돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스 발현 벡터 구축을 위한 원활한 클로닝 접근법

여기에서는 인서트의 3' 말단에 적절한 제한 부위를 도입하여 pVAX1-PRRSV 발현 벡터를 얻기 위한 프로토콜을 제시합니다. 우리는 상동 재조합 기술을 통해 벡터를 선형화하고 DNA 단편을 벡터에 하나씩 결합할 수 있습니다.

유전자 발현 벡터의 구성은 실험 생물학에서 실험실 작업의 중요한 구성 요소입니다. Gibson Assembly와 같은 기술 발전으로 벡터 구성이 상대적으로 간단하고 효율적이 되었습니다. 그러나 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스(PRRSV)의 전장 게놈이 cDNA의 단일 중합효소 연쇄 반응(PCR)으로 쉽게 증폭될 수 없거나 시험관 내에서 여러 삽입물의 상동 재조합으로 전장 유전자 발현 벡터를 획득하기 어려운 경우 현재의 Gibson Assembly 기술로는 이 목표를 달성하지 못합니다.

결과적으로, 우리는 PRRSV 게놈을 여러 단편으로 나누고 PCR 증폭 단편을 얻기 위해 역 프라이머에 적절한 제한 부위를 도입하는 것을 목표로 했습니다. 상동 재조합 기술에 의해 이전의 DNA 단편을 벡터에 결합한 후, 새로운 벡터는 제한 효소 절단 부위를 획득했습니다. 따라서 새로 추가된 효소 절단 부위를 사용하여 벡터를 선형화하고 업스트림 DNA 단편의 다운스트림에 다음 DNA 단편을 도입할 수 있습니다.

업스트림 DNA 단편의 3' 말단에 도입된 제한효소 절단 부위가 제거되고, 새로운 절단 부위가 다운스트림 DNA 단편의 3' 말단에 도입됩니다. 이런 식으로 DNA 조각을 벡터에 하나씩 결합할 수 있습니다. 이 방법은 PRRSV 발현 벡터를 성공적으로 구성하는 데 적용할 수 있으며, 많은 수의 단편을 발현 벡터로 조립하는 데 효과적인 방법입니다.

원핵 및 진핵 세포에서 발현을 위한 DNA 기반 실험 도구를 구성하는 데 필수적인 기술로서 분자 클로닝은 실험 생물학의 매우 중요한 구성 요소입니다. 분자 클로닝은 삽입 DNA의 획득, 적절한 벡터로의 삽입물의 ligation, 재조합 벡터를 대장균(E. coli)으로의 변환, 양성 클론의 식별의 네 가지 프로세스를 포함합니다¹. 지금까지 제한 효소 ^2,3 및 PCR 매개 재조합 ^4,5,6을 사용하여 DNA 분자를 결합하기 위해 여러 가지 방법이 채택되었습니다. Seamless cloning 기술로 알려진 Homologous recombination은 벡터에 하나 이상의 DNA 단편을 서열에 독립적이고 흉터 없이 삽입할 수 있는 클로닝 방법 그룹입니다. 이 기술에는 염기서열 및 결찰 독립적 클로닝(SLIC), 이음매 없는 결찰 클로닝 추출물(SLiCE), In-Fusion 및 Gibson Assembly가 포함됩니다. 엑소뉴클레아제를 사용하여 삽입체의 한 가닥과 벡터를 분해하여 응집력 있는 말단을 생성하고, 생체 내 수리 또는 시험관 내 재조합을 사용하여 포스포디에스테르 결합을 형성하여 삽입물을 벡터에 공유 결합합니다. 흉터 없이 모든 시퀀스에서 단일 insert를 벡터에 결합할 수 있는 기능은 매우 매력적입니다. 또한, 이 기술은 서열 제한 없이 미리 결정된 순서로 5-10개의 단편을 결합할 수 있는 능력을 가지고 있습니다.

많은 재조합 DNA 기술 중 하나로서, 현재 가장 효과적인 클로닝 방법 ^7,8인 Gibson Assembly 기술은 하나 또는 여러 선형화된 DNA 단편을 매끄럽게 조립하는 견고하고 우아한 엑소뉴클레아제 기반 방법입니다. Gibson Assembly 반응은 세 가지 효소, 즉 5' 엑소뉴클레아제, 고충실도 중합효소 및 내열성 DNA 리가아제의 혼합물을 사용하여 등온 조건에서 수행됩니다. 5'-3' 엑소뉴클레아제에 의해 생성된 단일 가닥 3' 돌출부는 한쪽 끝에서 상보성을 공유하는 단편의 어닐링에 기여합니다. 고충실도 중합효소는 dNTP를 첨가하여 어닐링된 단일 가닥 영역의 틈을 효과적으로 메우고, 내열성 DNA 리가아제는 흠집을 밀봉하여 결합 DNA 분자를 형성합니다⁸. 따라서, 이 기술적 방법은 유전자 발현 벡터의 구축에 널리 사용되어 왔다.

돼지 생식기 호흡기 증후군(PRRS)은⁹세에 PRRSV로 인해 돼지에서 생식 장애 및 호흡 부전을 일으키는 바이러스성 질병입니다. 이 증후군은 발열, 식욕 부진, 폐렴, 무기력, 우울증 및 호흡 곤란으로 나타납니다. 또한, 귀의 적색/청색 변색을 포함한 임상 징후가 일부 전염병에서 관찰되었습니다. PRRSV는 동맥바이러스과에 속하는 것으로, 소변, 초유, 타액을 포함한 체액의 직접적인 접촉 및 교환을 통해 돼지고기 생산국에 널리 전염됩니다. 미국에서 PRRSV의 확산으로 인해 돼지 고기 산업의 총 경제적 손실은 580 만 마리의 암퇘지와 1 억 1 천만 마리의 돼지의 사육 규모를 기준으로 연간 약 6 억 6 천 4 백만 달러로 추정되었습니다^10,11. 동식물건강검사국(Animal and Plant Health Inspection Service) 보고서에 따르면 백신을 접종하지 않은 돼지의 49.8%가 혈청¹²에서 PRRSV가 존재하며, 감염된 돼지에서 낮은 수준의 PRRSV가 타액, 코 분비물, 소변 및 대변을 통해 배설된다¹³. PRRSV 전파를 제어하기 위해 여러 전략이 구현되었습니다 14,15,16. 완전히 바이러스가 음성인 집단을 생성하거나 생물 안전성 및 관리를 개선하기 위한 제거 절차 외에도 백신을 투여하는 것은 PRRS를 통제하는 효과적인 수단입니다.

PRRSV는 약 15킬로베이스(kb) 길이의 외피, 단일 가닥, 양성 감지 RNA 바이러스입니다. PRRSV 게놈은 최소 10개의 열린 판독 프레임(ORF), 짧은 5' 번역되지 않은 영역(5' UTR) 및 3' 말단의 폴리(A) 꼬리로 구성됩니다(그림 1A)¹⁷. 음성 가닥 RNA 바이러스의 게놈은 비감염성인 반면 양성 가닥 RNA 바이러스의 게놈은 전염성이 있습니다. 바이러스 자손을 생성하기 위한 RNA 및 DNA transfection에는 두 가지 주요 전략이 있습니다¹⁸. 그러나 RNA 게놈에 해당하는 전장 단편을 클로닝하는 것은 감염성 클론 구축에 매우 중요합니다. PRRSV 게놈의 길고 복잡한 특성으로 인해 PCR을 통해 한 번에 전체 길이 게놈을 쉽게 얻을 수 없습니다. 또한 PRRSV 유전자의 인공 합성이 효과적인 해결책이지만 긴 단편을 합성하는 데는 종종 비용이 많이 듭니다. 따라서 PRRSV 전장 발현 벡터를 얻기 위해 다중 삽입 상동 재조합 방법^19,20으로 생성하려고 시도했습니다. 불행히도, 우리는 전장 유전자 발현 벡터를 얻을 수 없었습니다. 따라서 본 연구에서는 역프라이머에 적절한 restriction site를 추가하고 여러 차례의 상동 재조합 반응을 통해 pVAX1-PRRSV 발현 벡터를 성공적으로 획득했습니다. 또한, 이 방법은 표적 유전자의 결실 또는 돌연변이를 달성할 수 있으며 많은 수의 DNA 단편을 발현 벡터에 효율적으로 결합할 수 있습니다.

1. PRRSV 유전자 템플릿의 제조

1. RNA 추출 시약 1mL에서 바이러스 스톡을 해동합니다( 재료 표 참조).
2. 클로로포름 0.2mL를 넣고 잘 섞는다. 3분 동안 배양합니다.
3. 혼합물을 4°C에서 12,000× g 에서 15분 동안 원심분리합니다.
   알림: 혼합물은 무색 수성상, 간기 및 적색 페놀-클로로포름 상의 세 단계로 나뉩니다.
4. 무색 수성을 단계적으로 피펫하여 새 튜브로 옮깁니다.
5. 수성상을 0.5mL의 이소프로판올과 철저히 혼합하고 4°C에서 10분 동안 배양합니다.
6. 4°C에서 12,000× g 에서 10분 동안 원심분리합니다.
   참고: 튜브 바닥에는 흰색 RNA 침전물이 있습니다.
7. 마이크로피펫을 사용하여 튜브의 상층액을 버립니다.
8. 1mL의 75% 에탄올을 첨가하여 펠릿과 와류를 잠시 재현탁시킵니다.
9. 4 °C에서 7,500 × g 에서 5분 동안 원심분리합니다. 마이크로피펫을 사용하여 튜브의 상층액을 버립니다.
10. RNA를 5분 동안 건조시키고 RNase가 없는 물 20-50μL를 추가하여 RNA를 재현탁시킨 다음 철저히 혼합합니다.
11. 역전사 수행을 진행합니다. 표 1과 같이 역전사를 수행하기 위한 반응을 설정합니다.
    참고: 성공적인 역전사를 보장하려면 고품질 RNA 템플릿을 사용하십시오.
12. 생성된 cDNA를 PCR에 사용하거나 -20°C에서 보관합니다.

2. PCR 프라이머 디자인

1. 포워드 프라이머 설계
   1. 소프트웨어를 열고 새 DNA 파일을 선택하십시오.
   2. NCBI의 PRRSV 유전자 염기서열(GenBank: FJ548852.1)을 소프트웨어에 붙여넣습니다. 확인을 클릭하여 시퀀스 파일을 생성합니다.
   3. 염기서열을 분석하고 단편 접합을 표시합니다. 단편의 전방 특이적 염기서열 프라이머를 설계합니다. 대부분의 경우 바람직한 용융 온도(Tm)는 55°C에서 62°C 사이이고 GC 함량은 40-60%입니다.
   4. Primers(프라이머)를 클릭하고 Add Primer(프라이머 추가)를 선택합니다.
   5. 특정 염기서열을 붙여넣고 벡터의 overlap 염기서열을 특정 염기서열 primer의 처음 5' 뉴클레오티드에 추가합니다. 각 접합 근처에서 20-40 bp를 선택하여 인접한 두 조각 사이의 겹침 영역으로 사용합니다.
   6. 돌출부와 특정 염기서열을 포함하는 전방 프라이머의 이름을 지정합니다( 보충 그림 S1 참조).
   7. Add Primer to Template(템플릿에 입문서 추가)을 클릭합니다.
2. 리버스 프라이머 설계
   1. 염기서열을 분석하고 소프트웨어에서 단편 접합을 표시합니다. 단편의 역 특이적 염기서열 프라이머를 설계합니다.
   2. Primers(프라이머)를 클릭하고 Add Primer(프라이머 추가)를 선택합니다.
   3. 특정 염기서열을 붙여넣고 제한 부위를 특정 염기서열 프라이머의 처음 5' 뉴클레오티드에 추가합니다.
      참고: 추가된 제한 사이트는 여러 복제 사이트를 제외하고 삽입 조각과 벡터에 없어야 합니다.
   4. 벡터의 20-40 bp 돌출 서열을 제한 부위의 처음 5' 뉴클레오티드에 추가합니다.
   5. 돌출부와 특정 염기서열을 포함하는 역 프라이머의 이름을 지정합니다( 보충 그림 S1 참조).
   6. Add Primer to Template(템플릿에 입문서 추가)을 클릭합니다.

3. 단편을 증폭하는 PCR

1. 6 개의 개별 PCR 반응을 설정하십시오 (표 2) : 단편 1의 경우 프라이머 P1 및 P2를 사용하십시오 ( 보충 그림 S2 참조). 단편 2의 경우 프라이머 P3 및 P4를 사용하십시오( 보충 그림 S2 참조). 단편 3의 경우 프라이머 P5 및 P6을 사용하십시오( 보충 그림 S2 참조). 단편 4의 경우 프라이머 P7 및 P8을 사용하십시오( 보충 그림 S2 참조). 단편 5의 경우 프라이머 P9 및 P10을 사용하십시오. 프라이머 P11 및 P12를 사용하여 단편 6을 증폭합니다( 보충 그림 S2 참조).
   알림: 사용하기 전에 각 구성 요소를 해동, 혼합 및 잠시 원심분리하십시오.
2. 표 2의 3단계 프로토콜을 사용하여 PCR을 실행합니다.
3. PCR 산물 5 μL에 1 μL의 6x DNA 로딩 버퍼를 추가하고 혼합한 후 내용물을 잠시 원심분리합니다.
4. 1% 아가로스 겔 전기영동을 사용하여 샘플을 분석합니다.

4. PCR 단편의 정제

참고: 겔 추출 키트( 재료 표 참조)를 사용하여 겔에서 PCR 산물을 정제하는 것은 벡터 구성에 중요합니다.

1. PCR 산물 45 μL에 9 μL의 6x DNA 로딩 버퍼를 추가하고 혼합한 후 내용물을 잠시 원심분리합니다.
2. DNA 단편을 분리하기 위해 1% 아가로스 겔/골드뷰 전기영동을 수행합니다.
   참고: pH 값이 DNA 절편 회수에 영향을 미치므로 TAE 실행 버퍼를 재사용하지 마십시오.
3. 띠를 적절하게 분리한 후 날카로운 메스를 사용하여 DNA 띠를 조심스럽게 절제합니다.
   알림: 과도한 아가로스를 잘라내어 겔 슬라이스의 크기를 최소화합니다.
4. 깨끗한 1.5mL 미세원심분리기 튜브에서 겔 절편의 무게를 측정하고, 겔 절편에 동일한 부피의 결합 완충액을 추가하고(예: 0.3mL에서 0.3g 절편), 60°C에서 7분 동안 배양합니다.
5. 2mL 수집 튜브에 미니 컬럼을 삽입합니다. 4.4단계에서 700μL의 DNA/아가로스 용액을 미니 컬럼에 추가합니다.
6. 10,000× g 에서 실온에서 1분 동안 원심분리합니다. 여과액을 버리고 수집 튜브를 재사용하십시오.
7. 300μL의 결합 완충액을 추가하고 실온에서 1분 동안 13,000× g 에서 원심분리기를 추가합니다. 여과액을 버리고 수집 튜브를 재사용하십시오.
8. 700μL의 세척 버퍼와 13,000× g 의 원심분리기를 실온에서 1분 동안 추가합니다. 여과액을 버리고 수집 튜브를 재사용하십시오.
9. 빈 미니 컬럼을 최대 속도로 2분 동안 돌려 컬럼 매트릭스를 건조시킵니다. 미니 컬럼을 깨끗한 1.5mL 마이크로 원심분리기 튜브에 넣습니다.
10. 20μL의 탈이온수를 컬럼 멤브레인 중앙에 직접 추가하고 실온에서 2분 동안 그대로 둡니다. 13,000 × g 의 속도로 1분 동안 원심분리기
11. DNA를 -20 °C에서 보관합니다.

5. 선형화된 벡터의 준비

NOTE: 플라스미드를 준비한 후 선택한 효소를 사용하여 절단할 수 있습니다. 긴 소화 또는 이중 효소 분해는 모든 DNA의 소화를 보장하는 데 매우 중요합니다. 이렇게 하면 후속 실험에서 위양성 클론의 수를 줄일 수 있습니다.

1. pVAX1 선형화
   1. 반응 혼합물을 표시된 순서대로 실온에서 제조한다(표 3).
      알림: 표시된 총 반응량을 유지하기 위해 물의 부피를 추가해야 합니다. 여기서, 플라스미드 1 μg을 반응 혼합물에서 효소로 절단하였다. 플라스미드 농도에 따라, 플라스미드의 부피는 반응 혼합물에서 조정될 수 있습니다.
   2. 부드럽게 섞는다. 그런 다음 스핀 다운. 37°C의 열 블록 또는 물 온도 조절기에서 60분 동안 배양합니다.
   3. 겔 추출 키트를 사용하여 섹션 4의 PCR 단편 정제와 유사한 겔 정제를 수행합니다( 재료 표 참조).
2. pVAX1-F1 선형화
   참고: pVAX1-F1은 pVAX1(NdeI 및 HindIII) 및 단편 1 재조합의 첫 번째 라운드에서 얻은 벡터입니다. pVAX1-F2는 pVAX1-F1(NdeI) 및 단편 2 재조합의 라운드에서 얻은 벡터입니다. pVAX1-F3는 pVAX1-F2(NdeI) 및 단편 3 재조합의 라운드에서 얻은 벡터입니다. pVAX1-F4는 pVAX1-F3(NdeI) 및 단편 4 재조합의 라운드에서 얻은 벡터입니다. pVAX1-F5는 pVAX1-F4(EcoRV 및 NtoI) 및 단편 5 재조합의 라운드에서 얻은 벡터입니다.
   1. 각 벡터에 대해 표시된 순서대로 실온에서 반응 혼합물을 별도로 준비합니다(표 3).
   2. 부드럽게 섞는다. 그런 다음 스핀 다운. 37°C의 열 블록 또는 물 온도 조절기에서 60분 동안 배양합니다.
   3. 겔 추출 키트를 사용하여 섹션 4의 PCR 단편 정제와 유사한 겔 정제를 수행합니다( 재료 표 참조).

6. 새 벡터로 서브클로닝

참고: 50-200 ng의 벡터 및 인서트를 사용할 때 우수한 클로닝 효율을 달성할 수 있습니다.

1. ExonArt Seamless 클로닝 및 어셈블리 반응을 설정합니다(표 4). 멸균된 탈이온화된_H2O를 사용하여 총 반응량을 10μL로 조정하고 혼합합니다.
2. 50 ° C에서 15-60 분 동안 thermocycler에서 반응을 배양합니다. 샘플을 얼음에 보관하십시오.
   알림: 인큐베이션을 최대 60분까지 연장하면 조립 효율성이 향상될 수 있습니다.
3. DH5α 화학적으로 적합한 세포를 얼음 위에서 해동합니다.
4. 조립 생성물 10μL를 competent cell에 추가합니다. 그런 다음 위아래로 피펫팅하여 부드럽게 섞습니다.
5. 혼합물을 얼음 위에 30분 동안 올려 놓습니다.
6. 45°C에서 45초 동안 열 충격을 가하고 튜브를 얼음 위로 3분 동안 옮깁니다.
7. 튜브에 900μL의 SOC 매체를 추가합니다.
8. 225rpm에서 37°C 진탕 인큐베이터에서 1시간 동안 튜브를 흔듭니다.
9. 6,000× g 에서 2분 동안 변형 반응을 원심분리합니다. 상층액을 버리고 100μL의 신선한 SOC 배지에 세포를 재현탁시킵니다.
10. 형질전환된 세포 현탁액을 50μg/mL 카나마이신이 있는 별도의 LB 플레이트에 펴 바릅니다.
11. 모든 플레이트를 37°C에서 밤새 배양합니다. 각 실험 플레이트에서 분리된 개별 콜로니를 선택합니다.

7. 형질전환체 분석

1. 50 μg/mL 카나마이신을 함유한 20 μL의 LB 배지에 8개의 콜로니를 선택합니다.
2. colony PCR 반응을 설정하고 PCR을 실행합니다(표 5).
   참고: 단편 1에 대한 콜로니 PCR 반응의 경우 프라이머 P1 및 P2를 사용하십시오( 보충 파일 1 참조). 단편 2의 경우 프라이머 P3 및 P4를 사용합니다( 보충 파일 1 참조). 단편 3의 경우 프라이머 P5 및 P6을 사용합니다( 보충 파일 1 참조). 단편 4의 경우 프라이머 P7 및 P8을 사용하십시오( 보충 그림 S2 참조). 단편 5의 경우 프라이머 P9 및 P10을 사용하십시오. 프라이머 P11 및 P12를 사용하여 단편 6을 검출합니다( 보충 그림 S2 참조).
3. PCR 산물 5 μL에 6x DNA 로딩 완충액 1 μL를 첨가하고 혼합한 후 내용물을 잠시 원심분리합니다.
4. 1% 아가로스 겔 전기영동을 사용하여 결과를 분석합니다.
5. 50μg/mL 카나마이신을 함유한 5mL의 LB 배지에 하나의 양성 콜로니를 선택하고 37°C에서 밤새 성장시킵니다.
6. 제조업체의 지침에 따라 plasmid DNA mini kit( 재료 표 참조)를 사용하여 plasmid를 얻습니다.
7. 1% 아가로스 겔 전기영동을 사용하여 결과를 시각화합니다.

이 논문에서는 지속적으로 도입된 restriction site를 통해 reverse primer를 사용하여 겹치는 DNA 분자를 조립하고 수리하는 in vitro recombination system을 제시합니다(그림 1B). 이 체계는 선형 벡터의 준비를 포함하는 및 적합한 5' 연장 순서 및 제한 위치를 비치하는 뇌관을 가진 PCR에 의해 소개된 돌출부를 포함하는 삽입 파편의 준비를 포함하는 포함하는 간단한 능률적인 절차입니다; 시험관 내 단일 등온 반응 및 재조합 산물을 적합한 숙주 박테리아로 표준 화학적 변형; 그리고 양성 콜로니를 선택하고 다음 클로닝을 위한 재조합 벡터를 얻습니다. pVAX1-PRRSV 벡터를 단계별로 얻기 위해서는 재조합 벡터의 insert와 multiple cloning site에 restriction site가 없어야 합니다.

단일 PCR로 전체 길이 및 복잡한 유전자 염기서열을 얻기 어렵기 때문에 PRRSV의 삽입 단편은 6개의 PCR 반응으로만 증폭할 수 있었습니다(그림 1C). 첫 번째 재조합 라운드에서 PRRSV의 Fragment 1을 pVAX1 벡터에 성공적으로 삽입하고, 도입된 제한 부위(NheI, 단일 효소 절단 부위)를 가진 새로운 재조합 플라스미드를 pVAX1-F1로 명명했습니다(그림 1D). 두 번째 재조합에서 pVAX1-F1 벡터는 제한 효소 NheI로 선형화되었으며, 단편 2는 pVAX1-F1 벡터에 성공적으로 삽입되어 제한 부위(NheI, 단일 효소 절단 부위)가 있는 재조합 플라스미드 pVAX1-F2를 수득했습니다(그림 1D). 그림 1D에 나타난 바와 같이, 세 번째 재조합의 경우, 단편 3을 pVAX1-F2 벡터에 성공적으로 삽입하여 제한 부위(NheI, 단일 효소 절단 부위)가 있는 pVAX1-F3를 수득하였다. 네 번째 재조합에서는 제한 부위 EcoRV(단일 효소 절단 부위)가 있는 단편 4를 도입하여 pVAX1-F4 벡터를 얻었습니다. 그런 다음, pVAX1-F4 벡터를 제한 효소 EcoRV 및 NotI에 의해 선형화하고, 단편 5를 pVAX1-F4 벡터로 클로닝하여 제한 부위(I가 아님, 단일 효소 절단 부위)가 있는 pVAX1-F5를 수득했습니다. 마지막 재조합 라운드 후, PRRSV 전장 과발현 벡터(pVAX1-PRRSV)를 성공적으로 수득하였다(보충 파일 1). 그림 1D에서 볼 수 있듯이, 새로운 재조합 플라스미드는 단편의 지속적인 도입에 따라 점점 더 커집니다. 따라서, 이러한 결과는 적절한 제한 부위를 추가하고 Gibson Assembly 기법을 활용하는 조합이 DNA 단편을 벡터에 효율적으로 도입할 수 있음을 나타냈습니다.

그림 1: 상동 재조합에 의한 pVAX1-F6(pVAX1-PRRSV) 벡터의 구성 및 구성. (A) PRRSV 게놈의 조직. ORF1b는 RNA 의존성 RNA 중합효소, RNA 헬리카제 및 다핵 아연 결합 도메인을 암호화합니다. 다른 ORF는 막 관련 당단백질(GP2, GP3, GP4 및 GP5), E 단백질, 막 외피 단백질 및 뉴클레오캡시드 단백질을 암호화합니다. (B) pVAX1-PRRSV 벡터의 생성 과정에 대한 개략도. (C) DNA 아가로스 겔은 표적 단편의 PCR 증폭을 보여줍니다. (D) 단편의 삽입에 따라, 재조합 벡터의 크기는 점차 증가한다. 약어: PRRSV = 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스; ORF = 열린 판독 프레임; GP = 당단백질; E = E 단백질; M = 막 외피 단백질; N = 뉴클레오캡시드 단백질. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

표 1: 역전사 설정 및 조건.

표 2: PCR 반응 설정 및 조건.

표 3: pVAX1, pVAX1-F1, pVAX1-F2, pVAX1-F3, pVAX1-F4 및 pVAX1-F5의 선형화 혼합물.

표 4: ExonArt 심리스 클로닝 및 어셈블리 반응 설정.

표 5: 콜로니 PCR 설정 및 조건.

보충 그림 S1: 프라이머 디자인 과정의 개략도. P5 및 P6과 같은 다른 프라이머 디자인도 표시됩니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 S2: 프라이머 서열. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 파일 1: DNA 염기서열 분석 데이터. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

Gibson 조립 기술은 DNA 단편⁸의 조립을 위한 시험관 내 재조합 기반 분자 클로닝 방법입니다. 이 방법을 사용하면 단일 튜브 등온 반응에서 여러 DNA 단편을 원형 플라스미드로 조립할 수 있습니다. 그러나 Gibson Assembly 기술의 장애물 중 하나는 cDNA에서 긴 단편을 획득하는 것입니다. 긴 조각은 여러 가지 이유로 정확하게 증폭하기 어렵습니다. 예를 들어, 프라이머는 장시간 동안 불일치하기 쉽고, cDNA의 품질이 좋지 않을 수 있으며, GC가 풍부한 영역은 DNA 중합을 중단합니다. PCR을 사용하여 cDNA에서 전장 단편을 쉽게 얻을 수 없는 경우, 증폭을 위해 전장 단편을 여러 단편으로 나누어야 합니다. 그러나, 삽입된 DNA 단편의 수와 길이가 증가함에 따라, 상동 재조합 분석의 효율 및 양성 클론도 현저히 감소할 것이다. 따라서 우리는 인서트의 3' 끝에 적절한 제한 부위를 도입하여 대체 솔루션을 시도했습니다. 그런 다음 상동 재조합 기술을 통해 벡터를 선형화하고 DNA 단편을 벡터에 하나씩 결합하고 상동 재조합 반응을 통해 원치 않는 제한 부위를 제거할 수 있습니다.

세계 시장에서 가장 경제적으로 중요한 병원체 중 하나 인 PRRSV는 지난 30 년 동안 항상 연구자들의 관심을 끌었습니다 10,21,22. 이 바이러스는 길이가 약 15kb인 양성 가닥 RNA 바이러스이며, 긴 DNA 단편은 cDNA에서 쉽게 증폭할 수 없습니다. 따라서 이 방법이 긴 단편의 클로닝에 사용될 수 있는지 여부를 조사하기 위해 PRRSV를 전체 길이 게놈 클로닝을 위한 템플릿으로 사용했습니다. 본 연구에서는 full-length sequence를 6개의 fragment로 나누고 reverse primer에 적절한 restriction site를 추가하여 PCR로 6개의 fragment를 수득하였다. 그런 다음 여러 차례의 재조합 반응을 통해 전장 pVAX1-PRRSV 발현 벡터를 성공적으로 획득했습니다. 또한, 생성된 PRRSV 발현 벡터는 transfection 또는 mRNA 백신 연구를 위한 capped RNA를 얻기 위한 in vitro transcription을 위한 템플릿 역할을 할 수 있습니다. 한편, 생성된 mRNA 바이러스 플라스미드는 표면 플라즈몬 공명^23,24와 같은 분자 상호 작용 기술을 통해 시험관 내에서 항바이러스 천연 화합물의 배치 스크리닝에 사용할 수 있습니다. pVAX1 플라스미드는 in vitro transcription assay가 T7 promoter를 가진 high-copy plasmid를 필요로 하기 때문에 이러한 요건을 충족합니다. 또한, CMV 프로모터를 함유하는 pVAX1-PRRSV 플라스미드는 바이러스 게놈 발현을 위해 BHK-21세포로 transfection할 수 있다^25,26.

요약하면, 이 프로토콜을 통해 긴 전장 유전자를 PCR 증폭으로 얻은 여러 단편으로 나눌 수 있음을 보여줍니다. 여러 차례의 재조합 반응으로 전장 유전자 발현 벡터를 얻을 수 있도록 역 프라이머를 적절한 제한 부위에 도입하는 것이 중요합니다. 이 방법은 단일 PCR로 직접 얻을 수 없는 전장 유전자 또는 여러 삽입물의 상동 재조합으로 얻을 수 없는 전장 유전자에 사용할 수 있습니다. 따라서 이 접근 방식은 Gibson Assembly 기술에 대한 중요한 보완 자료이며, 긴 DNA 단편의 클로닝 및 융합 유전자 구축에 널리 사용될 수 있을 것으로 예상됩니다.

저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

이 연구는 중국 서부 사범 대학(No. 20E059)에서 제공하는 박사 연구 시작 기금의 재정 지원으로 지원되었습니다.