Lazer Yakalama Mikrodiseksiyonu ile Oral Submukoz Fibrozis Örneklerinden Morfolojik ve Mekansal Bilgilerle Hücrelerin İzolasyonu

Oral submukoz fibroz dokularının lazer yakalama mikrodiseksiyonu, morfolojik ve mekansal bilgilerle multi-omik verilerin analizi için ilgilenilen histolojik bölgelerden hücrelerin hassas bir şekilde çıkarılmasına izin verir.

Oral submukoz fibrozis (OSF), ağız boşluğunda yaygın olarak görülen potansiyel olarak malign bir bozukluk türüdür. Epitel atrofisi ve lamina propria ve submukoza fibrozisi sıklıkla histopatolojik slaytlarda bulunur. Epitelyal displazi, epitelyal atrofi ve yaşlanan fibroblastların OSF'nin malign transformasyonu ile ilişkili olduğu öne sürülmüştür. Bununla birlikte, potansiyel olarak malign oral bozuklukların ve oral skuamöz hücreli karsinomun heterojenliği nedeniyle, OSF'de malign transformasyonun spesifik moleküler mekanizmalarını tanımlamak zordur. Burada, formalinle sabitlenmiş parafine gömülü doku preparatları üzerinde lazer yakalama mikrodiseksiyonu ile morfolojik veri ve uzamsal bilgi taşıyan az sayıda epitelyal veya mezenkimal hücre elde etmek için bir yöntem sunuyoruz. Mikroskop kullanarak, mikro ölçekli (~ 500 hücre) displastik veya atrofik epitel dokusunu ve fibrotik subepitel dokusunu hassas bir şekilde yakalayabiliriz. Ekstrakte edilen hücreler, morfolojik ve mekansal bilgilerle genomik ve transkriptomik veriler elde etmek için genom veya transkriptom dizilimi ile değerlendirilebilir. Bu yaklaşım, toplu OSF doku diziliminin heterojenliğini ve lezyonsuz alanlardaki hücrelerin neden olduğu girişimi ortadan kaldırarak, OSF dokusunun hassas uzamsal-omik analizine izin verir.

Oral submükoz fibrozis (OSF), esas olarak bukkal mukozada gelişen ve ağız açıklığının kısıtlanması ile sonuçlanan kronik, sinsi bir hastalıktır¹. OSF multifaktöriyel bir hastalık iken, areca fıstığı veya tembul fıstığı çiğneme OSF ^2,3'ün ana nedenidir. Coğrafi olarak spesifik olan bu alışkanlık nedeniyle, OSF ağırlıklı olarak Güneydoğu ve Güney Asya'daki popülasyonlarda yoğunlaşmıştır³. OSF'nin yaygın histolojik özellikleri arasında oral mukozal epitelin altındaki bağ dokusunda anormal kollajen birikimi, vasküler stenoz ve oklüzyon¹ yer alır. OSF epitel dokusu, oral lökoplaki ile birlikte olduğunda atrofi veya hiperplazi ve hatta displazi belirtileri ile ortaya çıkabilir ^4,5.

OSF, Dünya Sağlık Örgütü tarafından %4-%6 malign dönüşüm oranı ile oral skuamöz hücreli karsinomlara ilerleme potansiyeli sergileyen yaygın bir oral potansiyel malign bozukluk (OPMD) olarak tanımlanmaktadır6,7,8,9. OSF'nin malign dönüşümünün altında yatan mekanizma kompleks^10'dur. Hem displazi hem de atrofi dahil olmak üzere epitelin anormal büyümesi, karsinogenez potansiyelini arttırır ve stromadaki yaşlanan fibroblastlar, reaktif oksijen türleri (ROS) ve diğer moleküller yoluyla epitelyal-mezenkimal geçişi (EMT) indükleyerek OSF'nin malign ilerlemesinde rol oynayabilir¹⁰.

Mekansal-omik analizler için teknolojiler, kanser mekanizmaları hakkında içgörü sağlayan morfolojik ve mekansal bilgilerle multi-omik veriler üretti^11,12,13. Burada, lazer mikrodiseksiyon ile formalinle sabitlenmiş parafine gömülü OSF dokusundan morfoloji ile ilişkili hücre popülasyonlarını yakalamak için bir protokol sunuyoruz. Bu örneklerin multi-omik analizleri, doku içi heterojenlik ile ilgili zorlukların üstesinden gelebilir ve OSF^14'teki moleküler patolojinin ve malign transformasyon mekanizmalarının anlaşılmasını artırabilir.

Bu çalışma, Pekin Üniversitesi Okul ve Hastanesi kurumsal inceleme kurulu tarafından onaylanmıştır. Hastalardan bilgilendirilmiş onam alındı. Bu çalışmada kullanılan doku örnekleri tanımlandı. Çalışma şeması Şekil 1'de gösterilmiştir.

1. Numune hazırlama

1. Formalinle sabitlenmiş parafine gömülü oral submukoz fibroz dokularını bir mikrotom üzerinde 3 μm ve 10 μm kalınlığında sürekli bölümler halinde kesin.
2. Bölümleri suda açın ve ardından kaydırakların üzerine balık tutun. 3 μM ve 10 μm'lik bölümleri sırasıyla yapışma mikroskobu slaytlarına (slayt A) ve PEN membran slaytlarına (slayt B) sabitleyin.
3. Slaytları 2 saat boyunca 60 °C'de bir sıcak plaka üzerine yerleştirin.

2. Hematoksilen-eozin boyama

1. A ve B slaytlarını 10 dakika boyunca ksilene (DİKKAT) yerleştirin ve bu adımı üç kez tekrarlayın.
2. Hidrat, derecelendirilmiş etanol çözeltilerinde A ve B'yi her konsantrasyonda 1 dakika boyunca %100, %100, %90, %80 ve %70 sırasına göre kaydırır.
3. A ve B slaytlarını 30 saniye boyunca ultra saf damıtılmış suya koyun
4. A ve B slaytlarını 90 saniye boyunca Harris hematoksilen boya çözeltisine yerleştirin.
5. A ve B slaytlarını 30 saniye boyunca ultra saf damıtılmış suya koyun ve bu adımı üç kez tekrarlayın.
6. A ve B slaytlarını 2 saniye boyunca div-hematoksilen çözeltisine (DİKKAT) yerleştirin.
7. A ve B slaytlarını 30 saniye boyunca ultra saf damıtılmış suya koyun ve bu adımı üç kez tekrarlayın.
8. Slaytları A ve B'ye 2 saniye boyunca% 1 yeniden mavi çözelti içinde yerleştirin.
9. A ve B slaytlarını 30 saniye boyunca ultra saf damıtılmış suya koyun ve bu adımı üç kez tekrarlayın.
10. Slaytları 2 saniye boyunca eozin çözeltisine yerleştirin.
11. A ve B slaytlarını 30 saniye boyunca ultra saf damıtılmış suya koyun ve bu adımı üç kez tekrarlayın.
12. Slaytları dereceli etanol çözeltilerinde her konsantrasyonda 2 saniye boyunca %70, %80, %90, %100 ve %100 sırasına göre kurutun.
13. Slayt A'yı 3 dakika boyunca ksilene yerleştirin ve bu adımı iki kez tekrarlayın.
14. A'yı kaydırmak için bir damla montaj ortamı (DİKKAT) ekleyin ve bir kapak camı ile örtün.

3. Histolojik morfolojinin gözlenmesi ve lazer yakalama mikrodiseksiyonu

1. Lazer mikrodiseksiyon sistemini ve yazılımını başlatın (Şekil 2).
2. Slayt A'yı slayt tablasına yerleştirin ve lazer mikrodiseksiyonu için ilgilenilen alanı belirlemek için histolojik morfolojiyi gözlemleyin.
3. A slaytını çıkarın ve B slaytını slayt sahnesine ters olarak yerleştirin.
4. Toplama cihazını dışarı itmek için Kaldır düğmesine (Şekil 2) tıklayın. Toplama cihazına bir polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) tüpü yerleştirin ve tüpün sabit tutulduğundan emin olun. Tamam düğmesine tıklayın (Şekil 3).
5. Toplayıcı Aygıt: Tüp Kapakları'nı işaretleyen ilgili kırmızı daireye tıklayarak bir kapak seçin. Seçilen daire yeşile dönecektir.
6. Çiz düğmesini ve Çiz + Kes düğmesini tıklayın ve ilgilendiğiniz alanı çizmek için fareyi kullanın.
7. Tıkla Kesimi Başlat İlgilenilen alanı yakalamak için düğmesine basın; yakalanan numune kapak tarafından toplanacaktır (Şekil 4).
8. Yakalanan örneğin toplandığından emin olmak için Alt düğmeye tıklayın (Şekil 5).
9. Bir sonraki örneği yakalamak için Numune düğmesine tıklayın.
10. Tıkla Boşalt PCR tüpünü yakalanan sample ile boşaltmak için.

OSF dokularının lazer mikrodiseksiyonu ile displastik epitel, displastik epitel altında stroma, atrofik epitel ve atrofik epitel dokusu altında stroma örnekleri elde edildi (Şekil 1). DNA'nın çıkarılması ve düşük derinlikli tüm genom dizilimi yoluyla, morfolojiyle ilgili kopya sayısı değişikliklerini (CNA) analiz ^edebildik15. CNA, OPMD^15,16'da artmış malign transformasyon riski ile ilişkili yaygın bir genomik instabilite şeklidir. Dört çeşit örnek arasında farklı CNA desenleri tespit ettik. Şekil 6'da gösterildiği gibi, CNA epitel örneklerinde mevcuttu, ancak stroma örneklerinde yoktu. Örnekler aynı hastadan alınmasına rağmen, displastik epiteldeki CNA paterni atrofik epiteldeki ile aynı değildi. Displastik epitelde kromozom 3 ve 8'de CNA saptanırken, atrofik epitelde kromozom 8'de daha düşük frekansta CNA saptandı.

Şekil 1: Oral submukoz fibrozis örneklerinin lazer yakalama mikrodiseksiyonunun şeması. Farklı desenlere sahip epitel ve stroma dokuları mikroskop altında lazerle yakalanır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Lazer mikrodiseksiyon yazılımı. Canlı paneli gösteren yazılımın ekran görüntüsü. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Toplayıcı cihaz penceresi. Toplama cihazını seçmek için toplayıcı cihaz penceresini gösteren yazılımın ekran görüntüsü. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: İlgilenilen alandaki numunenin yakalanması. Kesmeyi Başlat düğmesine tıklamak, ilgilenilen alanın yakalanmasına izin verecektir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: Yakalanan örnek. Yakalanan örnek, PCR tüpünün kapağında görülebilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 6: Kopya numarası değişiklikleri. Çeşitli örnekler arasında farklı kopya numarası değişikliklerinin temsili sonuçları. Displastik epitel ve atrofik epitel arasında farklı kopya sayısı değişiklikleri vardır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Bu protokol, lazer mikrodiseksiyon yoluyla daha fazla mekansal-omik analiz için morfolojik ve mekansal bilgilerle OSF doku örneklerini yakalamak için bir boru hattı bildirdi. Temsili sonuçlardan, morfoloji ile ilgili çeşitli örnekler arasında farklı CNA kalıpları belirledik.

OPMD'nin bir türü olan OSF, oral skuamöz hücreli karsinomun yaygın bir prekanseröz durumudur⁶. Genomik instabilitenin OPMD^17,18'in gelişimi ve malign transformasyonu ile ilişkili olduğu bildirilmiştir. Çok sayıda çalışma, genomik, transkriptomik ve proteomik verilerden OSF'nin ilerlemesi ve malign dönüşümü ile ilişkili kromozom değişiklikleri, diferansiyel gen ekspresyonu ve epigenetik varyasyonlar bildirmiştir 19,20,21,22,23,24. Arekolin gibi areca fıstığının kanserojen bileşenleri sadece OSF'nin gelişmesine yol açmakla kalmadı, aynı zamanda uzun süreli stimülasyon aynı zamanda fibroblastların ve EMT'nin yaşlanmasını ve reaktif oksijen türlerinin (ROS) sürekli üretimini indükledi, böylece bağışıklık mikroçevresini ve TGF-β ve NF-κB sinyalleri gibi sinyal yollarını düzenleyerek malign dönüşüme neden oldu^{5, 10,21}. Bununla birlikte, OSF dokularında hem anormal epitelyal hem de stromal histolojik değişiklikler mevcuttur ve OSF'de hangi doku veya hücresel değişikliklerin malign dönüşümü tetiklediği belirsizliğini korumaktadır. Önceki çalışmalar çoğunlukla, moleküler ekspresyon ve ilgili yolları daha fazla analiz etmek için DNA veya RNA'nın bir doku bloğundan ekstrakte edildiği toplu dizileme analizlerini kullanmıştır. Bununla birlikte, bu analiz histoloji ile morfolojik bir korelasyondan yoksundu ve doku içi heterojenliği göz ardı etti; Ayrıca, bu yaklaşım farklı histolojik alanlarda diferansiyel moleküler değişiklikler olup olmadığını belirleyemez.

Son yıllarda yapılan çalışmalarda birçok hastalıkta mekansal-omik analizler bildirilmiştir^11,13,25. Hassas mekansal-omik analizler sayesinde, artan sayıda molekül ve hedef keşfedilmekte ve hücresel etkileşimler ve kümelenme aydınlatılmaktadır^11,12,13. Bununla birlikte, OSF'nin uzamsal olarak çözülmüş omik analizinin hala eksikliği vardır. OSF örnekleri genellikle oral mukoza biyopsilerinden alındı ve küçük hacimlerde formalinle sabitlenmiş, parafine gömülü örnekler olarak hazırlandı, bu da büyük örneklere ihtiyaç duyan tek hücreli uzamsal omik dizilemenin gerçekleştirilmesini zorlaştırdı. Bu nedenle, formalinle sabitlenmiş parafine gömülü numuneler kullanılarak uzamsal çözünürlüğe sahip yöntemlerin geliştirilmesi önemli bir fayda sağlayabilir. Mevcut protokolün OSF ve diğer OPMD türleri üzerinde çalışan araştırmacılara fayda sağlamasını ve OPMD'nin gelişim ve malign dönüşüm mekanizmalarının anlaşılmasına katkıda bulunmasını bekliyoruz.

Bu yöntemin bazı sınırlamaları vardır. İlk olarak, protokol, formalinle sabitlenmiş parafine gömülü numuneler kullanılarak gerçekleştirildi ve bu da dizileme analizi için RNA'nın çıkarılmasını zorlaştırdı; bununla birlikte, kristalin menekşe boyama kullanılırken ve aseptik uygulamalar sürdürülürken morfolojiye bağlı RNA dizileme analizi yapılabilir^15,26. Şu anda yakalanan örnekler, tek hücre çözünürlüğü seviyesini karşılayamadı, çünkü hücre sayısı çok küçük olduğunda, hücreler lazer ışını tarafından parçalanabilir ve DNA ekstraksiyonunu etkileyebilir.

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmezler.

Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (81671006, 81300894), CAMS Tıp Bilimleri İnovasyon Fonu (2019-I2M-5-038), Ulusal klinik anahtar disiplin inşaat projesi (PKUSSNKP-202102), Pekin Üniversitesi Sağlık Bilimleri Merkezi (BMU2022BSS001) Üstün Doktora Adayları için İnovasyon Fonu.