragment 1 sind die Primer P1 und P2 zu verwenden (siehe Ergänzende Datei 1); für Fragment 2 sind die Primer P3 und P4 zu verwenden (siehe Zusatzdatei 1); für Fragment 3 sind die Primer P5 und P6 zu verwenden (siehe Zusatzdatei 1); für Fragment 4 sind die Primer P7 und P8 zu verwenden (siehe Ergänzende Abbildung S2); für Fragment 5 die Primer P9 und P10 verwenden; und verwenden Sie die Primer P11 und P12, um Fragment 6 zu detektieren (siehe Ergänzende Abbildung S2).
3. Geben Sie 1 μl 6x DNA-Ladepuffer zu 5 μl des PCR-Produkts, mischen Sie und zentrifugieren Sie den Inhalt kurz.
4. Analysieren Sie die Ergebnisse mit 1% Agarose-Gelelektrophorese.
5. Wählen Sie eine positive Kolonie in 5 mL LB-Medium mit 50 μg/mL Kanamycin aus und züchten Sie über Nacht bei 37 °C.
6. Beziehen Sie das Plasmid mit einem Plasmid-DNA-Mini-Kit (siehe Materialtabelle) gemäß den Anweisungen des Herstellers.
7. Visualisieren Sie die Ergebnisse mit einer Elektrophorese von 1 % Agarose-Gel.

In dieser Arbeit stellen wir ein in vitro Rekombinationssystem vor, um überlappende DNA-Moleküle mit Hilfe des Reverse-Primers über kontinuierlich eingeführte Restriktionsstellen zu assemblieren und zu reparieren (Abbildung 1B). Dieses System ist ein einfaches und effizientes Verfahren, das die Präparation des linearen Vektors und der Insert-Fragmente umfasst, die durch PCR eingeführte Überhänge enthalten, wobei Primer geeignete 5'-Verlängerungssequenzen und Restriktionsstellen aufweisen; eine in vitro einfach isotherme Reaktion und die standardmäßige chemische Umwandlung von Rekombinationsprodukten in geeignete Wirtsbakterien; und die Selektion einer positiven Kolonie und die Gewinnung des rekombinanten Vektors für die nächste Runde der Klonierung. Um den pVAX1-PRRSV-Vektor Schritt für Schritt zu erhalten, müssen Restriktionsstellen an den Inserts und mehreren Klonierungsstellen des rekombinanten Vektors nicht vorhanden sein.

Da es schwierig ist, mit einer einzigen PCR vollständige und komplexe Gensequenzen zu erhalten, konnten Insert-Fragmente von PRRSV nur mit sechs PCR-Reaktionen amplifiziert werden (Abbildung 1C). Während der ersten Rekombinationsrunde wurde Fragment 1 von PRRSV erfolgreich in den pVAX1-Vektor eingefügt, und das neue rekombinante Plasmid mit den eingeführten Restriktionsstellen (NheI, eine Spaltstelle mit einem Enzym) erhielt den Namen pVAX1-F1 (Abbildung 1D). In der zweiten Rekombinationsrunde wurde der pVAX1-F1-Vektor mit dem Restriktionsenzym NheI linearisiert. Fragment 2 wurde erfolgreich in den pVAX1-F1-Vektor eingefügt, wodurch das rekombinante Plasmid pVAX1-F2 mit Restriktionsstellen (NheI, eine Spaltstelle mit einem Enzym) entstand (Abbildung 1D). Für die dritte Rekombinationsrunde, wie in Abbildung 1D gezeigt, wurde Fragment 3 erfolgreich in den pVAX1-F2-Vektor eingefügt, um pVAX1-F3 mit Restriktionsstellen (NheI, eine einzelne Enzymspaltstelle) zu erhalten. In der vierten Rekombinationsrunde erhielten wir den pVAX1-F4-Vektor, indem wir Fragment 4 mit den Restriktionsstellen EcoRV (eine einzelne Enzymspaltstelle) einführten. Dann wurde der pVAX1-F4-Vektor durch das Restriktionsenzym EcoRV und NotI linearisiert. Fragment 5 wurde in den pVAX1-F4-Vektor kloniert, um pVAX1-F5 mit Restriktionsstellen (NotI, eine einzelne Enzymspaltstelle) zu erhalten. Nach der letzten Rekombinationsrunde wurde der PRRSV-Überexpressionsvektor in voller Länge (pVAX1-PRRSV) erfolgreich erhalten (Supplemental File 1). Wie in Abbildung 1D dargestellt, wird das neue rekombinante Plasmid mit der kontinuierlichen Einführung von Fragmenten immer größer. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Kombination aus dem Hinzufügen geeigneter Restriktionsstellen und der Verwendung der Gibson-Assemblierungstechnik die effiziente Einführung von DNA-Fragmenten in den Vektor erreichen kann.

Abbildung 1: Organisation und Konstruktion von pVAX1-F6 (pVAX1-PRRSV) Vektoren durch homologe Rekombination. (A) Organisation des PRRSV-Genoms. ORF1b kodiert für RNA-abhängige RNA-Polymerase, RNA-Helikase- und mehrkernige Zink-Bindungsdomänen. Andere ORFs kodieren für membranassoziierte Glykoproteine (GP2, GP3, GP4 und GP5), das E-Protein, das Membranhüllprotein und das Nukleokapsidprotein. (B) Schematische Darstellung des Prozesses der Erzeugung des pVAX1-PRRSV-Vektors. (C) DNA-Agarose-Gel zeigt eine PCR-Amplifikation von Zielfragmenten. (D) Mit der Insertion von Fragmenten nimmt die Größe des rekombinanten Vektors allmählich zu. Abkürzungen: PRRSV = Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus; ORF = offener Leserahmen; GP = Glykoprotein; E = E-Protein; M = Membran-Hüllprotein; N = Nukleokapsid-Protein. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Tabelle 1: Aufbau und Bedingungen der reversen Transkription.

Tabelle 2: Aufbau und Bedingungen der PCR-Reaktion.

Tabelle 3: Linearisierungsgemisch aus pVAX1, pVAX1-F1, pVAX1-F2, pVAX1-F3, pVAX1-F4 und pVAX1-F5.

Tabelle 4: Nahtloser Aufbau der ExonArt-Klonierung und Assemblierungsreaktion.

Tabelle 5: Aufbau und Bedingungen der Kolonie-PCR.

Ergänzende Abbildung S1: Schematische Darstellung des Prozesses des Primer-Designs. Andere Primer-Designs wie P5 und P6 werden ebenfalls gezeigt. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung S2: Primer-Sequenzen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Datei 1: DNA-Sequenzierungsdaten. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Die Gibson-Assemblierungstechnik ist eine auf In-vitro-Rekombination basierende molekulare Klonierungsmethode zur Assemblierung von DNA-Fragmenten⁸. Diese Methode ermöglicht den Zusammenbau mehrerer DNA-Fragmente zu einem zirkulären Plasmid in einer isothermen Reaktion mit einem einzigen Röhrchen. Eines der Hindernisse für die Gibson-Assemblierungstechnik ist jedoch die Gewinnung langer Fragmente aus cDNA. Die langen Fragmente sind aus vielen Gründen schwer genau zu vervielfältigen. Zum Beispiel sind Primer bei langen Verlängerungszeiten leichter falsch zusammenzufügen, cDNA ist möglicherweise nicht von guter Qualität oder GC-reiche Regionen stoppen die DNA-Polymerisation. Wenn das Fragment in voller Länge nicht einfach mittels PCR aus cDNA gewonnen werden kann, muss das Fragment in voller Länge für die Amplifikation in mehrere Fragmente aufgeteilt werden. Mit zunehmender Anzahl und Länge der eingefügten DNA-Fragmente nehmen jedoch auch die Effizienz und die positiven Klone aus dem homologen Rekombinationsassay signifikant ab. Daher haben wir eine alternative Lösung ausprobiert, indem wir geeignete Restriktionsstellen am 3'-Ende der Einsätze eingeführt haben. Dann könnten wir den Vektor linearisieren und die DNA-Fragmente durch die homologe Rekombinationstechnologie nacheinander mit dem Vektor verbinden und die unerwünschten Restriktionsstellen über die homologe Rekombinationsreaktion eliminieren.

Als einer der wirtschaftlich bedeutendsten Krankheitserreger auf den Weltmärkten hat PRRSV in den letzten 30 Jahren immer die Aufmerksamkeit der Forscher auf sich gezogen 10,21,22. Es handelt sich um ein positivsträngiges RNA-Virus mit einer Länge von etwa 15 kb, und das lange DNA-Fragment kann nicht einfach aus cDNA amplifiziert werden. Um zu untersuchen, ob diese Methode für die Klonierung langer Fragmente verwendet werden kann, haben wir das PRRSV als Template für die Klonierung von Genomen in voller Länge verwendet. In dieser Studie teilten wir die Sequenz in voller Länge in sechs Fragmente auf und fügten dem reversen Primer geeignete Restriktionsstellen hinzu, wodurch wir sechs Fragmente durch PCR erhielten. Anschließend gelang es uns, den pVAX1-PRRSV-Expressionsvektor in voller Länge durch mehrere Runden von Rekombinationsreaktionen zu erhalten. Darüber hinaus kann der konstruierte PRRSV-Expressionsvektor als Vorlage für die in vitro Transkription dienen, um gekapselte RNAs für die Transfektion oder mRNA-Impfstoffforschung zu erhalten. In der Zwischenzeit kann das konstruierte mRNA-Virusplasmid für das Chargenscreening von antiviralen Naturstoffen in vitro durch molekulare Interaktionstechniken, wie z. B. die Oberflächenplasmonenresonanz^23,24, verwendet werden. Das pVAX1-Plasmid erfüllt die Anforderungen, da für einen in vitro Transkriptionsassay ein Plasmid mit hoher Kopienzahl und einem T7-Promotor erforderlich ist. Außerdem kann das pVAX1-PRRSV-Plasmid, das den CMV-Promotor enthält, zur viralen Genomexpression in BHK-21-Zellen transfiziert werden^25,26.

Zusammenfassend zeigen wir mit diesem Protokoll, dass lange Gene in voller Länge in mehrere Fragmente unterteilt werden können, die durch PCR-Amplifikation gewonnen werden. Es ist wichtig, dass die reversen Primer in die entsprechenden Restriktionsstellen eingeführt werden, so dass der Genexpressionsvektor in voller Länge durch mehrere Runden von Rekombinationsreaktionen erhalten werden kann. Diese Methode kann für Gene in voller Länge verwendet werden, die nicht direkt durch eine einzige PCR gewonnen werden können, oder für Gene in voller Länge, die nicht durch homologe Rekombination mehrerer Inserts gewonnen werden können. Daher ist dieser Ansatz eine wichtige Ergänzung zur Gibson-Assemblierungstechnik, wir gehen davon aus, dass er in großem Umfang für die Klonierung langer DNA-Fragmente und die Konstruktion von Fusionsgenen eingesetzt werden kann.

Die Autoren erklären, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Diese Arbeit wurde durch die finanzielle Unterstützung der Promotionsanbahnungsmittel unterstützt, die von der China West Normal University (Nr. 20E059) zur Verfügung gestellt wurden.