激光捕获显微切割从口腔粘膜下纤维化样本中分离具有形态学和空间信息的细胞

口腔粘膜下纤维化组织的激光捕获显微切割允许从感兴趣的组织学区域精确提取细胞，以分析具有形态学和空间信息的多组学数据。

口腔粘膜下纤维化 （OSF） 是口腔中一种常见的潜在恶性疾病。上皮萎缩以及固有层和粘膜下层的纤维化经常在组织病理学载玻片上发现。上皮发育不良、上皮萎缩和衰老成纤维细胞被认为与 OSF 的恶性转化有关。然而，由于潜在恶性口腔疾病和口腔鳞状细胞癌的异质性，很难确定OSF中恶性转化的具体分子机制。在这里，我们提出了一种通过在福尔马林固定石蜡包埋的组织载玻片上进行激光捕获显微切割来获得少量携带形态学数据和空间信息的上皮或间充质细胞的方法。使用显微镜，我们可以精确捕获微尺度（~500 个细胞）发育不良或萎缩的上皮组织和纤维化上皮下组织。提取的细胞可以通过基因组或转录组测序进行评估，以获取具有形态学和空间学信息的基因组和转录组数据。这种方法消除了大量OSF组织测序的异质性和非病变区域细胞引起的干扰，从而可以对OSF组织进行精确的空间组学分析。

口腔粘膜下纤维化 （OSF） 是一种慢性隐匿性疾病，主要发生在颊粘膜，导致张口受限¹。虽然 OSF 是一种多因素疾病，但槟榔或咀嚼槟榔是 OSF^{的主要原因 2,3}。由于这种地理上特定的习性，OSF主要集中在东南亚和南亚的人群中³。OSF 的常见组织学特征包括口腔黏膜上皮下方结缔组织中胶原蛋白异常沉积、血管狭窄和闭塞¹。OSF上皮组织可表现为萎缩或增生，甚至在口腔白斑时出现异型增生^4,5。

OSF 被世界卫生组织定义为一种常见的口腔潜在恶性疾病 （OPMD），具有进展为口腔鳞状细胞癌的潜力，恶性转化率为 4%-6%6,7,8,9。OSF恶性转化的机制是复杂的¹⁰。上皮细胞的异常生长，包括发育不良和萎缩，增加了致癌的可能性，基质中的衰老成纤维细胞可能通过活性氧 （ROS） 和其他分子诱导上皮-间充质转化 （EMT） 参与 OSF 的恶性进展¹⁰。

空间组学分析技术生成了具有形态学和空间信息的多组学数据，为癌症机制提供了见解^11,12,13。在这里，我们提出了一种通过激光显微切割从福尔马林固定石蜡包埋的OSF组织中捕获形态相关细胞群的方案。对这些样本进行多组学分析可以克服组织内异质性的挑战，并增加对 OSF¹⁴ 中分子病理学和恶性转化机制的理解。

本研究经北京大学附属学校机构评审委员会批准。已获得患者的知情同意。本研究中使用的组织样本被去标识化。研究方案如图 1所示。

1. 样品制备

1. 在切片机上将福尔马林固定石蜡包埋的口腔粘膜下纤维化组织切成3μm和10μm厚度的连续切片。
2. 在水中展开各部分，然后捞到载玻片上。将3μM和10μm切片分别固定在粘附显微镜载玻片（载玻片A）和PEN膜载玻片（载玻片B）上。
3. 将载玻片放在60°C的热板上2小时。

2.苏木精-伊红染色

1. 将载玻片A和B置于二甲苯（注意）中10分钟，并重复此步骤三次。
2. 在分级乙醇溶液中以100%，100%，90%，80%和70%的顺序将A和B水合物载玻片1分钟。
3. 将载玻片 A 和 B 置于超纯蒸馏水中 30 秒
4. 将载玻片A和B置于Harris苏木精染料溶液中90秒。
5. 将载玻片A和B置于超纯蒸馏水中30秒，并重复此步骤三次。
6. 将载玻片A和B置于二苏木精溶液（注意）中2秒。
7. 将载玻片A和B置于超纯蒸馏水中30秒，并重复此步骤三次。
8. 将载玻片置于 A 和 B 中，置于 1% 再发蓝溶液中 2 秒。
9. 将载玻片A和B置于超纯蒸馏水中30秒，并重复此步骤三次。
10. 将载玻片放入曙红溶液中 2 秒。
11. 将载玻片A和B置于超纯蒸馏水中30秒，并重复此步骤三次。
12. 在分级乙醇溶液中以70%，80%，90%，100%和100%的顺序脱水载玻片，每个浓度为2秒。
13. 将载玻片A置于二甲苯中3分钟，然后重复此步骤两次。
14. 在载玻片 A 中加入一滴安装介质 （CAUTION） 并用盖玻片盖住它。

3.组织形态观察和激光捕获显微解剖

1. 启动激光显微切割系统和软件（图2）。
2. 将载玻片A放在载玻片台上并观察组织学形态，以确定激光显微切割的感兴趣区域。
3. 取下载玻片 A，将载玻片 B 反向放在载玻片台上。
4. 单击 "卸载 "按钮（图 2）以推出收集设备。将聚合酶链式反应 （PCR） 管插入收集装置并确保管保持固定。单击 OK 按钮（图 3）。
5. 通过单击标记收集器设备的相应红色圆圈来选择盖 子:管盖。选定的圆圈将变为绿色。
6. 单击" 绘图 "按钮和 "绘制 + 剪切 "按钮，然后使用鼠标绘制感兴趣区域的草图。
7. 单击" 开始切割 "按钮以捕获感兴趣的区域;捕获的样品将由盖子收集（图4）。
8. 单击 "下" 按钮以确保收集捕获的样本（图 5）。
9. 单击" 标本 "按钮以捕获下一个样品。
10. 单击"卸载"按钮，将捕获的样本 卸载 到PCR管中。

通过对OSF组织进行激光显微切割，我们捕获了发育不良上皮、发育不良上皮下的基质、萎缩上皮和萎缩上皮组织下的基质样本（图1）。通过提取DNA和低深度全基因组测序，我们能够分析形态学相关的拷贝数改变（CNA）¹⁵。CNA 是一种常见的基因组不稳定形式，与 OPMD^15,16 中恶性转化的风险增加有关。我们在4种样本中检测到不同的CNA模式。如图 6 所示，CNA 存在于上皮样本中，但不存在于基质样本中。虽然样本来自同一患者，但发育不良上皮细胞中的 CNA 模式与萎缩性上皮细胞中的 CNA 模式不同。在发育不良的上皮细胞中检测到 3 号和 8 号染色体中的 CNA，而在萎缩性上皮细胞的 8 号染色体中检测到 CNA 的频率较低。

图1:口腔粘膜下纤维化样本激光捕获显微切割方案。 在显微镜下通过激光捕获具有不同图案的上皮和基质组织。 请点击这里查看此图的较大版本.

图 2:激光显微切割软件。 显示实时面板的软件屏幕截图。 请点击这里查看此图的较大版本.

图 3:收集器设备窗口。 显示用于选择收集设备的收集器设备窗口的软件屏幕截图。 请点击这里查看此图的较大版本.

图 4:捕获感兴趣区域中的样品。 单击" 开始切割 "按钮将允许捕获感兴趣的区域。 请点击这里查看此图的较大版本.

图 5:捕获的样本。 捕获的样品可以在PCR管的盖子中看到。 请点击这里查看此图的较大版本.

图 6:拷贝数更改。 不同样品间不同拷贝数改变模式的代表性结果。发育不良上皮和萎缩性上皮之间存在不同的拷贝数改变。 请点击这里查看此图的较大版本.

该协议报告了一个管道，用于捕获具有形态和空间信息的OSF组织样本，以便通过激光显微切割进行进一步的空间组学分析。从代表性结果中，我们在各种形态相关样品中鉴定出不同的CNA模式。

OSF 是 OPMD 的一种，是口腔鳞状细胞癌⁶ 的常见癌前病变。据报道，基因组不稳定性与 OPMD^17,18 的发展和恶性转化有关。多项研究从基因组学、转录组学和蛋白质组学数据中报告了与 OSF 进展和恶性转化相关的染色体改变、差异基因表达和表观遗传变异 19,20,21,22,23,24.槟榔的致癌成分如槟榔碱，不仅导致了OSF的发生，而且长期的刺激还诱导成纤维细胞和EMT的衰老和活性氧（ROS）的持续产生，从而通过调节免疫微环境和TGF-β和NF-κB信号等信号通路导致恶性转化^5，10,21.然而，OSF 组织中同时存在异常的上皮和基质组织学变化，哪些组织或细胞改变驱动了 OSF 的恶性转化仍不清楚。以前的研究大多使用批量测序分析，其中从组织块中提取DNA或RNA以进一步分析分子表达和相关途径。然而，该分析缺乏与组织学的形态学相关性，并且忽略了组织内的异质性;此外，这种方法无法确定不同组织学区域是否存在不同的分子改变。

最近的研究报道了许多疾病的空间组学分析^11,13,25。通过精确的空间组学分析，越来越多的分子和靶标被发现，细胞相互作用和聚类正在被阐明^11,12,13。然而，目前仍缺乏对OSF进行空间分辨的组学分析。OSF样本通常取自口腔黏膜活检，制备为少量福尔马林固定、石蜡包埋的样本，因此难以进行需要大量样本的单细胞空间组学测序。因此，使用福尔马林固定石蜡包埋样品开发具有空间分辨率的方法可能是一个显着的好处。我们预计目前的协议将使从事OSF和其他类型的OPMD的研究人员受益，并有助于理解OPMD的发展和恶性转化的机制。

此方法有一些局限性。首先，该方案使用福尔马林固定石蜡包埋的样品进行，因此难以提取RNA进行测序分析;然而，当使用结晶紫染色和维持无菌实践时，可以进行形态学相关的RNA测序分析^15,26。目前捕获的样本无法达到单细胞分辨率的水平，因为当细胞数量太少时，细胞可能会被激光束分解，影响DNA提取。

作者声明没有利益冲突。

本研究得到了国家自然科学基金（81671006、81300894）、中国医学科学院医学创新基金（2019-I2M-5-038）、国家临床重点学科建设项目（PKUSSNKP-202102）、北京大学医学部优秀博士生创新基金（BMU2022BSS001）的资助。