ブタ繁殖呼吸器症候群ウイルス発現ベクター構築のためのシームレスクローニングアプローチ

ここでは、インサートの3'末端に適切な制限部位を導入することにより、pVAX1-PRRSV発現ベクターを取得するためのプロトコルを示します。相同組換え技術により、ベクターを直列化し、DNA断片を1つずつベクターに結合することができます。

遺伝子発現ベクターの構築は、実験生物学における実験室研究の重要な要素です。Gibson Assemblyのような技術の進歩により、ベクトル構築は比較的簡単で効率的になります。しかし、ブタ生殖呼吸器症候群ウイルス(PRRSV)の完全長ゲノムがcDNAからの単一ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって容易に増幅できない場合、または複数のインサートを in vitroで相同組換えして完全長遺伝子発現ベクターを取得することが困難な場合、現在のギブソンアセンブリ技術ではこの目標を達成することができません。

そこで、PRRSVゲノムをいくつかのフラグメントに分割し、リバースプライマーに適切な制限部位を導入してPCR増幅フラグメントを得ることを目指しました。相同組換え技術により、以前のDNA断片をベクターに結合した後、新しいベクターは制限酵素切断部位を獲得した。このように、新たに追加された酵素切断部位を用いてベクターを直鎖化し、上流のDNA断片の下流に次のDNA断片を導入することができます。

上流のDNA断片の3'末端に導入された制限酵素切断部位は排除され、新しい切断部位が下流DNA断片の3'末端に導入されます。このようにして、DNA断片を1つずつベクターに結合することができます。この方法は、PRRSV発現ベクトルをうまく構築するために適用可能であり、多数のフラグメントを発現ベクトルに組み立てるのに有効な方法です。

原核細胞および真核細胞における発現のためのDNAベースの実験ツールを構築するための必須技術として、分子クローニングは実験生物学の非常に重要な要素です。分子クローニングには、インサートDNAの取得、インサートの適切なベクターへのライゲーション、組換えベクターの大腸菌(大腸菌)への変換、および陽性クローンの同定という4つのプロセス^{が含まれます1。}これまで、制限酵素^2,3やPCRを介した組換え^4,5,6を用いてDNA分子を結合する方法が複数採用されてきました。シームレスクローニング技術として知られる相同組換えは、DNAの1つ以上の断片を配列に依存しない、傷跡のないベクターへの挿入を可能にするクローニング方法のグループです。このテクノロジーには、配列およびライゲーションに依存しないクローニング(SLIC)、シームレスライゲーションクローニング抽出物(SLiCE)、In-Fusion、およびGibsonアセンブリが含まれます。これは、エキソヌクレアーゼを使用してインサートの1本鎖を分解し、ベクターを使用して凝集末端を生成し、in vivo修復またはin vitro組換えのいずれかを使用して、ホスホジエステル結合を形成することによりインサートをベクターに共有結合します。傷跡のない任意のシーケンスで単一のインサートをベクターに結合する能力は非常に魅力的です。さらに、この技術は、配列制限なしに5〜10個のフラグメントを所定の順序で結合する能力を有する。

多くの組換えDNA技術の1つとして、現在最も効果的なクローニング法であるギブソンアセンブリ法^7,8は、1つまたは複数の直鎖状DNA断片をシームレスに組み立てるための堅牢でエレガントなエキソヌクレアーゼベースの方法です。ギブソンアセンブリ反応は、5'エキソヌクレアーゼ、高忠実度ポリメラーゼ、および耐熱性DNAリガーゼの3つの酵素の混合物を使用して、等温条件下で行われます。5'-3'エキソヌクレアーゼによって作成される一本鎖3'オーバーハングは、一端で相補性を共有するフラグメントのアニーリングに寄与します。ハイフィデリティポリメラーゼは、dNTPを添加することによりアニールされた一本鎖領域のギャップを効果的に埋め、耐熱性DNAリガーゼはニックをシールして結合DNA分子を形成する⁸。したがって、この技術的方法は、遺伝子発現ベクターの構築に広く使用されています。

ブタ繁殖呼吸障害症候群(PRRS)は、^{9歳に関係なく}、PRRSVによって引き起こされるブタの生殖障害と呼吸不全を引き起こすウイルス性疾患です。この症候群は、発熱、食欲不振、肺炎、嗜眠、うつ病、呼吸困難として現れます。さらに、一部の流行では、耳の赤/青の変色などの臨床徴候が観察されています。PRRSVはアルテリウイルス科の一員として、尿、初乳、唾液などの体液と直接接触し交換することで、豚肉生産国に広く感染します。米国でのPRRSVの蔓延により、豚肉産業の総経済的損失は、580万頭の雌豚と1億1000万頭の豚の繁殖規模に基づいて、年間約6億6400万ドルと推定されています^10,11。動植物衛生検査局の報告によると、ワクチン未接種の豚の49.8%が血清中にPRRSVの存在を示しており¹²、感染した豚の低レベルのPRRSVは唾液、鼻汁、尿、および糞便¹³を通じて排泄されます。PRRSVの伝搬を制御するために、複数の戦略が実装されている14,15,16。ワクチンの投与は、完全にウイルス陰性の集団を作り出すための排除手順や、バイオセーフティと管理の改善に加えて、PRRSを制御する効果的な手段です。

PRRSV は、長さが約 15 キロベース (kb) のエンベロープ一本鎖ポジティブセンス RNA ウイルスです。PRRSVゲノムは、少なくとも10のオープンリーディングフレーム(ORF)、短い5'非翻訳領域(5' UTR)、および3'末端のポリ(A)テール(図1A)から構成される(図1A)¹⁷。ネガティブストランドRNAウイルスのゲノムは非感染性ですが、ポジティブストランドRNAウイルスのゲノムは感染性です。ウイルスの子孫を生成するためのRNAおよびDNAトランスフェクションには、主に2つの戦略があります¹⁸。しかし、RNAゲノムに対応する全長フラグメントをクローニングすることは、感染性クローンの構築に不可欠です。PRRSVゲノムは長く複雑な性質を持つため、PCRによって完全長ゲノムを一度に取得することは容易ではありません。さらに、PRRSV遺伝子の人工合成は効果的な解決策ですが、長いフラグメントの合成にはしばしば費用がかかります。したがって、PRRSV完全長発現ベクトルを得るために、多重挿入相同組換え法^19,20によって作成しようと試みた。残念ながら、完全長の遺伝子発現ベクターを得ることはできませんでした。そこで、本研究では、リバースプライマーに適切な制限部位を添加し、数ラウンドの相同組換え反応によりpVAX1-PRRSV発現ベクターを得ることに成功しました。さらに、この方法は、標的遺伝子の欠失または突然変異を達成し、多数のDNA断片を発現ベクターに効率的に結合することもできる。

1. PRRSV遺伝子のテンプレートの調製

1. 1 mLのRNA抽出試薬でウイルスストックを解凍します( 材料の表を参照)。
2. クロロホルム0.2mLを加え、よく混ぜます。3分間インキュベートします。
3. 混合物を12,000 × g 、4°Cで15分間遠心分離します。
   注:混合物は、無色の水相、間相、および赤色フェノール-クロロホルム相の3つの相に分けられます。
4. 無色の水性相をピペットで取り出し、新しいチューブに移します。
5. 水相を0.5 mLのイソプロパノールと十分に混合し、4°Cで10分間インキュベートします。
6. 12,000 × g 、4°Cで10分間遠心分離します。
   注:チューブの底には白色RNA沈殿物があります。
7. マイクロピペットを使用して、チューブの上清を捨てます。
8. 1 mLの75%エタノールを加えてペレットを再懸濁し、短時間ボルテックスします。
9. 7,500 × g 、4°Cで5分間遠心分離します。 マイクロピペットを使用して、チューブの上清を捨てます。
10. RNAを5分間乾燥させ、RNaseフリーの水20〜50μLを加えてRNAを再懸濁し、十分に混合します。
11. 逆転写の実行に進みます。 表1に示すように、逆転写を行うように反応を設定します。
    注:逆転写を成功させるには、高品質のRNAテンプレートを使用してください。
12. 得られたcDNAをPCRに使用するか、-20°Cで保存します。

2. PCRプライマーの設計

1. フォワードプライマーの設計
   1. ソフトウェアを開き、[ 新しいDNAファイル]を選択します。
   2. NCBIからPRRSV遺伝子配列(GenBank:FJ548852.1)をソフトウェアに貼り付けます。 「OK 」をクリックして、シーケンス・ファイルを生成します。
   3. 配列を解析し、フラグメントジャンクションをマークします。フラグメントの前方特異的配列プライマーを設計します。ほとんどの場合、好ましい融解温度(Tm)は55°C〜62°Cで、GC含有量は40〜60%です。
   4. プライマーをクリックし、プライマーの追加を選択します。
   5. 特定の配列を貼り付け、ベクターのオーバーラップ配列を特定の配列プライマーの最初の5'ヌクレオチドに追加します。各ジャンクションの近くで、2 つの隣接するフラグメント間のオーバーラップ領域として機能する 20 から 40 bp を選択します。
   6. オーバーハングと特定の配列を含むフォワードプライマーに名前を付けます( 補足図S1を参照)。
   7. 「テンプレートにプライマーを追加」をクリックします。
2. リバースプライマーの設計
   1. 配列を解析し、ソフトウェアでフラグメントジャンクションをマークします。フラグメントの逆特異的配列プライマーを設計します。
   2. プライマーをクリックし、プライマーの追加を選択します。
   3. 特定の配列を貼り付け、制限部位を特定の配列プライマーの最初の5'ヌクレオチドに添加します。
      注:追加する制限部位は、複数のクローニング部位を除き、インサートフラグメントおよびベクターに存在してはなりません。
   4. 20-40 bpのオーバーハング配列を制限部位の最初の5'ヌクレオチドに加えます。
   5. オーバーハングと特定の配列を含むリバースプライマーに名前を付けます( 補足図S1を参照)。
   6. 「テンプレートにプライマーを追加」をクリックします。

3. フラグメントを増幅するためのPCR

1. 6つの個別のPCR反応を設定します(表2):フラグメント1には、プライマーP1およびP2を使用します( 補足図S2を参照)。フラグメント2については、プライマーP3およびP4を使用します( 補足図S2を参照)。フラグメント3については、プライマーP5およびP6を使用します( 補足図S2を参照)。フラグメント4については、プライマーP7およびP8を使用します( 補足図S2を参照)。フラグメント5については、プライマーP9およびP10を使用します。そして、プライマーP11およびP12を使用してフラグメント6を増幅します( 補足図S2を参照)。
   注:使用前に各コンポーネントを解凍し、混合し、短時間遠心分離します。
2. 表2の3ステップのプロトコルを使用してPCRを実行します。
3. 1 μL の 6x DNA ローディングバッファーを 5 μL の PCR 産物に添加し、混合し、内容物を短時間遠心分離します。
4. 1%アガロースゲル電気泳動を使用してサンプルを分析します。

4. PCRフラグメントの精製

注:ゲル抽出キット( 材料表を参照)を使用してゲルからPCR産物を精製することは、ベクター構築にとって重要です。

1. 45 μLのPCR産物に9 μLの6x DNAローディングバッファーを加えて混合し、内容物を短時間遠心分離します。
2. 1%アガロースゲル/ゴールドビュー電気泳動を行い、DNA断片を分離します。
   注:TAEランニングバッファーは、そのpH値がDNAフラグメントの回収率に影響を与えるため、再利用しないでください。
3. バンドを適切に分離したら、鋭利なメスを使用してDNAバンドを慎重に切除します。.
   注:余分なアガロースを切り取ることにより、ゲルスライスのサイズを最小限に抑えます。
4. 清潔な1.5 mLの微量遠心チューブでゲルスライスを秤量し、ゲルスライスに同量の結合バッファー(0.3 mLから0.3 gスライスなど)を加え、60°Cで7分間インキュベートします。
5. ミニカラムを2 mLの採取チューブに挿入します。ステップ4.4のDNA/アガロース溶液700μLをミニカラムに加えます。
6. 10,000 × g で室温で1分間遠心分離します。ろ液を廃棄し、収集チューブを再利用します。
7. 300 μLの結合バッファーを添加し、13,000 × g で室温で1分間遠心分離します。ろ液を廃棄し、収集チューブを再利用します。
8. 700 μLの洗浄バッファーを添加し、13,000 × g で室温で1分間遠心分離します。ろ液を廃棄し、収集チューブを再利用します。
9. 空のミニカラムを最大速度で2分間回転させ、カラムマトリックスを乾燥させます。ミニカラムを清潔な1.5 mLマイクロ遠心チューブに入れます。
10. 20 μL の脱イオン水を直接カラムメンブレンの中心に加え、室温で 2 分間放置します。13,000 × g の速度で1分間遠心分離します。
11. DNAを-20°Cで保存します。

5. 線形化ベクトルの準備

注:プラスミドを調製した後、選択した酵素を使用してプラスミドを切断できます。長時間の消化または二重酵素消化は、すべてのDNAの消化を確実にするために重要です。これにより、その後の実験で偽陽性のクローンの数が減少します。

1. pVAX1 線形化
   1. 反応混合物を室温で示された順序で調製します(表3)。
      注:示された総反応量を維持するために、水の量を追加する必要があります。ここでは、プラスミド1μgを反応混合物中の酵素で消化しました。プラスミド濃度に応じて、プラスミドの容量を反応混合物中で調整することができます。
   2. 穏やかに混ぜます。その後、スピンダウンします。37°Cのヒートブロックまたは水サーモスタットで60分間インキュベートします。
   3. ゲル抽出キットを使用して、セクション4のPCRフラグメントの精製と同様のゲル精製を行います( 材料の表を参照)。
2. pVAX1-F1 線形化
   注:pVAX1-F1は、pVAX1の最初のラウンド(NdeIおよび HindIII)とフラグメント1の再結合から得られたベクターです。pVAX1-F2は、pVAX1-F1(NdeI)とフラグメント2の組換えのラウンドから得られるベクターです。pVAX1-F3は、pVAX1-F2(NdeI)とフラグメント3の組換えのラウンドから得られるベクターです。pVAX1-F4は、pVAX1-F3(NdeI)とフラグメント4組換えのラウンドから得られるベクターです。pVAX1-F5は、pVAX1-F4(EcoRVおよび NtoI)とフラグメント5組換えのラウンドから得られるベクターです。
   1. 各ベクターについて、示された順序で室温で反応混合物を別々に調製します(表3)。
   2. 穏やかに混ぜます。その後、スピンダウンします。37°Cのヒートブロックまたは水サーモスタットで60分間インキュベートします。
   3. ゲル抽出キットを使用して、セクション4のPCRフラグメントの精製と同様のゲル精製を行います( 材料の表を参照)。

6. 新しいベクターへのサブクローニング

注:50-200 ngのベクターとインサートを使用すると、良好なクローニング効率が得られます。

1. ExonArtのシームレスなクローニングおよびアセンブリ反応をセットアップします(表4)。滅菌脱イオン_H2Oを使用して総反応量を10μLに調整し、混合します。
2. 反応液をサーモサイクラーで50°Cで15〜60分間インキュベートします。 サンプルを氷上に保存します。
   注:インキュベーションを最大60分まで延長すると、組み立て効率が向上する場合があります。
3. DH5αケミカルコンピテントセルを氷上で解凍します。
4. 10 μLのアセンブリ製品をコンピテントセルに加えます。その後、ピペッティングで上下させて穏やかに混合します。
5. 混合物を氷の上に30分間置きます。
6. 45°Cで45秒間ヒートショックを行い、チューブを氷上に3分間移します。
7. 900 μLのSOC培地をチューブに加えます。
8. チューブを225rpmで37°Cの振盪インキュベーターで1時間振とうします。
9. 形質転換反応を6,000 × g で2分間遠心分離します。上清を捨て、細胞を100 μLの新鮮なSOC培地に再懸濁します。
10. 形質転換細胞懸濁液を別のLBプレートに広げ、50 μg/mLのカナマイシンを入れます。
11. すべてのプレートを37°Cで一晩インキュベートします。 各実験プレートから個々の単離コロニーを選択します。

7. 形質転換体の解析

1. 50 μg/mL カナマイシンを含む 20 μL の LB 培地に 8 つのコロニーを選別します。
2. コロニーPCR反応をセットアップし、PCRを実行します(表5)。
   注:フラグメント1のコロニーPCR反応には、プライマーP1およびP2を使用します( 補足ファイル1を参照)。フラグメント2については、プライマーP3およびP4を使用します( 補足ファイル1を参照)。フラグメント3には、プライマーP5およびP6を使用します( 補足ファイル1を参照)。フラグメント4については、プライマーP7およびP8を使用します( 補足図S2を参照)。フラグメント5については、プライマーP9およびP10を使用します。プライマーP11およびP12を使用してフラグメント6を検出します( 補足図S2を参照)。
3. 1 μL の 6x DNA ローディングバッファーを 5 μL の PCR 産物に加え、混合し、内容物を短時間遠心分離します。
4. 1%アガロースゲル電気泳動を使用して結果を分析します。
5. 50 μg/mL カナマイシンを含む 5 mL の LB 培地に 1 つの陽性コロニーを選択し、37 °C で一晩増殖します。
6. 製造元の指示に従って、プラスミドDNAミニキット( 材料表を参照)を使用してプラスミドを入手します。
7. 1%アガロースゲル電気泳動を使用して結果を視覚化します。

この論文では、連続的に導入された制限部位を介してリバースプライマーを使用して、重複するDNA分子を組み立てて修復する in vitro 組換えシステムを紹介します(図1B)。このシステムは、線形ベクターと、適切な5'伸長配列および制限部位を有するプライマーを用いてPCRによって導入されたオーバーハングを含むインサートフラグメントの調製を含む、単純で効率的な手順である。 in vitro での単一等温反応と、組換え生成物の適切な宿主細菌への標準的な化学変換。そして、ポジティブコロニーの選択と、次のクローニングラウンドのための組換えベクターの取得。pVAX1-PRRSVベクターを段階的に取得するためには、組換えベクターのインサートおよび複数のクローニング部位に制限部位が存在しない必要があります。

1回のPCRで完全長で複雑な遺伝子配列を取得することは困難であるため、PRRSVのインサートフラグメントは6回のPCR反応でしか増幅できませんでした(図1C)。組換えの最初のラウンドでは、PRRSVのフラグメント1がpVAX1ベクターに正常に挿入され、導入された制限部位(NheI、単一の酵素切断部位)を持つ新しい組換えプラスミドをpVAX1-F1と命名しました(図1D)。組換えの2回目のラウンドでは、pVAX1-F1ベクターを制限酵素 NheIと直鎖化しました。フラグメント2をpVAX1-F1ベクターにうまく挿入し、制限部位(NheI、単一酵素切断部位)を有する組換えプラスミドpVAX1-F2が得られました(図1D)。組換えの3回目のラウンドでは、 図1Dに示すように、フラグメント3をpVAX1-F2ベクターにうまく挿入し、制限部位(NheI、単一の酵素切断部位)を持つpVAX1-F3を得ました。組換えの第4ラウンドでは、制限部位 EcoRV(単一酵素切断部位)を持つフラグメント4を導入することにより、pVAX1-F4ベクターを取得しました。次に、pVAX1-F4ベクターを 制限酵素EcoRVと NotIによって直鎖化しました。フラグメント5をpVAX1-F4ベクターにクローニングして、制限部位(NotI、単一の酵素切断部位)を持つpVAX1-F5を得ました。最後の組換えラウンドの後、PRRSV完全長過剰発現ベクター(pVAX1-PRRSV)が無事に取得されました(補足ファイル1)。 図1Dに示すように、新しい組換えプラスミドは、フラグメントの連続的な導入に伴ってますます大きくなります。したがって、これらの結果は、適切な制限部位を付加することとGibson Assembly技術を利用することの組み合わせにより、DNA断片をベクターに効率的に導入できることを示しました。

図1:相同組換えによるpVAX1-F6(pVAX1-PRRSV)ベクターの組織化と構築。 (A)PRRSVゲノムの組織化。ORF1bは、RNA依存性RNAポリメラーゼ、RNAヘリカーゼ、および多核亜鉛結合ドメインをコードしています。他のORFは、膜結合糖タンパク質(GP2、GP3、GP4、およびGP5)、Eタンパク質、膜エンベロープタンパク質、およびヌクレオカプシドタンパク質をコードしています。(B) pVAX1-PRRSVベクトルの生成過程の概略図。(C)DNAアガロースゲルは、標的フラグメントのPCR増幅を示す。略語:PRRSV =豚繁殖呼吸器症候群ウイルス;ORF = オープンリーディングフレーム;GP =糖タンパク質;E = Eタンパク質;M =膜エンベロープタンパク質;N =ヌクレオカプシドタンパク質。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

表1:逆転写のセットアップと条件。

表2:PCR反応のセットアップと条件。

表3:pVAX1、pVAX1-F1、pVAX1-F2、pVAX1-F3、pVAX1-F4、およびpVAX1-F5の線形化混合物。

表4:ExonArtのシームレスなクローニングとアセンブリ反応のセットアップ。

表5:コロニーPCRのセットアップと条件。

補足図S1:プライマー設計のプロセスの概略図。 P5やP6などの他のプライマーデザインも示されています。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足図S2:プライマー配列。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足ファイル1:DNAシーケンシングデータ。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

ギブソンアセンブリ技術は、DNA断片⁸のアセンブリのためのin vitro組換えベースの分子クローニング法である。この方法により、複数のDNA断片を単管等温反応で環状プラスミドに組み立てることができます。しかし、ギブソンアセンブリ技術の障害の1つは、cDNAからの長いフラグメントの獲得です。長いフラグメントは、多くの理由で正確に増幅するのが困難です。例えば、プライマーは長時間の延長でミスマッチになりやすい、cDNAの品質が良くない、GCが豊富な領域でDNAの重合が止まってしまう、などです。PCRを用いてcDNAから完全長フラグメントを簡単に取得できない場合、完全長フラグメントを複数のフラグメントに分割して増幅する必要があります。しかし、挿入されたDNA断片の数と長さが増加するにつれて、相同組換えアッセイの効率と陽性クローンも大幅に低下します。したがって、インサートの3'端に適切な制限サイトを導入することにより、代替ソリューションを試みました。その後、相同組換え技術によりベクターを直鎖化し、DNA断片を1つずつベクターに結合し、相同組換え反応により不要な制限部位を排除することができます。

世界市場で最も経済的に重要な病原体の1つとして、PRRSVは過去30年間、常に研究者の注目を集めてきました10,21,22。これは、長さが約15kbの正鎖RNAウイルスであり、長いDNA断片はcDNAから容易に増幅することはできません。そこで、この手法が長鎖断片のクローニングに利用できるかどうかを調べるため、完全長ゲノムクローニングのテンプレートとしてPRRSVを採用しました。本研究では、完全長配列を6つのフラグメントに分割し、リバースプライマーに適切な制限部位を添加することで、PCRにより6つのフラグメントを得ました。その後、数回の組換え反応により、完全長pVAX1-PRRSV発現ベクターを得ることに成功しました。さらに、構築されたPRRSV発現ベクターは、トランスフェクションまたはmRNAワクチン研究用のキャップ付きRNAを取得するためのin vitro転写のテンプレートとして役立ちます。一方、構築されたmRNAウイルスプラスミドは、表面プラズモン共鳴^23,24などの分子間相互作用技術を通じて、in vitroで抗ウイルス天然化合物のバッチスクリーニングに使用することができます。pVAX1プラスミドは、in vitro転写アッセイにはT7プロモーターを含む高コピープラスミドが必要であるため、要件を満たしています。また、CMVプロモーターを含むpVAX1-PRRSVプラスミドは、ウイルスゲノム発現のためにBHK-21細胞にトランスフェクションすることができる^25,26。

要約すると、このプロトコルでは、長い全長遺伝子をPCR増幅によって得られるいくつかのフラグメントに分割できることを実証します。リバースプライマーを適切な制限部位に導入して、完全長の遺伝子発現ベクターを数回の組換え反応で取得できるようにすることが重要です。この方法は、単一のPCRでは直接取得できない完全長遺伝子や、複数のインサートの相同組換えでは取得できない完全長遺伝子に使用できます。したがって、このアプローチはギブソンアセンブリ技術の重要な補足であり、長いDNAフラグメントのクローニングや融合遺伝子の構築に広く使用できると期待しています。

著者は、利益相反を宣言しません。

本研究は、中国西師範大学(No. 20E059)の博士研究開始基金の財政的支援を受けて行われました。