Chronisch unvorhersehbarer milder Stress bei Ratten basierend auf der mongolischen Medizin

Dieses Protokoll skizziert ein CUMS-Modell (Chronic Unpredictable Mild Stress) für Depressionen, das auf der mongolischen medizinischen Theorie basiert, zusammen mit Methoden zur Validierung von Verhaltenstests.

Depression ist eine weit verbreitete affektive Störung und stellt eine der Hauptursachen für globale Behinderung dar. Die Einschränkungen der derzeitigen pharmakologischen Interventionen tragen zu der erheblichen gesundheitlichen Belastung bei, die dieser Erkrankung zugeschrieben wird. Es besteht ein dringender Bedarf an einem tieferen Verständnis der zugrunde liegenden Mechanismen der Depression, so dass präklinische Modelle mit translationalem Potenzial sehr wertvoll sind. Die mongolische Medizin, eine Untergruppe der traditionellen Medizin, postuliert, dass das Auftreten von Krankheiten eng mit dem Gleichgewicht von Wind, Galle und Schleim verbunden ist. In dieser Studie stellen wir ein Protokoll für die CUMS-Methode (Chronic Unpredictable Mild Stress) bei Ratten vor. In diesem Rahmen werden Ratten einer Reihe von fluktuierenden, milden Stressoren ausgesetzt, um einen depressionsähnlichen Phänotyp zu induzieren, der die Pathogenese der menschlichen Depression nachahmt. Zu den Verhaltenstests, die in diesem Protokoll verwendet werden, gehören der Saccharose-Präferenztest (SPT), der auf Anhedonie hinweist - ein Kernsymptom der Depression; der Open Field Test (OFT), der das Angstniveau misst; und der Morris Water Maze Test (MWM), der das räumliche Gedächtnis und die Lernfähigkeiten bewertet. Die CUMS-Methode demonstriert die Fähigkeit, Anhedonie zu induzieren und langfristige Verhaltensdefizite zu verursachen. Darüber hinaus orientiert sich dieses Protokoll stärker an der mongolischen Medizintheorie als andere Tiermodelle, die darauf ausgelegt sind, depressionsähnliches Verhalten hervorzurufen. Die Entwicklung dieses Tiermodells und die anschließende Forschung bieten eine solide Grundlage für zukünftige innovative Studien im Bereich der mongolischen Medizin.

Die Major Depression (MDD) ist eine weit verbreitete psychische Erkrankung, die weltweit die dritthäufigste Ursache für Behinderungen ist und von der über 300 Millionen Menschen betroffen sind^1,2,3. Es wird geschätzt, dass mindestens die Hälfte der Betroffenen keine angemessene Behandlung erhält⁴. Angesichts dieser Lücke dienen Tiermodelle als wichtiges Instrument, um die Ätiologie von Depressionen zu untersuchen. Bis heute existieren mehr als 20 verschiedene Tiermodelle für Depressionen⁵. Unter diesen ist das Modell des chronisch unvorhersehbaren milden Stresses (CUMS), das 1987 von Paul Winer verfeinert wurde, das am häufigsten verwendete Modell⁶. Das CUMS-Modell geht von der Prämisse aus, dass die Exposition von Nagetieren gegenüber einer Vielzahl von sozio-ökologischen Stressoren zu Symptomen führt, die mit Angstzuständen, Anspannung und Depressionen vergleichbar sind. Die Methodik besteht darin, die Tiere über mehrere Wochen hinweg verschiedenen leichten Stressoren auszusetzen, was in einer Reihe von Verhaltensänderungen gipfelt, darunter Anhedonie und depressive Verhaltensweisen^7,8. Diese Veränderungen gehen mit Verschiebungen der endokrinen und Neurotransmitterprofile einher, wie z. B. einer Verringerung der 5-HT^9,10. Diese Ergebnisse entsprechen weitgehend denen, die bei Menschen mit MDD beobachtet wurden, was den Nutzen des Modells bestätigt. Das CUMS-Modell wird besonders für seine Wirksamkeit bei der Bewertung von Antidepressiva geschätzt und zeigt ein hohes Maß an oberflächlicher, struktureller und prädiktiver Validität^11,12. Im Gegensatz zu anderen Modellen reagiert CUMS empfindlich auf die Auswirkungen der chronischen Verabreichung von monoaminergen Antidepressiva. Zum Beispiel hat sich gezeigt, dass selektive Serotonin-Wiederaufnahmehemmer (SSRIs) wie Citalopram, Paroxetin und Fluoxetin Anhedonie unter chronischen Stressbedingungen verhindern und umkehren können^12,13. Darüber hinaus haben auch neue schnell wirkende Antidepressiva wie Ketamin in diesem Modell Wirksamkeit gezeigt^14,15. Im Gegensatz dazu sind andere Tests wie der Forced Swimming Test (FST) und der Tail Suspension Test (TST) weniger zuverlässig für die Modellierung langfristiger Verhaltensänderungen und spiegeln oft eher Anpassungen an akuten Stress als anhaltende Symptome einer Depression wider¹⁶. Diese Merkmale unterstreichen die robuste Validität des CUMS-Modells in der Depressionsforschung. Eines der hervorstechendsten Merkmale des CUMS-Modells, das in der Altertumswissenschaft für seine hohe Zuverlässigkeit anerkannt ist, ist die Anhedonie - die Unfähigkeit, Freude oder Interesse an alltäglichen Aktivitäten zu empfinden^17,18. Dieses Phänomen wird häufig mit Saccharose-Präferenztests bewertet, und es wurde gezeigt, dass viele Antidepressiva den reduzierten Saccharosekonsum rückgängig machen. In der CUMS-Literatur werden auch mehrere andere Metriken häufig verwendet, darunter der Open Field Test (OFT), der das willkürliche motorische Verhalten, die explorativen Tendenzen und die Anspannung bewertet und so den Schweregrad der Depression misst¹⁹. Andere Tests wie der erhöhte Plus-Labyrinth (EPM) bewerten angstähnliche Verhaltensweisen, der Morris-Wasserlabyrinth-Test (MWM) untersucht die kognitiven Funktionen²⁰, und der FST bewertet die Anfälligkeit für negative Emotionen und Verhaltensverzweiflung²⁰. Darüber hinaus sind die meisten Stressoren, die sich auf den Menschen auswirken, sozialer Natur. Personen mit suboptimalen sozialen Beziehungen, die durch eingeschränkte soziale Aktivitäten, Netzwerke und Unterstützung gekennzeichnet sind, haben ein erhöhtes Risiko für verschiedene Krankheiten^21,22. Dies gilt auch für Nagetiere, bei denen es sich um soziale Tiere handelt, die in Gruppen leben. Zum Beispiel weisen Ratten, die in Isolation gehalten werden, Merkmale des sogenannten Isolationssyndroms auf, das sozialen Stress hervorruft und das Auftreten von Depressionen beschleunigt²³.

Die mongolische Medizin, ein bedeutender Zweig der chinesischen Medizin, geht davon aus, dass der Ausbruch einer Krankheit ein komplexes Zusammenspiel zwischen intrinsischen und externen Faktoren ist. Zu diesen externen Faktoren, die als die vier Nebenbedingungen bezeichnet werden, gehören der Klimawandel, die Ernährung, der Lebensstil und plötzliche Ereignisse wie Infektionen, überraschende Ereignisse und psychische Störungen. Der Krankheitsprozess wird als eine fortlaufende Interaktion zwischen drei Elementen - die als die drei Arten von Homoren bezeichnet werden - und den sieben körperlichen Bestandteilen in Übereinstimmung mit den vier Hilfsbedingungen^{konzeptualisiert 24}. Die mongolische Medizin geht davon aus, dass der menschliche Körper als eine integrierte Einheit funktioniert, die durch ein relatives Gleichgewicht zwischen den drei Homorn aufrechterhalten wird. Eine Störung dieses Gleichgewichts wird als Vorläufer der Krankheit^{angesehen 24}. Angesichts der zentralen Rolle von Tierversuchen bei der Brücke zwischen traditioneller und moderner Medizin ist es von entscheidender Bedeutung, Tiermodelle zu entwickeln, die für die Forschung im Bereich der mongolischen Medizin relevant sind. Dementsprechend haben wir eine 28-tägige Isolationsmethodik in Verbindung mit CUMS eingesetzt, um diese physiologischen und psychologischen Stressoren zu simulieren. Wir wählten neun spezifische unvorhersehbare Stressoren aus und versuchten, diese Modellierungsmethode durch die Drei-Homors-Theorie der mongolischen Medizin zu untermauern. Die Etablierung eines robusten Tiermodells ist grundlegend für die Förderung der Grundlagenforschung in der mongolischen Medizin und wird wesentlich zu deren Grundlagenstudien beitragen.

Die Versuchsprotokolle wurden vom Ethics of Animal Trial Care Committee der Medizinischen Universität der Inneren Mongolei (YKD202301172) genehmigt und entsprachen den Richtlinien der National Institutes of Health für Tierpflege und Ethik. Die Lizenznummer für unser Tierzentrum lautet NO.110324230102364187. Vierundzwanzig männliche Sprague-Dawley (SD) Ratten, jeweils 8 Wochen alt (200 g ± 20 g), wurden erworben und in einer kontrollierten Umgebung mit einer Temperatur von 22 °C ± 2 °C und einer Luftfeuchtigkeit von 55 % ± 15 % untergebracht. Füttern Sie die Ratten mit einem Nagetier-Erhaltungsfutter und reinem Wasser mit Maiskolben als Einstreu. Die Ratten wurden vor dem Experiment 1 Woche lang einem 12 h/12 h Hell-Dunkel-Zyklus unterzogen.

1. Etablierung des CUMS-Rattenmodells

1. Gruppierung
   1. Teilen Sie die 24 Ratten nach dem Zufallsprinzip in 2 Gruppen auf: die Kontrollgruppe (CON), die keiner Isolation oder Stress ausgesetzt wird, und die Modellgruppe (MOD). Jede Gruppe enthält 12 Ratten.
   2. Halten Sie die Ratten in Standardkäfigen mit den Maßen 55 cm x 40 cm x 20 cm mit 6 Ratten pro Käfig. Behalten Sie die Käfigbelegung während der gesamten Eingewöhnungsphase bei, sofern nicht anders angegeben.
   3. Füllen Sie jeden Aufzuchtkäfig mit frischer Einstreu und tauschen Sie ihn zweimal pro Woche aus.
   4. Führen Sie eine 1-wöchige Eingewöhnungsphase durch. Ermöglichen Sie den Ratten uneingeschränkten Zugang zu Futter und Wasser, außer während der Anwendung von CUMS-Stressoren. Halten Sie eine konstante Umgebung mit einer Temperatur von 22 °C ± 2 °C, einer Luftfeuchtigkeit von 55 % ± 15 % und einem Hell-/Dunkelzyklus von 12 Stunden/12 Stunden von 08:00 bis 20:00 Uhr aufrecht, sofern nicht anders angegeben.
   5. Vor Beginn des Experiments sollten die Ratten täglich angefasst werden, um sie an den Forscher zu gewöhnen und zusätzlichen Stress während der Versuchsphase zu minimieren.
2. Isolation mit chronisch unvorhersehbarem leichtem Stress
   1. Platzieren Sie die MOD- und CON-Gruppen gleichzeitig in getrennten Räumen. Halten Sie die MOD-Gruppenratten einzeln unter, während Sie die CON-Gruppenratten zusammen halten. Halten Sie alle anderen Bedingungen konstant.
   2. Implementieren Sie ein 28-tägiges Stressor-Regime²⁵. Um Gewöhnung zu verhindern und die Unvorhersehbarkeit der Stressoren zu gewährleisten, verabreichen Sie einen zufälligen Stressor pro Tag und vermeiden Sie die Verwendung desselben Stressors an aufeinanderfolgenden Tagen.
   3. Wenden Sie nach dem Zufallsprinzip einen der folgenden neun Stressoren^26,27 an verschiedenen Tagen an: 24 h Wasserentzug, 24 h Nahrungsentzug, nasses Polstern, Käfigneigung, Inversion des Hell-Dunkel-Zyklus, Kälteeinwirkung bei 4 °C, Hitzeeinwirkung bei 45 °C, 1 min Schwanzklemmung oder 15 min Schütteln bei 160 U/min. Das spezifische Design ist in Tabelle 1 dargestellt.
   4. Beschränken Sie während der Anwendung des Stressors den Zugang zu Nahrung und Wasser auf die MOD-Gruppe, bis der Stress vorüber ist, außer während der Umkehrung des Hell-Dunkel-Zyklus. Die CON-Gruppe war nicht verpflichtet, Einschränkungen bei Wasser und Ernährung zu machen.
3. Stress-Methoden
   1. Beginnen Sie das Experiment, indem Sie Depressionsstimuli in Verbindung mit einer 28-tägigen Isolation auf alle Ratten anwenden, mit Ausnahme der Kontrollgruppe. Halten Sie diese Ratten in einzelnen Käfigen. In Tabelle 2 finden Sie Zustände im Zusammenhang mit Depressionsreizen.
   2. Um die Schwanzklemmmethode durchzuführen, sichern Sie den Schwanz einer Ratte aus der MOD-Gruppe, indem Sie den Schwanz mit einer Standard-Büroklammer in einem Abstand von 1-2 cm von der Schwanzwurzel der Ratte festklemmen. Messen Sie die Spannzeit für eine Dauer von 1 min (n = 12).
   3. Bei der Wasserentzugsmethode wird einer Ratte der MOD-Gruppe Wasser vorenthalten, indem man die Wasserflasche entfernt und 24 Stunden lang aufzeichnet.
      HINWEIS: Der Zeitpunkt des Beginns des Wasserentzugs wurde aufgezeichnet, damit die Endzeit genau berechnet werden konnte. Das Verhalten der Ratten während dieser Zeit wurde beobachtet, einschließlich Aktivität, Appetit und psychischer Verfassung.
   4. Bei der Methode des Nahrungsentzugs wird einer Ratte der MOD-Gruppe das Futter vorenthalten und 24 Stunden lang aufgezeichnet.
      HINWEIS: Notieren Sie den Zeitpunkt, zu dem der Nahrungsentzug beginnt, damit die Endzeit genau berechnet werden kann. sicherzustellen, dass die Ratten während dieser Zeit ausreichend mit Flüssigkeit versorgt sind; und beobachten Sie das Verhalten der Ratten während dieser Zeit, einschließlich Aktivität und mentalem Zustand usw.
   5. Für die Kältestimulation bei 4 °C eine Ratte aus der MOD-Gruppe in einen Eimer mit kaltem Wasser legen und 5 Minuten lang aufnehmen. Stellen Sie sicher, dass die Wassertemperatur während des gesamten Tests konstant bleibt. Trocknen Sie die Ratte am Ende des Versuchs mit einem Gebläse ab und setzen Sie sie wieder in ihren ursprünglichen Käfig ein.
      HINWEIS: Halten Sie die Temperatur des kalten Wassers mit einem Thermometer und Eiswürfeln auf 4 °C, um die Wassertemperatur zu regulieren, wenn sie steigt. Das Wasser sollte regelmäßig gewechselt werden, um sicherzustellen, dass die Wasserqualität sauber und die Temperatur konstant ist. Beim Schwimmen sollten alle Gliedmaßen und Rüssel der Ratten mit Ausnahme des Kopfes in kaltes Wasser getaucht werden. Die Wassertiefe muss größer sein als die Körperlänge der Ratte, um zu verhindern, dass die Ratte durch Kontakt mit dem Boden des Eimers aus dem Wasser springt.
   6. Um eine Hitzebelastung von 45 °C zu bewältigen, legen Sie eine MOD-Gruppenratte in einen Inkubator und zeichnen Sie sie 5 Minuten lang auf, um sicherzustellen, dass die Temperatur während des gesamten Tests stabil bleibt.
   7. Bei der Umkehrung des Hell-Dunkel-Zyklus hüllen Sie den Käfig für 1 h in ein schwarzes Tuch, um die Dunkelheit am Tag zu simulieren. Beleuchten Sie den Käfig anschließend nachts 12 Stunden lang, um das Tageslicht nachzuahmen. Notieren Sie das Verhalten der Ratte, die Nahrungs- und Wasseraufnahme sowie das Schlafverhalten für 24 Stunden.
   8. Für das Nasspolsterexperiment geben Sie 200 ml Wasser in einen Käfig mit 100 g Polsterung. Halten Sie eine MOD-Gruppenratte im nassen Käfig und zeichnen Sie das Verhalten der Ratten unter nassem Einstreustress auf, einschließlich Aktivität, Appetit, Wasseraufnahme usw. Beobachten Sie, ob es abnormale Verhaltensweisen oder unangenehme Reaktionen gibt, wie z. B. den Haut- und Haarzustand der Ratten, die durch die nasse Polsterung verursacht werden können, und zeichnen Sie diese rechtzeitig für die anschließende Analyse für 24 Stunden auf. Trocknen Sie die Ratte nach dem Test mit einem Gebläse ab und stellen Sie sie wieder in einen Käfig mit frischen Holzspänen.
   9. Bei der Käfigneigungsmethode wird eine Ratte der MOD-Gruppe in einem Käfig platziert, der in einem Winkel von 45° gegen eine Wand geneigt ist, und 24 Stunden lang aufgezeichnet. Verwenden Sie die Käfigrahmenstruktur, um den Winkel anzupassen und den Käfig an Ort und Stelle zu sichern.
      HINWEIS: Berechnen Sie die Zeit von Anfang bis Ende und beobachten Sie das Verhalten der Ratten während der Zeit des Kippens des Käfigs, einschließlich Aktivität, Appetit und mentaler Verfassung, und stellen Sie sicher, dass der Winkel des gekippten Käfigs korrekt eingestellt ist und stabil bleibt, um die Genauigkeit und Reproduzierbarkeit des Experiments zu gewährleisten.
   10. Für das Schütteln mit hoher Geschwindigkeit setzen Sie eine MOD-Gruppenratte in einen mechanischen Shaker, der auf 160 U/min eingestellt ist, und nehmen Sie die Ratte 15 Minuten lang auf. Anschließend werden Verhaltenstestmethoden verwendet, um die erfolgreiche Etablierung des Modells zu bewerten.
   11. Verschieben Sie nach dem Anwenden von Stressoren die MOD-Gruppenkäfige aus dem CUMS-Raum zurück in den Haltungsraum. Halten Sie die CON-Gruppe während der 4-wöchigen Stressexpositionsphase in ihren Heimkäfigen, die sich im Haltungsraum befinden.
4. Vorsichtsmaßnahmen während der Versuche
   1. Bringen Sie die Käfige der MOD-Gruppe nach dem Anlegen des Stressors im CUMS-Raum zurück in den allgemeinen Haltungsraum.
   2. Tierüberwachung während der CUMS-Modellierung
      1. Während des Schwanzklemmens wird das Tier aufgrund der induzierten Stimulation wahrscheinlich Schwierigkeiten haben. Überwachen Sie während dieser Zeit kontinuierlich die Klemme. Wenn es sich löst, halten Sie den Timer an, setzen Sie die Klemme erneut auf und setzen Sie den Timer dann für 1 Minute fort.
      2. Verhängen Sie nicht gleichzeitig Wasserentzug und Stressfaktoren für nasse Einstreu.
         HINWEIS: Die Vermeidung des gleichzeitigen Auferlegens von nasser Polsterung und Wasserentzug trägt zur Aufrechterhaltung der experimentellen Integrität bei, reduziert Störvariablen und fördert den Tierschutz.
      3. Die Körpertemperatur des Tieres und die Umgebungstemperatur im Raum können die Wassertemperatur beim Schwimmen in kaltem Wasser erhöhen. Passen Sie daher durch Zugabe von Eiswasser oder Eiswürfeln an, um eine konstante Wassertemperatur zu halten.
      4. Beobachten Sie die Ratten in Abständen von 30 Minuten während der Anwendung von Stressoren, außer während der Tagesumkehr. Achten Sie besonders auf Anzeichen von ungewöhnlichem Stress wie Zittern, Lethargie oder Bewegungsmangel. Wenn solche Symptome beobachtet werden - insbesondere eine mögliche Unterkühlung beim Schwimmen in kaltem Wasser bei 4 °C und nasser Einstreu - entfernen Sie die Ratte sofort aus dem Stressor.
         HINWEIS: Die Versuchstiere sind aus der Studie zu entfernen, wenn sie gesundheitliche Probleme haben, wie z. B. Infektionen, schwere Traumata, aggressives Verhalten, abnormale Mobilität usw. Die Bedingungen für die Entfernung der Tiere aus der Studie drehen sich in der Regel um den Schutz ihrer Gesundheit und Sicherheit bei gleichzeitiger Gewährleistung der Integrität der Versuchsergebnisse.
      5. Führen Sie tägliche Inspektionen auf Wunden oder andere körperliche oder Verhaltensauffälligkeiten bei jeder Ratte durch. Wenn Anomalien festgestellt werden, konsultieren Sie den Labortierarzt, um festzustellen, ob die Ratte aus dem Versuch ausgeschlossen werden sollte.
      6. Wiegen Sie jede Ratte alle 3 Tage. Verliert ein Tier mehr als 20 % seines Basalgewichts vor der Fütterung, muss es vom Versuch ausgeschlossen werden.

2. Verhaltenstests

1. Zu Beginn verabreichen Sie die Depressionsreize in Verbindung mit einer Isolation für 28 Tage an alle Ratten, mit Ausnahme der Kontrollgruppe. Halten Sie die Ratten in einzelnen Käfigen. In Tabelle 2 finden Sie Einzelheiten zu den Zuständen, die bei Depressionsreizen auftreten.
2. Für den Freilandtest unterteilen Sie eine Blackbox in 25 quadratische Abschnitte mit gleicher Fläche. Installieren Sie ein Video-Tracking-Analysesystem in der Box. Platzieren Sie die Ratte auf dem zentralen Platz und überwachen Sie ihre horizontalen und vertikalen Aktivitäten für eine Dauer von 5 Minuten.
   HINWEIS: Die Abmessungen der Box betragen 500 mm x 500 mm x 300 mm. Aktivitätsdaten werden mit Hilfe des Video-Tracking-Systems gesammelt, um angstbedingte Verhaltensweisen bei Nagetieren zu bewerten, wenn sie einer neuen Umgebung ausgesetzt sind.
3. Zählen Sie anschließend die Anzahl der Felder, die die Ratte mit allen Pfoten zurückgelegt hat, um die horizontale Aktivität zu quantifizieren. Zählen Sie Fälle von Stehen und Putzen als Indikatoren für vertikale Aktivität. Desinfizieren Sie die Box nach jedem Test mit 75 % Alkohol, um alle verbleibenden Rattengerüche für nachfolgende Tests zu entfernen.
4. Als nächstes wird die Anhedonie durch den Saccharose-Präferenztest bewertet. Stellen Sie zwei Flaschen auf den Käfigdeckel: Flasche A enthält reines Wasser, Flasche B 1%ige Saccharoselösung. Erlauben Sie der Ratte ad libitum den Zugang zu beiden Lösungen. Wiegen Sie die Flaschen vor und nach dem Verzehr, um die 60-minütigen Saccharose-Präferenzraten an den Tagen 0, 7, 14, 21 und 28 zu berechnen. Die Formel lautet wie folgt:
   Saccharoseverbrauch = × 100%
5. Um das räumliche Gedächtnis und die Lernfähigkeiten zu messen, verwenden Sie den Morris-Wasserlabyrinth-Test. Teilen Sie den Pool in vier Quadranten auf und nummerieren Sie sie von eins bis vier. Stellen Sie eine untergetauchte Ruheplattform 1 cm unter der Wasseroberfläche im dritten Quadranten auf.
6. Geben Sie Milch in das Becken, um die Wassertrübung zu erhöhen und eine Wassertemperatur von ca. 23 °C während des gesamten Versuchsverfahrens aufrechtzuerhalten.
7. Platziere jede Ratte in verschiedenen Quadranten des Labyrinths, so dass sie 120 Sekunden Zeit hat, die versteckte Plattform zu finden. Die Ratten müssen sich auf ihr räumliches Gedächtnis und ihre Lernfähigkeiten verlassen, um sich den Standort der Plattform zu merken. Sobald sie den Standort der Plattform kennen, können sie direkt dorthin schwimmen. Zeichnen Sie die Latenzzeit mit dem Morris Wasserlabyrinth-Videoverfolgungssystem auf.
8. Positionieren Sie die Ratte an einem festen Platz im Pool. Wenn das Subjekt die versteckte Plattform nicht innerhalb von 120 s finden kann, zeichnen Sie die Latenz mit 120 s auf.
9. Zum Schluss entfernst du die versteckte Plattform, setzt die Ratte wieder ins Wasser und notierst die Anzahl der Zonendurchquerungen über einen Zeitraum von 120 s.

3. Statistische Analyse

1. Um signifikante Unterschiede in den biochemischen Parametern zu bewerten, verwenden Sie eine Einweg-Varianzanalyse (ANOVA), gefolgt von Duncans Post-hoc-Test. Präsentieren Sie die Daten als Mittelwert ± Standardfehlers (SE) und betrachten Sie einen p-Wert von weniger als 0,05 als statistisch signifikant.

Ergebnisse der Verhaltenstests im CUMS-induzierten Rattendepressionsmodell
Um die Wirksamkeit des CUMS-Verfahrens bei der Induktion von depressionsähnlichen Verhaltensweisen zu bestätigen, wurde ein Manipulationscheck durchgeführt. Männliche Sprague-Dawley-Ratten (SD) wurden über einen Zeitraum von 4 Wochen nach dem Zufallsprinzip entweder der MOD- oder der CON-Gruppe zugeteilt, wie in Schritt 1.2.3 beschrieben. Anschließend wurden die Ratten getötet und ihre Hippocampi vollständig präpariert, um 5-HT, einen Neurotransmitter, der stark mit der Pathophysiologie der Depression^{assoziiert ist 10}, unter Verwendung des Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)²⁸ zu bestimmen.

Vor der CUMS-Induktion wurden keine signifikanten Unterschiede zwischen den getesteten Gruppen im OFT-Score, in der Saccharosepräferenz oder in der MWM-Analyse beobachtet.

Nach der Etablierung des CUMS-Modells zeigte eine unidirektionale Varianzanalyse (ANOVA) einen signifikanten Einfluss von CUMS auf das Angstverhalten von Ratten. Insbesondere im OFT wurden signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen beobachtet. Die MOD-Gruppe wies im Vergleich zur CON-Gruppe niedrigere vertikale und horizontale Werte auf (**P < 0,01; Abbildung 1A,B,E), was darauf hindeutet, dass das CUMS-Verfahren wirksam bei der Induktion von Angst war.

Anschließend wurde der Saccharose-Präferenztest (SPT) über 5 Tage durchgeführt, wie in Schritt 2.4 beschrieben, um zu beurteilen, ob die Ratten Anzeichen einer Anhedonie nach CUMS-Exposition zeigten. Die Ergebnisse zeigten keine signifikanten Unterschiede in der prozentualen Saccharosepräferenz zwischen den Gruppen an Tag 0. Die unidirektionale ANOVA zeigte jedoch einen signifikanten Unterschied in der Saccharoseaufnahme zwischen den Gruppen an Tag 28. Insbesondere war der Prozentsatz der Saccharosepräferenz in der MOD-Gruppe niedriger als in der CON-Gruppe (**P < 0,01; Abbildung 1C), was die Wirksamkeit des CUMS-Protokolls bei der Induktion von Anhedonie bestätigt.

Eine unidirektionale ANOVA zeigte, dass CUMS das räumliche Gedächtnis und die Lernfähigkeiten von Ratten signifikant beeinflusste, wie im MWM-Test festgestellt wurde. Die Latenz für die MOD-Gruppe zum Auffinden der Plattform war deutlich länger als die für die CON-Gruppe (**P < 0,01). Was die Überquerungszeiten anbelangt, so überquerte die MOD-Gruppe weniger Male als die CON-Gruppe (**P < 0,01; Abbildung 1D,F). Diese Ergebnisse unterstützen die Wirksamkeit des CUMS-Protokolls bei der Induktion von Gedächtnisstörungen bei Ratten.

Ergebnisse der 5-HT-Spiegel im Hippocampus im CUMS-induzierten Depressionsmodell der Ratte
Die unidirektionale ANOVA auf den hippokampalen 5-HT-Spiegeln zeigte einen signifikanten Unterschied zwischen den Gruppen (**P < 0,01). Die MOD-Gruppe wies im Vergleich zur CON-Gruppe reduzierte hippocampale 5-HT-Spiegel auf (Abbildung 2). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass das CUMS-Protokoll die 5-HT-Spiegel im Hippocampus effektiv senkte, ein Phänomen, das häufig bei menschlichen Depressionen beobachtet wird²⁹.

Abbildung 1: Auswirkungen des CUMS-induzierten Rattendepressionsmodells. (A) Vertikale Ergebnisse des Open Field Test (OFT). (B) Horizontale Ergebnisse bei offenen Feldtests. (C) Saccharoseverbrauch (%) an den Tagen 0 und 28. CUMS-induzierte Anhedonie und reduzierte Saccharosepräferenz bei Ratten. (D) Latenzzeit und Zonenüberschreitungszahlen im MWM-Test. Die Ergebnisse werden als mittlere ± SE dargestellt (n = 12 Ratten pro Gruppe). **P < 0,01 zeigt signifikante Veränderungen in der Modellgruppe (MOD) im Vergleich zur Kontrollgruppe (CON) an, die mit Hilfe einer unidirektionalen Varianzanalyse (ANOVA) berechnet wurde. (E) OFT-Tracks für Ratten in jeder Gruppe. (F) MWM-Tracks für jede Gruppe von Ratten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Wirkung auf die 5-HT-Spiegel im Gehirn im CUMS-induzierten Depressionsmodell bei Ratten. Ratten, die 4 Wochen lang CUMS erhielten, zeigten eine signifikante Verringerung der 5-HT-Spiegel im Hippocampus im Vergleich zur Kontrollgruppe (CON). Die Ergebnisse werden als mittlere ± SE dargestellt (n = 12 Ratten pro Gruppe). **P < 0,01 deutet auf signifikante Änderungen in der Modellgruppe (MOD) im Vergleich zur CON-Gruppe hin, die mit einer unidirektionalen Varianzanalyse (ANOVA) berechnet wurde. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Tabelle 1: Zeitplan für chronisch unvorhersehbaren milden Stress (CUMS). Stressoren und Ausführungstermine für die Induktion von CUMS bei Ratten.

Tabelle 2. Neun Stressoren mit den vier Nebenbedingungen und die Theorie der drei Homors in der mongolischen Medizin. Die intrinsische Beziehung zwischen den neun Stressoren, die Theorie der drei Homore und die vier Hilfsbedingungen in der mongolischen Medizin.

Depression ist eine psychische Störung, die durch Symptome wie schlechte Stimmung, mangelnde Lust und verminderte Energie gekennzeichnet^{ist 30}. Im Bereich der Depressionsforschung ist die Etablierung eines verlässlichen Tiermodells entscheidend, um therapeutische Interventionen voranzutreiben. Unter den verschiedenen Tiermodellen ist das CUMS-Modell besonders bemerkenswert für seine hohe Reliabilität, Validität und Kongruenz mit den Merkmalen der menschlichen Depression³¹. Es eignet sich gut, um die kumulativen Auswirkungen von Low-Level-Stressoren über einen längeren Zeitraum in verschiedenen Umgebungen nachzuahmen. In dieser Studie etablierten wir ein CUMS-induziertes Depressionsmodell bei Ratten, das eine Reihe von Stressoren verwendete, die in Schritt 1.2.3 und Tabelle 2 beschrieben sind. Mehrere Aspekte des Stressprotokolls sind entscheidend für den Erfolg des Modells. Erstens müssen Ratten in allen MOD-Gruppen einzeln untergebracht werden, im Gegensatz zu denen in der CON-Gruppe. Zweitens sollte das CUMS-Stressregime sorgfältig geplant werden, um die Unvorhersehbarkeit aufrechtzuerhalten. Konkret sollten Ratten wöchentlich einer randomisierten Auswahl von sieben der neun möglichen Stressoren unterzogen werden. Die Variabilität und Unvorhersehbarkeit dieser Stressoren sind wesentlich für die Wirksamkeit des Modells^32,33. Schließlich sollte die wiederholte Anwendung desselben Stressors minimiert werden, um zu verhindern, dass sich die Ratten anpassen, was die Integrität der Versuchsergebnisse beeinträchtigen könnte. Darüber hinaus wurden die Stressoreinstellungen so konzipiert, dass sie im Laufe der Studie anpassbar sind.

Das CUMS-Modell bietet als Depressionsmodell mehrere Vorteile. Sie lehnt sich eng an die Pathogenese der menschlichen Depression an und stellt die meisten klinischen Symptome und zugrunde liegenden Mechanismen genau dar³⁴. Eine seiner Hauptstärken besteht darin, dass es die Anhedonie oder den Mangel an Lust als quantifizierbaren Indikator verwendet ^6,7. Das Modell berücksichtigt auch die verschiedenen Faktoren, die zum Auftreten von Depressionen beitragen^35,36. Wichtig ist, dass das CUMS-Modell für eine langfristige Anwendung über mehrere Monate ausgelegt ist. Diese Dauer entspricht den Anforderungen eines Depressionsmodells und ermöglicht die Bewertung von Arzneimitteln in einem chronischen Dosierungsschema sowie die Identifizierung von Verbindungen mit schnellen Wirkmechanismen³⁶. Aufgrund seines umfassenden Charakters hat sich das CUMS-Modell in der wissenschaftlichen Literatur durchgesetzt.

Trotz dieser Vorteile ist das CUMS-Modell nicht ohne Einschränkungen ^5,37. Einer der Hauptnachteile ist die ressourcenintensive Natur, die erhebliche Investitionen in Umwelt, Arbeitskräfte und Zeit erfordert, was folglich zu einer geringen Reproduzierbarkeit führt³⁸. Auch in der Literatur gibt es Inkonsistenzen hinsichtlich der Auswahl und Intensität von Stressoren sowie der Reihenfolge, in der sie angewendet werden³⁸. Solche Inkonsistenzen machen es schwierig, das Modell in verschiedenen Labors zu replizieren. Darüber hinaus fehlt in der Literatur ein detaillierter Zeitplan für die Anwendung von Stressoren, was eine weitere Ebene der Ambiguität darstellt^39,40. Ein weiteres Problem ergibt sich aus der Variation der Kombinationsmethoden, die in verschiedenen Studien angewandt werden. Diese haben oft keine explizite Begründung, was zu Schwierigkeiten bei der Modellreplikation führt. Die Versuchstiere reagieren sehr empfindlich auf geringfügige Veränderungen im Stressordesign, was ebenfalls zu einer geringen Reproduzierbarkeit beiträgt⁴⁰. Darüber hinaus kann die Verwendung einer begrenzten Anzahl von Stressoren zu einer Gewöhnung bei den Versuchstieren führen, wodurch das Stressordesign vorhersehbar wird. Schließlich zeigen Tiere aus verschiedenen Laboratorien unterschiedliche Reaktionen auf Stressoren, was zu der schlechten Reproduzierbarkeit in allen Studien beiträgt. In der vorhandenen Literatur wurden Ratten mit Wistar Kyoto (WKY) als besonders anfällig für einen depressionsähnlichen Phänotyp nach Exposition gegenüber CUMS^{identifiziert 25,41}. Dies deutet darauf hin, dass die Variabilität zwischen den Stämmen die Anfälligkeit für stressinduzierte Verhaltensänderungen signifikant beeinflussen kann. In ähnlicher Weise stellt der SPT, eine wichtige Kennzahl, die häufig zur Bewertung der Wirksamkeit von Depressionsmodellen verwendet wird, eine Reihe von Herausforderungen dar. Insbesondere zeigen einzelne Ratten eine Variabilität in ihrem Verbrauch einer 1%igen Saccharoselösung^20,42. Sowohl stressanfällige als auch stressresistente Tiere zeigen unter Stressbedingungen Veränderungen in ihrem Konsum von süßen Lösungen. Folglich wird es schwierig, den Anteil der Tiere innerhalb einer bestimmten Charge zu ermitteln, die wirklich stressresistent sind oder der entgegengesetzten Kategorie angehören. Diese Variabilität kann dazu führen, dass einige Tiere SPT-Ergebnisse aufweisen, die ihren Krankheitszustand nicht genau widerspiegeln.

Um die Zuverlässigkeit des CUMS-Modells zu erhöhen, schlagen wir mehrere methodische Verfeinerungen vor. Erstens ist es entscheidend, die Tiere in der CON-Gruppe von denen in der MOD-Gruppe zu trennen, um die Auswirkungen von olfaktorischen, visuellen und auditiven Reizen zu mildern, die bei den Tieren Stress auslösen können^43,44. Zweitens ist es zur Minimierung der Variabilität ratsam, ein oder zwei erfahrene Labormitarbeiter mit der Durchführung aller Experimente zu beauftragen. Dieser Ansatz dient dazu, Fehler zu reduzieren, die auf einzelne Faktoren zurückzuführen sind. Darüber hinaus wurden in früheren Forschungen stressresiliente Versuchstiere identifiziert¹³; Daher wäre es ratsam, nach solchen Gruppen zu suchen, entweder vor formellen Experimenten oder im Nachhinein, um die Ergebnisse besser interpretieren zu können. In Bezug auf den SPT-Test, bei dem es sich um eine belohnungsbasierte Verhaltensbewertung handelt, die die intrinsische Anhedonie misst, ist es wichtig, die optimale Saccharosekonzentration zu bestimmen, bevor das CUMS-Protokoll eingeleitet wird. Die vorläufige Festlegung einer Präferenz auf der Grundlage der Saccharosekonzentration kann die diskriminierende Sensitivität des Tests deutlich erhöhen²⁰. Es sollte jedoch beachtet werden, dass Ratten, die 24 Stunden lang Nahrungs- und Wasserentzug ausgesetzt sind, aufgrund von extremem Durst wahllos jede verfügbare Flüssigkeit zu sich nehmen können^35,45. Um ein genaueres Maß für die Saccharosepräferenz zu erhalten, empfehlen wir, den Verbrauch während der nächtlichen Phase des zirkadianen Zyklus zu bewerten, wenn Nagetiere am aktivsten sind. Stressoren, die während der täglichen (inaktiven) Phase angewendet werden, können zu chronischem Schlafentzug führen und dadurch einen unbeabsichtigten Stressor einführen^46,47. Schließlich ist es unerlässlich, den Einfluss der oben beschriebenen überschaubaren Faktoren sorgfältig zu kontrollieren, um sicherzustellen, dass die gesammelten Daten so zuverlässig wie möglich sind.

Die derzeitigen westlichen klinischen Behandlungsschemata für Depressionen sind oft mit ausgeprägten toxischen Nebenwirkungen und einer hohen Wahrscheinlichkeit eines Rückfalls nach Beendigung der Medikation verbunden. Die Untersuchung von Behandlungsansätzen, die in der traditionellen Medizin verwurzelt sind, und das Eintauchen in die Pathogenese der Depression durch die Linse der mongolischen Medizintheorie könnten innovative Einblicke in die Ätiologie der Krankheit bieten. In diesem Zusammenhang stellt die Entwicklung von Tiermodellen für Depressionen, die sich an den Prinzipien der traditionellen Medizin orientieren, einen entscheidenden Schritt in der mongolischen Medizinforschung dar. Besonders hervorzuheben ist die Auswahl der neun Stressoren in der CUMS-Modellierungsmethode für Solitärkulturen; sie ist geprägt von der Theorie der mongolischen Medizin von den drei Homoren und der inhärenten Beziehung zwischen den vier Hilfszuständen und den drei Homoren. Dieser Ansatz weist ein hohes Maß an Kompatibilität mit den einzigartigen Lehren der mongolischen Medizin auf. Phänotypische Analysen der Depression in Verbindung mit externen Faktoren zeigen signifikante Korrelationen mit den mongolischen medizinischen Konzepten von Wind und Schleim (siehe Tabelle 2). Insbesondere windbedingte Funktionsstörungen manifestieren sich klinisch als Symptome wie Energieverlust, Schlaflosigkeit, Vergesslichkeit, Müdigkeit und Schmerzen. Funktionsstörungen im Zusammenhang mit Schleim hingegen führen zu klinischen Manifestationen wie Reaktionslosigkeit, verschwommenem Bewusstsein, Pessimismus und Negativität. Diese Symptome stimmen eng mit den Kernsymptomen von MDD^{überein 48,49}. Daher dient das oben erwähnte CUMS-Modell als pathologisches Modell, das die komplexen Wechselwirkungen zwischen äußeren Bedingungen und das Gleichgewicht der drei Arten von Homoren, wie es von der mongolischen Medizintheorie postuliert wird, effektiv simuliert und so zum Ausbruch von Krankheiten beiträgt.

Die Stärken dieses Modells sind vielfältig. Erstens hält es sich an zeitgenössische medizinische ätiologische Theorien und erfüllt die Kriterien, die im Bereich der modernen Medizin für Tiermodelle festgelegt wurden. Zweitens bezieht es Prinzipien aus der traditionellen mongolischen Medizin ein, um spezifische Symptome menschlicher Krankheiten bei Tieren nachzubilden und damit Merkmale zu verkörpern, die für die mongolische medizinische Praxis einzigartig sind. Aufgrund seiner Ausrichtung sowohl an modernen als auch an traditionellen medizinischen Theorien dient dieses Modell als effektive Plattform für die Grundlagenforschung in der mongolischen Medizin. Die Integration von Krankheiten und Symptomen in dieses Tiermodell stellt daher einen Zusammenfluss von Forschung in der mongolischen und modernen Medizin dar. Das Modell hat zwar seine Grenzen, aber seine kontinuierliche Verfeinerung wird wesentlich zur Zukunft der Grundlagenforschung in der mongolischen Medizin beitragen.

Tiermodelle sind bei der Erforschung von Depressionen aufgrund der ethischen und praktischen Herausforderungen, die mit der direkten Erforschung des menschlichen Gehirns verbunden sind, unverzichtbar geworden. Trotz ihrer inhärenten Einschränkungen bei der vollständigen Replikation der Komplexität von Depressionen bleibt die Entwicklung und Validierung dieser Modelle ein kontinuierlicher Prozess. In dieser Studie haben wir Prinzipien aus der mongolischen und der modernen Medizin kombiniert, um ein Tiermodell für Depressionen zu entwickeln. Dieser kollaborative Ansatz bietet wertvolle Erkenntnisse für die Konstruktion eines umfassenderen Tiermodells, das sowohl traditionelle mongolische als auch moderne medizinische Theorien umfasst.

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Wir danken der mongolischen medizinischen Fakultät der Inneren Mongolischen Medizinischen Universität, China, für die Bereitstellung der Instrumente und des Labors. Diese Studie wurde unterstützt von für die Bereitstellung der notwendigen Instrumente und Laboreinrichtungen. Diese Studie wurde finanziell unterstützt von der National Natural Sciences Foundation of China (Grant No. 81760762) und dem Inner Mongolia Medical University Project of China (Grant No. YKD2022MS074) und das Wissenschaftliche Forschungsprojekt für Hochschulbildung in der Inneren Mongolei, China (Grant No. NJZY22661) und das Open Fund Project des Key Laboratory of Chinese and Mongolian Medicine in der Inneren Mongolei Autonomen Region, China (Grant No. MYX2023-K07).