Moğol tıbbına dayalı Sıçanlarda Kronik Öngörülemeyen Hafif Stres

Bu protokol, Moğol tıp teorisine dayanan depresyon için kronik öngörülemeyen hafif stres (CUMS) modelini ve davranışsal testleri doğrulama yöntemlerini ana hatlarıyla belirtir.

Depresyon yaygın bir duygusal bozukluktur ve küresel engelliliğin önde gelen bir nedenini oluşturur. Mevcut farmakolojik müdahalelerin sınırlamaları, bu duruma atfedilen önemli sağlık yüküne katkıda bulunmaktadır. Depresyonun altında yatan mekanizmaların daha derin bir şekilde anlaşılmasına acil bir ihtiyaç vardır ve bu da translasyon potansiyeline sahip klinik öncesi modelleri son derece değerli kılmaktadır. Geleneksel tıbbın bir alt kümesi olan Moğol tıbbı, hastalık oluşumunun rüzgar, safra ve balgam dengesine yakından bağlı olduğunu öne sürer. Bu çalışmada, sıçanlarda kronik öngörülemeyen hafif stres (CUMS) yöntemi için bir protokol sunuyoruz. Bu çerçevede, sıçanlar, insan depresyonunun patogenezini taklit eden depresyon benzeri bir fenotipi indüklemek için bir dizi dalgalı, hafif stresöre maruz bırakılır. Bu protokolde kullanılan davranışsal testler arasında, depresyonun temel bir belirtisi olan anhedoninin göstergesi olan sükroz tercih testi (SPT); kaygı düzeylerini ölçen açık alan testi (OFT); ve uzamsal hafızayı ve öğrenme yeteneklerini değerlendiren Morris su labirenti testi (MWM). CUMS yöntemi, anhedoniyi indükleme ve uzun vadeli davranışsal eksikliklere neden olma yeteneğini göstermektedir. Ayrıca, bu protokol Moğol tıp teorisi ile depresyon benzeri davranışları ortaya çıkarmak için tasarlanmış diğer hayvan modellerinden daha uyumludur. Bu hayvan modelinin geliştirilmesi ve müteakip araştırmalar, Moğol tıbbı alanında gelecekteki yenilikçi çalışmalar için sağlam bir temel oluşturmaktadır.

Majör depresif bozukluk (MDB), dünya çapında üçüncü önde gelen engellilik nedeni olarak sıralanan ve 300 milyondan fazla insanı etkileyen yaygın bir akıl hastalığıdır^1,2,3. Özellikle, etkilenen bireylerin en az yarısının yeterli tedavi almadığı tahmin edilmektedir⁴. Bu boşluk göz önüne alındığında, hayvan modelleri depresyonun etiyolojisini araştırmak için çok önemli bir araç olarak hizmet vermektedir. Bugüne kadar, depresyon için 20'den fazla farklı hayvan modeli bulunmaktadır⁵. Bunlar arasında, 1987 yılında Paul Winer tarafından rafine edilen kronik öngörülemeyen hafif stres (CUMS) modeli en sık kullanılanıdır⁶. CUMS modeli, kemirgenleri çok çeşitli sosyo-çevresel stres faktörlerine maruz bırakmanın anksiyete, gerginlik ve depresyona benzer semptomlara yol açtığı öncülüyle çalışır. Metodoloji, hayvanları birkaç hafta boyunca çeşitli hafif stres faktörlerine maruz bırakmayı içerir ve bu da anhedoni ve depresif benzeri davranışlar da dahil olmak üzere bir dizi davranış değişikliğiyle sonuçlanır^7,8. Bu değişikliklere, 5-HT'de bir azalma gibi endokrin ve nörotransmitter profillerindeki kaymalar eşlik eder^9,10. Bu sonuçlar, MDB teşhisi konan insanlarda gözlemlenenleri yakından yansıtır ve böylece modelin faydasını doğrular. CUMS modeli, antidepresanları değerlendirmede, yüksek düzeyde yüzeysel, yapısal ve öngörücü geçerlilik gösteren etkinliği nedeniyle özellikle değerlidir^11,12. Diğer modellerden farklı olarak, CUMS, monoaminerjik antidepresanların kronik uygulamasının etkilerine karşı hassastır. Örneğin, sitalopram, paroksetin ve fluoksetin gibi seçici serotonin geri alım inhibitörlerinin (SSRI'lar) kronik stres koşulları altında anhedoniyi önlediği ve tersine çevirdiği gösterilmiştir^12,13. Ek olarak, ketamin gibi yeni hızlı etkili antidepresanlar da bu modelde etkinlik göstermiştir^14,15. Buna karşılık, zorla yüzme testi (FST) ve kuyruk süspansiyon testi (TST) gibi diğer testler, uzun vadeli davranış değişikliklerini modellemek için daha az güvenilirdir ve genellikle depresyon semptomlarına dayanmak yerine akut strese adaptasyonları yansıtır¹⁶. Bu özellikler, depresyon araştırmalarında CUMS modelinin sağlam geçerliliğinin altını çizmektedir. Klasik çalışmalarda yüksek güvenilirliği ile tanınan CUMS modelinin en göze çarpan özelliklerinden biri, anhedoni-günlük aktivitelerde zevk veya ilgi duyma yetersizliğidir^17,18. Bu fenomen yaygın olarak sükroz tercih testleri kullanılarak değerlendirilir ve birçok antidepresanın azalmış sakaroz tüketimini tersine çevirdiği gösterilmiştir. CUMS literatüründe, istemli motor davranışı, keşif eğilimlerini ve gerginliği değerlendiren ve böylece depresyonun şiddetini ölçen açık alan testi (OFT) dahil olmak üzere bazı başka metrikler de yaygın olarak kullanılmaktadır¹⁹. Yükseltilmiş artı labirent (EPM) gibi diğer testler kaygı benzeri davranışları değerlendirir, Morris su labirenti testi (MWM) bilişsel işlevleri inceler²⁰ve FST, olumsuz duygulara ve davranışsal umutsuzluğa duyarlılığı değerlendirir²⁰. Ayrıca, insanları etkileyen stres faktörlerinin çoğu doğası gereği sosyaldir. Sınırlı sosyal aktiviteler, ağlar ve destek ile karakterize edilen optimal olmayan sosyal ilişkilere sahip bireyler, çeşitli hastalıklar için yüksek risk altındadır^21,22. Bu aynı zamanda gruplar halinde yaşayan sosyal hayvanlar olan kemirgenler için de geçerlidir. Örneğin, tecrit altında barındırılan sıçanlar, sosyal strese neden olan ve depresyonun başlangıcını hızlandıran izolasyon sendromu olarak adlandırılan özelliklerin özelliklerini sergiler²³.

Çin tıbbının önemli bir dalı olan Moğol tıbbı, hastalığın başlangıcının içsel ve dış faktörler arasında karmaşık bir etkileşim olduğunu öne sürüyor. Dört yardımcı koşul olarak adlandırılan bu dış faktörler, iklim değişikliği, diyet, yaşam tarzı ve enfeksiyonlar, şaşırtıcı olaylar ve psikolojik bozukluklar gibi ani olayları kapsar. Hastalık süreci, üç tip homor olarak adlandırılan üç unsur ile dört yardımcı koşulla uyum içinde Yedi Bedensel Bileşen arasında devam eden bir etkileşim olarak kavramsallaştırılır²⁴. Moğol tıbbı, insan vücudunun, üç homor arasında göreceli bir denge ile sürdürülen entegre bir varlık olarak işlev gördüğünü savunur. Bu dengedeki bir bozulmanın hastalığın habercisi olduğu düşünülmektedir²⁴. Hayvan deneylerinin geleneksel ve modern tıp arasında köprü kurmadaki önemli rolü göz önüne alındığında, Moğol tıbbı alanındaki araştırmalarla ilgili hayvan modelleri geliştirmek çok önemlidir. Buna göre, bu fizyolojik ve psikolojik stres faktörlerini simüle etmek için CUMS ile birlikte 28 günlük bir izolasyon metodolojisi kullandık. Dokuz spesifik öngörülemeyen stres faktörü seçtik ve bu modelleme yöntemini Moğol tıbbının Üç homor teorisi aracılığıyla desteklemeye çalıştık. Sağlam bir hayvan modeli oluşturmak, Moğol tıbbındaki temel araştırmaları ilerletmek için esastır ve temel çalışmalarına önemli ölçüde katkıda bulunacaktır.

Deney protokolleri, İç Moğolistan Tıp Üniversitesi (YKD202301172) Hayvan Deneyi Bakım Etiği Komitesi'nden onay aldı ve hayvan bakımı ve etiği için Ulusal Sağlık Enstitüleri yönergelerine bağlı kaldı. Hayvan merkezimizin lisans numarası NO.110324230102364187'dir. Her biri 8 haftalık (200 ±g ila 20 g) yirmi dört erkek Sprague-Dawley (SD) sıçanı alındı ve 22 ° C ± 2 ° C sıcaklık ve% 55 ± % 15 nem ile kontrollü bir ortamda barındırıldı. Fareleri kemirgen bakım yemi diyeti ve yatak takımları için mısır koçanı ile saf su ile besleyin. Sıçanlar, deneyden önce 1 hafta boyunca 12 saat / 12 saat aydınlık / karanlık döngüsüne tabi tutuldu.

1. CUMS sıçan modelinin kurulması

1. Grup -landırma
   1. 24 fareyi rastgele 2 gruba ayırın: izolasyon veya strese maruz kalmayacak kontrol (CON) grubu ve model (MOD) grubu. Her grup 12 sıçan içerir.
   2. Fareleri, kafes başına 6 sıçan olacak şekilde 55 cm x 40 cm x 20 cm ölçülerinde standart kafeslerde barındırın. Aksi belirtilmedikçe, iklimlendirme süresi boyunca kafes atamasını koruyun.
   3. Her yetiştirme kafesini yeni yataklarla doldurun ve haftada iki kez değiştirin.
   4. 1 haftalık bir iklimlendirme periyodu gerçekleştirin. CUMS stres etkeni uygulaması dışında, sıçanların yiyecek ve suya sınırsız erişimine izin verin. Aksi belirtilmedikçe, 22°C ± 2°C sıcaklık, %55 ± %15 nem ve 08:00 ile 20:00 arasında 12 saat/12 saat aydınlık/karanlık döngüsü ile sabit bir ortam sağlayın.
   5. Deneyi başlatmadan önce, fareleri araştırmacıya alıştırmak ve deney aşamasında ek stresi en aza indirmek için günlük olarak kullanın.
2. Kronik, öngörülemeyen hafif stres ile izolasyon
   1. Aynı anda MOD ve CON gruplarını ayrı odalara yerleştirin. CON grubu sıçanları bir arada tutarken, MOD grubu sıçanları ayrı ayrı barındırın. Diğer tüm koşulları sabit tutun.
   2. 28 günlük bir stres rejimi uygulayın²⁵. Alışkanlığı önlemek ve stresörün öngörülemezliğini sağlamak için, aynı stres etkenini ardışık günlerde kullanmaktan kaçınarak günde rastgele bir stres etkeni uygulayın.
   3. Aşağıdaki dokuz stres faktöründen^{birini 26,27} farklı günlerde rastgele uygulayın: 24 saat su yoksunluğu, 24 saat gıda yoksunluğu, ıslak dolgu, kafes eğimi, aydınlık/karanlık döngüsünün tersine çevrilmesi, 4 °C'de soğuğa maruz kalma, 45 °C'de ısıya maruz kalma, 1 dakika kuyruk sıkıştırma veya 160 rpm'de 15 dakika sallama. Spesifik tasarım Tablo 1'de özetlenmiştir.
   4. Stres etkeninin uygulanması sırasında, aydınlık/karanlık döngüsünün tersine çevrilmesi dışında, stres bitene kadar MOD grubuna yiyecek ve suya erişimi kısıtlayın. CON grubunun su ve diyeti kısıtlamasına gerek yoktu.
3. Stres yöntemleri
   1. Kontrol grubu hariç tüm sıçanlara 28 günlük izolasyon ile birlikte depresyon uyaranları uygulayarak deneyi başlatın. Bu fareleri ayrı kafeslerde barındırın. Depresyon uyaranlarıyla ilgili durumlar için Tablo 2'ye bakın.
   2. Kuyruk kelepçesi yöntemini gerçekleştirmek için, bir sıçanın kuyruğunu, sıçanın kuyruğunun kökünden 1-2 cm mesafede standart bir ataşla sıkıştırarak MOD grubundan sabitleyin. Sıkıştırma süresini 1 dakikalık bir süre boyunca ölçün (n = 12).
   3. Su yoksunluğu yönteminde, su şişesini çıkararak bir MOD grubu sıçandan suyu alıkoyun ve 24 saat boyunca kaydedin.
      NOT: Su yoksunluğunun başlama zamanı, bitiş zamanının doğru bir şekilde hesaplanabilmesi için kaydedilmiştir; Bu dönemde sıçanların davranışları, aktivite, iştah ve zihinsel durum dahil olmak üzere gözlendi.
   4. Yiyecek yoksunluğu yönteminde, yiyecekleri bir MOD grubu sıçandan alıkoyun ve 24 saat boyunca kaydedin.
      NOT: Bitiş zamanının doğru bir şekilde hesaplanabilmesi için gıda yoksunluğunun başladığı zamanı kaydedin; bu süre zarfında sıçanların yeterince su içtiğinden emin olun; ve bu süre zarfında farelerin davranışlarını, aktivite ve zihinsel durum vb. dahil olmak üzere gözlemleyin.
   5. 4 ° C'de soğuk stimülasyon için, MOD grubundan bir fareyi bir kova soğuk suya koyun ve 5 dakika kaydedin. Test boyunca su sıcaklığının sabit kaldığından emin olun. Deneyin sonunda, fareyi bir üfleyici ile kurulayın ve orijinal kafesine geri koyun.
      NOT: Yükseldiğinde su sıcaklığını düzenlemek için bir termometre ve buz küpleri kullanarak soğuk su sıcaklığını 4 °C'de tutun. Su kalitesinin temiz ve sıcaklığın sabit olmasını sağlamak için su düzenli olarak değiştirilmelidir. Yüzerken, sıçanların tüm uzuvları ve gövdeleri baş hariç soğuk suya batırılmalıdır. Kovanın dibiyle temas nedeniyle sıçanın sudan atlamasını önlemek için suyun derinliği sıçanın vücudunun uzunluğundan daha büyük olmalıdır.
   6. 45 ° C ısı stresi uygulamak için, bir MOD grubu sıçanı bir inkübatöre yerleştirin ve sıcaklığın test boyunca sabit kalmasını sağlayarak 5 dakika boyunca kaydedin.
   7. Aydınlık-karanlık döngüsünün tersine çevrilmesinde, gündüz karanlığını simüle etmek için kafesi 1 saat boyunca siyah bir bezle sarın. Ardından, gün ışığını taklit etmek için kafesi gece boyunca 12 saat aydınlatın. Farenin davranışını, yiyecek ve su alımını ve uyku düzenini 24 saat boyunca kaydedin.
   8. Islak dolgu deneyi için, 100 g dolgu içeren bir kafese 200 mL su verin. Islak kafeste bir MOD grubu sıçan barındırın ve sıçanların aktivite, iştah, su alımı vb. dahil olmak üzere ıslak yatak stresi altındaki davranışlarını kaydedin. Islak dolgunun neden olabileceği sıçanların cilt ve saç durumu gibi herhangi bir anormal davranış veya rahatsız edici reaksiyon olup olmadığını gözlemleyin ve 24 saat boyunca sonraki analizler için bunları zamanında kaydedin. Testin ardından, fareyi bir üfleyici ile kurulayın ve taze odun talaşı içeren bir kafese geri koyun.
   9. Kafes eğimi yönteminde, bir MOD grubu sıçanı bir duvara 45 ° açıyla eğilmiş bir kafese yerleştirin ve 24 saat boyunca kaydedin. Açıyı ayarlamak ve kafesi yerine sabitlemek için kafes çerçeve yapısını kullanın.
      NOT: Baştan sona geçen süreyi hesaplayın ve aktivite, iştah ve zihinsel durum dahil olmak üzere kafesin yatırılma süresi boyunca farelerin davranışlarını gözlemleyin ve eğik kafesin açısının doğru ayarlandığından ve deneyin doğruluğunu ve tekrarlanabilirliğini sağlamak için sabit kaldığından emin olun.
   10. Yüksek hızlı çalkalama için, 160 rpm'ye ayarlanmış mekanik bir çalkalayıcıya bir MOD grubu sıçan yerleştirin ve sıçanı 15 dakika boyunca kaydedin. Modelin başarılı bir şekilde kurulmasını değerlendirmek için daha sonra davranışsal test yöntemleri kullanılır.
   11. Stres faktörlerini uyguladıktan sonra, MOD grubu kafeslerini CUMS odasından muhafaza odasına geri taşıyın. 4 haftalık strese maruz kalma süresi boyunca, CON grubunu konut odasında bulunan ev kafeslerinde tutun.
4. Deneyler sırasında alınacak önlemler
   1. CUMS odasında stres etkenini uyguladıktan sonra MOD grubunun kafeslerini genel konut odasına geri aktarın.
   2. CUMS modellemesi sırasında hayvan izleme
      1. Kuyruk kelepçeleme sırasında, hayvanın indüklenen stimülasyon nedeniyle mücadele etmesi muhtemeldir. Bu süre boyunca, kelepçeyi sürekli olarak izleyin. Yerinden çıkarsa, zamanlayıcıyı duraklatın, kelepçeyi yeniden uygulayın ve ardından zamanlayıcıyı 1 dakika devam ettirin.
      2. Su yoksunluğu ve ıslak yatak stresörlerini aynı anda uygulamayın.
         NOT: Islak dolgu ve su yoksunluğunun aynı anda uygulanmasından kaçınmak, deneysel bütünlüğün korunmasına yardımcı olur, kafa karıştırıcı değişkenleri azaltır ve hayvan refahını destekler.
      3. Hayvanın vücut ısısı ve ortam oda sıcaklığı, soğuk suda yüzme sırasında su sıcaklığını yükseltebilir. Bu nedenle, sabit bir su sıcaklığını korumak için buzlu su veya buz küpleri ekleyerek ayarlayın.
      4. Stresörlerin uygulanması sırasında, günlük tersine çevirme dışında, sıçanları 30 dakikalık aralıklarla gözlemleyin. Titreme, uyuşukluk veya hareket eksikliği gibi olağandışı sıkıntı belirtilerine özellikle dikkat edin. Bu tür semptomlar gözlenirse - özellikle 4 ° C soğuk suda yüzme ve ıslak yatak takımları sırasında potansiyel hipotermi - fareyi derhal stres etkeninden uzaklaştırın.
         NOT: Enfeksiyon, şiddetli travma, agresif davranışlar, anormal hareketlilik vb. gibi sağlık sorunları olduğunda deney hayvanlarını çalışmadan çıkarın, Hayvanları çalışmadan çıkarma koşulları tipik olarak deney sonuçlarının bütünlüğünü sağlarken sağlıklarını ve güvenliklerini koruma etrafında döner.
      5. Her sıçanda yaralar veya diğer fiziksel veya davranışsal anormallikler için günlük denetimler yapın. Herhangi bir anormallik gözlenirse, farenin deneyden çıkarılması gerekip gerekmediğini belirlemek için laboratuvar veterinerine danışın.
      6. Her fareyi her 3 günde bir tartın. Bir hayvan, beslenme öncesi bazal vücut ağırlığının% 20'sinden fazlasını kaybederse, deneyden çıkarılmalıdır.

2. Davranış testleri

1. Başlamak için, depresyon uyaranlarını, kontrol grubu hariç tüm sıçanlara 28 gün boyunca izolasyonla birlikte uygulayın. Fareleri ayrı kafeslerde barındırın. Depresyon uyaran koşullarıyla ilgili ayrıntılar için Tablo 2'ye bakın.
2. Açık alan testi için, bir kara kutuyu eşit alanlı 25 kare parçaya bölün. Kutuya bir video izleme analiz sistemi kurun. Fareyi merkezi kareye yerleştirin ve yatay ve dikey aktivitelerini 5 dakika boyunca izleyin.
   NOT: Kutunun boyutları 500 mm x 500 mm x 300 mm'dir. Aktivite verileri, yeni bir ortama maruz kaldıklarında kemirgenlerde kaygı ile ilgili davranışları değerlendirmek için video izleme sistemi kullanılarak toplanacaktır.
3. Daha sonra, yatay aktiviteyi ölçmek için tüm pençeleri kullanarak sıçan tarafından geçilen karelerin sayısını hesaplayın. Dikey aktivitenin göstergeleri olarak ayakta durma ve tımar etme örneklerini sayın. Her testten sonra, sonraki testler için kalan fare kokularını ortadan kaldırmak için kutuyu %75 alkol kullanarak sterilize edin.
4. Daha sonra, anhedoni sükroz tercih testi ile değerlendirilir. Kafes kapağına iki şişe yerleştirin: A şişesi saf su içerirken, B şişesi %1 sükroz çözeltisi içerir. Sıçan için her iki çözüme de ad libitum erişimine izin verin. 0, 7, 14, 21 ve 28. günlerde 60 dakikalık sükroz tercih oranlarını hesaplamak için şişeleri tüketmeden önce ve sonra tartın. Formül aşağıdaki gibidir:
   Sükroz tüketimi = × %100
5. Uzamsal hafızayı ve öğrenme yeteneklerini ölçmek için Morris su labirenti testini kullanın. Havuzu dört çeyreğe bölün ve bunları birden dörde kadar numaralandırın. Üçüncü çeyrekte su yüzeyinin 1 cm altına batık bir dinlenme platformu yerleştirin.
6. Su opaklığını artırmak ve deney prosedürü boyunca yaklaşık 23 ° C'lik bir su sıcaklığını korumak için havuza süt verin.
7. Her fareyi labirentin çeşitli kadranlarına yerleştirin ve gizli platformu bulmaları için 120 saniye bekleyin. Fareler, platformun konumunu hatırlamak için uzamsal hafızaya ve öğrenme becerilerine güvenmelidir. Platformun konumunu öğrendikten sonra doğrudan ona yüzebilirler. Morris su labirenti video izleme sistemini kullanarak gecikme süresini kaydedin.
8. Fareyi havuzda sabit bir yere yerleştirin. Konu 120 saniye içinde gizli platformu bulamazsa, gecikmeyi 120 saniye olarak kaydedin.
9. Son olarak, gizli platformu çıkarın, fareyi tekrar suya yerleştirin ve 120 sn'lik bir süre boyunca bölge geçişlerinin sayısını kaydedin.

3. İstatistiksel analiz

1. Biyokimyasal parametrelerdeki önemli farklılıkları değerlendirmek için, tek yönlü varyans analizi (ANOVA) ve ardından Duncan'ın post hoc testini kullanın. Verileri ortalama ± standart hata (SE) olarak sunun ve 0,05'ten küçük bir p değerini istatistiksel olarak anlamlı kabul edin.

CUMS ile indüklenen sıçan depresyonu modelindeki davranışsal testlerden elde edilen sonuçlar
Depresyon benzeri davranışları indüklemek için CUMS prosedürünün etkinliğini doğrulamak için bir manipülasyon kontrolü yapıldı. Erkek Sprague-Dawley (SD) sıçanları, adım 1.2.3'te belirtildiği gibi, 4 haftalık bir süre boyunca MOD veya CON grubuna rastgele tahsis edildi. Daha sonra, sıçanlar sakrifiye edildi ve hipokampusları, enzime bağlı immünosorbent testi (ELISA) ²⁸ kullanılarak, depresyon patofizyolojisi¹⁰ ile güçlü bir şekilde ilişkili bir nörotransmitter olan 5-HT'nin değerlendirilmesi için tamamen diseke edildi.

CUMS indüksiyonundan önce, OFT skoru, sükroz tercihi veya MWM analizinde test edilen gruplar arasında anlamlı bir fark gözlenmemiştir.

CUMS modeli oluşturulduktan sonra, tek yönlü bir varyans analizi (ANOVA), CUMS'nin sıçan kaygı davranışları üzerinde önemli bir etkisi olduğunu ortaya koymuştur. Spesifik olarak, OFT'de gruplar arasında önemli farklılıklar gözlendi. MOD grubu, CON grubuna kıyasla daha düşük dikey ve yatay puanlar sergiledi (**P < 0.01; Şekil 1A, B, E), CUMS prosedürünün anksiyeteyi tetiklemede etkili olduğunu düşündürmektedir.

Daha sonra, sükroz tercih testi (SPT), sıçanların CUMS maruziyeti sonrası anhedoni belirtileri gösterip göstermediğini değerlendirmek için adım 2.4'te açıklandığı gibi 5 gün boyunca uygulandı. Sonuçlar, 0. günde gruplar arasında sükroz tercih yüzdesinde anlamlı bir fark olmadığını gösterdi. Bununla birlikte, tek yönlü ANOVA, 28. günde gruplar arasında sükroz alımında önemli bir fark olduğunu ortaya koydu. Spesifik olarak, MOD grubundaki sükroz tercih yüzdesi, CON grubundakinden daha düşüktü (**P < 0.01; Şekil 1C), CUMS protokolünün anhedoniyi indüklemedeki etkinliğini doğrulamaktadır.

Tek yönlü bir ANOVA, CUMS'nin, MWM testi ile değerlendirildiği gibi, sıçanların uzamsal hafızasını ve öğrenme yeteneklerini önemli ölçüde etkilediğini ortaya koydu. MOD grubunun platformu bulması için gecikme süresi, CON grubununkinden önemli ölçüde daha uzundu (**P < 0.01). Geçiş süreleri açısından, MOD grubu CON grubundan daha az kez geçti (**P < 0.01; Şekil 1D, F). Bu bulgular, sıçanlarda hafıza bozukluğunu indüklemede CUMS protokolünün etkinliğini desteklemektedir.

CUMS ile indüklenen sıçan depresyonu modelinde hipokampal 5-HT düzeylerinin sonuçları
Hipokampal 5-HT düzeylerinde tek yönlü varyans analizi (P < 0.01) gruplar arasında anlamlı fark olduğunu gösterdi. MOD grubu, CON grubuna kıyasla daha düşük hipokampal 5-HT seviyeleri sergiledi (Şekil 2). Bu sonuçlar, CUMS protokolünün, insan depresyonunda yaygın olarak gözlenen bir fenomen olan hipokampal 5-HT seviyelerini etkili bir şekilde azalttığını göstermektedir²⁹.

Şekil 1: CUMS kaynaklı sıçan depresyonu modelinin etkileri. (A) Açık alan testi (OFT) dikey puanları. (B) Açık alan testi yatay puanları. (C) 0. ve 28. günlerde sükroz tüketim seviyeleri (%) CUMS'nin neden olduğu anhedoni ve sıçanlarda azalmış sakaroz tercihi. (D) MWM testinde gecikme süresi ve bölge geçiş numaraları. Sonuçlar ortalama ± SE olarak sunulur (grup başına n = 12 sıçan). **P < 0.01, tek yönlü varyans analizi (ANOVA) kullanılarak hesaplanan kontrol (CON) grubuna kıyasla model (MOD) grubundaki önemli değişiklikleri gösterir. (E) Her gruptaki sıçanlar için OFT izleri. (F) Her sıçan grubu için MWM izleri. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Sıçanlarda CUMS'nin neden olduğu depresyon modelinde beyin 5-HT seviyeleri üzerindeki etkisi. 4 haftalık CUMS'ye maruz kalan sıçanlar, kontrol (CON) grubuna kıyasla hipokampal 5-HT seviyelerinde önemli bir azalma gösterdi. Sonuçlar ortalama ± SE olarak sunulur (grup başına n = 12 sıçan). **P < 0.01, tek yönlü varyans analizi (ANOVA) kullanılarak hesaplanan CON grubuna kıyasla model (MOD) grubundaki önemli değişiklikleri gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: Kronik öngörülemeyen hafif stres (CUMS) programı. Sıçan deneklerde CUMS indüksiyonu için stresörler ve yürütme tarihleri.

Tablo 2. Moğol tıbbında dört yardımcı koşul ve üç homor teorisi ile dokuz stresör. Moğol tıbbında dokuz stres faktörü, üç homor teorisi ve dört yardımcı koşul arasındaki içsel ilişki.

Depresyon, düşük ruh hali, zevk eksikliği ve düşük enerji gibi semptomlarla karakterize zihinsel bir bozukluktur³⁰. Depresyon araştırmaları alanında, terapötik müdahaleleri ilerletmek için güvenilir bir hayvan modelinin oluşturulması çok önemlidir. Çeşitli hayvan modelleri arasında, CUMS modeli, yüksek güvenilirliği, geçerliliği ve insan depresyonunun özellikleriyle uyumu nedeniyle özellikle dikkat çekicidir³¹. Çeşitli ortamlarda uzun bir süre boyunca düşük seviyeli stres faktörlerinin kümülatif etkilerini taklit etmek için çok uygundur. Bu çalışmada, adım 1.2.3 ve Tablo 2'de özetlenen bir dizi stres faktörü kullanarak sıçanlarda CUMS'nin neden olduğu bir depresyon modeli oluşturduk. Stres protokolünün çeşitli yönleri, modelin başarısı için kritik öneme sahiptir. İlk olarak, tüm MOD gruplarındaki sıçanlar, CON grubundakilerden farklı olarak ayrı ayrı barındırılmalıdır. İkinci olarak, CUMS stres rejimi öngörülemezliği korumak için dikkatli bir şekilde planlanmalıdır. Spesifik olarak, sıçanlar haftalık olarak dokuz olası stres etkeninden yedisinin randomize bir seçimine tabi tutulmalıdır. Bu stresörlerin değişkenliği ve öngörülemezliği, modelin etkinliği için esastır^32,33. Son olarak, sıçanların adapte olmasını önlemek için aynı stres etkeninin tekrar tekrar kullanılması en aza indirilmelidir, bu da deneysel sonuçların bütünlüğünü tehlikeye atabilir. Ayrıca, stres etkeni ayarları çalışma boyunca ayarlanabilir olacak şekilde tasarlanmıştır.

CUMS modeli, bir depresyon modeli olarak çeşitli avantajlar sunar. İnsan depresyonunun patogenezi ile yakından uyumludur ve çoğu klinik semptomu ve altta yatan mekanizmaları doğru bir şekilde temsil eder³⁴. En güçlü yönlerinden biri, anhedoni veya zevk eksikliğini ölçülebilir bir gösterge olarak kullanmasıdır ^6,7. Model aynı zamanda depresyonun başlamasına katkıda bulunan çeşitli faktörleri de açıklamaktadır^35,36. Daha da önemlisi, CUMS modeli birkaç ay süren uzun süreli uygulama için tasarlanmıştır. Bu süre, bir depresyon modelinin ihtiyaçları ile tutarlıdır ve kronik bir doz rejiminde ilaçların değerlendirilmesine ve ayrıca hızlı etki mekanizmalarına sahip bileşiklerin tanımlanmasına izin verir³⁶. Kapsamlı doğası nedeniyle, CUMS modeli bilimsel literatürde yaygın olarak kabul görmüştür.

Bu avantajlara rağmen, CUMS modeli sınırsız değildir ^5,37. Başlıca dezavantajlarından biri, çevreye, insan gücüne ve zamana önemli yatırımlar gerektiren ve sonuç olarak düşük tekrarlanabilirlik ile sonuçlanan, kaynak yoğun doğasıdır³⁸. Literatürde stresörlerin seçimi ve yoğunluğu ile bunların uygulanma sırası ile ilgili tutarsızlıklar da vardır³⁸. Bu tür tutarsızlıklar, modeli farklı laboratuvarlarda tekrarlamayı zorlaştırır. Ayrıca, literatürde stresörlerin uygulanması için ayrıntılı bir zaman çizelgesi bulunmamakta ve bu da başka bir belirsizlik katmanı eklemektedir^39,40. Diğer bir sorun, farklı çalışmalarda kullanılan kombinasyon yöntemlerindeki çeşitlilikten kaynaklanmaktadır; Bunlar genellikle açık bir gerekçeden yoksundur ve model çoğaltmada zorluklar yaratır. Denek hayvanlar, stres etkeni tasarımındaki küçük değişikliklere karşı oldukça hassastır ve bu da düşük tekrarlanabilirliğe^{katkıda bulunur 40}. Ayrıca, sınırlı sayıda stres etkeni kullanmak, denek hayvanlar arasında alışkanlığa yol açabilir ve bu da stres etkeni tasarımını öngörülebilir hale getirir. Son olarak, farklı laboratuvarlardan gelen hayvanlar, stres faktörlerine karşı çeşitli tepkiler gösterir ve bu da çalışmalar arasında zayıf tekrarlanabilirliğe katkıda bulunur. Mevcut literatürde, Wistar Kyoto (WKY) sıçanlarının CUMS ^25,41'e maruz kaldıktan sonra depresyon benzeri bir fenotipe özellikle duyarlı oldukları tanımlanmıştır. Bu, suşlar arası değişkenliğin, strese bağlı davranış değişikliklerine duyarlılığı önemli ölçüde etkileyebileceğini düşündürmektedir. Benzer şekilde, depresyon modellerinin etkinliğini değerlendirmek için sıklıkla kullanılan önemli bir ölçü olan SPT, kendi zorluklarını ortaya koymaktadır. Spesifik olarak, bireysel sıçanlar% 1'lik bir sükroz çözeltisi^20,42 tüketiminde değişkenlik gösterir. Stres koşulları altında, hem strese eğilimli hem de strese dayanıklı hayvanlar, tatlı çözeltilerin tüketiminde değişiklikler gösterir. Sonuç olarak, belirli bir parti içindeki gerçekten strese dayanıklı veya karşı kategoriye ait olan hayvanların oranını tespit etmek zorlaşır. Bu değişkenlik, bazı hayvanların hastalık durumlarını doğru bir şekilde yansıtmayan SPT sonuçları göstermesine neden olabilir.

CUMS modelinin güvenilirliğini artırmak için çeşitli metodolojik iyileştirmeler öneriyoruz. İlk olarak, hayvanlarda strese neden olabilecek koku alma, görsel ve işitsel uyaranların etkisini azaltmak için CON grubundaki hayvanları MOD grubundakilerden ayırmak çok önemlidir^43,44. İkinci olarak, değişkenliği en aza indirmek için, tüm deneyleri yürütmek üzere bir veya iki deneyimli laboratuvar personelinin atanması tavsiye edilir. Bu yaklaşım, bireysel faktörlere atfedilebilen hataları azaltmaya hizmet eder. Ek olarak, önceki araştırmalar strese dayanıklı test hayvanlarını^{tanımlamıştır 13}; Bu nedenle, sonuçları daha iyi yorumlamak için resmi deneylerden önce veya post hoc olarak bu tür grupları taramak ihtiyatlı olacaktır. İçsel anhedoniyi ölçen ödüle dayalı bir davranışsal değerlendirme olan SPT testi ile ilgili olarak, CUMS protokolünü başlatmadan önce optimal sükroz konsantrasyonunu belirlemek önemlidir. Sükroz konsantrasyonuna dayalı olarak tercihin önceden belirlenmesi, testin ayırt edici duyarlılığını önemli ölçüde artırabilir²⁰. Bununla birlikte, 24 saat yiyecek ve su yoksunluğuna maruz kalan sıçanların, aşırı susuzluk nedeniyle mevcut herhangi bir sıvıyı ayrım gözetmeksizin tüketebilecekleri^{unutulmamalıdır 35,45}. Sükroz tercihinin daha doğru bir ölçüsünü elde etmek için, kemirgenlerin en aktif olduğu sirkadiyen döngünün gece evresinde tüketimi değerlendirmenizi öneririz. Günlük (inaktif) faz sırasında uygulanan stresörler, kronik uyku yoksunluğuna neden olabilir ve böylece istenmeyen bir stres etkeni ortaya çıkarabilir^46,47. Son olarak, toplanan verilerin mümkün olduğunca güvenilir olmasını sağlamak için yukarıda açıklanan yönetilebilir faktörlerin etkisini titizlikle kontrol etmek zorunludur.

Depresyon için mevcut Batı klinik tedavi rejimleri genellikle belirgin toksik yan etkiler ve ilacın kesilmesi üzerine yüksek nüks olasılığı ile birlikte gelir. Kökleri geleneksel tıbba dayanan tedavi yaklaşımlarını araştırmak ve Moğol tıbbı teorisinin merceğinden depresyonun patogenezini araştırmak, hastalığın etiyolojisine yenilikçi bakış açıları sunabilir. Bu bağlamda, geleneksel tıp ilkeleriyle uyumlu hayvan depresyon modellerinin geliştirilmesi, Moğol tıbbı araştırmalarında çok önemli bir adım olarak durmaktadır. Soliter kültür CUMS modelleme yönteminde dokuz stres faktörünün seçimi özellikle dikkat çekicidir; Moğol tıbbının üç homor teorisi ve dört yardımcı koşul ile üç homor arasındaki içsel ilişki tarafından bilgilendirilir. Bu yaklaşım, Moğol tıbbının benzersiz ilkeleriyle yüksek derecede uyumluluk sergiler. Depresyonun fenotipik analizleri, dış faktörlerle birlikte, Moğol tıbbi kavramları olan Rüzgar ve Balgam ile önemli korelasyonlar ortaya koymaktadır (bakınız Tablo 2). Spesifik olarak, rüzgarla ilgili işlev bozuklukları klinik olarak enerji kaybı, uykusuzluk, unutkanlık, yorgunluk ve ağrı gibi semptomlar olarak ortaya çıkar. Balgam ile ilgili işlev bozuklukları ise tepkisizlik, bulanık bilinç, karamsarlık ve olumsuzluk gibi klinik belirtilerle sonuçlanır. Bu semptomlar MDB^48,49'un temel semptomları ile yakından uyumludur. Bu nedenle, yukarıda bahsedilen CUMS modeli, Moğol tıbbı teorisinin öne sürdüğü gibi, dış koşullar arasındaki karmaşık etkileşimleri ve üç tip homorun dengesini etkili bir şekilde simüle eden ve böylece hastalığın başlamasına katkıda bulunan patolojik bir model olarak hizmet eder.

Bu modelin güçlü yönleri çok yönlüdür. İlk olarak, modern tıp alanındaki hayvan modelleri için belirlenen kriterleri karşılayan çağdaş tıbbi etiyolojik teorilere bağlı kalır. İkincisi, hayvanlarda insan hastalıklarının spesifik semptomlarını çoğaltmak için geleneksel Moğol tıbbının ilkelerini içerir, böylece Moğol tıbbi uygulamalarına özgü özellikleri somutlaştırır. Hem modern hem de geleneksel tıp teorileriyle uyumu göz önüne alındığında, bu model Moğol tıbbında temel araştırmalar için etkili bir platform görevi görür. Bu nedenle, hastalıkların ve semptomların bu hayvan modeline entegrasyonu, Moğol ve modern tıpta yapılan araştırmaların bir birleşimini temsil eder. Modelin sınırlamaları olsa da, devam eden iyileştirmesi Moğol tıbbındaki temel araştırmaların geleceğine önemli ölçüde katkıda bulunacaktır.

Hayvan modelleri, doğrudan insan beyni çalışmasıyla ilgili etik ve pratik zorluklar nedeniyle depresyonun araştırılmasında vazgeçilmez hale gelmiştir. Depresyonun karmaşıklıklarını tam olarak kopyalamadaki içsel sınırlamalarına rağmen, bu modellerin evrimi ve doğrulanması sürekli bir süreç olmaya devam etmektedir. Bu çalışmada, bir hayvan depresyon modeli geliştirmek için hem Moğol hem de modern tıbbın ilkelerini birleştirdik. Bu işbirlikçi yaklaşım, hem geleneksel Moğol hem de modern tıp teorilerini kapsayan daha kapsamlı bir hayvan modeli oluşturmak için değerli bilgiler sunmaktadır.

Yazarların açıklanacak herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Sağlanan enstrümantasyon ve laboratuvar için minnettarız, Çin İç Moğol Tıp Üniversitesi'nin Moğol tıp fakültesine şükranlarımızı sunuyoruz.Bu çalışma, gerekli enstrümantasyon ve laboratuvar olanaklarını sağlamak için desteklenmiştir. Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı'ndan (Hibe No. 81760762) ve Çin İç Moğolistan Tıp Üniversitesi Projesi'nden (Hibe No. YKD2022MS074) ve İç Moğolistan, Çin'deki Yüksek Öğretim Bilimsel Araştırma Projesi (Hibe No. NJZY22661) ve İç Moğolistan Özerk Bölgesi, Çin'deki Çin ve Moğol Tıbbı Anahtar Laboratuvarı Açık Fon Projesi (Hibe No. MYX2023-K07).