Method Article
לכידת לייזר microdissection של רקמות פיברוזיס submucous הפה מאפשר מיצוי מדויק של תאים מאזורים היסטולוגיים של עניין לניתוח של נתונים multi-omics עם מידע מורפולוגי ומרחבי.
פיברוזיס תת-רירית אוראלית (OSF) היא סוג נפוץ של הפרעה שעלולה להיות ממאירה בחלל הפה. ניוון אפיתל ופיברוזיס של lamina propria ואת submucosa נמצאים לעתים קרובות על שקופיות היסטופתולוגיות. דיספלסיה אפיתליאלית, ניוון אפיתל ופיברובלסטים מזדקנים הוצעו כקשורים לשינוי ממאיר של OSF. עם זאת, בגלל ההטרוגניות של הפרעות אוראליות שעלולות להיות ממאירות וקרצינומה של תאי קשקש אוראליים, קשה לזהות את המנגנונים המולקולריים הספציפיים של טרנספורמציה ממאירה ב- OSF. כאן, אנו מציגים שיטה להשגת מספר קטן של תאים אפיתליאליים או מזנכימליים הנושאים נתונים מורפולוגיים ומידע מרחבי על ידי לכידת לייזר microdissection על שקופיות רקמה משובצות פרפין קבוע פורמלין. באמצעות מיקרוסקופ, אנו יכולים ללכוד במדויק מיקרוסקאלה (~ 500 תאים) רקמת אפיתל דיספלסטית או אטרופית ורקמה תת-אפיתל פיברוטית. ניתן להעריך את התאים שחולצו על ידי ריצוף גנום או שעתוק כדי להשיג נתונים גנומיים ושעתוק עם מידע מורפולוגי ומרחבי. גישה זו מסירה את ההטרוגניות של ריצוף רקמות OSF בתפזורת ואת ההפרעה הנגרמת על ידי תאים באזורים שאינם נגועים, ומאפשרת ניתוח מרחבי מדויק של רקמת OSF.
פיברוזיס תת-רירית אוראלית (OSF) היא מחלה כרונית וחתרנית המתפתחת בעיקר ברירית הבוקאלית וגורמת לפתיחת פה מוגבלת1. בעוד OSF היא מחלה multifactorial, אגוז ארקה או אגוז betel לעיסה היא הגורם העיקרי של OSF 2,3. בגלל הרגל גיאוגרפי ספציפי זה, OSF מרוכז בעיקר באוכלוסיות בדרום מזרח ודרום אסיה3. המאפיינים ההיסטולוגיים הנפוצים של OSF כוללים שקיעת קולגן חריגה ברקמת החיבור מתחת לאפיתל רירית הפה, היצרות כלי הדם וחסימה1. רקמת אפיתל OSF יכולה להציג עם ביטויים של ניוון או hyperplasia ואפילו דיספלסיה כאשר במקביל leukoplakia אוראלי 4,5.
OSF מוגדר על ידי ארגון הבריאות העולמי כהפרעה פומית פוטנציאלית ממאירה נפוצה (OPMD) המציגה את הפוטנציאל להתקדם לקרצינומה של תאי קשקש אוראליים עם שיעור טרנספורמציה ממאירה של 4%-6%6,7,8,9. המנגנון העומד בבסיס הטרנספורמציה הממאירה של OSF הוא מורכב10. גדילה חריגה של האפיתל, כולל דיספלזיה וניוון, מגבירה את הפוטנציאל לקרצינוגנזה, ופיברובלסטים מזדקנים בסטרומה עשויים להיות מעורבים בהתקדמות הממאירה של OSF על ידי גרימת מעבר אפיתל-מזנכימלי (EMT) דרך מיני חמצן תגובתי (ROS) ומולקולות אחרות10.
טכנולוגיות לניתוחים מרחביים-אומיים הפיקו נתונים רב-אומיים עם מידע מורפולוגי ומרחבי שסיפקו תובנות לגבי מנגנוני סרטן11,12,13. כאן, אנו מציגים פרוטוקול ללכידת אוכלוסיות תאים הקשורות למורפולוגיה מרקמת OSF משובצת פרפין קבועה פורמלין על ידי מיקרודיסקציה בלייזר. ניתוחים רב-אומיים של דגימות אלה יכולים להתגבר על אתגרים עם הטרוגניות תוך רקמתית ולהגביר את ההבנה של הפתולוגיה המולקולרית והמנגנונים של טרנספורמציה ממאירה ב- OSF14.
מחקר זה אושר על ידי ועדת הביקורת המוסדית של בית הספר ובית החולים של אוניברסיטת פקין. התקבלה הסכמה מדעת מהמטופלים. דגימות הרקמה ששימשו במחקר זה לא זוהו. סכמת המחקר מוצגת באיור 1.
1. הכנת מדגם
2. צביעת Hematoxylin-eosin
3. תצפית על מורפולוגיה היסטולוגית ומיקרודיסקציה לכידת לייזר
על-ידי ביצוע מיקרודיסקציה בלייזר של רקמות OSF, לכדנו דגימות של אפיתל דיספלסטי, סטרומה מתחת לאפיתל דיספלסטי, אפיתל אטרופי וסטרומה מתחת לרקמת אפיתל אטרופית (איור 1). באמצעות חילוץ דנ"א וריצוף גנום שלם בעומק נמוך, הצלחנו לנתח שינויים הקשורים למורפולוגיה של מספרי העתקים (CNA)15. CNA היא צורה נפוצה של חוסר יציבות גנומית הקשורה לסיכון מוגבר לשינוי ממאיר ב- OPMD15,16. זיהינו דפוסי CNA שונים בין ארבעה סוגים של דגימות. כפי שניתן לראות באיור 6, CNA היה נוכח בדגימות אפיתל אך לא בדגימות סטרומה. למרות שהדגימות הגיעו מאותו חולה, דפוס CNA באפיתל הדיפלסטי לא היה זהה לזה שבאפיתל האטרופי. CNA בכרומוזומים 3 ו-8 זוהה באפיתל דיספלסטי, ואילו CNA זוהה בתדירות נמוכה יותר בכרומוזום 8 באפיתל אטרופי.
איור 1: סכימת לכידת לייזר של מיקרודיסקציה של דגימות פיברוזיס תת-ריריות דרך הפה. רקמות אפיתל וסטרומה עם דפוסים שונים נלכדים על ידי לייזר תחת מיקרוסקופ. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: תוכנת מיקרודיסקציה בלייזר. צילום מסך של התוכנה המציג את הפאנל החי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: חלון התקן אספן. צילום מסך של התוכנה המציג את חלון התקן האספן לבחירת התקן האיסוף. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: לכידת הדגימה בתחום העניין. לחיצה על כפתור התחל גזירה תאפשר לכידת תחום העניין. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: מדגם שנלכד. ניתן לראות את הדגימה שנלכדה במכסה של צינור ה- PCR. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: העתקת שינויים במספר. התוצאות המייצגות של דפוסים שונים של שינויים במספר העותקים בין מדגמים שונים. ישנם שינויים שונים במספר ההעתקה בין אפיתל דיספלסטי לבין אפיתל אטרופי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
פרוטוקול זה דיווח על צינור ללכידת דגימות רקמת OSF עם מידע מורפולוגי ומרחבי לניתוחים מרחביים-אומיים נוספים באמצעות מיקרודיסקציה בלייזר. מהתוצאות המייצגות, זיהינו דפוסי CNA שונים בקרב דגימות שונות הקשורות למורפולוגיה.
OSF, סוג של OPMD, הוא מצב טרום סרטני נפוץ של קרצינומה של תאי קשקש אוראליים6. דווח כי חוסר יציבות גנומית קשורה להתפתחות וטרנספורמציה ממאירה של OPMD17,18. מחקרים רבים דיווחו על שינויים בכרומוזומים, ביטוי גנים דיפרנציאלי ושינויים אפיגנטיים הקשורים להתקדמות וטרנספורמציה ממאירה של OSF מנתוני גנומיקה, שעתוק ופרוטאומיקה 19,20,21,22,23,24. המרכיבים המסרטנים של אגוז ארקה, כגון ארקולין, לא רק הובילו לפיתוח OSF, אלא שהגירוי ארוך הטווח גם גרם להזדקנות של פיברובלסטים ו- EMT וייצור מתמשך של מיני חמצן תגובתי (ROS), ובכך הביא לשינוי ממאיר על ידי ויסות המיקרו-סביבה החיסונית ומסלולי אותות כגון TGF-β ואותות NF-κB5, 10,21. עם זאת, הן שינויים אפיתליאליים חריגים והן שינויים היסטולוגיים סטרומליים קיימים ברקמות OSF, ואילו שינויים רקמתיים או תאיים מניעים את השינוי הממאיר ב- OSF נותר לא ברור. מחקרים קודמים השתמשו בעיקר בניתוחי ריצוף בתפזורת, שבהם DNA או RNA הופק מגוש רקמה כדי לנתח עוד יותר את הביטוי המולקולרי ואת המסלולים המעורבים. עם זאת, ניתוח זה היה חסר מתאם מורפולוגי עם היסטולוגיה והתעלם מההטרוגניות התוך-רקמתית; יתר על כן, גישה זו אינה יכולה לזהות אם קיימים שינויים מולקולריים דיפרנציאליים באזורים היסטולוגיים שונים.
מחקרים אחרונים דיווחו על ניתוח מרחבי-אומי במחלות רבות11,13,25. באמצעות ניתוח מרחבי-אומי מדויק, מתגלים מספר גדל והולך של מולקולות ומטרות, ואינטראקציות תאיות ואשכולות מתבררים11,12,13. עם זאת, עדיין חסר ניתוח אומיקס פתור מרחבית של OSF. דגימות OSF נלקחו בדרך כלל מביופסיות של רירית הפה והוכנו ככמויות קטנות של דגימות קבועות פורמלין, משובצות פרפין, מה שמקשה על ביצוע ריצוף אומיקס מרחבי חד-תאי, המצריך דגימות גדולות. לכן, פיתוח שיטות ברזולוציה מרחבית באמצעות דגימות משובצות פרפין קבועות פורמלין עשוי להיות יתרון משמעותי. אנו מצפים שהפרוטוקול הנוכחי יועיל לחוקרים העובדים על OSF וסוגים אחרים של OPMD ויתרום להבנת מנגנוני הפיתוח והטרנספורמציה הממאירה של OPMD.
לשיטה זו יש כמה מגבלות. ראשית, הפרוטוקול בוצע באמצעות דגימות משובצות פרפין קבועות פורמלין, מה שהקשה על חילוץ RNA לניתוח ריצוף; עם זאת, ניתן לבצע ניתוח ריצוף RNA הקשור למורפולוגיה בעת שימוש בצביעה סגולה גבישית ושמירה על פרקטיקות אספטיות 15,26. הדגימות שנלכדו כעת לא יכלו לעמוד ברמת הרזולוציה של תא בודד מכיוון שכאשר מספר התאים קטן מדי, התאים עלולים להתפרק על ידי קרן הלייזר, מה שמשפיע על מיצוי ה- DNA.
המחברים מצהירים כי אין ניגוד עניינים.
עבודה זו נתמכה על ידי מענקי מחקר מהקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (81671006, 81300894), קרן החדשנות CAMS למדעי הרפואה (2019-I2M-5-038), פרויקט הבנייה הלאומי של דיסציפלינה קלינית מרכזית (PKUSSNKP-202102), קרן חדשנות לדוקטורנטים מצטיינים של המרכז למדעי הבריאות באוניברסיטת פקין (BMU2022BSS001).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Adhesion microscope slides | CITOTEST | REF.188105 | |
Div-haematoxylin | YiLi | 20230326 | |
Eosin solution | BASO | BA4098 | |
Ethanol | PEKING REAGENT | No.32061 | |
Harris hematoxylin dye solution | YiLi | 20230326 | |
Hot plate | LEICA | HI1220 | |
Laser capture microdissection system | LEICA | LMD7 | Machine |
Laser microdissection microsystem | LEICA | 8.2.3.7603 | Software |
Micromount mounting medium | LEICA | REF.3801731 | |
Microscope cover glass | CITOTEST | REF.10212450C | |
Microtome | LEICA | RM2235 | |
PCR tubes | AXYGEN | 16421959 | |
PEN-membrane slides | LEICA | No.11505158 | |
Re-blue solution | YiLi | 20230326 | |
Ultrapure distilled water | Invitrogen | REF.10977-015 | |
Xylene | PEKING REAGENT | No.33535 |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved