Estrés crónico impredecible leve en ratas basado en la medicina mongola

Este protocolo describe un modelo de estrés leve crónico impredecible (CUMS) para la depresión basado en la teoría médica mongola, junto con métodos para validar las pruebas de comportamiento.

La depresión es un trastorno afectivo prevalente y constituye una de las principales causas de discapacidad en todo el mundo. Las limitaciones de las intervenciones farmacológicas actuales contribuyen a la importante carga sanitaria que se atribuye a esta afección. Existe una necesidad apremiante de una comprensión más profunda de los mecanismos subyacentes de la depresión, lo que hace que los modelos preclínicos con potencial traslacional sean muy valiosos. La medicina mongola, un subconjunto de la medicina tradicional, postula que la aparición de enfermedades está estrechamente relacionada con el equilibrio del viento, la bilis y la flema. En este estudio, presentamos un protocolo para el método de estrés leve crónico impredecible (CUMS) en ratas. Dentro de este marco, las ratas se someten a una serie de factores estresantes fluctuantes y leves para inducir un fenotipo similar a la depresión, imitando la patogénesis de la depresión humana. Los ensayos conductuales empleados en este protocolo incluyen la prueba de preferencia de sacarosa (SPT), indicativa de anhedonia, un síntoma central de la depresión; la prueba de campo abierto (OFT), que mide los niveles de ansiedad; y la prueba del laberinto acuático de Morris (MWM), que evalúa la memoria espacial y las habilidades de aprendizaje. El método CUMS demuestra la capacidad de inducir anhedonia y causar déficits conductuales a largo plazo. Además, este protocolo está más alineado con la teoría médica mongola que otros modelos animales diseñados para provocar un comportamiento similar a la depresión. El desarrollo de este modelo animal y la investigación posterior proporcionan una base sólida para futuros estudios innovadores en el ámbito de la medicina mongola.

El trastorno depresivo mayor (TDM) es una enfermedad mental prevalente, que se sitúa como la tercera causa de discapacidad a nivel mundial y afecta a más de 300 millones de personas^1,2,3. En particular, se estima que al menos la mitad de las personas afectadas no reciben el tratamiento adecuado⁴. Dada esta brecha, los modelos animales sirven como una herramienta crucial para investigar la etiología de la depresión. Hasta la fecha, existen más de 20 modelos animales diferentes para la depresión⁵. Entre estos, el modelo de estrés leve crónico impredecible (CUMS), refinado por Paul Winer en 1987, es el más utilizado⁶. El modelo CUMS opera sobre la premisa de que exponer a los roedores a una amplia gama de factores estresantes socioambientales conduce a síntomas similares a la ansiedad, la tensión y la depresión. La metodología consiste en exponer a los animales a varios factores estresantes leves durante varias semanas, que culminan en una serie de alteraciones del comportamiento, como la anhedonia y los comportamientos depresivos^7,8. Estos cambios van acompañados de cambios en los perfiles endocrinos y de neurotransmisores, como una reducción de la 5-HT^9,10. Estos resultados son muy similares a los observados en humanos diagnosticados con TDM, lo que valida la utilidad del modelo. El modelo CUMS es particularmente valorado por su efectividad en la evaluación de antidepresivos, manifestando altos niveles de validez superficial, estructural y predictiva^11,12. A diferencia de otros modelos, el CUMS es sensible a los efectos de la administración crónica de antidepresivos monoaminérgicos. Por ejemplo, se ha demostrado que los inhibidores selectivos de la recaptación de serotonina (ISRS) como el citalopram, la paroxetina y la fluoxetina previenen y revierten la anhedonia en condiciones de estrés crónico^12,13. Además, los nuevos antidepresivos de acción rápida, como la ketamina, también han demostrado eficacia en este modelo^14,15. Por el contrario, otras pruebas como la prueba de natación forzada (FST) y la prueba de suspensión de cola (TST) son menos confiables para modelar cambios de comportamiento a largo plazo, a menudo reflejando adaptaciones al estrés agudo en lugar de soportar síntomas de depresión¹⁶. Estas características subrayan la robusta validez del modelo CUMS en la investigación de la depresión. Una de las características más sobresalientes del modelo CUMS, reconocido por su alta fiabilidad en los estudios clásicos, es la anhedonia, la incapacidad de experimentar placer o interés en las actividades cotidianas^17,18. Este fenómeno se evalúa comúnmente utilizando pruebas de preferencia por la sacarosa, y se ha demostrado que muchos antidepresivos revierten la reducción del consumo de sacarosa. Varias otras métricas también se emplean comúnmente en la literatura de CUMS, incluida la prueba de campo abierto (OFT), que evalúa el comportamiento motor voluntario, las tendencias exploratorias y la tensión, midiendo así la gravedad de la depresión¹⁹. Otras pruebas, como el laberinto elevado (EPM) para evaluar comportamientos similares a la ansiedad, mientras que el test del laberinto acuático de Morris (MWM) examina el funcionamiento cognitivo²⁰, y el FST evalúa la susceptibilidad a las emociones negativas y a la desesperación conductual²⁰. Además, la mayoría de los factores estresantes que afectan a los seres humanos son de naturaleza social. Las personas con relaciones sociales subóptimas, caracterizadas por actividades sociales, redes y apoyo limitados, tienen un mayor riesgo de padecer diversas enfermedades^21,22. Esto también es relevante en el caso de los roedores, que son animales sociales que viven en grupos. Por ejemplo, las ratas que se alojan en aislamiento exhiben características de lo que se denomina síndrome de aislamiento, que induce estrés social y acelera la aparición de la depresión²³.

La medicina mongola, una rama importante de la medicina china, postula que la aparición de enfermedades es una interacción compleja entre factores intrínsecos y externos. Estos factores externos, conocidos como las cuatro condiciones auxiliares, abarcan el cambio climático, la dieta, el estilo de vida y eventos repentinos como infecciones, incidentes sorprendentes y trastornos psicológicos. El proceso de la enfermedad se conceptualiza como una interacción continua entre tres elementos, denominados los tres tipos de homores, y los Siete Constituyentes Corporales en concierto con las^{cuatro condiciones} auxiliares. La medicina mongola sostiene que el cuerpo humano funciona como una entidad integrada, mantenida por un equilibrio relativo entre los tres homors. Se considera que una ruptura de este equilibrio es precursora de la enfermedad²⁴. Dado el papel fundamental de la experimentación animal en la tendencia de puentes entre la medicina tradicional y la moderna, es crucial desarrollar modelos animales que sean relevantes para la investigación en el campo de la medicina mongola. En consecuencia, empleamos una metodología de aislamiento de 28 días junto con CUMS para simular estos factores estresantes fisiológicos y psicológicos. Seleccionamos nueve factores estresantes impredecibles específicos y buscamos respaldar este método de modelado a través de la teoría de los tres homores de la medicina mongola. El establecimiento de un modelo animal robusto es fundamental para avanzar en la investigación básica en medicina mongola y contribuirá significativamente a sus estudios fundamentales.

Los protocolos experimentales recibieron la aprobación del Comité de Ética del Cuidado de Experimentos Animales de la Universidad Médica de Mongolia Interior (YKD202301172) y se adhirieron a las pautas de los Institutos Nacionales de Salud para el cuidado y la ética de los animales. El número de licencia de nuestro centro de animales es NO.110324230102364187. Veinticuatro ratas macho Sprague-Dawley (SD), de 8 semanas de edad (200 g ± 20 g), fueron adquiridas y alojadas en un ambiente controlado con una temperatura de 22 °C ± 2 °C y una humedad de 55% ± 15%. Alimente a las ratas con una dieta de mantenimiento para roedores y agua pura con mazorcas de maíz como cama. Las ratas fueron sometidas a un ciclo de luz/oscuridad de 12 h/12 h durante 1 semana antes de la experimentación.

1. Establecimiento del modelo de rata CUMS

1. Agrupación
   1. Divida las 24 ratas aleatoriamente en 2 grupos: el grupo de control (CON), que no estará expuesto al aislamiento ni al estrés, y el grupo modelo (MOD). Cada grupo contiene 12 ratas.
   2. Aloja a las ratas en jaulas estándar de 55 cm x 40 cm x 20 cm, con 6 ratas por jaula. Conserve la asignación de jaulas durante todo el período de aclimatación, a menos que se indique lo contrario.
   3. Llene cada jaula de cría con ropa de cama limpia y reemplácela dos veces por semana.
   4. Realice un período de aclimatación de 1 semana. Permita que las ratas tengan acceso irrestricto a la comida y al agua, excepto durante la aplicación de factores estresantes de CUMS. Mantenga un ambiente constante con una temperatura de 22 °C ± 2 °C, una humedad del 55 % ± un 15 % y un ciclo de luz/oscuridad de 12 h/12 h de 08:00 a 20:00, a menos que se indique lo contrario.
   5. Antes de iniciar el experimento, manipule las ratas diariamente para aclimatarlas al investigador y minimizar el estrés adicional durante la fase experimental.
2. Aislamiento con estrés leve crónico impredecible
   1. Al mismo tiempo, coloque los grupos MOD y CON en habitaciones separadas. Aloje a las ratas del grupo MOD individualmente, mientras mantiene juntas a las ratas del grupo CON. Mantenga todas las demás condiciones constantes.
   2. Implementar un régimen de 28 días para factores estresantes²⁵. Para prevenir la habituación y asegurar la imprevisibilidad del factor estresante, administre un factor estresante aleatorio por día, evitando el uso del mismo factor estresante en días consecutivos.
   3. Aplique aleatoriamente uno de los siguientes nueve factores estresantes^26,27 en días diferentes: 24 h de privación de agua, 24 h de privación de alimentos, acolchado húmedo, inclinación de la jaula, inversión del ciclo de luz/oscuridad, exposición al frío a 4 °C, exposición al calor a 45 °C, 1 min de sujeción de la cola o 15 min de agitación a 160 rpm. El diseño específico se describe en la Tabla 1.
   4. Durante la aplicación del estresor, restrinja el acceso a alimentos y agua al grupo MOD hasta que el estrés haya terminado, excepto durante la inversión del ciclo de luz/oscuridad. El grupo CON no estaba obligado a restringir el agua y la dieta.
3. Métodos de estrés
   1. Inicie el experimento aplicando estímulos de depresión junto con un aislamiento de 28 días a todas las ratas, excluyendo el grupo de control. Aloja a estas ratas en jaulas individuales. Consulte la Tabla 2 para conocer las afecciones relacionadas con los estímulos depresivos.
   2. Para realizar el método de sujeción de la cola, asegure la cola de una rata del grupo MOD sujetando la cola con un clip estándar a una distancia de 1-2 cm de la raíz de la cola de la rata. Mida el tiempo de sujeción durante 1 min (n = 12).
   3. En el método de privación de agua, retenga el agua de una rata del grupo MOD quitando su botella de agua y registre durante 24 h.
      NOTA: La hora del inicio de la privación de agua se registró para que la hora de finalización pudiera calcularse con precisión; Se observó el comportamiento de las ratas durante este período, incluyendo actividad, apetito y estado mental.
   4. En el método de privación de alimentos, retenga la comida de una rata del grupo MOD y registre durante 24 h.
      NOTA: Registre la hora en que comienza la privación de alimentos para que la hora de finalización se pueda calcular con precisión; asegurarse de que las ratas estén adecuadamente hidratadas durante este período; y observar el comportamiento de las ratas durante este período, incluyendo la actividad y el estado mental, etcétera.
   5. Para la estimulación en frío a 4 °C, coloque una rata del grupo MOD en un cubo de agua fría y registre durante 5 min. Asegúrese de que la temperatura del agua permanezca constante durante toda la prueba. Al final del experimento, seca la rata con un soplador y devuélvela a su jaula original.
      NOTA: Mantenga la temperatura del agua fría a 4 °C utilizando un termómetro y cubitos de hielo para regular la temperatura del agua cuando sube. El agua debe cambiarse regularmente para garantizar que la calidad del agua esté limpia y la temperatura sea constante. Al nadar, todas las extremidades y trompas de las ratas deben sumergirse en agua fría, excepto la cabeza. La profundidad del agua debe ser mayor que la longitud del cuerpo de la rata para evitar que la rata salte fuera del agua debido al contacto con el fondo del balde.
   6. Para administrar un estrés térmico de 45 °C, coloque una rata del grupo MOD en una incubadora y registre durante 5 minutos, asegurándose de que la temperatura permanezca estable durante toda la prueba.
   7. En la inversión del ciclo de luz-oscuridad, envuelva la jaula en un paño negro durante 1 h para simular la oscuridad diurna. Posteriormente, ilumine la jaula durante 12 h durante la noche para imitar la luz del día. Registre el comportamiento de la rata, la ingesta de comida y agua y los patrones de sueño durante 24 horas.
   8. Para el experimento de relleno húmedo, introduzca 200 ml de agua en una jaula que contenga 100 g de relleno. Aloje una rata del grupo MOD en la jaula húmeda y registre el comportamiento de las ratas bajo el estrés de la cama mojada, incluida la actividad, el apetito, la ingesta de agua, etcétera. Observe si hay comportamientos anormales o reacciones incómodas, como el estado de la piel y el pelo de las ratas, que pueden ser causados por el acolchado mojado, y regístrelos a tiempo para su posterior análisis durante 24 horas. Después de la prueba, seca la rata con un soplador y devuélvela a una jaula con virutas de madera fresca.
   9. En el método de inclinación de la jaula, coloque una rata del grupo MOD en una jaula inclinada en un ángulo de 45° contra una pared y registre durante 24 h. Utilice la estructura del marco de la jaula para ajustar el ángulo y asegurar la jaula en su lugar.
      NOTA: Calcule el tiempo desde el principio hasta el final y observe el comportamiento de las ratas durante el período de inclinación de la jaula, incluida la actividad, el apetito y el estado mental, y asegúrese de que el ángulo de la jaula inclinada esté configurado correctamente y permanezca estable para garantizar la precisión y reproducibilidad del experimento.
   10. Para agitar a alta velocidad, coloque una rata del grupo MOD en un agitador mecánico ajustado a 160 rpm y registre la rata durante 15 minutos. Posteriormente, se utilizan métodos de prueba de comportamiento para evaluar el establecimiento exitoso del modelo.
   11. Después de aplicar los factores estresantes, reubique las jaulas del grupo MOD de la sala CUMS a la sala de alojamiento. Durante el período de exposición al estrés de 4 semanas, mantenga al grupo CON en sus jaulas de casa situadas en la sala de alojamiento.
4. Precauciones durante los experimentos
   1. Transfiera las jaulas del grupo MOD a la sala de alojamiento general después de aplicar el factor estresante en la sala CUMS.
   2. Seguimiento de animales durante el modelado CUMS
      1. Durante el pinzamiento de la cola, es probable que el animal tenga dificultades debido a la estimulación inducida. A lo largo de este período, controle continuamente la abrazadera. Si se desprende, detenga el temporizador, vuelva a aplicar la pinza y luego reanude el temporizador durante 1 minuto.
      2. No imponga simultáneamente factores estresantes de privación de agua y ropa de cama mojada.
         NOTA: Evitar la imposición simultánea de almohadillas húmedas y la privación de agua ayuda a mantener la integridad experimental, reduce las variables de confusión y promueve el bienestar animal.
      3. La temperatura corporal del animal y la temperatura ambiente de la habitación pueden elevar la temperatura del agua durante la natación en agua fría. Por lo tanto, ajuste agregando agua helada o cubitos de hielo para mantener una temperatura constante del agua.
      4. Observe a las ratas a intervalos de 30 minutos durante la aplicación de los factores estresantes, excepto durante la reversión diurna. Preste especial atención a los signos de angustia inusual, como escalofríos, letargo o falta de movimiento. Si se observan tales síntomas, en particular una hipotermia potencial durante la natación en agua fría a 4 °C y la ropa de cama mojada, retire inmediatamente a la rata del factor estresante.
         NOTA: Retirar a los animales de experimentación del estudio cuando tengan problemas de salud, como infección, traumatismos graves, comportamientos agresivos, movilidad anormal, etcétera. Las condiciones para retirar a los animales del estudio suelen girar en torno a la protección de su salud y seguridad, al tiempo que se garantiza la integridad de los resultados experimentales.
      5. Realice inspecciones diarias para detectar heridas u otras anomalías físicas o de comportamiento en cada rata. Si se observa alguna anomalía, consulte al veterinario del laboratorio para determinar si la rata debe excluirse del experimento.
      6. Pesa cada rata cada 3 días. Si un animal pierde más del 20% de su peso corporal basal previo a la alimentación, debe ser excluido del experimento.

2. Pruebas de comportamiento

1. Para empezar, administre los estímulos de depresión junto con el aislamiento durante 28 días a todas las ratas, excluyendo el grupo de control. Aloja a las ratas en jaulas individuales. Consulte la Tabla 2 para obtener información específica sobre las condiciones de estímulos depresivos.
2. Para la prueba de campo abierto, divida una caja negra en 25 secciones cuadradas de área igual. Instale un sistema de análisis de seguimiento de video en la caja. Coloque la rata en el cuadrado central y controle sus actividades horizontales y verticales durante 5 minutos.
   NOTA: Las dimensiones de la caja son 500 mm x 500 mm x 300 mm. Los datos de actividad se recopilarán utilizando el sistema de seguimiento de video para evaluar los comportamientos relacionados con la ansiedad en los roedores cuando se exponen a un entorno nuevo.
3. Posteriormente, cuenta el número de cuadrados atravesados por la rata, utilizando todas las patas, para cuantificar la actividad horizontal. Cuente los casos de estar de pie y acicalarse como indicadores de actividad vertical. Después de cada prueba, desinfecte la caja con alcohol al 75% para eliminar cualquier olor residual de rata para pruebas posteriores.
4. A continuación, se evalúa la anhedonia a través de la prueba de preferencia de sacarosa. Coloque dos botellas en la tapa de la jaula: la botella A contiene agua pura, mientras que la botella B contiene una solución de sacarosa al 1%. Permitir el acceso ad libitum a ambas soluciones para la rata. Pese los frascos antes y después del consumo para calcular las tasas de preferencia de sacarosa de 60 minutos en los días 0, 7, 14, 21 y 28. La fórmula es la siguiente:
   Consumo de sacarosa = × 100%
5. Para medir la memoria espacial y las habilidades de aprendizaje, emplee la prueba del laberinto acuático de Morris. Divida la piscina en cuatro cuadrantes, numerándolos del uno al cuatro. Coloque una plataforma de descanso sumergida a 1 cm por debajo de la superficie del agua en el tercer cuadrante.
6. Introducir leche en la piscina para aumentar la opacidad del agua y mantener una temperatura del agua de aproximadamente 23 °C durante todo el procedimiento experimental.
7. Coloque cada rata en varios cuadrantes del laberinto, permitiéndoles 120 segundos para localizar la plataforma oculta. Las ratas deben confiar en la memoria espacial y las habilidades de aprendizaje para recordar la ubicación de la plataforma. Una vez que aprenden la ubicación de la plataforma, pueden nadar directamente hacia ella. Registre el tiempo de latencia utilizando el sistema de seguimiento de video del laberinto acuático Morris.
8. Coloca a la rata en un lugar fijo de la piscina. Si el sujeto no logra localizar la plataforma oculta dentro de los 120 s, registre la latencia como 120 s.
9. Finalmente, retire la plataforma oculta, vuelva a colocar la rata en el agua y registre el número de cruces de zona durante un período de 120 s.

3. Análisis estadístico

1. Para evaluar las diferencias significativas en los parámetros bioquímicos, se empleó el análisis de varianza unidireccional (ANOVA) seguido de la prueba post hoc de Duncan. Presentar los datos como media ± error estándar (SE) y considerar un valor p inferior a 0,05 como estadísticamente significativo.

Resultados de las pruebas de comportamiento en el modelo de depresión en ratas inducida por CUMS
Para corroborar la eficacia del procedimiento CUMS para inducir conductas similares a la depresión, se realizó un control de manipulación. Las ratas macho Sprague-Dawley (SD) se asignaron aleatoriamente al grupo MOD o CON durante un período de 4 semanas, como se describe en el paso 1.2.3. Posteriormente, las ratas fueron sacrificadas y sus hipocampos fueron completamente diseccionados para la evaluación de 5-HT, un neurotransmisor fuertemente asociado con la fisiopatología de la depresión¹⁰, utilizando el ensayo de inmunoadsorción enzimática (ELISA)²⁸.

Antes de la inducción de CUMS, no se observaron diferencias significativas entre los grupos evaluados en la puntuación OFT, la preferencia por la sacarosa o el análisis MWM.

Después de establecer el modelo CUMS, un análisis de varianza unidireccional (ANOVA) reveló un impacto significativo de CUMS en los comportamientos de ansiedad de las ratas. En concreto, en la OFT se observaron diferencias significativas entre los grupos. El grupo MOD exhibió puntuaciones verticales y horizontales más bajas en comparación con el grupo CON (**P < 0,01; Figura 1A,B,E), lo que sugiere que el procedimiento CUMS fue efectivo para inducir ansiedad.

Posteriormente, se administró la prueba de preferencia de sacarosa (SPT) durante 5 días, como se describe en el paso 2.4, para evaluar si las ratas mostraban signos de anhedonia después de la exposición a CUMS. Los resultados indicaron que no hubo diferencias significativas en el porcentaje de preferencia por la sacarosa entre los grupos en el día 0. Sin embargo, el ANOVA de un factor reveló una diferencia significativa en la ingesta de sacarosa entre los grupos el día 28. En concreto, el porcentaje de preferencia por la sacarosa en el grupo MOD fue menor que en el grupo CON (**P < 0,01; Figura 1C), confirmando la efectividad del protocolo CUMS en la inducción de anhedonia.

Un ANOVA de un factor reveló que el CUMS afectó significativamente la memoria espacial y las habilidades de aprendizaje de las ratas, según lo evaluado por la prueba MWM. La latencia para que el grupo MOD localizara la plataforma fue notablemente más larga que la del grupo CON (**P < 0,01). En cuanto a los tiempos de cruce, el grupo MOD cruzó menos veces que el grupo CON (**P < 0,01; Figura 1D,F). Estos hallazgos respaldan la eficacia del protocolo CUMS en la inducción del deterioro de la memoria en ratas.

Resultados de los niveles de 5-HT en el hipocampo en el modelo de depresión de rata inducida por CUMS
El ANOVA de un factor en los niveles de 5-HT en el hipocampo indicó una diferencia significativa entre los grupos (**P < 0,01). El grupo MOD mostró niveles reducidos de 5-HT en el hipocampo en comparación con el grupo CON (Figura 2). Estos resultados sugieren que el protocolo CUMS disminuyó efectivamente los niveles de 5-HT en el hipocampo, un fenómeno comúnmente observado en la depresión humana²⁹.

Figura 1: Efectos del modelo de depresión en ratas inducida por CUMS. (A) Puntuaciones verticales de la prueba de campo abierto (OFT). (B) Puntuaciones horizontales de pruebas de campo abierto. (C) Niveles de consumo de sacarosa (%) en los días 0 y 28. Anhedonia inducida por CUMS y menor preferencia por la sacarosa en ratas. (D) Latencia, tiempo y números de cruce de zona en la prueba MWM. Los resultados se presentan como la media ± SE (n = 12 ratas por grupo). **P < 0,01 indica cambios significativos en el grupo del modelo (MOD) en comparación con el grupo de control (CON) calculado mediante el análisis de varianza unidireccional (ANOVA). (E) Huellas OFT para ratas en cada grupo. (F) Huellas de MWM para cada grupo de ratas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Efecto sobre los niveles cerebrales de 5-HT en el modelo de depresión inducida por CUMS en ratas. Las ratas sometidas a 4 semanas de CUMS demostraron una reducción significativa en los niveles de 5-HT en el hipocampo en comparación con el grupo de control (CON). Los resultados se presentan como la media ± SE (n = 12 ratas por grupo). **P < 0,01 indica cambios significativos en el grupo del modelo (MOD) en comparación con el grupo CON calculado mediante el análisis de varianza unidireccional (ANOVA). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: Horario de estrés leve crónico impredecible (CUMS). Estresores y fechas de ejecución para la inducción de CUMS en sujetos rata.

Tabla 2. Nueve estresores con las cuatro condiciones auxiliares y la teoría de los tres homores en la medicina mongola. La relación intrínseca entre los nueve factores estresantes, la teoría de los tres homores y las cuatro condiciones auxiliares en la medicina mongola.

La depresión es un trastorno mental caracterizado por síntomas como bajo estado de ánimo, falta de placer y disminución^{de la energía}. En el campo de la investigación de la depresión, el establecimiento de un modelo animal fiable es crucial para avanzar en las intervenciones terapéuticas. Entre varios modelos animales, el modelo CUMS es particularmente notable por su alta confiabilidad, validez y su congruencia con las características de la depresión humana³¹. Es muy adecuado para imitar los efectos acumulativos de los factores estresantes de bajo nivel durante un período prolongado en varios entornos. En este estudio, establecimos un modelo de depresión inducida por CUMS en ratas, empleando una serie de factores estresantes descritos en el paso 1.2.3 y la Tabla 2. Varios aspectos del protocolo de estrés son críticos para el éxito del modelo. En primer lugar, las ratas de todos los grupos MOD deben alojarse individualmente, a diferencia de las del grupo CON. En segundo lugar, el régimen de estrés CUMS debe planificarse cuidadosamente para mantener la imprevisibilidad. Específicamente, las ratas deben ser sometidas a una selección aleatoria de siete de los nueve posibles factores estresantes semanalmente. La variabilidad e imprevisibilidad de estos estresores son esenciales para la eficacia del modelo^32,33. Por último, el uso repetido del mismo factor estresante debe minimizarse para evitar que las ratas se adapten, lo que podría comprometer la integridad de los resultados experimentales. Además, los ajustes de los factores estresantes se diseñaron para ser ajustables a lo largo del estudio.

El modelo CUMS ofrece varias ventajas como modelo de depresión. Se alinea estrechamente con la patogénesis de la depresión humana y representa con precisión la mayoría de los síntomas clínicos y los mecanismos subyacentes³⁴. Una de sus principales fortalezas es que utiliza la anhedonia, o la falta de placer, como indicador cuantificable ^6,7. El modelo también da cuenta de los diversos factores que contribuyen a la aparición de la depresión^35,36. Es importante destacar que el modelo CUMS está diseñado para una aplicación a largo plazo, que abarca varios meses. Esta duración es consistente con las necesidades de un modelo de depresión y permite la evaluación de fármacos en un régimen de dosificación crónica, así como la identificación de compuestos con mecanismos de acción rápidos³⁶. Debido a su carácter integral, el modelo CUMS ha adquirido una amplia aceptación en la literatura científica.

A pesar de estas ventajas, el modelo CUMS no está exento de limitaciones ^5,37. Uno de los principales inconvenientes es su naturaleza intensiva en recursos, que requiere importantes inversiones en medio ambiente, mano de obra y tiempo, lo que en consecuencia se traduce en una baja reproducibilidad³⁸. También existen inconsistencias en la literatura en cuanto a la selección e intensidad de los estresores, así como en la secuencia en la que se aplican³⁸. Estas inconsistencias dificultan la replicación del modelo en diferentes laboratorios. Además, la literatura carece de un cronograma detallado para la aplicación de los factores estresantes, lo que añade otra capa de ambigüedad^39,40. Otro problema surge de la variación en los métodos de combinación empleados en los diferentes estudios; Estos a menudo carecen de una justificación explícita, lo que crea dificultades en la replicación del modelo. Los animales objeto de estudio son muy sensibles a alteraciones menores en el diseño del estresor, lo que también contribuye a una baja reproducibilidad⁴⁰. Además, el uso de un número limitado de factores estresantes puede conducir a la habituación entre los animales sujetos, lo que hace que el diseño del factor estresante sea predecible. Por último, los animales de diferentes laboratorios muestran respuestas variadas a los factores estresantes, lo que contribuye a la escasa reproducibilidad entre los estudios. En la literatura existente, las ratas Wistar Kyoto (WKY) han sido identificadas como particularmente susceptibles a un fenotipo similar a la depresión después de la exposición a CUMS^25,41. Esto sugiere que la variabilidad entre cepas puede afectar significativamente la susceptibilidad a los cambios de comportamiento inducidos por el estrés. De manera similar, el SPT, una métrica clave que se utiliza a menudo para evaluar la eficacia de los modelos de depresión, presenta su propio conjunto de desafíos. Específicamente, las ratas individuales muestran variabilidad en su consumo de una solución de sacarosa al 1%^20,42. En condiciones de estrés, tanto los animales propensos al estrés como los resistentes al estrés presentan alteraciones en su consumo de soluciones dulces. En consecuencia, se vuelve difícil determinar la proporción de animales dentro de un lote determinado que son realmente resistentes al estrés o pertenecen a la categoría opuesta. Esta variabilidad puede dar lugar a que algunos animales muestren resultados de SPT que no reflejan con precisión su estado de enfermedad.

Para mejorar la fiabilidad del modelo CUMS, proponemos varios refinamientos metodológicos. En primer lugar, es crucial separar a los animales del grupo CON de los del grupo MOD para mitigar el impacto de los estímulos olfativos, visuales y auditivos, que pueden inducir estrés en los animales ^43,44. En segundo lugar, para minimizar la variabilidad, es aconsejable designar a uno o dos miembros del personal de laboratorio con experiencia para realizar todos los experimentos. Este enfoque sirve para reducir los errores atribuibles a factores individuales. Además, investigaciones anteriores han identificado animales de prueba resistentes al estrés¹³; Por lo tanto, sería prudente seleccionar estos grupos antes de la experimentación formal o post hoc para interpretar mejor los resultados. Con respecto a la prueba SPT, que es una evaluación conductual basada en la recompensa que mide la anhedonia intrínseca, es esencial determinar la concentración óptima de sacarosa antes de iniciar el protocolo CUMS. El establecimiento preliminar de la preferencia basada en la concentración de sacarosa puede mejorar notablemente la sensibilidad discriminativa de la prueba²⁰. Sin embargo, cabe destacar que las ratas sometidas a 24 horas de privación de alimento y agua pueden consumir indiscriminadamente cualquier líquido disponible debido a la sed extrema^35,45. Para obtener una medida más precisa de la preferencia por la sacarosa, recomendamos evaluar el consumo durante la fase nocturna del ciclo circadiano, cuando los roedores están más activos. Los factores estresantes aplicados durante la fase diurna (inactiva) podrían dar lugar a una privación crónica del sueño, introduciendo así un factor estresante no deseado^46,47. Por último, es imperativo controlar meticulosamente la influencia de los factores manejables descritos anteriormente para garantizar que los datos recopilados sean lo más fiables posible.

Los regímenes de tratamiento clínico occidentales actuales para la depresión a menudo vienen con efectos secundarios tóxicos pronunciados y una alta probabilidad de recaída al dejar de tomar la medicación. Investigar los enfoques de tratamiento arraigados en la medicina tradicional y profundizar en la patogénesis de la depresión a través de la lente de la teoría de la medicina mongola podría ofrecer perspectivas innovadoras sobre la etiología de la enfermedad. En este contexto, el desarrollo de modelos animales de depresión que se alinean con los principios de la medicina tradicional se erige como un paso fundamental en la investigación de la medicina mongola. La selección de los nueve estresores en el método de modelado CUMS de cultivo solitario es particularmente notable; se basa en la teoría de la medicina mongola de los tres homores y la relación inherente entre las cuatro condiciones auxiliares y los tres homors. Este enfoque exhibe un alto grado de compatibilidad con los principios únicos de la medicina mongola. Los análisis fenotípicos de la depresión, junto con factores externos, revelan correlaciones significativas con los conceptos médicos mongoles de Viento y Flema (ver Tabla 2). Específicamente, las disfunciones relacionadas con el viento se manifiestan clínicamente como síntomas como pérdida de energía, insomnio, olvido, fatiga y dolor. Las disfunciones relacionadas con la flema, por otro lado, dan lugar a manifestaciones clínicas como falta de respuesta, conciencia borrosa, pesimismo y negatividad. Estos síntomas se alinean estrechamente con los síntomas centrales del TDM^48,49. Por lo tanto, el modelo CUMS antes mencionado sirve como un modelo patológico que simula efectivamente las complejas interacciones entre las condiciones externas y el equilibrio de los tres tipos de homores, como postula la teoría de la medicina mongola, contribuyendo así a la aparición de la enfermedad.

Los puntos fuertes de este modelo son polifacéticos. En primer lugar, se adhiere a las teorías etiológicas médicas contemporáneas, satisfaciendo los criterios establecidos para los modelos animales dentro del ámbito de la medicina moderna. En segundo lugar, incorpora principios de la medicina tradicional mongola para reproducir síntomas específicos de enfermedades humanas en animales, incorporando así características únicas de las prácticas médicas mongolas. Dada su alineación con las teorías médicas modernas y tradicionales, este modelo sirve como una plataforma efectiva para la investigación fundamental en la medicina mongola. Por lo tanto, la integración de enfermedades y síntomas dentro de este modelo animal representa una confluencia de investigación en la medicina mongola y moderna. Si bien el modelo tiene sus limitaciones, su perfeccionamiento continuo contribuirá significativamente al futuro de la investigación básica en medicina mongola.

Los modelos animales se han vuelto indispensables en la exploración de la depresión debido a los desafíos éticos y prácticos asociados con el estudio directo del cerebro humano. A pesar de sus limitaciones inherentes para replicar plenamente las complejidades de la depresión, la evolución y validación de estos modelos sigue siendo un proceso continuo. En este estudio, hemos combinado principios de la medicina mongola y moderna para desarrollar un modelo animal de depresión. Este enfoque colaborativo ofrece información valiosa para construir un modelo animal más completo que abarque tanto las teorías médicas tradicionales mongolas como las modernas.

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Estamos agradecidos por la instrumentación y el laboratorio proporcionados porextender nuestra gratitud a la facultad de medicina mongola de la Universidad Médica de Mongolia Interior, China.Este estudio fue apoyado por, por proporcionar la instrumentación necesaria y las instalaciones de laboratorio. Este estudio recibió apoyo financiero de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Subvención Nº 81760762) y del Proyecto de la Universidad Médica de Mongolia Interior de China (Subvención Nº. YKD2022MS074), y el Proyecto de Investigación Científica de la Educación Superior en Mongolia Interior (China) (Subvención No. NJZY22661) y el Proyecto de Fondo Abierto del Laboratorio Clave de Medicina China y Mongolia en la Región Autónoma de Mongolia Interior, China (Subvención No. MYX2023-K07).