الإجهاد الخفيف المزمن غير المتوقع في الفئران على أساس الطب المنغولي

يحدد هذا البروتوكول نموذج الإجهاد المعتدل المزمن غير المتوقع (CUMS) للاكتئاب بناء على النظرية الطبية المنغولية ، إلى جانب طرق التحقق من صحة الاختبارات السلوكية.

الاكتئاب هو اضطراب عاطفي سائد ويشكل سببا رئيسيا للإعاقة العالمية. تساهم قيود التدخلات الدوائية الحالية في العبء الصحي الكبير المنسوب إلى هذه الحالة. هناك حاجة ملحة لفهم أعمق للآليات الأساسية للاكتئاب ، مما يجعل النماذج قبل السريرية ذات الإمكانات الانتقالية ذات قيمة عالية. يفترض الطب المنغولي ، وهو مجموعة فرعية من الطب التقليدي ، أن حدوث المرض يرتبط ارتباطا وثيقا بتوازن الرياح والصفراء والبلغم. في هذه الدراسة ، نقدم بروتوكولا لطريقة الإجهاد الخفيف المزمن غير المتوقع (CUMS) في الفئران. في هذا الإطار ، تتعرض الفئران لسلسلة من الضغوطات المتقلبة والخفيفة للحث على نمط ظاهري يشبه الاكتئاب ، يحاكي التسبب في الاكتئاب البشري. تشمل المقايسات السلوكية المستخدمة في هذا البروتوكول اختبار تفضيل السكروز (SPT) ، مما يدل على انعدام التلذذ - وهو أحد الأعراض الأساسية للاكتئاب. اختبار المجال المفتوح (OFT) ، الذي يقيس مستويات القلق ؛ واختبار موريس للمتاهة المائية (MWM) ، الذي يقيم الذاكرة المكانية وقدرات التعلم. توضح طريقة CUMS القدرة على إحداث anhedonia والتسبب في عجز سلوكي طويل الأجل. علاوة على ذلك ، فإن هذا البروتوكول أكثر توافقا مع النظرية الطبية المنغولية من النماذج الحيوانية الأخرى المصممة لاستنباط سلوك يشبه الاكتئاب. يوفر تطوير هذا النموذج الحيواني والبحوث اللاحقة أساسا قويا للدراسات المبتكرة المستقبلية في مجال الطب المنغولي.

الاضطراب الاكتئابي الشديد (MDD) هو مرض عقلي منتشر ، ويحتل المرتبة الثالثة كسبب رئيسي للإعاقة على مستوى العالم ويؤثر على أكثر من 300 مليون شخص^1,2,3. والجدير بالذكر أن التقديرات تشير إلى أن ما لا يقل عن نصف الأفراد المصابين لا يتلقون العلاج المناسب.⁴. بالنظر إلى هذه الفجوة ، تعمل النماذج الحيوانية كأداة حاسمة للتحقيق في مسببات الاكتئاب. حتى الآن ، يوجد أكثر من 20 نموذجا حيوانيا مختلفا للاكتئاب⁵. من بين هؤلاء ، نموذج الإجهاد المعتدل المزمن الذي لا يمكن التنبؤ به (CUMS) ، الذي صقله بول وينر في عام 1987 ، هو الأكثر استخداما⁶. يعمل نموذج CUMS على فرضية أن تعريض القوارض لمجموعة متنوعة من الضغوطات الاجتماعية والبيئية يؤدي إلى أعراض مشابهة للقلق والتوتر والاكتئاب. تتضمن المنهجية تعريض لضغوط خفيفة مختلفة على مدى عدة أسابيع ، وبلغت ذروتها في مجموعة من التغييرات السلوكية ، بما في ذلك انعدام التلذذ والسلوكيات الشبيهة بالاكتئاب.^7,8. ويرافق هذه التغييرات تحولات في ملامح الغدد الصماء والناقلات العصبية ، مثل انخفاض في 5-HT^9,10. تعكس هذه النتائج عن كثب تلك التي لوحظت في البشر الذين تم تشخيصهم ب MDD ، وبالتالي التحقق من صحة فائدة النموذج. يتم تقييم نموذج CUMS بشكل خاص لفعاليته في تقييم مضادات الاكتئاب ، مما يدل على مستويات عالية من الصلاحية السطحية والهيكلية والتنبؤية^11,12. على عكس النماذج الأخرى ، فإن CUMS حساس لآثار الإدارة المزمنة لمضادات الاكتئاب أحادية الأمين. على سبيل المثال ، ثبت أن مثبطات امتصاص السيروتونين الانتقائية (SSRIs) مثل سيتالوبرام وباروكستين وفلوكستين تمنع وتعكس anhedonia في ظل ظروف الإجهاد المزمن^12,13. بالإضافة إلى ذلك ، أثبتت مضادات الاكتئاب الجديدة سريعة المفعول ، مثل الكيتامين ، فعاليتها في هذا النموذج.^14,15. في المقابل ، فإن الاختبارات الأخرى مثل اختبار السباحة القسرية (FST) واختبار تعليق الذيل (TST) أقل موثوقية لنمذجة التغيرات السلوكية طويلة المدى ، وغالبا ما تعكس التكيف مع الإجهاد الحاد بدلا من تحمل أعراض الاكتئاب.¹⁶. تؤكد هذه الخصائص على الصلاحية القوية لنموذج CUMS في أبحاث الاكتئاب. واحدة من أبرز ميزات نموذج CUMS ، المعترف بها لموثوقيتها العالية في الدراسات الكلاسيكية ، هي anhedonia - عدم القدرة على تجربة المتعة أو الاهتمام بالأنشطة اليومية^17,18. يتم تقييم هذه الظاهرة بشكل شائع باستخدام اختبارات تفضيل السكروز ، وقد ثبت أن العديد من مضادات الاكتئاب تعكس انخفاض استهلاك السكروز. كما يتم استخدام العديد من المقاييس الأخرى بشكل شائع في أدبيات CUMS ، بما في ذلك اختبار المجال المفتوح (OFT) ، الذي يقيم السلوك الحركي الإرادي ، والميول الاستكشافية ، والتوتر ، وبالتالي قياس شدة الاكتئاب¹⁹. اختبارات أخرى مثل المتاهة المرتفعة زائد (EPM) تقييم السلوكيات الشبيهة بالقلق ، اختبار متاهة موريس المائية (MWM) يفحص الأداء المعرفي²⁰، ويقيم FST القابلية للمشاعر السلبية واليأس السلوكي²⁰. علاوة على ذلك ، فإن غالبية الضغوطات التي تؤثر على البشر ذات طبيعة اجتماعية. الأفراد الذين لديهم علاقات اجتماعية دون المستوى الأمثل ، والتي تتميز بأنشطة اجتماعية وشبكات ودعم محدودة ، معرضون لخطر متزايد للإصابة بأمراض مختلفة^21,22. هذا مهم أيضا في حالة القوارض ، الذين هم اجتماعية تعيش في مجموعات. على سبيل المثال ، تظهر الفئران التي يتم إيواؤها في عزلة خصائص ما يسمى بمتلازمة العزلة ، والتي تحفز الإجهاد الاجتماعي وتسرع ظهور الاكتئاب.²³.

يفترض الطب المنغولي ، وهو فرع مهم من الطب الصيني ، أن ظهور المرض هو تفاعل معقد بين العوامل الجوهرية والخارجية. تشمل هذه العوامل الخارجية ، التي يشار إليها باسم الحالات المساعدة الأربعة ، تغير المناخ ، والنظام الغذائي ، ونمط الحياة ، والأحداث المفاجئة مثل العدوى والحوادث المذهلة والاضطرابات النفسية. يتم تصور عملية المرض على أنها تفاعل مستمر بين ثلاثة عناصر - يشار إليها باسم الأنواع الثلاثة من homors - والمكونات الجسدية السبعة بالتنسيق مع الحالات المساعدة الأربعة²⁴. يرى الطب المنغولي أن جسم الإنسان يعمل ككيان متكامل ، يتم الحفاظ عليه من خلال توازن نسبي بين الهومورز الثلاثة. يعتبر الاضطراب في هذا التوازن مقدمة للمرض²⁴. نظرا للدور المحوري للتجارب على في سد الفجوة بين الطب التقليدي والحديث ، فمن الأهمية بمكان تطوير نماذج حيوانية ذات صلة بالبحث في مجال الطب المنغولي. وفقا لذلك ، استخدمنا منهجية عزل لمدة 28 يوما إلى جانب CUMS لمحاكاة هذه الضغوطات الفسيولوجية والنفسية. اخترنا تسعة ضغوط محددة لا يمكن التنبؤ بها وسعينا إلى دعم طريقة النمذجة هذه من خلال نظرية هومورز الثلاثة للطب المنغولي. يعد إنشاء نموذج حيواني قوي أمرا أساسيا للنهوض بالبحوث الأساسية في الطب المنغولي وسيساهم بشكل كبير في دراساته التأسيسية.

حصلت البروتوكولات التجريبية على موافقة من لجنة أخلاقيات رعاية التجارب على بجامعة منغوليا الطبية الداخلية (YKD202301172) والتزمت بإرشادات المعاهد الوطنية للصحة لرعاية وأخلاقياته. رقم الترخيص لمركز لدينا هو NO.110324230102364187. تم الحصول على أربعة وعشرين من ذكور فأر Sprague-Dawley (SD) ، كل منها يبلغ من العمر 8 أسابيع (200 جم ± 20 جم) ، وإيواؤها في بيئة خاضعة للرقابة بدرجة حرارة 22 درجة مئوية ± 2 درجة مئوية ورطوبة 55٪ ± 15٪. إطعام الفئران مع اتباع نظام غذائي صيانة القوارض والمياه النقية مع الكيزان الذرة للفراش. تعرضت الفئران لدورة ضوء / مظلمة لمدة 12 ساعة / 12 ساعة لمدة أسبوع واحد قبل التجربة.

1. إنشاء نموذج الفئران CUMS

1. تجميع
   1. قسم الفئران ال 24 عشوائيا إلى مجموعتين: مجموعة التحكم (CON) ، والتي لن تتعرض للعزل أو الإجهاد ، ومجموعة النموذج (MOD). تحتوي كل مجموعة على 12 فأرا.
   2. ضع الفئران في أقفاص قياسية بقياس 55 سم × 40 سم × 20 سم ، مع 6 فئران لكل قفص. احتفظ بتخصيص القفص طوال فترة التأقلم ما لم يذكر خلاف ذلك.
   3. املأ كل قفص تربية بفراش جديد واستبدله مرتين في الأسبوع.
   4. إجراء فترة التأقلم 1 أسبوع. السماح للفئران بالوصول غير المقيد إلى الطعام والماء ، إلا أثناء تطبيق CUMS الضغط. الحفاظ على بيئة ثابتة مع درجة حرارة 22 درجة مئوية ± 2 درجة مئوية ، ورطوبة 55٪ ± 15٪ ، ودورة ضوء / مظلمة لمدة 12 ساعة / 12 ساعة من الساعة 08:00 إلى الساعة 20:00 ، ما لم ينص على خلاف ذلك.
   5. قبل بدء التجربة ، تعامل مع الفئران يوميا لتأقلمها مع الباحث وتقليل الضغط الإضافي أثناء المرحلة التجريبية.
2. العزلة مع الإجهاد الخفيف المزمن غير المتوقع
   1. ضع مجموعات MOD و CON في نفس الوقت في غرف منفصلة. إيواء فئران مجموعة MOD بشكل فردي ، مع الحفاظ على فئران مجموعة CON معا. الحفاظ على جميع الشروط الأخرى ثابتة.
   2. تنفيذ نظام الإجهاد لمدة 28 يوما²⁵. لمنع التعود ولضمان عدم القدرة على التنبؤ بالإجهاد ، قم بإدارة ضغوط عشوائية واحدة يوميا ، وتجنب استخدام نفس الضغوطات في أيام متتالية.
   3. قم بتطبيق أحد الضغوطات التسعة التالية بشكل عشوائي^26,27 في أيام مختلفة: الحرمان من الماء لمدة 24 ساعة ، والحرمان من الطعام لمدة 24 ساعة ، والحشو الرطب ، وميل القفص ، وانعكاس دورة الضوء / الظلام ، والتعرض للبرد عند 4 درجات مئوية ، والتعرض للحرارة عند 45 درجة مئوية ، أو 1 دقيقة لقط الذيل ، أو 15 دقيقة من الاهتزاز عند 160 دورة في الدقيقة. ويرد التصميم المحدد في الجدول 1.
   4. أثناء تطبيق الضغوطات ، قم بتقييد الوصول إلى الطعام والماء لمجموعة MOD حتى ينتهي الضغط ، باستثناء أثناء انعكاس دورة الضوء / الظلام. لم يكن مطلوبا من مجموعة CON تقييد الماء والنظام الغذائي.
3. طرق الإجهاد
   1. ابدأ التجربة من خلال تطبيق محفزات الاكتئاب بالتزامن مع العزل لمدة 28 يوما على جميع الفئران ، باستثناء المجموعة الضابطة. منزل هذه الفئران في أقفاص فردية. راجع الجدول 2 لمعرفة الحالات المتعلقة بمحفزات الاكتئاب.
   2. لتنفيذ طريقة مشبك الذيل ، قم بتأمين ذيل الفئران من مجموعة MOD عن طريق تثبيت الذيل بمشبك ورق قياسي على مسافة 1-2 سم من جذر ذيل الفئران. قم بقياس وقت التثبيت لمدة 1 دقيقة (ن = 12).
   3. في طريقة الحرمان من الماء ، احجب الماء عن فأر مجموعة MOD عن طريق إزالة زجاجة الماء الخاصة به وسجلها لمدة 24 ساعة.
      ملاحظة: تم تسجيل وقت بدء الحرمان من المياه بحيث يمكن حساب وقت الانتهاء بدقة؛ لوحظ سلوك الفئران خلال هذه الفترة ، بما في ذلك النشاط والشهية والحالة العقلية.
   4. في طريقة الحرمان من الطعام ، حجب الطعام عن فأر مجموعة MOD وسجل لمدة 24 ساعة.
      ملاحظة: سجل الوقت الذي يبدأ فيه الحرمان من الطعام بحيث يمكن حساب وقت الانتهاء بدقة ؛ التأكد من أن الفئران رطبة بشكل كاف خلال هذه الفترة ؛ ومراقبة سلوك الفئران خلال هذه الفترة ، بما في ذلك النشاط والحالة العقلية ، إلخ.
   5. للتحفيز البارد عند 4 درجات مئوية ، ضع فأرا من مجموعة MOD في دلو من الماء البارد وسجله لمدة 5 دقائق. تأكد من أن درجة حرارة الماء تظل ثابتة طوال الاختبار. في ختام التجربة ، جفف الفئران بمنفاخ وأعده إلى قفصه الأصلي.
      ملاحظة: حافظ على درجة حرارة الماء البارد عند 4 درجات مئوية باستخدام مقياس حرارة ومكعبات ثلج لتنظيم درجة حرارة الماء عند ارتفاعه. يجب تغيير الماء بانتظام للتأكد من أن جودة المياه نظيفة ودرجة الحرارة ثابتة. عند السباحة ، يجب غمر جميع أطراف وجذوع الفئران في الماء البارد باستثناء الرأس. يجب أن يكون عمق الماء أكبر من طول جسم الجرذ لمنع الجرذ من القفز من الماء بسبب ملامسته لقاع الدلو.
   6. لإدارة الإجهاد الحراري 45 درجة مئوية ، ضع فأر مجموعة MOD في حاضنة وسجل لمدة 5 دقائق ، مما يضمن بقاء درجة الحرارة مستقرة طوال الاختبار.
   7. في انعكاس دورة الضوء والظلام ، قم بتغليف القفص بقطعة قماش سوداء لمدة 1 ساعة لمحاكاة ظلام النهار. بعد ذلك ، قم بإضاءة القفص لمدة 12 ساعة أثناء الليل لتقليد ضوء النهار. سجل سلوك الفئران ، وتناول الطعام والماء ، وأنماط النوم لمدة 24 ساعة.
   8. لتجربة الحشو الرطب ، أدخل 200 مل من الماء في قفص يحتوي على 100 جرام من الحشو. إيواء فأر مجموعة MOD في القفص الرطب وتسجيل سلوك الفئران تحت ضغط الفراش الرطب ، بما في ذلك النشاط والشهية وتناول الماء وما إلى ذلك. لاحظ ما إذا كانت هناك أي سلوكيات غير طبيعية أو ردود فعل غير مريحة ، مثل حالة الجلد والشعر للفئران ، والتي قد تكون ناجمة عن الحشو الرطب ، وسجلها في الوقت المناسب للتحليل اللاحق لمدة 24 ساعة. بعد الاختبار ، جفف الفئران بمنفاخ وأعده إلى قفص به نشارة خشبية جديدة.
   9. في طريقة انحدار القفص ، ضع فأر مجموعة MOD في قفص مائل بزاوية 45 درجة على الحائط وسجل لمدة 24 ساعة. استخدم هيكل إطار القفص لضبط الزاوية وتثبيت القفص في مكانه.
      ملاحظة: حساب الوقت من البداية إلى النهاية ومراقبة سلوك الفئران خلال فترة إمالة القفص بما في ذلك النشاط والشهية والحالة العقلية، والتأكد من ضبط زاوية القفص المائل بشكل صحيح وبقائه ثابتا لضمان دقة التجربة وقابليتها للتكرار.
   10. للاهتزاز عالي السرعة ، ضع فأرا من مجموعة MOD في شاكر ميكانيكي مضبوط على 160 دورة في الدقيقة وسجل الجرذ لمدة 15 دقيقة. يتم استخدام طرق الاختبار السلوكي لاحقا لتقييم الإنشاء الناجح للنموذج.
   11. بعد تطبيق الضغوطات ، انقل أقفاص مجموعة MOD من غرفة CUMS إلى غرفة السكن. خلال فترة التعرض للإجهاد لمدة 4 أسابيع ، حافظ على مجموعة CON في أقفاصهم المنزلية الموجودة في غرفة السكن.
4. الاحتياطات أثناء التجارب
   1. نقل أقفاص مجموعة MOD مرة أخرى إلى غرفة السكن العامة بعد تطبيق الضغط في غرفة CUMS.
   2. مراقبة الحيوانات أثناء نمذجة CUMS
      1. أثناء لقط الذيل ، من المرجح أن يكافح بسبب التحفيز المستحث. طوال هذه الفترة ، راقب المشبك باستمرار. إذا تم إزاحته ، فقم بإيقاف المؤقت مؤقتا ، وأعد تطبيق المشبك ، ثم استأنف المؤقت لمدة 1 دقيقة.
      2. لا تفرض الحرمان من الماء وضغوط الفراش الرطب في وقت واحد.
         ملاحظة: يساعد تجنب الفرض المتزامن للحشو الرطب والحرمان من الماء في الحفاظ على سلامة التجارب ، ويقلل من المتغيرات المربكة ، ويعزز رفاهية.
      3. قد تؤدي درجة حرارة جسم ودرجة حرارة الغرفة المحيطة إلى رفع درجة حرارة الماء أثناء السباحة في الماء البارد. لذلك ، اضبط عن طريق إضافة الماء المثلج أو مكعبات الثلج للحفاظ على درجة حرارة ثابتة للماء.
      4. مراقبة الفئران على فترات 30 دقيقة أثناء تطبيق الضغوطات ، إلا أثناء انعكاس النهار. انتبه بشكل خاص لعلامات الضيق غير العادي ، مثل الارتعاش أو الخمول أو قلة الحركة. إذا لوحظت مثل هذه الأعراض - خاصة انخفاض حرارة الجسم المحتمل أثناء السباحة في الماء البارد 4 درجات مئوية والفراش الرطب - قم بإزالة الجرذ على الفور من الضغط.
         ملاحظة: قم بإزالة التجارب من الدراسة عندما يكون لديها مشاكل صحية ، مثل العدوى ، والصدمات الشديدة ، والسلوكيات العدوانية ، والحركة غير الطبيعية ، وما إلى ذلك ، وعادة ما تدور شروط إزالة من الدراسة حول حماية صحتهم وسلامتهم مع ضمان سلامة النتائج التجريبية.
      5. إجراء عمليات تفتيش يومية للجروح أو غيرها من التشوهات الجسدية أو السلوكية في كل فئران. إذا لوحظت أي تشوهات ، استشر الطبيب البيطري المختبري لتحديد ما إذا كان ينبغي استبعاد الفئران من التجربة.
      6. تزن كل فأر كل 3 أيام. إذا فقد أكثر من 20٪ من وزن جسمه القاعدي قبل التغذية ، فيجب استبعاده من التجربة.

2. الاختبارات السلوكية

1. للبدء ، قم بإعطاء محفزات الاكتئاب بالتزامن مع العزل لمدة 28 يوما لجميع الفئران ، باستثناء المجموعة الضابطة. منزل الفئران في أقفاص فردية. راجع الجدول 2 للحصول على تفاصيل حول حالات محفزات الاكتئاب.
2. لاختبار المجال المفتوح ، قسم الصندوق الأسود إلى 25 قسما مربعا بمساحة متساوية. قم بتثبيت نظام تحليل تتبع الفيديو في المربع. ضع الجرذ في الساحة المركزية وراقب أنشطته الأفقية والرأسية لمدة 5 دقائق.
   ملاحظة: أبعاد الصندوق 500 مم × 500 مم × 300 مم. سيتم جمع بيانات النشاط باستخدام نظام تتبع الفيديو لتقييم السلوكيات المرتبطة بالقلق في القوارض عند تعرضها لبيئة جديدة.
3. بعد ذلك ، قم بإحصاء عدد المربعات التي اجتازها الجرذ ، باستخدام جميع الكفوف ، لتحديد النشاط الأفقي. عد حالات الوقوف والاستمالة كمؤشرات للنشاط الرأسي. بعد كل اختبار ، قم بتعقيم الصندوق باستخدام 75٪ كحول للتخلص من أي روائح متبقية للفئران للاختبارات اللاحقة.
4. بعد ذلك ، يتم تقييم anhedonia من خلال اختبار تفضيل السكروز. ضع زجاجتين على غطاء القفص: تحتوي الزجاجة A على ماء نقي ، بينما تحتوي الزجاجة B على محلول سكروز بنسبة 1٪. السماح بالوصول إلى كلا الحلين للفئران. قم بوزن الزجاجات قبل الاستهلاك وبعده لحساب معدلات تفضيل السكروز لمدة 60 دقيقة في الأيام 0 و 7 و 14 و 21 و 28. الصيغة هي كما يلي:
   استهلاك السكروز = × 100٪
5. لقياس الذاكرة المكانية وقدرات التعلم ، استخدم اختبار متاهة موريس المائية. قسم المجموعة إلى أربعة أرباع ، مرقمة من واحد إلى أربعة. ضع منصة استراحة مغمورة 1 سم تحت سطح الماء في الربع الثالث.
6. أدخل الحليب إلى المسبح لزيادة عتامة الماء والحفاظ على درجة حرارة الماء حوالي 23 درجة مئوية طوال الإجراء التجريبي.
7. ضع كل فأر في أرباع مختلفة من المتاهة ، مما يسمح لهم ب 120 ثانية لتحديد موقع المنصة المخفية. يجب أن تعتمد الفئران على الذاكرة المكانية ومهارات التعلم لتذكر موقع المنصة. بمجرد أن يتعلموا موقع المنصة ، يمكنهم السباحة إليها مباشرة. سجل وقت الكمون باستخدام نظام تتبع فيديو متاهة المياه موريس.
8. ضع الفئران في مكان ثابت في حمام السباحة. إذا فشل الموضوع في تحديد موقع النظام الأساسي المخفي في غضون 120 ثانية ، فقم بتسجيل زمن الوصول على أنه 120 ثانية.
9. أخيرا ، قم بإزالة المنصة المخفية ، ووضع الجرذ مرة أخرى في الماء ، وسجل عدد معابر المنطقة خلال فترة 120 ثانية.

3. التحليل الإحصائي

1. لتقييم الاختلافات الكبيرة في المعلمات البيوكيميائية ، استخدم تحليل التباين أحادي الاتجاه (ANOVA) متبوعا باختبار دنكان اللاحق. قدم البيانات كمتوسط ± الخطأ المعياري (SE) واعتبر قيمة p أقل من 0.05 ذات دلالة إحصائية.

نتائج الاختبارات السلوكية في نموذج اكتئاب الفئران الناجم عن CUMS
لتأكيد فعالية إجراء CUMS للحث على سلوكيات شبيهة بالاكتئاب ، تم إجراء فحص للتلاعب. تم تخصيص ذكور الفئران Sprague-Dawley (SD) بشكل عشوائي إما لمجموعة MOD أو CON لمدة 4 أسابيع ، كما هو موضح في الخطوة 1.2.3. بعد ذلك ، تم التضحية بالفئران ، وتم تشريح الحصين بالكامل لتقييم 5-HT ، وهو ناقل عصبي مرتبط بقوة بالفيزيولوجيا المرضية للاكتئاب¹⁰ ، باستخدام مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA)²⁸.

قبل تحريض CUMS ، لم تلاحظ فروق ذات دلالة إحصائية بين المجموعات المختبرة في درجة OFT أو تفضيل السكروز أو تحليل MWM.

بعد إنشاء نموذج CUMS ، كشف تحليل أحادي الاتجاه للتباين (ANOVA) عن تأثير كبير ل CUMS على سلوكيات قلق الفئران. على وجه التحديد ، في OFT ، لوحظت اختلافات كبيرة بين المجموعات. أظهرت مجموعة MOD درجات رأسية وأفقية أقل مقارنة بمجموعة CON (** P < 0.01; الشكل 1A ، B ، E) ، مما يشير إلى أن إجراء CUMS كان فعالا في إحداث القلق.

بعد ذلك ، تم إجراء اختبار تفضيل السكروز (SPT) على مدار 5 أيام ، كما هو موضح في الخطوة 2.4 ، لتقييم ما إذا كانت الفئران أظهرت علامات التعرض لانعدام التلذذ بعد التعرض ل CUMS. أشارت النتائج إلى عدم وجود فروق ذات دلالة إحصائية في نسبة تفضيل السكروز بين المجموعات في اليوم 0. ومع ذلك ، كشفت ANOVA أحادية الاتجاه عن اختلاف كبير في تناول السكروز بين المجموعات في اليوم 28. على وجه التحديد ، كانت نسبة تفضيل السكروز في مجموعة MOD أقل من تلك الموجودة في مجموعة CON (** P < 0.01; الشكل 1C) ، مما يؤكد فعالية بروتوكول CUMS في إحداث انعدام التلذذ.

كشفت ANOVA أحادية الاتجاه أن CUMS أثرت بشكل كبير على الذاكرة المكانية وقدرات التعلم للفئران ، كما تم تقييمها بواسطة اختبار MWM. كان زمن انتقال مجموعة MOD لتحديد موقع النظام الأساسي أطول بشكل ملحوظ من زمن انتقال مجموعة CON (** P < 0.01). من حيث أوقات العبور ، عبرت مجموعة MOD مرات أقل من مجموعة CON (** P < 0.01; الشكل 1D ، F). تدعم هذه النتائج فعالية بروتوكول CUMS في إحداث ضعف الذاكرة في الفئران.

نتائج مستويات الحصين 5-HT في نموذج اكتئاب الفئران الناجم عن CUMS
أشار ANOVA أحادي الاتجاه على مستويات الحصين 5-HT إلى اختلاف كبير بين المجموعات (** P < 0.01). أظهرت مجموعة MOD انخفاض مستويات الحصين 5-HT بالمقارنة مع مجموعة CON (الشكل 2). تشير هذه النتائج إلى أن بروتوكول CUMS قلل بشكل فعال من مستويات الحصين 5-HT ، وهي ظاهرة شائعة في الاكتئاب البشري²⁹.

الشكل 1: آثار نموذج اكتئاب الفئران الناجم عن CUMS. (أ) الدرجات الرأسية لاختبار المجال المفتوح (OFT). (ب) الدرجات الأفقية لاختبار المجال المفتوح. (ج) مستويات استهلاك السكروز (٪) في اليومين 0 و28. انعدام التلذذ الناجم عن CUMS وتقليل تفضيل السكروز في الفئران. (د) وقت الكمون وأرقام عبور المنطقة في اختبار MWM. يتم عرض النتائج كمتوسط ± SE (n = 12 فأرا لكل مجموعة). ** يشير P < 0.01 إلى تغييرات كبيرة في مجموعة النموذج (MOD) مقارنة بمجموعة التحكم (CON) المحسوبة باستخدام تحليل التباين أحادي الاتجاه (ANOVA). ه: مسارات OFT للفئران في كل مجموعة. (F) مسارات MWM لكل مجموعة من الفئران. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: التأثير على مستويات 5-HT في الدماغ في نموذج الاكتئاب الناجم عن CUMS في الفئران. أظهرت الفئران التي خضعت ل 4 أسابيع من CUMS انخفاضا كبيرا في مستويات الحصين 5-HT مقارنة بمجموعة التحكم (CON). يتم عرض النتائج كمتوسط ± SE (n = 12 فأرا لكل مجموعة). ** يشير P < 0.01 إلى تغييرات كبيرة في مجموعة النموذج (MOD) مقارنة بمجموعة CON المحسوبة باستخدام تحليل التباين أحادي الاتجاه (ANOVA). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول 1: جدول الإجهاد الخفيف المزمن غير المتوقع (CUMS). الضغوطات ومواعيد التنفيذ لتحريض CUMS في مواضيع الفئران.

الجدول 2. تسعة ضغوط مع الشروط المساعدة الأربعة ونظرية ثلاثة هومورز في الطب المنغولي. العلاقة الجوهرية بين الضغوطات التسعة ، ونظرية الهومومور الثلاثة ، وأربعة حالات مساعدة في الطب المنغولي.

الاكتئاب هو اضطراب عقلي يتميز بأعراض مثل انخفاض الحالة المزاجية وقلة المتعة وانخفاض الطاقة³⁰. في مجال أبحاث الاكتئاب ، يعد إنشاء نموذج حيواني موثوق به أمرا بالغ الأهمية لتعزيز التدخلات العلاجية. من بين النماذج الحيوانية المختلفة ، يعد نموذج CUMS جديرا بالملاحظة بشكل خاص لموثوقيته العالية وصلاحيته وتطابقه مع خصائص الاكتئاب البشري³¹. إنه مناسب تماما لمحاكاة الآثار التراكمية للضغوط منخفضة المستوى على مدى فترة طويلة عبر بيئات مختلفة. في هذه الدراسة ، أنشأنا نموذج الاكتئاب الناجم عن CUMS في الفئران ، باستخدام مجموعة من الضغوطات الموضحة في الخطوة 1.2.3 والجدول 2. العديد من جوانب بروتوكول الإجهاد حاسمة لنجاح النموذج. أولا ، يجب إيواء الفئران في جميع مجموعات MOD بشكل فردي ، على عكس تلك الموجودة في مجموعة CON. ثانيا ، يجب التخطيط لنظام الإجهاد CUMS بعناية للحفاظ على عدم القدرة على التنبؤ. على وجه التحديد ، يجب أن تخضع الفئران لاختيار عشوائي لسبعة من أصل تسعة ضغوط محتملة على أساس أسبوعي. يعد تباين هذه الضغوطات وعدم القدرة على التنبؤ بها أمرا ضروريا لفعالية النموذج^32,33. أخيرا ، يجب تقليل الاستخدام المتكرر لنفس الضغوطات لمنع الفئران من التكيف ، مما قد يضر بسلامة النتائج التجريبية. علاوة على ذلك ، تم تصميم إعدادات الإجهاد لتكون قابلة للتعديل طوال فترة الدراسة.

يوفر نموذج CUMS العديد من المزايا كنموذج للاكتئاب. يتماشى بشكل وثيق مع التسبب في الاكتئاب البشري ويمثل بدقة معظم الأعراض السريرية والآليات الأساسية³⁴. واحدة من نقاط قوتها الرئيسية هي أنها تستخدم anhedonia ، أو عدم وجود متعة ، كمؤشر قابل للقياس الكمي ^6,7. يمثل النموذج أيضا العوامل المختلفة التي تساهم في ظهور الاكتئاب^35,36. الأهم من ذلك ، تم تصميم نموذج CUMS للتطبيق على المدى الطويل ، ويمتد لعدة أشهر. تتوافق هذه المدة مع احتياجات نموذج الاكتئاب وتسمح بتقييم الأدوية في نظام الجرعات المزمن ، وكذلك تحديد المركبات ذات آليات العمل السريعة³⁶. نظرا لطبيعته الشاملة ، أصبح نموذج CUMS مقبولا على نطاق واسع في الأدبيات العلمية.

على الرغم من هذه المزايا ، فإن نموذج CUMS لا يخلو من القيود ^5,37. أحد العيوب الرئيسية هو طبيعتها كثيفة الاستخدام للموارد ، مما يتطلب استثمارات كبيرة في البيئة والقوى العاملة والوقت ، مما يؤدي بالتالي إلى انخفاض قابلية التكاثر³⁸. هناك أيضا تناقضات في الأدبيات المتعلقة باختيار وشدة الضغوطات ، وكذلك التسلسل الذي يتم تطبيقه^{فيه 38}. مثل هذه التناقضات تجعل من الصعب تكرار النموذج عبر مختبرات مختلفة. علاوة على ذلك ، تفتقر الأدبيات إلى جدول زمني مفصل لتطبيق الضغوطات ، مما يضيف طبقة أخرى من الغموض^39,40. تنشأ مشكلة أخرى من الاختلاف في أساليب الجمع المستخدمة عبر الدراسات المختلفة. وغالبا ما تفتقر هذه إلى الأساس المنطقي الصريح، مما يخلق صعوبات في تكرار النموذج. الخاضعة حساسة للغاية للتغيرات الطفيفة في تصميم الإجهاد ، مما يساهم أيضا في انخفاض قابلية التكاثر⁴⁰. علاوة على ذلك ، يمكن أن يؤدي استخدام عدد محدود من الضغوطات إلى التعود بين الخاضعة ، مما يجعل تصميم الإجهاد متوقعا. أخيرا ، تظهر من مختبرات مختلفة استجابات متنوعة للضغوط ، مما يساهم في ضعف قابلية التكاثر عبر الدراسات. في الأدبيات الحالية ، تم تحديد فئران Wistar Kyoto (WKY) على أنها معرضة بشكل خاص للنمط الظاهري الشبيه بالاكتئاب بعد التعرض ل CUMS^25,41. هذا يشير إلى أن التباين بين الإجهاد يمكن أن يؤثر بشكل كبير على التعرض للتغيرات السلوكية الناجمة عن الإجهاد. وبالمثل ، فإن SPT ، وهو مقياس رئيسي يستخدم غالبا لتقييم فعالية نماذج الاكتئاب ، يقدم مجموعة من التحديات الخاصة به. على وجه التحديد ، تظهر الفئران الفردية تباينا في استهلاكها لمحلول السكروز 1٪^20,42. في ظل ظروف الإجهاد ، تظهر كل من المعرضة للإجهاد والمقاومة للإجهاد تغيرات في استهلاكها للحلول الحلوة. وبالتالي ، يصبح من الصعب التأكد من نسبة داخل دفعة معينة التي تكون مقاومة حقا للإجهاد أو تنتمي إلى الفئة المقابلة. قد يؤدي هذا التباين إلى عرض بعض لنتائج SPT التي لا تعكس بدقة حالة مرضها.

لتعزيز موثوقية نموذج CUMS ، نقترح العديد من التحسينات المنهجية. أولا ، من الأهمية بمكان فصل في مجموعة CON عن تلك الموجودة في مجموعة MOD للتخفيف من تأثير المحفزات الشمية والبصرية والسمعية ، والتي يمكن أن تحفز الإجهاد في^43,44. ثانيا ، لتقليل التباين ، ينصح بتعيين واحد أو اثنين من موظفي المختبرات ذوي الخبرة لإجراء جميع التجارب. يعمل هذا النهج على تقليل الأخطاء التي تعزى إلى عوامل فردية. بالإضافة إلى ذلك ، حددت الأبحاث السابقة الاختبار المقاومة للإجهاد¹³ ؛ ومن ثم، سيكون من الحكمة فحص هذه المجموعات إما قبل التجريب الرسمي أو بعد ذلك لتفسير النتائج بشكل أفضل. فيما يتعلق باختبار SPT ، وهو تقييم سلوكي قائم على المكافأة يقيس انعدام التلذذ الجوهري ، من الضروري تحديد تركيز السكروز الأمثل قبل بدء بروتوكول CUMS. يمكن أن يؤدي تحديد التفضيل بشكل مبدئي على أساس تركيز السكروز إلى تعزيز الحساسية التمييزية للاختبار بشكل ملحوظ²⁰. ومع ذلك ، تجدر الإشارة إلى أن الفئران التي تتعرض للحرمان من الطعام والماء لمدة 24 ساعة قد تستهلك بشكل عشوائي أي سائل متاح بسبب العطش الشديد^35,45. للحصول على مقياس أكثر دقة لتفضيل السكروز ، نوصي بتقييم الاستهلاك خلال المرحلة الليلية من الدورة البيولوجية ، عندما تكون القوارض أكثر نشاطا. يمكن أن تؤدي الضغوطات المطبقة خلال المرحلة النهارية (غير النشطة) إلى الحرمان المزمن من النوم ، وبالتالي إدخال ضغوط غير مقصودة^46,47. أخيرا ، من الضروري التحكم بدقة في تأثير العوامل التي يمكن التحكم فيها الموضحة أعلاه لضمان موثوقية البيانات التي تم جمعها قدر الإمكان.

غالبا ما تأتي أنظمة العلاج السريري الغربية الحالية للاكتئاب مع آثار جانبية سامة واضحة واحتمال كبير للانتكاس عند التوقف عن الدواء. إن التحقيق في مناهج العلاج المتجذرة في الطب التقليدي والخوض في التسبب في الاكتئاب من خلال عدسة نظرية الطب المنغولي يمكن أن يقدم رؤى مبتكرة حول مسببات المرض. في هذا السياق ، فإن تطوير نماذج حيوانية للاكتئاب تتماشى مع مبادئ الطب التقليدي يقف كخطوة محورية في أبحاث الطب المنغولي. اختيار الضغوطات التسعة في طريقة نمذجة CUMS للثقافة الانفرادية جدير بالملاحظة بشكل خاص. وهو مستوحى من نظرية الطب المنغولي عن الهومورات الثلاثة والعلاقة المتأصلة بين الحالات المساعدة الأربعة والهومورات الثلاثة. يظهر هذا النهج درجة عالية من التوافق مع المبادئ الفريدة للطب المنغولي. تكشف تحليلات النمط الظاهري للاكتئاب ، بالاقتران مع العوامل الخارجية ، عن ارتباطات كبيرة مع المفاهيم الطبية المنغولية للرياح والبلغم (انظر الجدول 2). على وجه التحديد ، تظهر الاختلالات المرتبطة بالرياح سريريا كأعراض مثل فقدان الطاقة والأرق والنسيان والتعب والألم. من ناحية أخرى ، تؤدي الاختلالات المتعلقة بالبلغم إلى مظاهر سريرية مثل عدم الاستجابة وعدم وضوح الوعي والتشاؤم والسلبية. تتوافق هذه الأعراض بشكل وثيق مع الأعراض الأساسية ل MDD^48,49. لذلك ، فإن نموذج CUMS المذكور أعلاه بمثابة نموذج مرضي يحاكي بشكل فعال التفاعلات المعقدة بين الظروف الخارجية وتوازن الأنواع الثلاثة من homors ، كما تفترض نظرية الطب المنغولي ، وبالتالي المساهمة في ظهور المرض.

نقاط القوة في هذا النموذج متعددة الأوجه. أولا ، تلتزم بالنظريات المسببة الطبية المعاصرة ، وتفي بالمعايير المحددة للنماذج الحيوانية في مجال الطب الحديث. ثانيا ، يتضمن مبادئ من الطب المنغولي التقليدي لتكرار أعراض محددة للأمراض البشرية في ، وبالتالي تجسيد الخصائص الفريدة للممارسات الطبية المنغولية. نظرا لمواءمته مع كل من النظريات الطبية الحديثة والتقليدية ، فإن هذا النموذج بمثابة منصة فعالة للبحث التأسيسي في الطب المنغولي. لذلك ، فإن دمج الأمراض والأعراض في هذا النموذج الحيواني يمثل التقاء البحث في الطب المنغولي والحديث. في حين أن النموذج له حدوده ، فإن تحسينه المستمر سيساهم بشكل كبير في مستقبل البحوث الأساسية في الطب المنغولي.

أصبحت النماذج الحيوانية لا غنى عنها في استكشاف الاكتئاب بسبب التحديات الأخلاقية والعملية المرتبطة بالدراسة المباشرة للدماغ البشري. على الرغم من القيود المتأصلة في تكرار تعقيدات الاكتئاب بشكل كامل ، فإن تطور هذه النماذج والتحقق من صحتها لا يزالان عملية مستمرة. في هذه الدراسة ، قمنا بدمج مبادئ من كل من الطب المنغولي والحديث لتطوير نموذج حيواني للاكتئاب. يقدم هذا النهج التعاوني رؤى قيمة لبناء نموذج حيواني أكثر شمولا يشمل كلا من النظريات الطبية المنغولية التقليدية والحديثة.

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.

نحن ممتنون للأجهزة والمختبرات المقدمة من قبل نعرب عن امتناننا لكلية الطب المنغولية في الجامعة الطبية المنغولية الداخلية ، الصين.تم دعم هذه الدراسة من قبل ، لتوفير الأجهزة اللازمة ومرافق المختبرات. وتلقت هذه الدراسة دعما ماليا من المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (المنحة رقم 81760762) ومشروع جامعة منغوليا الطبية الداخلية في الصين (المنحة رقم. YKD2022MS074)، ومشروع البحث العلمي للتعليم العالي في منغوليا الداخلية، الصين (المنحة رقم. NJZY22661) ومشروع الصندوق المفتوح للمختبر الرئيسي للطب الصيني والمنغولي في منطقة منغوليا الداخلية المتمتعة بالحكم الذاتي ، الصين (المنحة رقم. MYX2023-K07).