Бесшовный подход к клонированию векторов экспрессии вируса репродуктивного и респираторного синдрома свиней

В данной работе мы представляем протокол для получения вектора экспрессии pVAX1-PRRSV путем введения подходящих сайтов рестрикции на 3'-конце вставок. Мы можем линеаризовать вектор и присоединять фрагменты ДНК к вектору один за другим с помощью технологии гомологичной рекомбинации.

Построение векторов экспрессии генов является важной составляющей лабораторной работы в области экспериментальной биологии. Благодаря таким техническим достижениям, как сборка Gibson, векторное построение становится относительно простым и эффективным. Однако, когда полноразмерный геном вируса репродуктивного и респираторного синдрома свиней (РРСС) не может быть легко амплифицирован с помощью одной полимеразной цепной реакции (ПЦР) из кДНК или трудно получить полноразмерный вектор экспрессии генов путем гомологичной рекомбинации нескольких вставок in vitro, текущий метод сборки Gibson не достигает этой цели.

Следовательно, мы поставили перед собой цель разделить геном РРСС на несколько фрагментов и ввести соответствующие сайты рестрикции в обратный праймер для получения фрагментов, амплифицированных методом ПЦР. После присоединения предыдущего фрагмента ДНК к вектору с помощью технологии гомологичной рекомбинации новый вектор приобретал сайт расщепления фермента рестрикции. Таким образом, мы можем линеаризовать вектор, используя вновь добавленный сайт расщепления фермента, и ввести следующий фрагмент ДНК ниже по течению от вышестоящего фрагмента ДНК.

Введенный сайт расщепления фермента рестрикции на 3'-конце предшествующего фрагмента ДНК будет уничтожен, и новый сайт расщепления будет введен в 3'-конец нижестоящего фрагмента ДНК. Таким образом, мы можем присоединять фрагменты ДНК к вектору один за другим. Этот метод применим для успешного построения вектора экспрессии РРСС и является эффективным методом для сборки большого количества фрагментов в вектор экспрессии.

Молекулярное клонирование, являющееся важным методом создания основанных на ДНК экспериментальных инструментов для экспрессии экспрессии в прокариотических и эукариотических клетках, является очень важным компонентом экспериментальной биологии. Молекулярное клонирование включает в себя четыре процесса: получение ДНК вкладыша, лигирование вкладыша в соответствующий вектор, превращение рекомбинантного вектора в Escherichia coli (E. coli) и идентификацию положительных^{клонов.} До сих пор было использовано несколько методов соединения молекул ДНК с использованием ферментов^{рестрикции 2,3} и ПЦР-опосредованной рекомбинации ^4,5,6. Гомологичная рекомбинация, известная как технология бесшовного клонирования, представляет собой группу методов клонирования, которые позволяют последовательно и без шрамов встраивать один или несколько фрагментов ДНК в вектор. Эта технология включает в себя клонирование, независимое от последовательности и лигирования (SLIC), экстракт бесшовного клонирования с лигированием (SLiCE), In-Fusion и сборку Gibson. Он использует экзонуклеазу для разрушения одной нити вкладыша и вектор для генерации когезивных концов, а также для репарации in vivo или рекомбинации in vitro для ковалентного соединения вкладыша с вектором путем образования фосфодиэфирных связей. Возможность присоединить одну вставку к вектору в любой последовательности без каких-либо шрамов очень привлекательна. Кроме того, технология имеет возможность соединять 5-10 фрагментов в заранее определенном порядке без ограничений по последовательности.

Являясь одним из многих методов рекомбинантной ДНК, метод сборки Гибсона, в настоящее время наиболее эффективный метод клонирования ^7,8, представляет собой надежный и элегантный метод на основе экзонуклеазы для бесшовной сборки одного или нескольких линеаризованных фрагментов ДНК. Реакцию сборки Гибсона проводят в изотермических условиях с использованием смеси трех ферментов, а именно: 5'-экзонуклеазы, высокоточной полимеразы и термостабильной ДНК-лигазы. Одноцепочечные 3'-выступы, создаваемые 5'-3' экзонуклеазой, способствуют отжигу фрагментов, которые имеют общую комплементарность на одном конце. Высокоточная полимераза эффективно заполняет пробелы в отожженных одноцепочечных областях путем добавления dNTP, а термостабильная ДНК-лигаза запечатывает зазубрины, образуя совместные молекулы ДНК⁸. Следовательно, этот технический метод широко используется для создания векторов экспрессии генов.

Репродуктивно-респираторный синдром свиней (РРСС) — это вирусное заболевание, которое приводит к нарушению репродуктивной функции и дыхательной недостаточности у свиней, вызванным РРСС в возрасте⁹ лет. Синдром проявляется в виде лихорадки, анорексии, пневмонии, вялости, депрессии и респираторного дистресса. Кроме того, при некоторых эпидемиях наблюдались клинические признаки, в том числе красно-синее обесцвечивание ушей. Являясь членом семейства артеривирусов, РРСС широко передается в страны-производители свинины при прямом контакте и обмене жидкостями, включая мочу, молозиво и слюну. Из-за распространения РРСС в Соединенных Штатах общие экономические потери свиноводческой отрасли оцениваются примерно в 664 миллиона долларов в год, исходя из масштаба разведения 5,8 миллиона свиноматок и 110 миллионов ^{свиней10,11}. Отчет Службы инспекции здоровья животных и растений показывает, что у 49,8% невакцинированных свиней наблюдается присутствие РРСС в сыворотке^{крови 12}, а низкие уровни РРСС у инфицированных свиней выводятся через слюну, носовые выделения, мочу и фекалии13. Для борьбы с распространением РРСС 14,15,16 были реализованы различные стратегии. В дополнение к процедурам элиминации для создания полностью вирус-отрицательных популяций или улучшения биобезопасности и управления, введение вакцин является эффективным средством борьбы с РРСС.

РРСС представляет собой оболочечную одноцепочечную РНК-вирус с положительной смысловой РНК длиной около 15 килооснований (кб). Геном РРСС состоит по меньшей мере из 10 открытых рамок считывания (ORF), короткой 5' нетранслируемой области (5' UTR) и поли(A) хвоста на 3'-конце (рис. 1A)¹⁷. Геном вируса с отрицательной цепью РНК незаразен, в то время как геном вирусов с положительной цепью РНК является инфекционным. Существуют две основные стратегии трансфекции РНК и ДНК для получения потомства вируса¹⁸. Тем не менее, клонирование полноразмерного фрагмента, соответствующего геному РНК, имеет решающее значение для создания инфекционных клонов. Из-за длинного и сложного характера генома РРСС полный геном не может быть легко получен с помощью ПЦР за один раз. Кроме того, хотя искусственный синтез генов РРСС является эффективным решением, синтез длинных фрагментов часто обходится дорого. Следовательно, для получения полноразмерного вектора экспрессии РРСС мы попытались создать его методом гомологичной рекомбинации множественных вставок^19,20. К сожалению, нам не удалось получить полноразмерный вектор экспрессии генов. Поэтому в данном исследовании мы добавили соответствующие сайты рестрикции к обратному праймеру и успешно получили вектор экспрессии pVAX1-PRRSV с помощью нескольких раундов гомологичной рекомбинационной реакции. Кроме того, этот метод может также обеспечить делецию или мутацию генов-мишеней и эффективно присоединить большое количество фрагментов ДНК к вектору экспрессии.

1. Подготовка матрицы гена РРСС

1. Разморозьте запас вируса в 1 мл реагента для экстракции РНК (см. Таблицу материалов).
2. Добавьте 0,2 мл хлороформа и тщательно перемешайте. Выдерживать 3 мин.
3. Центрифугируйте смесь в течение 15 мин при 12 000 × г при 4 °C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Смесь делится на три фазы, а именно: бесцветную водную фазу, интерфазу и красную фенол-хлороформную фазу.
4. Пипетируйте бесцветную водную воду в фазе и переложите ее в новую пробирку.
5. Тщательно перемешайте водную фазу с 0,5 мл изопропанола и инкубируйте в течение 10 минут при 4 °C.
6. Центрифугировать в течение 10 мин при 12 000 × г при 4 °C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: На дне пробирки находится белый осадок РНК.
7. С помощью микропипетки удалите надосадочную жидкость из пробирки.
8. Добавьте 1 мл 75% этанола для ресуспендирования гранул и кратковременно перемешайте.
9. Центрифуга в течение 5 мин при 7 500 × г при 4 °C. С помощью микропипетки удалите надосадочную жидкость из пробирки.
10. Высушите РНК в течение 5 минут, добавьте 20-50 мкл воды, не содержащей РНКазы, чтобы ресуспендировать РНК, и тщательно перемешайте.
11. Приступайте к выполнению обратной транскрипции; настроить реакции для выполнения обратной транскрипции, как показано в таблице 1.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы обеспечить успешную обратную транскрипцию, используйте высококачественные шаблоны РНК.
12. Полученную кДНК использовать для ПЦР или хранить при температуре -20 °С.

2. Дизайн праймера для ПЦР

1. Проектирование переднего праймера
   1. Откройте программу и выберите «Новый файл ДНК».
   2. Вставьте последовательность гена PRRSV (GenBank: FJ548852.1) из NCBI в программное обеспечение. Нажмите кнопку OK , чтобы создать файлы последовательности.
   3. Проанализируйте последовательность и отметьте стыки фрагментов. Разработайте прямую специфическую последовательность праймера фрагментов. В большинстве случаев предпочтительная температура плавления (Tm) составляет от 55 °C до 62 °C, а содержание GC составляет 40-60%.
   4. Нажмите на Праймеры и выберите Добавить праймер.
   5. Вставьте конкретную последовательность и добавьте перекрывающиеся последовательности вектора к первым 5'-нуклеотидам праймера конкретной последовательности. Рядом с каждым соединением выберите 20-40.о., который будет служить областью перекрытия между двумя соседними фрагментами.
   6. Назовите передний праймер, содержащий выступы и конкретную последовательность (см. дополнительный рисунок S1).
   7. Нажмите на кнопку Добавить праймер к шаблону.
2. Проектирование обратной грунтовки
   1. Проанализируйте последовательность и отметьте стыки фрагментов в программном обеспечении. Разработайте обратную специфическую последовательность праймера из фрагментов.
   2. Нажмите на Праймеры и выберите Добавить праймер.
   3. Вставьте определенную последовательность и добавьте сайт рестрикции к первым 5'-нуклеотидам праймера специфической последовательности.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Добавленные сайты ограничения должны отсутствовать во фрагменте вставки и векторе, за исключением множественных сайтов клонирования.
   4. Добавьте 20-40.о. нависающие последовательности векторов к первым 5'-нуклеотидам сайта рестрикции.
   5. Назовите обратный капсюль, содержащий выступы и конкретную последовательность (см. дополнительный рисунок S1).
   6. Нажмите на кнопку Добавить праймер к шаблону.

3. ПЦР для амплификации фрагментов

1. Настройте шесть отдельных реакций ПЦР (табл. 2): для фрагмента 1 используйте праймеры P1 и P2 (см. дополнительный рисунок S2); для фрагмента 2 используйте праймеры P3 и P4 (см. дополнительный рисунок S2); для фрагмента 3 используйте капсюли P5 и P6 (см. дополнительный рисунок S2); для фрагмента 4 использовать капсюли P7 и P8 (см. дополнительный рисунок S2); для фрагмента 5 использовать капсюли Р9 и Р10; и использовать праймеры P11 и P12 для амплификации фрагмента 6 (см. дополнительный рисунок S2).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Разморозьте, смешайте и кратко центрифугируйте каждый компонент перед использованием.
2. Запустите ПЦР по трехэтапному протоколу, показанному в таблице 2.
3. Добавьте 1 мкл 6-кратного буфера загрузки ДНК к 5 мкл продукта ПЦР, перемешайте и кратковременно центрифугируйте содержимое.
4. Анализируйте образцы с помощью электрофореза в 1% агарозном геле.

4. Очистка фрагментов ПЦР

ПРИМЕЧАНИЕ: Очистка продуктов ПЦР от геля с помощью набора для экстракции геля (см. Таблицу материалов) важна для векторного конструирования.

1. Добавьте 9 мкл 6-кратного буфера загрузки ДНК к 45 мкл продуктов ПЦР, перемешайте и кратковременно центрифугируйте содержимое.
2. Проведите электрофорез 1% агарозного геля/голдвью для отделения фрагментов ДНК.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Не используйте повторно рабочий буфер TAE, так как его значение pH повлияет на восстановление фрагмента ДНК.
3. После достаточного разделения полос используйте острый скальпель, чтобы аккуратно вырезать полосы ДНК.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Минимизируйте размер гелевого ломтика, обрезав излишки агарозы.
4. Взвесьте гелевый ломтик в чистой микроцентрифужной пробирке объемом 1,5 мл, добавьте равный объем связующего буфера к гелевому ломтику (например, 0,3 мл на ломтик 0,3 г) и инкубируйте при 60 °C в течение 7 минут.
5. Вставьте мини-колонку в пробирку для сбора объемом 2 мл. Добавьте 700 мкл раствора ДНК/агарозы с шага 4.4 в мини-колонку.
6. Центрифуга при 10 000 × г в течение 1 мин при комнатной температуре. Выбросьте фильтрат и повторно используйте пробирку для сбора.
7. Добавьте 300 мкл связующего буфера и центрифугуйте при 13 000 × г в течение 1 минуты при комнатной температуре. Выбросьте фильтрат и повторно используйте пробирку для сбора.
8. Добавьте 700 μL промывочного буфера и центрифугуйте в дозе 13 000 × г в течение 1 минуты при комнатной температуре. Выбросьте фильтрат и повторно используйте пробирку для сбора.
9. Вращайте пустую мини-колонку в течение 2 минут на максимальной скорости, чтобы высушить матрицу колонны. Поместите мини-колонку в чистую микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл.
10. Добавьте 20 μL деионизированной воды непосредственно в центр мембраны колонны и оставьте при комнатной температуре на 2 минуты. Центрифуга при скорости 13 000 × g в течение 1 мин.
11. Храните ДНК при температуре -20 °C.

5. Подготовка линеаризованного вектора

ПРИМЕЧАНИЕ: После подготовки плазмиды выбранные ферменты можно использовать для ее разрезания. Длительное переваривание или переваривание с помощью двух ферментов имеет решающее значение для обеспечения переваривания всей ДНК. Это позволит снизить количество ложноположительных клонов в последующих экспериментах.

1. Линеаризация pVAX1
   1. Приготовьте реакционную смесь при комнатной температуре в указанном порядке (табл. 3).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Объем воды следует добавить, чтобы сохранить указанный общий объем реакции. Здесь 1 г плазмиды расщепляли ферментами в реакционной смеси. В зависимости от концентрации плазмиды объем плазмиды может быть скорректирован в реакционной смеси.
   2. Аккуратно перемешайте; Затем вращаем вниз. Инкубировать при температуре 37 °C в тепловом блоке или водяном термостате в течение 60 минут.
   3. Проводят очистку гелем аналогично очистке фрагментов ПЦР в разделе 4 с помощью набора для экстракции геля (см. Таблицу материалов).
2. Линеаризация pVAX1-F1
   Примечание: pVAX1-F1 является вектором, полученным в результате рекомбинации первого раунда pVAX1 (NdeI и HindIII) и фрагмента 1. pVAX1-F2 — вектор, полученный в результате рекомбинации раунда pVAX1-F1 (NdeI) и фрагмента 2. pVAX1-F3 — вектор, полученный в результате рекомбинации раунда pVAX1-F2 (NdeI) и фрагмента 3. pVAX1-F4 — вектор, полученный в результате рекомбинации раунда pVAX1-F3 (NdeI) и фрагмента 4. pVAX1-F5 — вектор, полученный в результате рекомбинации раунда pVAX1-F4 (EcoRV и NtoI) и фрагмента 5.
   1. Для каждого вектора готовьте реакционную смесь отдельно при комнатной температуре в указанном порядке (табл. 3).
   2. Аккуратно перемешайте; Затем вращаем вниз. Инкубировать при температуре 37 °C в тепловом блоке или водяном термостате в течение 60 минут.
   3. Проводят очистку гелем аналогично очистке фрагментов ПЦР в разделе 4 с помощью набора для экстракции геля (см. Таблицу материалов).

6. Субклонирование на новый вектор

ПРИМЕЧАНИЕ: Хорошая эффективность клонирования может быть достигнута при использовании 50-200 нг вектора и вкладышей.

1. Настройте реакцию бесшовного клонирования и сборки ExonArt (табл. 4). Отрегулируйте общий объем реакции до 10 мкл с помощью стерилизованного деионизированного H₂O и перемешайте.
2. Инкубируйте реакцию в термоамплификаторе в течение 15-60 мин при 50 °C. Храните образцы на льду.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Увеличение продолжительности инкубации до 60 минут может повысить эффективность сборки.
3. Разморозьте химически компетентные клетки DH5α на льду.
4. Добавьте 10 μL сборочного продукта в соответствующие ячейки; Затем аккуратно перемешайте, пипетируя вверх и вниз.
5. Выложите смесь на лед на 30 минут.
6. Тепловой шок при 45 °C в течение 45 с и перенос трубок на лед на 3 мин.
7. Добавьте в пробирку 900 μл среды SOC.
8. Встряхивайте пробирку при 225 об/мин в течение 1 ч в встряхивающем инкубаторе при температуре 37 °C.
9. Центрифугируйте реакцию превращения при 6 000 × г в течение 2 мин. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клетки в 100 мкл свежей среды SOC.
10. Распределите трансформированную клеточную суспензию на отдельную ЛБ-пластину с 50 мкг/мл канамицина.
11. Инкубируйте все планшеты в течение ночи при температуре 37 °C. Выберите отдельные изолированные колонии из каждой экспериментальной пластины.

7. Анализ трансформантов

1. Соберите восемь колоний в 20 мкл LB среды, содержащей 50 мкг/мл канамицина.
2. Настройте реакцию ПЦР на колонию и запустите ПЦР (табл. 5).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для ПЦР-реакции колонии для фрагмента 1 используйте праймеры P1 и P2 (см. Дополнительный файл 1); для фрагмента 2 использовать праймеры P3 и P4 (см. Дополнительный файл 1); для фрагмента 3 использовать капсюли P5 и P6 (см. Дополнительный файл 1); для фрагмента 4 использовать капсюли P7 и P8 (см. дополнительный рисунок S2); для фрагмента 5 использовать капсюли Р9 и Р10; и использовать праймеры P11 и P12 для обнаружения фрагмента 6 (см . дополнительный рисунок S2).
3. Добавьте 1 мкл 6-кратного буфера для загрузки ДНК в 5 мкл продукта ПЦР, перемешайте и кратковременно центрифугируйте содержимое.
4. Проанализируйте результаты с помощью электрофореза в 1% агарозном геле.
5. Выберите одну положительную колонию в 5 мл LB среды, содержащей 50 мкг/мл канамицина, и выращивайте в течение ночи при 37 °C.
6. Получите плазмиду с помощью мини-набора для плазмидной ДНК (см. Таблицу материалов) в соответствии с инструкциями производителя.
7. Визуализируйте результаты с помощью электрофореза в 1% агарозном геле.

В данной работе мы представляем систему рекомбинации in vitro для сборки и восстановления перекрывающихся молекул ДНК с использованием обратного праймера с помощью постоянно вводимых сайтов рестрикции (рис. 1B). Эта система представляет собой простую и эффективную процедуру, включающую получение линейного вектора и фрагментов вставки, содержащих выступы, введенные методом ПЦР, с праймерами, имеющими соответствующие 5'-последовательности удлинения и сайты рестрикции; одиночная изотермическая реакция in vitro и стандартное химическое превращение продуктов рекомбинации в пригодные бактерии-хозяева; а также отбор положительной колонии и получение рекомбинантного вектора для следующего раунда клонирования. Для поэтапного получения вектора pVAX1-PRRSS в вставках и множественных сайтах клонирования рекомбинантного вектора должны отсутствовать сайты рестрикции.

Поскольку с помощью одной ПЦР трудно получить полноразмерные и сложные последовательности генов, вставные фрагменты РРСС могут быть амплифицированы только с помощью шести ПЦР-реакций (рис. 1C). Во время первого раунда рекомбинации фрагмент 1 РРСС был успешно вставлен в вектор pVAX1, а новая рекомбинантная плазмида с введенными сайтами рестрикции (NheI, сайт расщепления одного фермента) была названа pVAX1-F1 (рис. 1D). На втором раунде рекомбинации вектор pVAX1-F1 линеаризовался ферментом рестрикции NheI. Фрагмент 2 был успешно вставлен в вектор pVAX1-F1, в результате чего образовалась рекомбинантная плазмида pVAX1-F2 с сайтами рестрикции (NheI, сайт расщепления одного фермента) (рис. 1D). Для третьего раунда рекомбинации, как показано на рисунке 1D, фрагмент 3 был успешно вставлен в вектор pVAX1-F2 для получения pVAX1-F3 с сайтами рестрикции (NheI, сайт расщепления одного фермента). В четвертом раунде рекомбинации мы получили вектор pVAX1-F4 путем введения фрагмента 4 с сайтами рестрикции EcoRV (сайт расщепления одного фермента). Затем вектор pVAX1-F4 линеаризовали ферментом рестрикции EcoRV и NotI. Фрагмент 5 клонировали в вектор pVAX1-F4 для получения pVAX1-F5 с сайтами рестрикции (NotI, сайт расщепления одного фермента). После последнего раунда рекомбинации был успешно получен полноразмерный вектор сверхэкспрессии РРСС (pVAX1-PRRSV) (Дополнительный файл 1). Как показано на рисунке 1D, новая рекомбинантная плазмида становится все больше и больше по мере непрерывного введения фрагментов. Таким образом, эти результаты указывают на то, что комбинация добавления соответствующих сайтов рестрикции и использования метода сборки Гибсона может обеспечить эффективное внедрение фрагментов ДНК в вектор.

Рисунок 1: Организация и построение векторов pVAX1-F6 (pVAX1-PRRSV) путем гомологичной рекомбинации. (А) Организация генома РРСС. ORF1b кодирует РНК-зависимую РНК-полимеразу, РНК-геликазу и многоядерные цинк-связывающие домены. Другие ORF кодируют мембраноассоциированные гликопротеины (GP2, GP3, GP4 и GP5), белок E, белок мембранной оболочки и белок нуклеокапсида. (B) Принципиальная схема процесса генерации вектора pVAX1-PRRSV. (C) ДНК-агарозный гель демонстрирует ПЦР-амплификацию фрагментов мишени. (D) При введении фрагментов размер рекомбинантного вектора постепенно увеличивается. Сокращения: РРСС = вирус репродуктивного и респираторного синдрома свиней; ORF = открытая рамка для чтения; GP = гликопротеин; Е = белок Е; M = белок мембранной оболочки; N = нуклеокапсидный белок. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Таблица 1: Настройка и условия обратной транскрипции.

Таблица 2: Настройка и условия проведения ПЦР-реакции.

Таблица 3: Линеаризационная смесь pVAX1, pVAX1-F1, pVAX1-F2, pVAX1-F3, pVAX1-F4 и pVAX1-F5.

Таблица 4: Бесшовное клонирование ExonArt и настройка реакции сборки.

Таблица 5: Установка и условия ПЦР Colony.

Дополнительный рисунок S1: Схема процесса проектирования грунтовки. Также показаны другие конструкции грунтов, такие как P5 и P6. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок S2: Последовательности праймеров. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный файл 1: Данные секвенирования ДНК. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Метод сборки Гибсона представляет собой метод молекулярного клонирования на основе рекомбинации in vitro для сборки фрагментов ДНК⁸. Этот метод позволяет собрать несколько фрагментов ДНК в кольцевую плазмиду в ходе изотермической реакции в одной пробирке. Однако одним из препятствий для метода сборки Гибсона является получение длинных фрагментов из кДНК. Длинные фрагменты трудно точно амплифицировать по многим причинам. Например, праймеры легче не совпадают в течение длительного времени, кДНК может быть плохого качества, или участки, богатые GC, остановят полимеризацию ДНК. Когда полноразмерный фрагмент не может быть легко получен из кДНК с помощью ПЦР, полноразмерный фрагмент необходимо разделить на несколько фрагментов для амплификации. Однако по мере увеличения количества и длины вставленных фрагментов ДНК эффективность и положительные клоны из анализа гомологичной рекомбинации также будут значительно снижаться. Поэтому мы попробовали альтернативное решение, внедрив подходящие места ограничения на 3'-конце пластин. Затем мы могли линеаризовать вектор и соединить фрагменты ДНК в вектор один за другим с помощью технологии гомологичной рекомбинации и устранить нежелательные сайты рестрикции с помощью реакции гомологичной рекомбинации.

Являясь одним из наиболее экономически значимых патогенов на мировых рынках, РРСС всегда привлекал внимание исследователей в течение последних 30^лет. Это вирус с положительной цепью РНК, длиной около 15 кб, и длинный фрагмент ДНК не может быть легко амплифицирован из кДНК. Следовательно, чтобы выяснить, можно ли использовать этот метод для клонирования длинных фрагментов, мы использовали РРСС в качестве матрицы для клонирования полноразмерного генома. В этом исследовании мы разделили полноразмерную последовательность на шесть фрагментов и добавили соответствующие сайты рестрикции к обратному праймеру, получив шесть фрагментов методом ПЦР. Затем мы успешно получили полноразмерный вектор экспрессии pVAX1-PRRSV с помощью нескольких раундов реакций рекомбинации. Кроме того, сконструированный вектор экспрессии РРСС может служить матрицей для транскрипции in vitro с целью получения кэпированных РНК для исследования трансфекции или мРНК-вакцины. Между тем, сконструированная плазмида вируса мРНК может быть использована для пакетного скрининга противовирусных природных соединений in vitro с помощью методов молекулярного взаимодействия, таких как поверхностный плазмонный резонанс^23,24. Плазмида pVAX1 соответствует требованиям, поскольку для анализа транскрипции in vitro требуется плазмида с высоким содержанием копий и промотором T7. Кроме того, плазмида pVAX1-PRRSV, содержащая промотор ЦМВ, может быть трансфицирована в клетки BHK-21 для экспрессии вирусного генома^25,26.

Таким образом, с помощью этого протокола мы демонстрируем, что длинные полноразмерные гены могут быть разделены на несколько фрагментов, полученных с помощью ПЦР-амплификации. Важно, чтобы обратные праймеры вводились в соответствующие сайты рестрикции, чтобы можно было получить полноразмерный вектор экспрессии генов с помощью нескольких раундов реакций рекомбинации. Этот метод может быть использован для полноразмерных генов, которые не могут быть получены непосредственно с помощью одной ПЦР, или для полноразмерных генов, которые не могут быть получены путем гомологичной рекомбинации нескольких вставок. Таким образом, этот подход является важным дополнением к методу сборки Гибсона, мы ожидаем, что он может быть широко использован для клонирования длинных фрагментов ДНК и конструирования генов слияния.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Эта работа была поддержана финансовой поддержкой фондов для инициирования докторских исследований, предоставленных Китайским западным педагогическим университетом (No 20E059).