לחץ כרוני בלתי צפוי קל בחולדות מבוסס על התרופה המונגולית

פרוטוקול זה מתאר מודל לחץ קל כרוני בלתי צפוי (CUMS) לדיכאון המבוסס על תיאוריה רפואית מונגולית, יחד עם שיטות לאימות מבחנים התנהגותיים.

דיכאון הוא הפרעה רגשית נפוצה ומהווה גורם מוביל לנכות עולמית. מגבלות ההתערבויות הפרמקולוגיות הנוכחיות תורמות לנטל הבריאותי המשמעותי המיוחס למצב זה. יש צורך דחוף בהבנה עמוקה יותר של המנגנונים הבסיסיים של דיכאון, מה שהופך מודלים פרה-קליניים עם פוטנציאל תרגומי בעלי ערך רב. הרפואה המונגולית, תת-קבוצה של הרפואה המסורתית, מניחה כי הופעת מחלות קשורה קשר הדוק לשיווי המשקל של רוח, מרה וליחה. במחקר זה אנו מציגים פרוטוקול לשיטת העקה הקלה הכרונית הבלתי צפויה (CUMS) בחולדות. במסגרת זו, חולדות חשופות לסדרה של גורמי עקה משתנים וקלים כדי לגרום לפנוטיפ דמוי דיכאון, המחקה את הפתוגנזה של דיכאון אנושי. בדיקות התנהגותיות המשמשות בפרוטוקול זה כוללות את מבחן העדפת סוכרוז (SPT), המעיד על אנהדוניה - תסמין ליבה של דיכאון; מבחן השדה הפתוח (OFT), המודד את רמות החרדה; ומבחן מבוך המים מוריס (MWM), המעריך זיכרון מרחבי ויכולות למידה. שיטת CUMS מדגימה את היכולת לגרום לאנהדוניה ולגרום לליקויים התנהגותיים ארוכי טווח. יתר על כן, פרוטוקול זה תואם יותר את התיאוריה הרפואית המונגולית מאשר מודלים אחרים של בעלי חיים שנועדו לעורר התנהגות דמוית דיכאון. פיתוח מודל זה של בעלי חיים והמחקר שבעקבותיו מספקים בסיס איתן למחקרים חדשניים עתידיים בתחום הרפואה המונגולית.

הפרעת דיכאון מג'ורי (MDD) היא מחלת נפש נפוצה, המדורגת כגורם השלישי המוביל לנכות ברחבי העולם ומשפיעה על יותר מ -300 מיליון אנשים^1,2,3. יש לציין כי ההערכה היא כי לפחות מחצית מהאנשים שנפגעו אינם מקבלים טיפול הולם⁴. בהינתן פער זה, מודלים של בעלי חיים משמשים כלי מכריע לחקר האטיולוגיה של דיכאון. נכון להיום, קיימים יותר מ -20 מודלים שונים של בעלי חיים לדיכאון⁵. מבין אלה, מודל הלחץ המתון הכרוני הבלתי צפוי (CUMS), ששוכלל על ידי פול וינר בשנת 1987, הוא הנפוץ ביותר⁶. מודל CUMS פועל על בסיס ההנחה שחשיפת מכרסמים למגוון רחב של גורמי עקה חברתיים-סביבתיים מובילה לתסמינים הדומים לחרדה, מתח ודיכאון. המתודולוגיה כוללת חשיפת בעלי חיים לגורמי עקה קלים שונים במשך מספר שבועות, ששיאם במגוון שינויים התנהגותיים, כולל אנהדוניה והתנהגויות דיכאוניות^7,8. שינויים אלה מלווים בשינויים בפרופילים האנדוקריניים והנוירוטרנסמיטרים, כגון ירידה ב-5-HT^9,10. תוצאות אלה דומות מאוד לאלה שנצפו בבני אדם שאובחנו עם MDD, ובכך מאמתות את התועלת של המודל. מודל CUMS מוערך במיוחד בשל יעילותו בהערכת תרופות נוגדות דיכאון, המבטאות רמות גבוהות של תקפות פני השטח, המבנה והחיזוי^11,12. שלא כמו מודלים אחרים, CUMS רגיש להשפעות של ניהול כרוני של תרופות נוגדות דיכאון מונואמינרגיות. לדוגמה, מעכבי ספיגה חוזרת של סרוטונין סלקטיביים (SSRI) כגון citalopram, paroxetine ו- fluoxetine הוכחו כמונעים והופכים אנהדוניה בתנאים של לחץ כרוני^12,13. בנוסף, תרופות נוגדות דיכאון מהירות פעולה חדשות, כגון קטמין, הוכיחו יעילות גם במודל זה^14,15. לעומת זאת, מבחנים אחרים כמו מבחן השחייה הכפויה (FST) ומבחן מתלה הזנב (TST) הם פחות אמינים למידול שינויים התנהגותיים ארוכי טווח, ולעתים קרובות משקפים הסתגלות ללחץ אקוטי ולא סימפטומים מתמשכים של דיכאון¹⁶. מאפיינים אלה מדגישים את התוקף האיתן של מודל CUMS במחקר דיכאון. אחד המאפיינים הבולטים ביותר של מודל CUMS, המוכר באמינותו הגבוהה בלימודים קלאסיים, הוא anhedonia - חוסר היכולת לחוות הנאה או עניין בפעילויות יומיומיות^17,18. תופעה זו מוערכת בדרך כלל באמצעות בדיקות העדפת סוכרוז, ותרופות נוגדות דיכאון רבות הוכחו כמחזירות את צריכת הסוכרוז המופחתת. מספר מדדים אחרים משמשים בדרך כלל גם בספרות CUMS, כולל מבחן שדה פתוח (OFT), אשר מעריך התנהגות מוטורית רצונית, נטיות גישוש, ומתח, ובכך מודד את חומרת הדיכאון¹⁹. מבחנים אחרים כגון מבוך פלוס מוגבה (EPM) מעריכים התנהגויות דמויות חרדה, מבחן מבוך המים מוריס (MWM) בוחן תפקוד קוגניטיבי²⁰וה- FST מעריך רגישות לרגשות שליליים וייאוש התנהגותי.,²⁰. יתר על כן, רוב גורמי הלחץ המשפיעים על בני אדם הם חברתיים מטבעם. אנשים עם קשרים חברתיים לא אופטימליים, המאופיינים בפעילויות חברתיות מוגבלות, רשתות ותמיכה, נמצאים בסיכון מוגבר למחלות שונות^21,22. זה רלוונטי גם במקרה של מכרסמים, שהם בעלי חיים חברתיים החיים בקבוצות. לדוגמה, חולדות השוכנות בבידוד מציגות מאפיינים של מה שמכונה תסמונת בידוד, הגורמת ללחץ חברתי ומזרזת את הופעת הדיכאון²³.

הרפואה המונגולית, ענף משמעותי של הרפואה הסינית, מניחה כי הופעת המחלה היא יחסי גומלין מורכבים בין גורמים פנימיים וחיצוניים. גורמים חיצוניים אלה, המכונים ארבעת תנאי העזר, כוללים שינויי אקלים, תזונה, אורח חיים ואירועים פתאומיים כגון זיהומים, אירועים מבהילים והפרעות פסיכולוגיות. תהליך המחלה מושג כאינטראקציה מתמשכת בין שלושה יסודות - המכונים שלושת סוגי ההומורים - לבין שבעת מרכיבי הגוף בתיאום עם ארבעת תנאי העזר²⁴ . הרפואה המונגולית גורסת כי גוף האדם מתפקד כישות משולבת, הנשמרת על ידי איזון יחסי בין שלושת ההומורים. הפרעה באיזון זה נחשבת כמבשרת מחלה²⁴ . בהתחשב בתפקיד המרכזי של ניסויים בבעלי חיים בגישור בין רפואה מסורתית למודרנית, חיוני לפתח מודלים של בעלי חיים הרלוונטיים למחקר בתחום הרפואה המונגולית. בהתאם לכך, השתמשנו במתודולוגיית בידוד של 28 יום יחד עם CUMS כדי לדמות גורמי לחץ פיזיולוגיים ופסיכולוגיים אלה. בחרנו תשעה גורמי לחץ בלתי צפויים ספציפיים וביקשנו לבסס את שיטת המידול הזו באמצעות תיאוריית שלושת ההומורים של הרפואה המונגולית. ביסוס מודל חזק של בעלי חיים הוא יסוד לקידום המחקר הבסיסי ברפואה המונגולית ויתרום משמעותית למחקרי היסוד שלו.

פרוטוקולי הניסוי קיבלו אישור מהוועדה לטיפול באתיקה של ניסויים בבעלי חיים באוניברסיטה הרפואית של מונגוליה הפנימית (YKD202301172) ועמדו בהנחיות המכונים הלאומיים לבריאות לטיפול ואתיקה בבעלי חיים. מספר הרישוי של מרכז בעלי החיים שלנו הוא NO.110324230102364187. עשרים וארבע חולדות ספראג-דולי (SD) זכרים, כל אחת בת 8 שבועות (200 גרם ±-20 גרם), נרכשו ושוכנו בסביבה מבוקרת עם טמפרטורה של 22 מעלות צלזיוס ±-2 מעלות צלזיוס ולחות של 55% ±-15%. האכילו את החולדות בתזונה של תחזוקת מכרסמים ומים טהורים בקלחי תירס למצעים. החולדות היו נתונות למחזור אור/חושך של 12 שעות/12 שעות במשך שבוע לפני הניסויים.

1. הקמת מודל חולדות CUMS

1. קיבוץ
   1. חלקו את 24 החולדות באופן אקראי לשתי קבוצות: קבוצת הביקורת (CON), שלא תהיה חשופה לבידוד או ללחץ, וקבוצת המודל (MOD). כל קבוצה מכילה 12 חולדות.
   2. מאכלסים את החולדות בכלובים סטנדרטיים בגודל 55X40X20 ס"מ, עם 6 חולדות בכל כלוב. יש לשמור על הקצאת הכלוב לאורך כל תקופת ההתאקלמות, אלא אם צוין אחרת.
   3. מלאו כל כלוב גידול במצעים רעננים והחליפו אותו פעמיים בשבוע.
   4. יש לבצע תקופת התאקלמות של שבוע. אפשרו לחולדות גישה בלתי מוגבלת למזון ומים, למעט במהלך הפעלת לחץ CUMS. יש לשמור על סביבה קבועה עם טמפרטורה של 22°C ±-2°C, לחות של 55% ±-15%, ומחזור אור/חושך של 12 שעות/12 שעות בין השעות 08:00 ל-20:00, אלא אם צוין אחרת.
   5. לפני תחילת הניסוי, טפלו בחולדות מדי יום כדי להרגיל אותן בפני החוקר ולמזער עקה נוספת במהלך שלב הניסוי.
2. בידוד עם מתח קל כרוני בלתי צפוי
   1. במקביל, מקם את קבוצות MOD ו- CON בחדרים נפרדים. בית חולדות קבוצת MOD בנפרד, תוך שמירה על חולדות קבוצת CON יחד. שמור על כל התנאים האחרים קבועים.
   2. יישמו משטר לחצים של 28 יום²⁵. כדי למנוע התרגלות ולהבטיח לחץ בלתי צפוי, לנהל גורם לחץ אקראי אחד ביום, הימנעות משימוש באותו גורם לחץ בימים רצופים.
   3. יש להפעיל באופן אקראי אחד מתשעת גורמי הלחץ הבאים ^26,27 בימים שונים: מניעת מים למשך 24 שעות, מניעת מזון למשך 24 שעות, ריפוד רטוב, שיפוע הכלוב, היפוך מחזור האור/חושך, חשיפה לקור ב-4°C, חשיפה לחום ב-45°C, הידוק זנב למשך דקה אחת או טלטול של 15 דקות ב-160 סל"ד. העיצוב הספציפי מתואר בטבלה 1.
   4. במהלך הפעלת גורם הדחק, יש להגביל את הגישה למזון ומים לקבוצת MOD עד לסיום הלחץ, למעט במהלך היפוך מחזור האור/חושך. קבוצת CON לא נדרשה להגביל מים ודיאטה.
3. שיטות לחץ
   1. התחל את הניסוי על ידי הפעלת גירויי דיכאון בשילוב עם בידוד של 28 יום לכל החולדות, למעט קבוצת הביקורת. אכסנו את החולדות האלה בכלובים נפרדים. עיין בטבלה 2 עבור מצבים הקשורים לגירויי דיכאון.
   2. כדי לבצע את שיטת מהדק הזנב, אבטחו זנב של חולדה מקבוצת MOD על ידי הידוק הזנב עם אטב נייר סטנדרטי במרחק של 1-2 ס"מ משורש זנב החולדה. מדוד את זמן ההידוק למשך דקה אחת (n = 12).
   3. בשיטת המחסור במים, יש למנוע מים מחולדה מקבוצת MOD על ידי הוצאת בקבוק המים שלה ולהקליט במשך 24 שעות.
      הערה: שעת תחילת המחסור במים נרשמה כך שניתן היה לחשב במדויק את שעת הסיום; נצפתה התנהגות החולדות בתקופה זו, כולל פעילות, תיאבון ומצב נפשי.
   4. בשיטת מניעת מזון, יש למנוע מזון מחולדה מקבוצת MOD ולרשום במשך 24 שעות.
      הערה: רשום את הזמן שבו מתחיל מחסור במזון כדי שניתן יהיה לחשב במדויק את שעת הסיום; להבטיח כי חולדות הם hydrated כראוי בתקופה זו; ולהתבונן בהתנהגות החולדות בתקופה זו, כולל פעילות ומצב נפשי וכו'.
   5. לגירוי קר ב 4 מעלות צלזיוס, הניחו חולדה מקבוצת MOD בדלי מים קרים והקליטו במשך 5 דקות. יש לוודא שטמפרטורת המים נשארת עקבית לאורך כל הבדיקה. בסיום הניסוי, יבשו את החולדה עם מפוח והחזירו אותה לכלוב המקורי שלה.
      הערה: שמור על טמפרטורת המים הקרים ב -4 °C באמצעות מדחום וקוביות קרח כדי לווסת את טמפרטורת המים כאשר היא עולה. יש להחליף את המים באופן קבוע כדי להבטיח שאיכות המים נקייה והטמפרטורה קבועה. בעת שחייה, כל הגפיים והגזעים של החולדות צריכים להיות שקועים במים קרים למעט הראש. עומק המים חייב להיות גדול מאורך גוף החולדה כדי למנוע מהחולדה לקפוץ מהמים עקב מגע עם תחתית הדלי.
   6. כדי לנהל עקת חום של 45 מעלות צלזיוס, הניחו חולדה מקבוצת MOD באינקובטור והקליטו במשך 5 דקות, כדי להבטיח שהטמפרטורה תישאר יציבה לאורך כל הבדיקה.
   7. בהיפוך מחזור האור-חושך, עטפו את הכלוב בבד שחור למשך שעה אחת כדי לדמות חושך בשעות היום. לאחר מכן, האר את הכלוב למשך 12 שעות במהלך הלילה כדי לחקות את אור היום. רשמו את התנהגות החולדה, צריכת המזון והמים ודפוסי השינה שלה במשך 24 שעות.
   8. לניסוי הריפוד הרטוב, הכניסו 200 מ"ל מים לכלוב המכיל 100 גרם ריפוד. משכן חולדה מקבוצת MOD בכלוב הרטוב ומתעד את התנהגות החולדות תחת לחץ מצעים רטוב, כולל פעילות, תיאבון, צריכת מים וכו'. שימו לב אם יש התנהגויות חריגות או תגובות לא נוחות, כגון מצב העור והשיער של החולדות, שעלולות להיגרם על ידי הריפוד הרטוב, ותיעדו אותן בזמן לניתוח הבא במשך 24 שעות. לאחר הבדיקה יבשו את החולדה עם מפוח והחזירו אותה לכלוב עם שבבי עץ טריים.
   9. בשיטת שיפוע הכלוב, מקמו חולדה מקבוצת MOD בכלוב המוטה בזווית של 45 מעלות כנגד קיר ותיעדו במשך 24 שעות. השתמש במבנה מסגרת הכלוב כדי להתאים את הזווית ולאבטח את הכלוב במקומו.
      הערה: חשב את הזמן מתחילתו ועד סופו והתבונן בהתנהגות החולדות במהלך תקופת הטיית הכלוב, כולל פעילות, תיאבון ומצב נפשי, וודא שזווית הכלוב המוטה מוגדרת כראוי ונשארת יציבה כדי להבטיח את הדיוק והשחזור של הניסוי.
   10. לניעור במהירות גבוהה, הניחו חולדה מקבוצת MOD בשייקר מכני המכוון ל-160 סל"ד ותיעדו את החולדה למשך 15 דקות. שיטות בדיקה התנהגותיות משמשות לאחר מכן כדי להעריך את ההקמה המוצלחת של המודל.
   11. לאחר הפעלת גורמי לחץ, העבירו את הכלובים הקבוצתיים של משרד הביטחון מחדר ה-CUMS בחזרה לחדר הדיור. במהלך תקופת החשיפה לסטרס של 4 שבועות, שמרו על קבוצת CON בכלובים הביתיים שלהם הממוקמים בחדר הדיור.
4. אמצעי זהירות במהלך ניסויים
   1. העברת כלובי קבוצת משרד הביטחון חזרה לחדר הדיור הכללי לאחר הפעלת גורם הלחץ בחדר ה- CUMS.
   2. ניטור בעלי חיים במהלך מידול CUMS
      1. במהלך הידוק הזנב, בעל החיים צפוי להיאבק בשל הגירוי המושרה. במהלך תקופה זו, ברציפות לפקח על המהדק. אם הוא מתנתק, השהה את הטיימר, הפעל מחדש את המהדק ולאחר מכן חדש את הטיימר למשך דקה.
      2. אין להטיל מניעת מים ולחצים על מצעים רטובים בו זמנית.
         הערה: הימנעות מכפייה בו זמנית של ריפוד רטוב ומניעת מים מסייעת לשמור על שלמות הניסוי, מפחיתה משתנים מבלבלים ומקדמת רווחת בעלי חיים.
      3. טמפרטורת הגוף של בעל החיים וטמפרטורת החדר עשויים להעלות את טמפרטורת המים במהלך שחייה במים קרים. לכן, התאימו על ידי הוספת מי קרח או קוביות קרח כדי לשמור על טמפרטורת מים קבועה.
      4. התבוננו בחולדות במרווחים של 30 דקות במהלך הפעלת גורמי סטרס, למעט במהלך היפוך יומי. שימו לב במיוחד לסימנים של מצוקה חריגה, כגון רעד, עייפות או חוסר תנועה. אם נצפים תסמינים כאלה - במיוחד היפותרמיה פוטנציאלית במהלך 4 מעלות צלזיוס, שחייה במים קרים ומצעים רטובים - הסר מיד את החולדה מגורם הלחץ.
         הערה: הסר את חיות הניסוי מהמחקר כאשר יש להן בעיות בריאותיות, כגון זיהום, טראומה חמורה, התנהגויות תוקפניות, ניידות לא תקינה וכו ', התנאים להוצאת בעלי החיים מהמחקר סובבים בדרך כלל סביב הגנה על בריאותם ובטיחותם תוך הבטחת שלמות תוצאות הניסוי.
      5. ערכו בדיקות יומיות לאיתור פצעים או הפרעות פיזיות או התנהגותיות אחרות בכל חולדה. אם נצפות חריגות כלשהן, התייעצו עם וטרינר המעבדה כדי לקבוע אם יש להוציא את החולדה מהניסוי.
      6. שוקלים כל חולדה כל 3 ימים. אם בעל חיים מאבד יותר מ -20% ממשקל גופו הבסיסי לפני ההאכלה, יש להוציא אותו מהניסוי.

2. מבחנים התנהגותיים

1. כדי להתחיל, לתת את גירויי דיכאון בשילוב עם בידוד במשך 28 ימים לכל החולדות, למעט קבוצת הביקורת. אכסנו את החולדות בכלובים נפרדים. עיין בטבלה 2 לקבלת פרטים על מצבי גירויי דיכאון.
2. עבור בדיקת השדה הפתוח, חלק קופסה שחורה ל- 25 מקטעים מרובעים בעלי שטח שווה. התקן מערכת ניתוח מעקב וידאו בתיבה. הניחו את החולדה בריבוע המרכזי ועקבו אחר פעילותה האופקית והאנכית למשך 5 דקות.
   הערה: מידות התיבה הן 500 מ"מ x 500 מ"מ x 300 מ"מ. נתוני הפעילות ייאספו באמצעות מערכת מעקב הווידאו כדי להעריך התנהגויות הקשורות לחרדה אצל מכרסמים כאשר הם נחשפים לסביבה חדשה.
3. לאחר מכן, ספרו את מספר הריבועים שהחולדה חצתה, תוך שימוש בכל הכפות, כדי לכמת את הפעילות האופקית. ספור מופעים של עמידה וטיפוח כאינדיקטורים לפעילות אנכית. לאחר כל בדיקה, יש לחטא את הקופסה באמצעות 75% אלכוהול כדי לסלק שאריות ריחות של חולדות בבדיקות הבאות.
4. לאחר מכן, anhedonia מוערך באמצעות מבחן העדפת סוכרוז. הניחו שני בקבוקים על מכסה הכלוב: בקבוק A מכיל מים טהורים, ואילו בקבוק B מכיל תמיסת סוכרוז 1%. אפשר גישה לשני הפתרונות עבור החולדה. שקלו את הבקבוקים לפני ואחרי הצריכה כדי לחשב את שיעורי העדפת סוכרוז של 60 דקות בימים 0, 7, 14, 21 ו-28. הנוסחה היא כדלקמן:
   צריכת סוכרוז = × 100%
5. כדי למדוד זיכרון מרחבי ויכולות למידה, השתמשו במבחן מבוך המים מוריס. חלקו את הבריכה לארבעה רבעים, וספרו אותם מאחד עד ארבעה. הניחו ברביע השלישי משטח מנוחה שקוע 1 ס"מ מתחת לפני המים.
6. הכניסו חלב לבריכה כדי להגביר את אטימות המים ולשמור על טמפרטורת מים של כ -23 מעלות צלזיוס לאורך כל הליך הניסוי.
7. מקמו כל חולדה ברבעים שונים של המבוך, ואפשרו להם 120 שניות לאתר את הפלטפורמה הנסתרת. החולדות צריכות להסתמך על זיכרון מרחבי ומיומנויות למידה כדי לזכור את מיקום הרציף. ברגע שהם לומדים את מיקום הרציף, הם יכולים לשחות ישירות אליו. הקלט את זמן ההשהיה באמצעות מערכת מעקב הווידאו של מבוך המים מוריס.
8. מקמו את החולדה במקום קבוע בבריכה. אם הנושא אינו מצליח לאתר את הפלטפורמה המוסתרת בתוך 120 שניות, רשום את ההשהיה כ- 120 שניות.
9. לבסוף, הסירו את הפלטפורמה הנסתרת, החזירו את החולדה למים, ותיעדו את מספר מעברי האזור במשך תקופה של 120 שניות.

3. ניתוח סטטיסטי

1. כדי להעריך הבדלים משמעותיים בפרמטרים ביוכימיים, השתמש בניתוח חד-כיווני של שונות (ANOVA) ואחריו מבחן פוסט-הוק של דאנקן. הצג את הנתונים כממוצע ± שגיאת תקן (SE) והתייחס לערך p של פחות מ- 0.05 כמובהק סטטיסטית.

תוצאות המבחנים ההתנהגותיים במודל דיכאון חולדות הנגרם על ידי CUMS
כדי לאשש את היעילות של הליך CUMS לגרימת התנהגויות דמויות דיכאון, בוצעה בדיקת מניפולציה. חולדות Sprague-Dawley (SD) זכרים הוקצו באופן אקראי לקבוצת MOD או CON לתקופה של 4 שבועות, כמתואר בשלב 1.2.3. לאחר מכן, החולדות הוקרבו, וההיפוקמפוס שלהן נותח לחלוטין להערכה של 5-HT, מוליך עצבי הקשור מאוד לפתופיזיולוגיה של דיכאון¹⁰, באמצעות בדיקת אימונוסורבנט מקושרת אנזים (ELISA)²⁸.

לפני השראת CUMS, לא נצפו הבדלים משמעותיים בין הקבוצות שנבדקו בציון OFT, העדפת סוכרוז או ניתוח MWM.

לאחר ביסוס מודל CUMS, ניתוח חד-כיווני של שונות (ANOVA) חשף השפעה משמעותית של CUMS על התנהגויות חרדה של חולדות. באופן ספציפי, ב- OFT, נצפו הבדלים משמעותיים בין הקבוצות. קבוצת MOD הציגה ציונים אנכיים ואופקיים נמוכים יותר בהשוואה לקבוצת CON (**P < 0.01; איור 1A,B,E), מה שמרמז על כך שהליך CUMS היה יעיל בגרימת חרדה.

לאחר מכן, בדיקת העדפת סוכרוז (SPT) ניתנה במשך 5 ימים, כמתואר בשלב 2.4, כדי להעריך אם החולדות הראו סימנים של anhedonia לאחר חשיפה CUMS. התוצאות הצביעו על כך שלא היו הבדלים משמעותיים באחוז ההעדפה לסוכרוז בין הקבוצות ביום ה-0. עם זאת, ANOVA חד כיווני גילה הבדל משמעותי בצריכת סוכרוז בין הקבוצות ביום ה -28. באופן ספציפי, אחוז העדפת הסוכרוז בקבוצת MOD היה נמוך מזה שבקבוצת CON (**P < 0.01; איור 1C), המאשר את היעילות של פרוטוקול CUMS בגרימת אנהדוניה.

מחקר חד-כיווני של ANOVA גילה כי CUMS השפיע באופן משמעותי על הזיכרון המרחבי ויכולות הלמידה של חולדות, כפי שהוערך על ידי מבחן MWM. זמן ההשהיה של קבוצת MOD לאיתור הפלטפורמה היה ארוך משמעותית מזה של קבוצת CON (**P < 0.01). במונחים של זמני חצייה, קבוצת MOD חצתה פחות פעמים מקבוצת CON (**P < 0.01; איור 1D,F). ממצאים אלה תומכים ביעילות של פרוטוקול CUMS בגרימת פגיעה בזיכרון בחולדות.

תוצאות של רמות 5-HT בהיפוקמפוס במודל דיכאון חולדות המושרה על ידי CUMS
ANOVA חד-כיווני ברמות 5-HT בהיפוקמפוס הצביע על הבדל משמעותי בין הקבוצות (**P < 0.01). קבוצת MOD הראתה רמות נמוכות יותר של 5-HT בהיפוקמפוס בהשוואה לקבוצת CON (איור 2). תוצאות אלה מצביעות על כך שפרוטוקול CUMS הפחית ביעילות את רמות 5-HT בהיפוקמפוס, תופעה נפוצה בדיכאון אנושי²⁹.

איור 1: ההשפעות של מודל דיכאון חולדות הנגרם על-ידי CUMS. (A) ציונים אנכיים של מבחן שדה פתוח (OFT). (B) ציונים אופקיים של מבחן שדה פתוח. (ג) רמות צריכת סוכרוז (%) בימים 0 ו-28. אנהדוניה הנגרמת על ידי CUMS והפחיתה את העדפת הסוכרוז בחולדות. (D) זמן השהיה ומספרי חציית אזורים בבדיקת MWM. התוצאות מוצגות כממוצע ± SE (n = 12 חולדות לקבוצה). **P < 0.01 מצביע על שינויים משמעותיים בקבוצת המודל (MOD) בהשוואה לקבוצת הבקרה (CON) המחושבת באמצעות ניתוח חד-כיווני של שונות (ANOVA). (E) מסלולי OFT לאיתור חולדות בכל קבוצה. (F) מסלולי MWM עבור כל קבוצת חולדות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: השפעה על רמות 5-HT במוח במודל דיכאון הנגרם על ידי CUMS בחולדות. חולדות שנחשפו ל-4 שבועות של CUMS הדגימו ירידה משמעותית ברמות 5-HT בהיפוקמפוס בהשוואה לקבוצת הביקורת (CON). התוצאות מוצגות כממוצע ± SE (n = 12 חולדות לקבוצה). **P < 0.01 מצביע על שינויים משמעותיים בקבוצת המודל (MOD) בהשוואה לקבוצת CON המחושבת באמצעות ניתוח חד-כיווני של שונות (ANOVA). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

טבלה 1: לוח זמנים של מתח קל כרוני בלתי צפוי (CUMS). גורמי עקה ותאריכי ביצוע להשראת CUMS בחולדות.

טבלה 2. תשעה גורמי לחץ עם ארבעת תנאי העזר והתיאוריה של שלושה הומורים ברפואה המונגולית. הקשר הפנימי בין תשעת גורמי הלחץ, התיאוריה של שלושה הומורים, וארבעה תנאי עזר ברפואה המונגולית.

דיכאון הוא הפרעה נפשית המאופיינת בתסמינים כגון מצב רוח ירוד, חוסר הנאה ואנרגיה מופחתת³⁰. בתחום חקר הדיכאון, ביסוס מודל אמין של בעלי חיים הוא חיוני לקידום התערבויות טיפוליות. בין מודלים שונים של בעלי חיים, מודל CUMS ראוי לציון במיוחד בשל אמינותו הגבוהה, תוקפו, וחפיפתו למאפייני הדיכאון האנושי³¹. הוא מתאים היטב לחקות את ההשפעות המצטברות של גורמי לחץ ברמה נמוכה לאורך תקופה ממושכת במסגרות שונות. במחקר זה ביססנו מודל דיכאון הנגרם על ידי CUMS בחולדות, תוך שימוש במגוון גורמי עקה המתוארים בשלב 1.2.3 ובטבלה 2. מספר היבטים של פרוטוקול הלחץ הם קריטיים להצלחת המודל. ראשית, חולדות בכל קבוצות MOD חייבות להיות מאוכלסות בנפרד, בניגוד לחולדות בקבוצת CON. שנית, משטר הלחץ של CUMS צריך להיות מתוכנן בקפידה כדי לשמור על בלתי צפוי. באופן ספציפי, חולדות צריכות להיות נתונות לבחירה אקראית של שבעה מתוך תשעת גורמי העקה האפשריים על בסיס שבועי. השונות וחוסר החיזוי של גורמי לחץ אלה חיוניים ליעילות המודל^32,33. לבסוף, יש למזער שימוש חוזר באותו גורם עקה כדי למנוע מהחולדות להסתגל, מה שעלול לפגוע בשלמות תוצאות הניסוי. יתר על כן, הגדרות הלחץ תוכננו כך שניתן יהיה לכוונן אותן במהלך המחקר.

מודל CUMS מציע מספר יתרונות כמודל דיכאון. הוא תואם באופן הדוק את הפתוגנזה של דיכאון אנושי ומייצג במדויק את רוב הסימפטומים הקליניים ואת המנגנונים הבסיסיים³⁴. אחת מנקודות החוזק העיקריות שלה היא שהיא משתמשת באנהדוניה, או חוסר הנאה, כאינדיקטור הניתן לכימות ^6,7. המודל לוקח בחשבון גם את הגורמים השונים התורמים להופעת דיכאון^35,36. חשוב לציין, מודל CUMS מיועד ליישום לטווח ארוך, המתפרש על פני מספר חודשים. משך זמן זה עולה בקנה אחד עם הצרכים של מודל דיכאון ומאפשר הערכה של תרופות במשטר מינון כרוני, כמו גם זיהוי של תרכובות עם מנגנונים מהירים של פעולה³⁶. בשל אופיו המקיף, מודל CUMS הפך מקובל בספרות המדעית.

למרות יתרונות אלה, מודל CUMS אינו נטול מגבלות ^5,37. אחד החסרונות העיקריים הוא אופיו עתיר המשאבים, הדורש השקעות משמעותיות בסביבה, בכוח אדם ובזמן, וכתוצאה מכך יכולת השחזור שלו^נמוכה. יש גם חוסר עקביות בספרות לגבי הבחירה והעוצמה של גורמי לחץ, כמו גם את הרצף שבו הם מיושמים³⁸. חוסר עקביות כזה מקשה על שכפול המודל במעבדות שונות. יתר על כן, הספרות חסרה לוח זמנים מפורט להפעלת גורמי לחץ, מה שמוסיף שכבה נוספת של עמימות^39,40. סוגיה נוספת נובעת מהשונות בשיטות המשולבות הנהוגות במחקרים שונים; אלה לעתים קרובות חסרים רציונל מפורש, מה שיוצר קשיים בשכפול מודלים. בעלי חיים נבדקים רגישים מאוד לשינויים קלים בעיצוב הדחק, מה שתורם גם ליכולת שחזור נמוכה⁴⁰. יתר על כן, שימוש במספר מוגבל של גורמי לחץ יכול להוביל להרגל בקרב בעלי החיים הנבדקים, מה שהופך את עיצוב הלחץ לחיזוי. לבסוף, בעלי חיים ממעבדות שונות מראים תגובות מגוונות לגורמי עקה, מה שתורם ליכולת השחזור הירודה במחקרים שונים. בספרות הקיימת, חולדות Wistar Kyoto (WKY) זוהו כרגישות במיוחד לפנוטיפ דמוי דיכאון בעקבות חשיפה ל- CUMS^25,41. זה מצביע על כך ששונות בין זנים יכולה להשפיע באופן משמעותי על הרגישות לשינויים התנהגותיים הנגרמים על ידי מתח. באופן דומה, SPT, מדד מפתח המשמש לעתים קרובות להערכת היעילות של מודלים דיכאון, מציג קבוצה משלו של אתגרים. באופן ספציפי, חולדות בודדות מראות שונות בצריכה של תמיסת סוכרוז 1%^20,42. בתנאי עקה, הן בעלי חיים נוטים ללחץ והן בעלי חיים עמידים ללחץ מפגינים שינויים בצריכת תמיסות מתוקות. כתוצאה מכך, זה הופך להיות מאתגר לקבוע את חלקם של בעלי החיים בתוך קבוצה נתונה שהם באמת עמידים ללחץ או שייכים לקטגוריה ההפוכה. שונות זו עלולה לגרום לכך שחלק מבעלי החיים יציגו תוצאות SPT שאינן משקפות במדויק את מצב המחלה שלהם.

כדי לשפר את האמינות של מודל CUMS, אנו מציעים מספר חידודים מתודולוגיים. ראשית, חיוני להפריד בין בעלי חיים בקבוצת CON לבין בעלי חיים בקבוצת MOD כדי למתן את ההשפעה של גירויי ריח, ראייה ושמיעה, אשר יכולים לגרום ללחץ אצל בעלי חיים^43,44. שנית, כדי למזער את השונות, מומלץ למנות איש מעבדה מנוסה אחד או שניים לביצוע כל הניסויים. גישה זו משמשת להפחתת טעויות המיוחסות לגורמים בודדים. בנוסף, מחקרים קודמים זיהו חיות ניסוי עמידות ללחץ¹³; לפיכך, יהיה זה נבון לסנן קבוצות כאלה לפני ניסויים רשמיים או פוסט הוק כדי לפרש טוב יותר את התוצאות. לגבי מבחן SPT, שהוא הערכה התנהגותית מבוססת תגמול המודדת אנהדוניה פנימית, חיוני לקבוע את ריכוז הסוכרוז האופטימלי לפני תחילת פרוטוקול CUMS. קביעה ראשונית של העדפה על בסיס ריכוז סוכרוז יכולה לשפר באופן ניכר את הרגישות הפליה של הבדיקה²⁰. עם זאת, יש לציין כי חולדות הנתונות למחסור של 24 שעות במזון ומים עלולות לצרוך ללא הבחנה כל נוזל זמין עקב צמא קיצוני^35,45. כדי לקבל מדד מדויק יותר של העדפת סוכרוז, אנו ממליצים להעריך את הצריכה בשלב הלילי של המחזור הביולוגי, כאשר מכרסמים הם הפעילים ביותר. גורמי לחץ המופעלים במהלך השלב היומי (לא פעיל) עלולים לגרום למחסור כרוני בשינה, ובכך לגרום לגורם דחק לא מכוון^46,47. לבסוף, הכרחי לשלוט בקפידה בהשפעתם של גורמים הניתנים לניהול שתוארו לעיל כדי להבטיח שהנתונים שנאספו אמינים ככל האפשר.

משטרי הטיפול הקליניים המערביים הנוכחיים בדיכאון מגיעים לעתים קרובות עם תופעות לוואי רעילות בולטות וסבירות גבוהה להישנות עם הפסקת התרופות. חקירת גישות טיפול המושרשות ברפואה המסורתית והתעמקות בפתוגנזה של דיכאון דרך עדשת תיאוריית הרפואה המונגולית יכולים להציע תובנות חדשניות לגבי האטיולוגיה של המחלה. בהקשר זה, פיתוחם של מודלים חייתיים של דיכאון התואמים את עקרונות הרפואה המסורתית מהווה צעד מכריע במחקר הרפואה המונגולית. הבחירה של תשעת גורמי הלחץ בשיטת המידול CUMS של תרבות בודדת ראויה לציון במיוחד; הוא מבוסס על התאוריה של הרפואה המונגולית על שלושת ההומורים ועל הקשר האינהרנטי בין ארבעת תנאי העזר לבין שלושת ההומורים. גישה זו מפגינה רמה גבוהה של התאמה לעקרונות הייחודיים של הרפואה המונגולית. ניתוחים פנוטיפיים של דיכאון, בשילוב עם גורמים חיצוניים, מגלים מתאמים משמעותיים עם המושגים הרפואיים המונגוליים של רוח וליחה (ראו טבלה 2). באופן ספציפי, תפקוד לקוי הקשור לרוח מתבטא קלינית כתסמינים כגון אובדן אנרגיה, נדודי שינה, שכחה, עייפות וכאב. תפקוד לקוי הקשור לליחה, לעומת זאת, גורם לביטויים קליניים כמו חוסר תגובה, תודעה מטושטשת, פסימיות ושליליות. תסמינים אלה תואמים באופן הדוק את תסמיני הליבה של MDD ^48,49. לכן, מודל CUMS הנ"ל משמש כמודל פתולוגי המדמה ביעילות את האינטראקציות המורכבות בין תנאים חיצוניים ואת האיזון של שלושת סוגי ההומורים, כפי שהוצגה על ידי תורת הרפואה המונגולית, ובכך תורם להופעת המחלה.

נקודות החוזק של מודל זה הן מרובות פנים. ראשית, היא דבקה בתיאוריות אטיולוגיות רפואיות עכשוויות, ועונה על הקריטריונים שנקבעו למודלים של בעלי חיים בתחום הרפואה המודרנית. שנית, הוא משלב עקרונות מהרפואה המונגולית המסורתית כדי לשכפל סימפטומים ספציפיים של מחלות אנושיות בבעלי חיים, ובכך מגלם מאפיינים ייחודיים לפרקטיקות הרפואה המונגוליות. בהינתן התאמתו לתיאוריות רפואיות מודרניות ומסורתיות כאחד, מודל זה משמש פלטפורמה יעילה למחקר בסיסי ברפואה המונגולית. לכן, שילוב מחלות ותסמינים בתוך מודל בעלי חיים זה מייצג מפגש של מחקר ברפואה המונגולית והמודרנית. בעוד שלמודל יש מגבלות, השכלול המתמשך שלו יתרום משמעותית לעתיד המחקר הבסיסי ברפואה המונגולית.

מודלים של בעלי חיים הפכו להכרחיים בחקר הדיכאון בשל האתגרים האתיים והמעשיים הקשורים למחקר ישיר של המוח האנושי. למרות המגבלות הטבועות בהם בשכפול מלא של מורכבות הדיכאון, האבולוציה והאימות של מודלים אלה נותרו תהליך מתמשך. במחקר זה, שילבנו עקרונות הן מהרפואה המונגולית והן מהרפואה המודרנית כדי לפתח מודל חייתי של דיכאון. גישה שיתופית זו מציעה תובנות חשובות לבניית מודל מקיף יותר של בעלי חיים הכולל הן תיאוריות מונגוליות מסורתיות והן תיאוריות רפואיות מודרניות.

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

אנו אסירי תודה על המכשור והמעבדה שסופקו על ידיהרחבת תודתנו לפקולטה לרפואה מונגולית של האוניברסיטה הרפואית המונגולית הפנימית, סין.מחקר זה נתמך על ידי, על מתן המכשור הדרוש ומתקני מעבדה. מחקר זה קיבל תמיכה כספית מהקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מענק מס '81760762) ומפרויקט האוניברסיטה הרפואית של מונגוליה הפנימית של סין (מענק מס '. YKD2022MS074), ופרויקט המחקר המדעי להשכלה גבוהה במונגוליה הפנימית, סין (מענק מס' NJZY22661) ופרויקט הקרן הפתוחה של מעבדת מפתח לרפואה סינית ומונגולית באזור האוטונומי מונגוליה הפנימית, סין (מענק מס. MYX2023-K07).