Uma abordagem de clonagem perfeita para a construção do vetor de expressão do vírus da síndrome reprodutiva e respiratória suína

Aqui, apresentamos um protocolo para obter o vetor de expressão pVAX1-PRRSV introduzindo locais de restrição adequados na extremidade 3' das inserções. Podemos linearizar o vetor e unir fragmentos de DNA ao vetor um por um por meio da tecnologia de recombinação homóloga.

A construção de vetores de expressão gênica é um componente importante do trabalho de laboratório em biologia experimental. Com avanços técnicos como o Gibson Assembly, a construção vetorial torna-se relativamente simples e eficiente. No entanto, quando o genoma completo do Vírus da Síndrome Reprodutiva e Respiratória Suína (PRRSV) não pode ser facilmente amplificado por uma única reação em cadeia da polimerase (PCR) do cDNA, ou é difícil adquirir um vetor de expressão gênica de comprimento total por recombinação homóloga de múltiplas inserções in vitro, a atual técnica de montagem de Gibson não consegue atingir esse objetivo.

Consequentemente, nosso objetivo foi dividir o genoma do PRRSV em vários fragmentos e introduzir locais de restrição apropriados no primer reverso para a obtenção de fragmentos amplificados por PCR. Depois de unir o fragmento de DNA anterior ao vetor por tecnologia de recombinação homóloga, o novo vetor adquiriu o local de clivagem da enzima de restrição. Assim, podemos linearizar o vetor usando o local de clivagem enzimática recém-adicionado e introduzir o próximo fragmento de DNA a jusante do fragmento de DNA a montante.

O local de clivagem da enzima de restrição introduzido na extremidade 3' do fragmento de DNA a montante será eliminado e um novo local de clivagem será introduzido na extremidade 3' do fragmento de DNA a jusante. Desta forma, podemos unir fragmentos de DNA ao vetor um por um. Este método é aplicável para construir com sucesso o vetor de expressão PRRSV e é um método eficaz para montar um grande número de fragmentos no vetor de expressão.

Como uma técnica essencial para construir ferramentas experimentais baseadas em DNA para expressão em células procarióticas e eucarióticas, a clonagem molecular é um componente muito importante da biologia experimental. A clonagem molecular envolve quatro processos: a aquisição do DNA da inserção, a ligação da inserção no vetor apropriado, a transformação do vetor recombinante em Escherichia coli (E. coli) e a identificação dos clones positivos¹. Até agora, vários métodos foram adotados para unir moléculas de DNA usando enzimas de restrição ^2,3 e recombinação mediada por PCR ^4,5,6. A recombinação homóloga, conhecida como tecnologia de clonagem contínua, é o grupo de métodos de clonagem que permite a inserção independente de sequência e sem cicatrizes de um ou mais fragmentos de DNA em um vetor. Essa tecnologia inclui clonagem independente de sequência e ligação (SLIC), Extrato de Clonagem de Ligação Contínua (SLiCE), In-Fusion e Gibson Assembly. Ele emprega uma exonuclease para degradar uma fita da inserção e um vetor para gerar extremidades coesivas e, seja reparo in vivo ou recombinação in vitro para unir covalentemente a inserção ao vetor, formando ligações fosfodiéster. A capacidade de unir uma única inserção a um vetor em qualquer sequência sem cicatrizes é muito atraente. Além disso, a tecnologia tem a capacidade de unir de 5 a 10 fragmentos em uma ordem predeterminada sem restrições de sequência.

Como uma das muitas técnicas de DNA recombinante, a técnica de montagem de Gibson, atualmente o método de clonagem mais eficaz ^7,8, é um método robusto e elegante baseado em exonuclease para montar um ou vários fragmentos de DNA linearizados sem problemas. A reação de montagem de Gibson é realizada em condições isotérmicas usando uma mistura de três enzimas, a saber, exonuclease 5', polimerase de alta fidelidade e uma DNA ligase termoestável. As saliências de fita simples de 3 'criadas pela exonuclease 5'-3' contribuem para o recozimento de fragmentos que compartilham complementaridade em uma extremidade. A polimerase de alta fidelidade preenche efetivamente as lacunas nas regiões de fita simples recozidas adicionando dNTPs, e a DNA ligase termoestável sela os cortes para formar moléculas de DNA conjuntas⁸. Assim, este método técnico tem sido amplamente utilizado para a construção de vetores de expressão gênica.

A síndrome reprodutiva e respiratória suína (PRRS) é uma doença viral que leva ao comprometimento reprodutivo e insuficiência respiratória em suínos causada pelo PRRSV em qualquer idade^{de 9} anos. A síndrome se manifesta como febre, anorexia, pneumonia, letargia, depressão e dificuldade respiratória. Além disso, sinais clínicos, incluindo descoloração vermelha/azul das orelhas, foram observados em algumas epidemias. Como membro da família arterivírus, o PRRSV é amplamente transmitido aos países produtores de carne suína por contato direto e troca de fluidos, incluindo urina, colostro e saliva. Devido à disseminação do PRRSV nos Estados Unidos, as perdas econômicas totais da indústria de suínos foram estimadas em aproximadamente US$ 664 milhões por ano, com base na escala de criação de 5,8 milhões de porcas e 110 milhões de suínos^10,11. O relatório do Serviço de Inspeção de Saúde Animal e Vegetal mostra que 49,8% dos suínos não vacinados apresentam a presença de PRRSV no soro¹² e baixos níveis de PRRSV em suínos infectados são excretados pela saliva, secreções nasais, urina e fezes¹³. Múltiplas estratégias foram implementadas para controlar a propagação do PRRSV 14,15,16. Além dos procedimentos de eliminação para criar populações completamente negativas para o vírus ou melhorar a biossegurança e o manejo, a administração de vacinas é um meio eficaz de controlar a PRRS.

O PRRSV é um vírus de RNA envelopado, de fita simples e de sentido positivo com um comprimento de aproximadamente 15 quilobases (kb). O genoma do PRRSV consiste em pelo menos 10 quadros de leitura abertos (ORFs), uma região curta de 5 'não traduzida (5' UTR) e uma cauda poli (A) no terminal 3 '( Figura 1A ) ¹⁷ . O genoma de um vírus de RNA de fita negativa não é infeccioso, enquanto o genoma de vírus de RNA de fita positiva é infeccioso. Existem duas estratégias principais de transfecção de RNA e DNA para gerar progênie viral¹⁸. No entanto, a clonagem do fragmento de comprimento total correspondente ao genoma do RNA é crucial para a construção de clones infecciosos. Devido à natureza longa e complexa do genoma do PRRSV, o genoma completo não pode ser facilmente obtido por PCR de uma só vez. Além disso, embora a síntese artificial de genes PRRSV seja uma solução eficaz, a síntese de fragmentos longos costuma ser cara. Assim, para obter o vetor de expressão de comprimento total PRRSV, tentamos criá-lo pelo método de recombinação homóloga de múltiplas inserções^19,20. Infelizmente, não conseguimos obter o vetor de expressão gênica de comprimento total. Portanto, neste estudo, adicionamos locais de restrição apropriados ao primer reverso e obtivemos com sucesso o vetor de expressão pVAX1-PRRSV por várias rodadas de reações de recombinação homóloga. Além disso, este método também pode alcançar a deleção ou mutação de genes-alvo e unir eficientemente um grande número de fragmentos de DNA ao vetor de expressão.

1. Preparação do molde do gene PRRSV

1. Descongele o estoque de vírus em 1 mL de reagente de extração de RNA (consulte a Tabela de Materiais).
2. Adicione 0,2 mL de clorofórmio e misture bem. Incubar por 3 min.
3. Centrifugue a mistura durante 15 min a 12.000 × g a 4 °C.
   NOTA: A mistura é dividida em três fases, a saber, uma fase aquosa incolor, uma interfase e uma fase vermelha de fenol-clorofórmio.
4. Pipetar a fase aquosa incolor e transferi-la para um novo tubo.
5. Misture bem a fase aquosa com 0,5 mL de isopropanol e incube por 10 min a 4 ° C.
6. Centrifugue por 10 min a 12.000 × g a 4 °C.
   NOTA: O fundo do tubo tem um precipitado de RNA branco.
7. Use uma micropipeta para descartar o sobrenadante do tubo.
8. Adicione 1 mL de etanol a 75% para ressuspender brevemente o pellet e o vórtice.
9. Centrifugue por 5 min a 7.500 × g a 4 °C. Use uma micropipeta para descartar o sobrenadante do tubo.
10. Seque o RNA por 5 min, adicione 20-50 μL de água livre de RNase para ressuspender o RNA e misture bem.
11. Prossiga para realizar a transcrição reversa; configurar as reações para realizar a transcrição reversa, conforme mostrado na Tabela 1.
    NOTA: Para garantir uma transcrição reversa bem-sucedida, use modelos de RNA de alta qualidade.
12. Use o cDNA resultante para PCR ou armazene-o a -20 °C.

2. Projeto de primer PCR

1. Projetando o primer direto
   1. Abra o software e escolha Novo arquivo de DNA.
   2. Cole a sequência do gene PRRSV (GenBank: FJ548852.1) do NCBI no software. Clique em OK para gerar os arquivos de sequência.
   3. Analise a sequência e marque as junções do fragmento. Projete o primer de sequência específica direta dos fragmentos. Para a maioria dos casos, a temperatura de fusão preferível (Tm) está entre 55 °C e 62 °C, e o teor de GC é de 40-60%.
   4. Clique em Primers e escolha Add Primer.
   5. Cole a sequência específica e adicione sequências sobrepostas do vetor ao primeiro nucleotídeo 5' do primer de sequência específica. Perto de cada junção, escolha 20-40 pb para servir como a região de sobreposição entre os dois fragmentos adjacentes.
   6. Nomeie o primer direto que contém as saliências e a sequência específica (consulte a Figura Suplementar S1).
   7. Clique em Adicionar primer ao modelo.
2. Projetando o primer reverso
   1. Analise a sequência e marque as junções de fragmentos no software. Projete o primer de sequência específica reversa dos fragmentos.
   2. Clique em Primers e escolha Add Primer.
   3. Cole a sequência específica e adicione o local de restrição ao primeiro nucleotídeo 5 'do primer de sequência específica.
      NOTA: Os sites de restrição adicionados devem estar ausentes do fragmento de inserção e do vetor, exceto para os vários sites de clonagem.
   4. Adicione sequências de vetores de saliência de 20-40 pb ao primeiro nucleotídeo 5 'do local de restrição.
   5. Nomeie o primer reverso contendo as saliências e a sequência específica (consulte a Figura Suplementar S1).
   6. Clique em Adicionar primer ao modelo.

3. PCR para amplificar fragmentos

1. Configure seis reações de PCR individuais (Tabela 2): para o fragmento 1, use os primers P1 e P2 (ver Figura Suplementar S2); para o fragmento 2, use os primers P3 e P4 (ver Figura Suplementar S2); para o fragmento 3, use os primers P5 e P6 (ver Figura Suplementar S2); para o fragmento 4, use os primers P7 e P8 (ver Figura Suplementar S2); para o fragmento 5, utilizar os primers P9 e P10; e use os primers P11 e P12 para amplificar o fragmento 6 (ver Figura Suplementar S2).
   NOTA: Descongele, misture e centrifugue brevemente cada componente antes de usar.
2. Execute o PCR usando o protocolo de três etapas na Tabela 2.
3. Adicione 1 μL de tampão de carga de DNA 6x a 5 μL de produto de PCR, misture e centrifugue brevemente o conteúdo.
4. Analise as amostras usando eletroforese em gel de agarose a 1%.

4. Purificação dos fragmentos de PCR

NOTA: Purificar os produtos de PCR de um gel usando um kit de extração de gel (consulte a Tabela de Materiais) é importante para a construção do vetor.

1. Adicione 9 μL de tampão de carga de DNA 6x a 45 μL de produtos de PCR, misture e centrifugue brevemente o conteúdo.
2. Realize eletroforese em gel de agarose / goldview a 1% para separar os fragmentos de DNA.
   NOTA: Não reutilize o tampão de corrida TAE, pois seu valor de pH afetará a recuperação do fragmento de DNA.
3. Após a separação adequada das bandas, use um bisturi afiado para extirpar cuidadosamente as bandas de DNA.
   NOTA: Minimize o tamanho da fatia de gel cortando o excesso de agarose.
4. Pese a fatia de gel em um tubo de microcentrífuga limpo de 1,5 mL, adicione um volume igual de tampão de ligação à fatia de gel (por exemplo, 0,3 mL a uma fatia de 0,3 g) e incube a 60 ° C por 7 min.
5. Insira uma mini coluna em um tubo de coleta de 2 mL. Adicione 700 μL de solução de DNA/agarose da etapa 4.4 à mini coluna.
6. Centrifugue a 10.000 × g por 1 min em temperatura ambiente. Descarte o filtrado e reutilize o tubo de coleta.
7. Adicione 300 μL de tampão de ligação e centrifugue a 13.000 × g por 1 min em temperatura ambiente. Descarte o filtrado e reutilize o tubo de coleta.
8. Adicione 700 μL de tampão de lavagem e centrifugue a 13.000 × g por 1 min em temperatura ambiente. Descarte o filtrado e reutilize o tubo de coleta.
9. Gire a mini coluna vazia por 2 min na velocidade máxima para secar a matriz da coluna. Coloque a mini coluna em um tubo de microcentrífuga limpo de 1.5 mL.
10. Adicione 20 μL de água deionizada diretamente no centro da membrana da coluna e deixe descansar em temperatura ambiente por 2 min. Centrifugue na velocidade de 13.000 × g por 1 min.
11. Armazenar o ADN a -20 °C.

5. Preparação de um vetor linearizado

NOTA: Depois de preparar o plasmídeo, as enzimas selecionadas podem ser usadas para cortá-lo. A digestão longa ou digestão enzimática dupla é crucial para garantir a digestão de todo o DNA. Isso reduzirá o número de clones falso-positivos em experimentos subsequentes.

1. Linearização pVAX1
   1. Preparar a mistura de reacção à temperatura ambiente pela ordem indicada (quadro 3).
      NOTA: O volume de água deve ser adicionado para manter o volume total de reação indicado. Aqui, 1 μg do plasmídeo foi digerido com enzimas na mistura de reação. Dependendo da concentração do plasmídeo, o volume do plasmídeo pode ser ajustado na mistura de reação.
   2. Misture delicadamente; então gire para baixo. Incubar a 37 °C num bloco de calor ou termóstato de água durante 60 min.
   3. Realize a purificação do gel semelhante à purificação dos fragmentos de PCR na seção 4 usando o kit de extração de gel (consulte a Tabela de Materiais).
2. Linearização pVAX1-F1
   NOTA: pVAX1-F1 é o vetor obtido da primeira rodada de recombinação de pVAX1 (NdeI e HindIII) e fragmento 1. pVAX1-F2 é o vetor obtido a partir da rodada de pVAX1-F1 (NdeI) e recombinação do fragmento 2. pVAX1-F3 é o vetor obtido a partir da rodada de recombinação de pVAX1-F2 (NdeI) e fragmento 3. pVAX1-F4 é o vetor obtido a partir da rodada de recombinação de pVAX1-F3 (NdeI) e fragmento 4. pVAX1-F5 é o vetor obtido a partir da rodada de pVAX1-F4 (EcoRV e Nto I) e recombinação do fragmento5.
   1. Para cada vector, preparar a mistura de reacção separadamente à temperatura ambiente, pela ordem indicada (quadro 3).
   2. Misture delicadamente; então gire para baixo. Incubar a 37 °C num bloco de calor ou termóstato de água durante 60 min.
   3. Realize a purificação do gel semelhante à purificação dos fragmentos de PCR na seção 4 usando o kit de extração de gel (consulte a Tabela de Materiais).

6. Subclonagem para um novo vetor

NOTA: Boa eficiência de clonagem pode ser alcançada ao usar 50-200 ng de vetor e inserções.

1. Configure a reação de clonagem e montagem perfeita do ExonArt (Tabela 4). Ajustar o volume total da reacção a 10 μL utilizando H₂O desionizado esterilizado e misturar.
2. Incubar a reação em um termociclador por 15-60 min a 50 °C. Armazene as amostras no gelo.
   NOTA: Estender a incubação em até 60 min pode aumentar a eficiência da montagem.
3. Descongele células quimicamente competentes DH5α no gelo.
4. Adicionar 10 μl do produto de montagem às células competentes; Em seguida, misture delicadamente pipetando para cima e para baixo.
5. Coloque a mistura no gelo por 30 min.
6. Choque térmico a 45 °C por 45 s e transfira os tubos para o gelo por 3 min.
7. Adicione 900 μL de meio SOC ao tubo.
8. Agitar o tubo a 225 rpm durante 1 h numa incubadora com agitação a 37 °C.
9. Centrifugue a reação de transformação a 6.000 × g por 2 min. Rejeitar o sobrenadante e ressuspender as células em 100 μL de meio SOC fresco.
10. Espalhar a suspensão de células transformadas numa placa LB separada com 50 μg/ml de canamicina.
11. Incubar todas as placas durante a noite a 37 °C. Escolha colônias isoladas individuais de cada placa experimental.

7. Analisando os transformantes

1. Escolha oito colônias em 20 μL de meio LB contendo 50 μg / mL de canamicina.
2. Configure a reação de PCR da colônia e execute a PCR (Tabela 5).
   NOTA: Para a reação de PCR de colônia para o fragmento 1, use os primers P1 e P2 (consulte o Arquivo Suplementar 1); para o fragmento 2, use os primers P3 e P4 (consulte o Arquivo Suplementar 1); para o fragmento 3, use os primers P5 e P6 (consulte o Arquivo Suplementar 1); para o fragmento 4, use os primers P7 e P8 (ver Figura Suplementar S2); para o fragmento 5, utilizar os primers P9 e P10; e use os primers P11 e P12 para detectar o fragmento 6 (ver Figura Suplementar S2).
3. Adicione 1 μL de tampão de carga de DNA 6x a 5 μL do produto de PCR, misture e centrifugue brevemente o conteúdo.
4. Analise os resultados usando eletroforese em gel de agarose a 1%.
5. Selecione uma colônia positiva em 5 mL de meio LB contendo 50 μg / mL de canamicina e cresça durante a noite a 37 ° C.
6. Obtenha o plasmídeo usando um minikit de DNA de plasmídeo (consulte a Tabela de Materiais) de acordo com as instruções do fabricante.
7. Visualize os resultados usando eletroforese em gel de agarose a 1%.

Neste artigo, apresentamos um sistema de recombinação in vitro para montar e reparar moléculas de DNA sobrepostas usando o primer reverso por meio de locais de restrição continuamente introduzidos (Figura 1B). Este sistema é um procedimento simples e eficiente que compreende a preparação do vetor linear e dos fragmentos de inserção contendo saliências introduzidas por PCR com primers com sequências de extensão 5' e locais de restrição apropriados; uma reacção isotérmica única in vitro e a transformação química padrão de produtos de recombinação em bactérias hospedeiras adequadas; e a seleção de uma colônia positiva e a obtenção do vetor recombinante para a próxima rodada de clonagem. Para obter o vetor pVAX1-PRRSV passo a passo, os locais de restrição devem estar ausentes das inserções e vários locais de clonagem do vetor recombinante.

Como é difícil obter sequências gênicas completas e complexas com uma única PCR, fragmentos de inserção de PRRSV só puderam ser amplificados com seis reações de PCR (Figura 1C). Durante a primeira rodada de recombinação, o Fragmento 1 do PRRSV foi inserido com sucesso no vetor pVAX1, e o novo plasmídeo recombinante com os sítios de restrição introduzidos (NheI, um único sítio de clivagem enzimática) foi denominado pVAX1-F1 (Figura 1D). Na segunda rodada de recombinação, o vetor pVAX1-F1 foi linearizado com a enzima de restrição NheI. O fragmento 2 foi inserido com sucesso no vetor pVAX1-F1, produzindo o plasmídeo recombinante pVAX1-F2 com locais de restrição (NheI, um único local de clivagem enzimática) (Figura 1D). Para a terceira rodada de recombinação, conforme mostrado na Figura 1D, o fragmento 3 foi inserido com sucesso no vetor pVAX1-F2 para obter pVAX1-F3 com locais de restrição (NheI, um único local de clivagem enzimática). Na quarta rodada de recombinação, obtivemos o vetor pVAX1-F4 introduzindo o fragmento 4 com sítios de restrição EcoRV (um único sítio de clivagem enzimática). Em seguida, o vetor pVAX1-F4 foi linearizado pela enzima de restrição EcoRV e NotI. O fragmento 5 foi clonado no vetor pVAX1-F4 para obter pVAX1-F5 com sítios de restrição (NotI, um único sítio de clivagem enzimática). Após a última rodada de recombinação, o vetor de superexpressão de comprimento total do PRRSV (pVAX1-PRRSV) foi obtido com sucesso (Arquivo Suplementar 1). Conforme ilustrado na Figura 1D, o novo plasmídeo recombinante torna-se cada vez maior com a introdução contínua de fragmentos. Assim, esses resultados indicaram que a combinação da adição de sítios de restrição apropriados e a utilização da técnica de Montagem de Gibson pode alcançar a introdução eficiente de fragmentos de DNA no vetor.

Figura 1: Organização e construção de vetores pVAX1-F6 (pVAX1-PRRSV) por recombinação homóloga. (A) Organização do genoma do PRRSV. ORF1b codifica RNA polimerase dependente de RNA, RNA helicase e domínios multinucleares de ligação ao zinco. Outras ORFs codificam glicoproteínas associadas à membrana (GP2, GP3, GP4 e GP5), proteína E, proteína do envelope de membrana e proteína do nucleocapsídeo. (B) Diagrama esquemático do processo de geração do vetor pVAX1-PRRSV. (C) O gel de DNA agarose mostra amplificação por PCR de fragmentos alvo. (D) Com a inserção de fragmentos, o tamanho do vetor recombinante aumenta gradualmente. Abreviaturas: PRRSV = Vírus da Síndrome Reprodutiva e Respiratória Suína; ORF = quadro de leitura aberto; GP = glicoproteína; Proteína E = E; M = proteína do envelope de membrana; N = proteína do nucleocapsídeo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Configuração e condições de transcrição reversa.

Tabela 2: Configuração e condições da reação de PCR.

Tabela 3: Mistura de linearização de pVAX1, pVAX1-F1, pVAX1-F2, pVAX1-F3, pVAX1-F4 e pVAX1-F5.

Tabela 4: Configuração de reação de montagem e clonagem perfeita do ExonArt.

Tabela 5: Configuração e condições de PCR de colônias.

Figura Suplementar S1: Esquema do processo de design de primer. Outros designs de primer, como P5 e P6, também são mostrados. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura Suplementar S2: Sequências de primers. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo Suplementar 1: Dados de sequenciamento de DNA. Clique aqui para baixar este arquivo.

A técnica de montagem de Gibson é um método de clonagem molecular baseado em recombinação in vitro para a montagem de fragmentos de DNA⁸. Este método permite a montagem de vários fragmentos de DNA em um plasmídeo circular em uma reação isotérmica de tubo único. No entanto, um dos obstáculos para a técnica de Montagem de Gibson é a aquisição de longos fragmentos do cDNA. Os fragmentos longos são difíceis de amplificar com precisão por vários motivos. Por exemplo, os primers são mais fáceis de incompatível durante longos períodos de extensão, o cDNA pode não ser de boa qualidade ou as regiões ricas em GC interromperão a polimerização do DNA. Quando o fragmento de comprimento total não pode ser facilmente obtido do cDNA usando PCR, o fragmento de comprimento total precisa ser dividido em vários fragmentos para amplificação. No entanto, à medida que o número e o comprimento dos fragmentos de DNA inseridos aumentam, a eficiência e os clones positivos do ensaio de recombinação homóloga também diminuem significativamente. Portanto, tentamos uma solução alternativa, introduzindo locais de restrição adequados na extremidade 3' das inserções. Então, poderíamos linearizar o vetor e unir os fragmentos de DNA no vetor um por um por meio da tecnologia de recombinação homóloga e eliminar os locais de restrição indesejados por meio da reação de recombinação homóloga.

Como um dos patógenos economicamente mais significativos nos mercados globais, o PRRSV sempre atraiu a atenção de pesquisadores nos últimos 30 anos 10,21,22. É um vírus de RNA de fita positiva, com aproximadamente 15 kb de comprimento, e o fragmento de DNA longo não pode ser facilmente amplificado a partir do cDNA. Assim, para investigar se este método pode ser usado para a clonagem de fragmentos longos, empregamos o PRRSV como um modelo para clonagem do genoma completo. Neste estudo, dividimos a sequência completa em seis fragmentos e adicionamos sítios de restrição apropriados ao primer reverso, obtendo-se seis fragmentos por PCR. Em seguida, obtivemos com sucesso o vetor de expressão pVAX1-PRRSV de comprimento total por várias rodadas de reações de recombinação. Além disso, o vetor de expressão PRRSV construído pode servir como modelo para transcrição in vitro para obter RNAs tampados para transfecção ou pesquisa de vacina de mRNA. Enquanto isso, o plasmídeo do vírus de mRNA construído pode ser usado para triagem em lote de compostos naturais antivirais in vitro por meio de técnicas de interação molecular, como ressonância plasmônica de superfície^23,24. O plasmídeo pVAX1 atende aos requisitos porque um ensaio de transcrição in vitro requer um plasmídeo de alta cópia com um promotor T7. Além disso, o plasmídeo pVAX1-PRRSV contendo o promotor do CMV pode ser transfectado em células BHK-21 para expressão do genoma viral^25,26.

Em resumo, com este protocolo, demonstramos que genes longos de comprimento total podem ser divididos em vários fragmentos obtidos por amplificação por PCR. É importante que os primers reversos sejam introduzidos nos locais de restrição apropriados para que o vetor de expressão gênica de comprimento total possa ser obtido por várias rodadas de reações de recombinação. Este método pode ser usado para genes de comprimento total que não podem ser obtidos diretamente por uma única PCR ou para genes de comprimento total que não podem ser obtidos por recombinação homóloga de múltiplas inserções. Portanto, esta abordagem é um complemento importante para a técnica de montagem de Gibson, prevemos que ela pode ser amplamente utilizada para a clonagem de fragmentos longos de DNA e construção de genes de fusão.

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Este trabalho foi apoiado pelo apoio financeiro dos fundos de iniciação à pesquisa de doutorado fornecidos pela China West Normal University (nº 20E059).