Isolamento de Células com Informações Morfológicas e Espaciais de Amostras de Fibrose Submucosa Oral por Microdissecção por Captura a Laser

A microdissecção por captura a laser de tecidos de fibrose submucosa oral permite a extração precisa de células de regiões histológicas de interesse para a análise de dados multi-ômicos com informações morfológicas e espaciais.

A fibrose submucosa oral (FSO) é um tipo comum de doença potencialmente maligna na cavidade oral. A atrofia do epitélio e a fibrose da lâmina própria e da submucosa são frequentemente encontradas nas lâminas histopatológicas. Displasia epitelial, atrofia epitelial e fibroblastos senescentes têm sido propostos como associados à transformação maligna da FSO. No entanto, devido à heterogeneidade de doenças orais potencialmente malignas e carcinoma epidermóide oral, é difícil identificar os mecanismos moleculares específicos de transformação maligna em FSO. Apresentamos um método para obter um pequeno número de células epiteliais ou mesenquimais carregando dados morfológicos e informações espaciais por microdissecção por captura a laser em lâminas de tecido fixadas em formalina e emblocadas em parafina. Usando um microscópio, podemos capturar precisamente em microescala (~500 células) tecido epitelial displásico ou atrófico e tecido subepitelial fibrótico. As células extraídas podem ser avaliadas por sequenciamento genômico ou transcriptoma para aquisição de dados genômicos e transcriptômicos com informações morfológicas e espaciais. Essa abordagem elimina a heterogeneidade do sequenciamento tecidual de OSF em massa e a interferência causada por células em áreas não lesionadas, permitindo uma análise espacial-ômica precisa do tecido OSF.

A fibrose submucosa oral (FSO) é uma doença crônica e insidiosa que se desenvolve principalmente na mucosa bucal e resulta em restrição da abertura^bucal1. Enquanto a FSO é uma doença multifatorial, a mastigação da noz de areca ou noz de betel é a principal causa de FSO ^2,3. Devido a esse hábito geograficamente específico, a FSO está predominantemente concentrada em populações do Sudeste e Sul da Ásia³. As características histológicas comuns da FSO incluem deposição anormal de colágeno no tecido conjuntivo abaixo do epitélio da mucosa oral, estenose vascular e oclusão¹. O tecido epitelial da FSO pode apresentar manifestações de atrofia ou hiperplasia e até displasia quando concomitante à leucoplasia^oral4,5.

A FSO é definida pela Organização Mundial da Saúde como uma doença oral comum potencialmente maligna (DMOP) que apresenta potencial para evoluir para carcinoma epidermóide oral com taxa de transformação maligna de 4%-6%6,7,8,9. O mecanismo subjacente à transformação maligna da FSO é complexo¹⁰. O crescimento anormal do epitélio, incluindo tanto displasia quanto atrofia, aumenta o potencial de carcinogênese, e fibroblastos senescentes no estroma podem estar envolvidos na progressão maligna da FSO por induzir a transição epitélio-mesenquimal (TEM) através de espécies reativas de oxigênio (EROs) e outras moléculas¹⁰.

Tecnologias para análises espaço-ômicas geraram dados multi-ômicos com informações morfológicas e espaciais que forneceram informações sobre os mecanismos do câncer^11,12,13. Aqui, apresentamos um protocolo para capturar populações celulares relacionadas à morfologia de tecido OSF fixado em formalina e embebido em parafina por microdissecção a laser. Análises multi-ômicas dessas amostras podem superar desafios com heterogeneidade intratecidual e aumentar a compreensão da patologia molecular e dos mecanismos de transformação maligna em FSO¹⁴.

Este estudo foi aprovado pelo comitê de ética em pesquisa da Escola e Hospital da Universidade de Pequim. Os pacientes assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido. As amostras de tecido utilizadas neste estudo foram desidentificadas. O esquema do estudo é mostrado na Figura 1.

1. Preparação da amostra

1. Corte tecidos de fibrose oral submucosa fixados em formalina e fixados em parafina em cortes contínuos de 3 μm e 10 μm de espessura em micrótomo.
2. Desdobre as seções na água e, em seguida, pesque nos escorregadores. Fixar os cortes de 3 μM e 10 μm nas lâminas do microscópio de adesão (lâmina A) e PEN-membrana (lâmina B), respectivamente.
3. Coloque as lâminas numa placa quente a 60 °C durante 2 horas.

2. Coloração hematoxilina-eosina

1. Coloque as lâminas A e B em xileno (CUIDADO) por 10 min e repita esta etapa três vezes.
2. Hidratar as lâminas A e B em soluções graduadas de etanol da ordem de 100%, 100%, 90%, 80% e 70% por 1 min em cada concentração.
3. Coloque as corrediças A e B em água destilada ultrapura por 30 s
4. Colocar as lâminas A e B em solução corante de hematoxilina Harris por 90 s.
5. Coloque as lâminas A e B em água destilada ultrapura por 30 s e repita esta etapa três vezes.
6. Coloque as lâminas A e B em solução de div-hematoxilina (CUIDADO) por 2 s.
7. Coloque as lâminas A e B em água destilada ultrapura por 30 s e repita esta etapa três vezes.
8. Coloque as lâminas em A e B em solução reazul a 1% por 2 s.
9. Coloque as lâminas A e B em água destilada ultrapura por 30 s e repita esta etapa três vezes.
10. Coloque as lâminas em solução de eosina por 2 s.
11. Coloque as lâminas A e B em água destilada ultrapura por 30 s e repita esta etapa três vezes.
12. Desidratar as lâminas em soluções graduadas de etanol da ordem de 70%, 80%, 90%, 100% e 100% por 2 s em cada concentração.
13. Coloque o slide A em xileno por 3 min e repita este passo duas vezes.
14. Adicione uma gota de meio de montagem (CUIDADO) ao slide A e cubra com um vidro de cobertura.

3. Observação da morfologia histológica e microdissecção por captura a laser

1. Iniciar o sistema de microdissecção a laser e o software (Figura 2).
2. Coloque a lâmina A no palco da lâmina e observe a morfologia histológica para identificar a área de interesse para microdissecção a laser.
3. Remova o slide A e coloque o slide B inversamente no palco do slide.
4. Clique no botão Unload (Figura 2) para enviar o dispositivo de coleta. Insira um tubo de reação em cadeia da polimerase (PCR) no dispositivo de coleta e certifique-se de que o tubo seja mantido fixo. Clique no botão OK (Figura 3).
5. Selecione uma tampa clicando no círculo vermelho correspondente marcando o Dispositivo coletor: tampas de tubo. O círculo selecionado ficará verde.
6. Clique no botão Desenhar e no botão Desenhar + Recortar e use o mouse para esboçar a área de interesse.
7. Clique no botão Iniciar Recorte para capturar a área de interesse; a amostra capturada será coletada pela tampa (Figura 4).
8. Clique no botão Inferior para garantir que a amostra capturada seja coletada (Figura 5).
9. Clique no botão Amostra para capturar a próxima amostra.
10. Clique no botão Descarregar para descarregar o tubo de PCR com a amostra capturada.

Através da microdissecção a laser dos tecidos da OSF, foram capturadas amostras de epitélio displásico, estroma abaixo do epitélio displásico, epitélio atrófico e estroma abaixo do tecido epitelial atrófico (Figura 1). Através da extração de DNA e sequenciamento do genoma completo em baixa profundidade, pudemos analisar as alterações no número de cópias relacionadas à morfologia (CNA)¹⁵. O CNA é uma forma comum de instabilidade genômica associada a um risco aumentado de transformação maligna na DMOP^15,16. Foram detectados diferentes padrões de CNA entre quatro tipos de amostras. Como mostrado na Figura 6, o CNA estava presente nas amostras epiteliais, mas não nas amostras do estroma. Embora as amostras tenham sido originadas do mesmo paciente, o padrão do CNA no epitélio displásico não foi o mesmo do epitélio atrófico. O CNA nos cromossomos 3 e 8 foi detectado no epitélio displásico, enquanto o CNA foi detectado em menor frequência no cromossomo 8 no epitélio atrófico.

Figura 1: Esquema de microdissecção por captura a laser de amostras de fibrose submucosa oral. Os tecidos de epitélio e estroma com diferentes padrões são captados a laser ao microscópio. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Software de microdissecção a laser. Uma captura de tela do software mostrando o painel ao vivo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Janela do dispositivo do coletor. Uma captura de tela do software mostrando a janela do dispositivo coletor para selecionar o dispositivo de coleta. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Captura da amostra na área de interesse. Clicar no botão Start Cut permitirá capturar a área de interesse. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Amostra capturada. A amostra capturada pode ser vista na tampa do tubo de PCR. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6: Alterações no número da cópia. Os resultados representativos de diferentes padrões de alterações no número de cópias entre várias amostras. Existem diferentes alterações no número de cópias entre o epitélio displásico e o epitélio atrófico. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Este protocolo relatou um pipeline para capturar amostras de tecido OSF com informações morfológicas e espaciais para análises espaço-ômicas adicionais através de microdissecção a laser. A partir dos resultados representativos, identificamos diferentes padrões de CNA entre várias amostras relacionadas à morfologia.

OSF, um tipo de DMOP, é uma condição pré-cancerosa comum do carcinoma epidermóide oral6^. A instabilidade genômica tem sido relatada como associada ao desenvolvimento e transformação maligna da DMOP^17,18. Múltiplos estudos têm relatado alterações cromossômicas, expressão gênica diferencial e variações epigenéticas associadas à progressão e transformação maligna da FSO a partir de dados genômicos, transcriptômicos e proteômicos19,20,21,22,23,24. Os componentes carcinogênicos da noz de areca, como a arecolina, não só levaram ao desenvolvimento da FSO, mas a estimulação a longo prazo também induziu a senescência de fibroblastos e EMT e a produção contínua de espécies reativas de oxigênio (EROs), resultando em transformação maligna pela regulação do microambiente imune e vias de sinalização como os sinais TGF-β e NF-κB^{5, 10,21}. No entanto, alterações histológicas epiteliais e estromais anormais estão presentes nos tecidos da FSO, e quais alterações teciduais ou celulares conduzem a transformação maligna na FSO ainda não estão claras. Estudos anteriores utilizaram principalmente análises de sequenciamento em massa, nas quais o DNA ou RNA foi extraído de um bloco de tecido para analisar melhor a expressão molecular e as vias envolvidas. No entanto, essa análise não teve correlação morfológica com a histologia e ignorou a heterogeneidade intratecidual; Além disso, essa abordagem não pode identificar se há alterações moleculares diferenciais em diferentes áreas histológicas.

Estudos recentes têm relatado análise espacial-ômica em diversas doenças11,13,25. Através de análises espaço-ômicas precisas, um número crescente de moléculas e alvos está sendo descoberto e interações celulares e agrupamento estão sendo elucidados^11,12,13. No entanto, ainda há uma falta de análise ômica espacialmente resolvida da OSF. As amostras de FSO foram geralmente retiradas de biópsias da mucosa oral e preparadas como pequenos volumes de amostras fixadas em formalina e incluídas em parafina, dificultando a realização do sequenciamento espacial de célula única, que necessita de grandes amostras. Portanto, o desenvolvimento de métodos com resolução espacial utilizando amostras fixadas em formalina e incluídas em parafina pode ser um benefício significativo. Esperamos que o protocolo atual beneficie os pesquisadores que trabalham com OSF e outros tipos de OPMD e contribua para a compreensão dos mecanismos de desenvolvimento e transformação maligna do OPMD.

Este método tem algumas limitações. Primeiramente, o protocolo foi realizado com amostras fixadas em formalina e incluídas em parafina, dificultando a extração de RNA para análise em sequenciamento; no entanto, a análise de sequenciamento de RNA relacionado à morfologia pode ser realizada quando se utiliza coloração violeta cristalina e manutenção de práticas assépticas^15,26. As amostras atualmente capturadas não podem atingir o nível de resolução de célula única porque quando o número de células é muito pequeno, as células podem ser quebradas pelo feixe de laser, afetando a extração de DNA.

Os autores declaram a inexistência de conflitos de interesse.

Este trabalho foi apoiado por bolsas de pesquisa da National Nature Science Foundation of China (81671006, 81300894), CAMS Innovation Fund for Medical Sciences (2019-I2M-5-038), National clinical key discipline construction project (PKUSSNKP-202102), Innovation Fund for Outstanding Doctoral Candidates of Peking University Health Science Center (BMU2022BSS001).