Method Article
* Bu yazarlar eşit katkıda bulunmuştur
Burada, kompleks dokulardaki fonksiyonel olarak ilgili kaspazları tanımlamak, doğrulamak ve hedeflemek için ayrıntılı bir immünohistokimya protokolü sunulmaktadır.
Kaspaz ailesinin, hücre farklılaşması, aksonal yol bulma ve proliferasyon dahil olmak üzere hücre ölümünün ötesinde birçok hücresel yola aracılık ettiği bilinmektedir. Hücre ölümü proteazları ailesinin tanımlanmasından bu yana, gelişim, sağlık ve hastalık durumlarında belirli aile üyelerinin işlevini tanımlamak ve genişletmek için araçlar araştırılmıştır. Bununla birlikte, şu anda yaygın olarak kullanılan ticari olarak temin edilebilen kaspaz araçlarının çoğu, hedeflenen kaspaz için spesifik değildir. Bu yazıda, sinir sistemindeki kaspaz-9'u tanımlamak, doğrulamak ve hedeflemek için kullandığımız yaklaşımı, immünohistokimyasal okumalarla yeni bir inhibitör ve genetik yaklaşımlar kullanarak tanımladık. Spesifik olarak, retinal nöronal dokuyu kaspazların varlığını ve işlevini tanımlamak ve doğrulamak için bir model olarak kullandık. Bu yaklaşım, hücre tipine özgü apoptotik ve apoptotik olmayan kaspaz-9 fonksiyonlarının sorgulanmasını sağlar ve ilgilenilen diğer karmaşık dokulara ve kaspazlara uygulanabilir. Kaspazların fonksiyonlarını anlamak, hücre biyolojisindeki mevcut bilgilerin genişletilmesine yardımcı olabilir ve ayrıca hastalığa katılımları nedeniyle potansiyel terapötik hedefleri tanımlamak için avantajlı olabilir.
Kaspazlar, hastalık 1,2'de gelişimsel hücre ölümünü, immün yanıtları ve anormal hücre ölümünü düzenleyen bir proteaz ailesidir. Kaspaz ailesinin üyelerinin çeşitli nörodejeneratif hastalıklarda indüklendiği iyi bilinmekle birlikte, hangi kaspazın hastalık patolojisini yönlendirdiğini anlamak daha zordur3. Bu tür çalışmalar, bireysel kaspaz ailesi üyelerinin işlevini tanımlamak, karakterize etmek ve doğrulamak için araçlar gerektirir. İlgili bireysel kaspazların ayrıştırılması hem mekanik hem de terapötik açıdan önemlidir, çünkü literatürde kaspazların farklı rollerine dair kanıtlar sağlayan çok sayıda çalışma vardır 4,5. Bu nedenle, amaç terapötik bir fayda için bir hastalıkta bir kaspazı hedeflemekse, ilgili aile üyelerinin spesifik olarak hedeflenmesi kritik öneme sahiptir. Dokudaki kaspaz düzeylerini saptamak için kullanılan geleneksel teknikler arasında batı lekelenmesi ve enzimatik ve florometrik yaklaşımlaryer almaktadır 3,6. Bununla birlikte, bu önlemlerin hiçbiri kaspaz seviyelerinin hücreye özgü tespitine izin vermez ve bazı senaryolarda, parçalanmış kaspazlar genellikle geleneksel protein analizi önlemleri ile tespit edilemez. Kaspazların aynı dokuda farklı apoptotik ve apoptotik olmayan roller oynayabileceği bilinmektedir7, bu nedenle gelişimsel ve hastalık yolaklarının doğru anlaşılması için hücreye özgü kaspaz düzeylerinin dikkatli bir şekilde karakterize edilmesi gerekmektedir.
Bu çalışmada nörovasküler hipoksi-iskemi - retinal ven tıkanıklığı (RVO)7,8 modelinde kaspaz aktivasyonu ve fonksiyonu gösterilmiştir. Retina gibi karmaşık bir dokuda, glial hücreler, nöronlar ve vaskülatür7 dahil olmak üzere RVO'da indüklenen hipoksi-iskemiden etkilenebilecek birden fazla hücre tipi vardır. Yetişkin fare retinasında, immünohistokimya (IHC)7 ile ölçüldüğü gibi, sağlıklı dokuda belirgin olan çok az kaspaz ekspresyonu vardır, ancak gelişim9 sırasında veya retina hastalığı10,11 modellerinde durum böyle değildir. IHC, biyomedikal araştırmalarda iyi kurulmuş ve hastalık ve patolojik hedeflerin doğrulanmasına, mekansal lokalizasyon yoluyla yeni rollerin tanımlanmasına ve proteinlerin nicelleştirilmesine izin veren bir tekniktir. Parçalanmış kaspaz ürünlerinin batı lekesi veya florometrik analiz ile tespit edilemediği durumlarda, farklı kaspazların spesifik hücre lokalizasyonu veya lokalizasyon yoluyla kaspaz sinyal yollarının sorgulanması durumunda, IHC kullanılmalıdır.
RVO'da fonksiyonel olarak ilişkili kaspaz (lar) ı belirlemek için, IHC, kaspazlar ve hücresel belirteçler için doğrulanmış antikorlarla birlikte kullanıldı. Laboratuvarda yapılan önceki çalışmalar, kaspaz-9'un bir iskemik inme modelinde ve nöronal disfonksiyon ve ölümden korunan oldukça spesifik bir inhibitör ile kaspaz-9'un inhibisyonunda hızla aktive olduğunu göstermiştir12. Retina, merkezi sinir sisteminin (CNS) bir parçası olduğundan, nörovasküler yaralanmalarda kaspaz-9'un rolünü sorgulamak ve daha fazla araştırmak için bir model sistem olarak hizmet eder13. Bu amaçla, RVO'nun fare modeli, kaspaz-9'un hücreye özgü yerini ve dağılımını ve nörovasküler hasardaki etkisini incelemek için kullanıldı. RVO, çalışan yaşlı erişkinlerde vasküler yaralanmadan kaynaklanan körlüğün yaygın bir nedenidir14. Kaspaz-9'un endotel hücrelerinde apoptotik olmayan bir şekilde eksprese edildiği, ancak nöronlarda eksprese edilmediği bulundu.
Bir doku olarak, retina, vasküler ağların takdir edilmesini sağlayan düz bir montaj veya nöronal retinal tabakaları vurgulayan kesitler olarak görselleştirilme avantajına sahiptir. Enine kesitlerde kaspaz proteini ekspresyonunun nicelleştirilmesi, retinadaki kaspaz (lar) ın lokalizasyonunu tanımlayarak retinal nöronal bağlantı ve görme fonksiyonunda hangi kaspazın potansiyel olarak kritik olduğu konusunda bağlam sağlar. Tanımlama ve validasyondan sonra, tanımlanan kaspazın indüklenebilir hücreye özgü delesyonu kullanılarak ilgilenilen kaspazın hedeflenmesi sağlanır. Potansiyel terapötik sorular için, aktif kaspazı inhibe etmek için özel araçlar kullanılarak ilgilenilen kaspazların alaka düzeyi test edildi. Kaspaz-9 için yüksek seçici inhibitör 7,15 pervane edilen bir hücre, Pen1-XBIR3 kullanıldı. Bu yazıda 2 aylık erkek C57BL/6J suşu ve C57BL/6J arka planlı tamoksifen kaynaklı endotelyal kaspaz-9 nakavt (iEC Casp9KO) suşu kullanıldı. Bu hayvanlar RVO'nun fare modeline maruz bırakıldı ve C57BL / 6J, kaspaz-9 seçici inhibitörü Pen1-XBir3 ile tedavi edildi. Tanımlanan metodoloji, merkezi ve periferik sistemlerdeki diğer hastalık modellerine uygulanabilir 7,15.
Bu protokol, Görme ve Oftalmoloji Araştırmaları Derneği'nin (ARVO) oftalmik ve görme araştırmalarında hayvanların kullanımı için yaptığı açıklamayı takip eder. Kemirgen deneyleri, Columbia Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmış ve izlenmiştir.
1. Retina dokusunun hazırlanması ve kriyoseksiyon
2. İmmünohistokimya
NOT: Hücre morfolojisini korumak için immünohistokimya için sabit kriyokorunmuş doku kullanın. İn vivo7 elde edilen optik koherens tomografi (OCT) görüntüleri düzeyinde olan bölümleri seçin. Kriyostattan toplanan ilk iki slayt serisini veya retina dokusuna 150 μm'den kesitleri kullanın.
3. Konfokal görüntüleme
4. Kaspaz seviyelerinin ölçülmesi
5. Endotel hücre kaspazı-9'un alaka düzeyinin genetik olarak doğrulanması
6. RVO'da kaspaz-9'un hedeflenmesi
Tanımlanan protokol, kullanıcının retina dokusundaki kaspaz-9 seviyelerini analiz etmesini ve ölçmesini sağlar. Ek olarak, kaspaz-9 ve aşağı akış substratlarını daha fazla tanımlamak, doğrulamak ve özellikle hedeflemek için araçlar sunar. Özetlenen adımlar, floresan fotomikrograflarda kaspaz seviyelerinin ve hücresel özgüllüğün ölçülebilir analizini sağlar. Tüm rakamlar, yaralanmamış ve 1 günlük P-RVO retina kesitlerinde toplam retina, endotel hücreleri ve nöronlarda belirtilen kaspaz seviyelerinin temsili fotomikrograflarını ve miktarını göstermektedir. Retinal kesit, Hoechst ile boyandığında retinal ganglion tabakasında (RGL), iç nükleer tabakada (INL) ve dış nükleer tabakada (ONL) retina çekirdeklerinin görüntülenmesini sağlar. Ek olarak, retinal kan damarları retinal pleksiform tabakalarda veya RGL ve INL arasında ve INL ile ONL arasında görülebilir. Kan damarlarının histolojik doğası nedeniyle, retina kesitlendiğinde, kan damarları pleksiform tabakaları besleyen bağlantısız ve ayrı olarak görünecektir. Şekil 2 , kaspaz-9'u yüksek oranda düzenlenmiş 1 günlük P-RVO olarak tanımlamaktadır. Şekil 3 , indüklenebilir endotel hücre nakavt farelerini kullanarak endotel kaspaz-9'un fonksiyonel uygunluğunu doğrulamaktadır. Şekil 4 , aktif kaspaz-9'un hedeflenmesinin farmakolojik olarak kaspaz-9-kaspaz-7'nin aşağı akış hedefinin indüksiyonunu engellediğini göstermektedir. Protokol, kaspazların hücresel lokalizasyonunu ve kaspazların eksprese edildiği nöronal retinal tabakaları tanımlar.
Şekil 1: Retinal görüntüleme şeması . (A) Retina kesitlerinin mikroskop slaydına yerleştirilmesi önerilir. (B) Retinadaki görüntüleme alanlarına genel bakış. (C) Retinal görünümün 20x hedefte gösterilmesi. Retinal tabakalar: RGL = retinal ganglion tabakası, INL = iç nükleer tabaka, ONL = dış nükleer tabaka. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: RVO, endotel hücrelerinde ve nöronlarda kaspaz-9'u indükler. (A) Cl-caspase-9 1:800 (yeşil), izolektin 1:200 (kırmızı) ve DAPI (beyaz) ile boyanmış yaralanmamış ve 1 günlük P-RVO'dan temsili retinal kesitler. (B) Cl-kaspaz-9'lu nöronların sayısının ölçülmesi (antikorlar hakkında ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakınız). (C) Cl-kaspaz-9 ile endotel hücrelerinin sayısının miktarının belirlenmesi. (D) Cl-kaspaz-9'u eksprese eden toplam hücre sayısı. Yaralanmamış, n = 6; 1 günlük P-RVO, n = 5. Hata çubukları SEM'± ortalamasını temsil eder; Tek yönlü ANOVA, Fisher'ın LSD testi. Ölçek çubuğu = 50 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Endotel kaspaz-9'un endotel hücre delesyonu, kaspaz-7'nin RVO-indüksiyonunu bloke eder. (A) Kaspaz-7 (yeşil), cl-kaspaz-9 (mavi), CD31, vasküler belirteç (kırmızı) ve DAPI (beyaz) ile boyanmış 1 günlük P-RVO 1 günlük P-RVO çöp arkadaşı farelerden temsili retinal kesitler. (B) İç retinadaki hücre sayısının cl-caspaz-9 ve caspaz-7 ile ölçülmesi. (C) Cl-kaspaz-9 ve kaspaz-7 ile endotel hücrelerinin sayısının miktarının ölçülmesi. (D) Cl-kaspaz-9 veya kaspaz-7 eksprese eden toplam hücre sayısı. iEC Casp9WT, n = 6-12; iEC Casp9KO, n = 3-8. Hata çubukları SEM'± ortalamasını temsil eder; Tek yönlü ANOVA, Fisher'ın LSD testi. Ölçek çubuğu = 50 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Kaspaz-9 aktivitesinin inhibisyonu kaspaz-7 ekspresyonu P-RVO'yu inhibe eder. (A) Kaspaz-7 (yeşil), izolektin (kırmızı) ve DAPI (beyaz) ile boyanmış Pen1-XBIR3 ile tedavi edilen veya edilmeyen yaralanmamış ve 1 günlük P-RVO'dan temsili retinal kesitler. (B) Kaspaz-7 ile endotel hücrelerinin sayısının ölçülmesi. (C) Kaspaz-7 ile lökosit sayısının miktarının ölçülmesi. (D) Kaspaz-7 ile nöronal tabaka başına düşen nöron sayısının miktarı. (E) Kaspaz-7 eksprese eden toplam hücre sayısı. Yaralanmamış Pen1 Salin, n = 6; yaralanmamış Pen1-XBIR3, n = 5; 1 günlük P-RVO Pen1 Salin, n = 5; 1 günlük P-RVO Pen1-XBIR3, n = 3. Hata çubukları SEM'± ortalamasını temsil eder; Tek yönlü ANOVA, Fisher'ın LSD testi. Kısaltmalar: RGL = retinal ganglion tabakası, INL = iç nükleer tabaka ve ONL = dış nükleer tabaka. Ölçek çubuğu = 50 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Kaspazlar, hücre ölümü ve inflamasyondaki rolleri için en iyi şekilde çalışılan çok üyeli bir proteaz ailesidir; Bununla birlikte, daha yakın zamanlarda, bazı aile üyeleri için çeşitli ölüm dışı işlevler ortaya çıkarılmıştır 4,5. Kaspaz fonksiyonu hakkındaki anlayışımızın çoğu, hücre kültüründeki çalışmalardan ve insan hastalığından elde edilen çıkarımsal verilerden kaynaklanmaktadır. Hastalıkta kaspazların anormal indüksiyonu, aktivasyonu veya inaktivasyonu olduğu takdir edilmekle birlikte, kaspazların hastalık patolojisine neden olup olmadığını fonksiyonel olarak belirlemek zor olmuştur. Belirli kaspazları değerlendirmek için kullanılan birçok araç, birden fazla aile üyesini tespit eder ve bu reaktiflerle elde edilen verilerin fonksiyonel uygunluğunu zayıflatır17. Burada, retinayı örnek olarak kullanarak karmaşık dokudaki kaspazları incelemek için bir protokol sunuyoruz. Sinir sisteminde, kaspaz ekspresyonu doğum öncesi ve sonrası aşağı regüle edilir. Bu, bir hastalık modelinde kaspaz seviyelerindeki değişiklikleri test etmek için spesifik antikorların kullanılmasına izin verir.
Protokolün odak noktası görüntü işleme ve analiz olsa da, tekniğin başarısı aynı zamanda verilerin tutarlılığını, geçerliliğini ve güvenilirliğini sağlamak için dikkatli doku hazırlığının yanı sıra IHC ve mikroskobik görüntülemeye de dayanmaktadır. Tüm veri kümesini görüntülemek için aynı parametreleri kullanmaya özen gösterilmelidir. Düşük kaliteli görüntüler, düşük kontrast ve bulanık odaklama güvenilir veriler sağlamaz. Retinanın P-RVO bölgelerini kesitlerken ve görüntülerken, yırtılmalardan ve katlanmalardan kaçınılmalıdır, çünkü bu alanlar artefaktlara neden olabilir. Doğrudan hasar gören alanlardan da kaçınılmalıdır. Görüntülemeyi yapan araştırmacının dokunun tedavisine kör olması gerekir. Analiz için, tedavi grubuna kör olmuş iki bağımsız gözlemcinin analizi yapması önerilir. Ek olarak, birincil fare antikorları fare yaralanması modellerinde kullanılmamalıdır, çünkü ikincil antikorlar vaskülatüre spesifik olmayan bir şekilde bağlanır. Bir alternatif, doğrudan konjuge birincil antikorların kullanılmasıdır.
Hücre sayımına alternatif bir yaklaşım, ifade alanının yüzdesinin nicelleştirilmesidir. Bu, hücre sayımı mümkün olmadığında kullanılabilir (örneğin, kaspaz ekspresyonu nöronal süreçlere veya fotoreseptör segmentlerine lokalize ise). Santral ve periferik retina çeşitli yaralanma modellerinde farklı şekillerde etkilenir. Yöntem, farklı retina bölgelerini özel olarak analiz etmek için uyarlanabilir. BRVO yapılıyorsa, gözün yaralı kısmından kesitler seçilmelidir. Protokol ayrıca kaspazın nerede eksprese edildiğini belirlemek için farklı hücre belirteçlerinin boyanmasını sağlar.
Yöntemin sınırlamaları, belirli bir hücredeki yüksek ve düşük kaspaz sinyali seviyeleri arasında ayrım yapmamasını içerir. Ek olarak, nöronal tabakaları tanımlamak için nükleer bir leke kullanmak uygundur, ancak nöronal ekspresyonu kesin olarak göstermez (glia ve lökositler bu katmanlarda da bulunur). Nöronal ekspresyonu doğrulamak için ek nöronal belirteçler kullanılabilir. Kaspaz ekspresyonunu değerlendirmek için çeşitli antikorlar da mevcuttur; bunlar en iyi insan kaspazı-9 için tanımlanmıştır, burada tam uzunluk / yarık (cl) kaspaz-9, otokparçalanmış kaspaz-9 ve kaspaz-3-yarıklı kaspaz-9 için antikorlar vardır.
IHC sinyalinin ortalama yoğunluğu sıklıkla bir niceleme yöntemi olarak bildirilir. Bununla birlikte, kırmızı kan hücrelerinden gelen arka plan gürültüsü veya otofloresan yanlış sonuçlar verebilir. Hücreye özgü niceleme, arka planın, spesifik olmayan boyama ve otofloresanın belirlenmesine ve ayırt edilmesine izin verir.
Bu protokol, bireysel kaspazların ekspresyonundaki doku çapındaki değişiklikleri, endotel hücresi gibi belirli bir hücre tipindeki ekspresyondaki değişiklikleri ve farklı retina katmanlarındaki nöronlar gibi belirli yerlerdeki spesifik hücre tiplerindeki değişiklikleri ölçmek için kullanılabilir. Bu esneklik, deneycinin hastalık durumunun bireysel kaspaz seviyelerini nasıl değiştirdiğini sorgulamasını sağlar. Mevcut / alternatif yöntemler, kaspaz sinyallemesinin yarı kantitatif karşılaştırması için batı lekelenme analizini kullanır, ancak yöntemler bu protokolün ağrıttığı hücresel lokalizasyonun net bir şekilde ayrılmasını sağlamaz. Özellikle, Şekil 3D'de, kaspaz-9 inhibisyonu, RGL'ye kıyasla, INL ve ONL'deki nöronal kaspaz-9'un azaltılmasında daha etkilidir. Bu tür bir çözümün diğer yöntemlerle elde edilmesi zordur. Ek olarak, bütün bir doku biyokimyasal olarak analiz edildiğinde, karmaşık bir dokuda birçok farklı hücre tipi bulunduğundan, değişen kaspaz seviyeleri toplanamayacak kadar düşük olabilir.
Kullanıcı tarafından doğrulanması gereken antikorlar, kaspaz probu için özgüllük sağlar. Kaspaslar kaskadlarda hareket edebilir (yani, başlatıcı aktive edici efektör ve daha sonra sonuca yol açar - ölüm, iltihaplanma, hücre sinyalizasyonu). Bu protokol, hasar sonrası farklı zaman noktalarında toplanan örneklerde kullanılabilir; Burada sunulan örneklerde, örnekler RVO sonrası farklı zamanlarda toplanmaktadır. Daha önce yayınlanmış çalışmalarda, kaspaz-9'un RVO7 sonrası 1 saat içinde arttığı ve bunun da daha fazla doğrulama ve hedefleme çalışmasına yol açtığı bulunmuştur. Endotel kaspaz-9'u RVO patolojisinin potansiyel bir sürücüsü olarak tanımladıktan sonra, endotel kaspaz-9'u doğrulamak için indüklenebilir endotel hücreli kaspaz-9KO'lu bir fare kullanıldı. İndüklenebilir hücreye özgü kaspaz KO farelerinin kullanımı başka bir özgüllük düzeyi sağlar ve yapısal kaspaz-9KO18 ile görülen gelişimsel ölümü önler. Ayrıca, kurucu kaspaz KO farelerde meydana geldiği gösterilen diğer aile üyelerinde telafi edici değişiklikleri önler19. Ayrıca, hücreye özgü indüklenebilir kaspaz KO farelerinin kullanımı, kaspazın dokudaki patolojiyi düzenlediği hücre tipinin tanımlanmasına izin verir. Protokol ayrıca, RVO'da aktif kaspaz-9'u hedef alan terapötik bir yaklaşımın etkinliğini sorgulamak için adımlar sağlar. Bu yaklaşım beyin de dahil olmak üzere diğer dokulara da uygulanabilir.
Yazarlar aşağıdaki rakip çıkarları beyan ederler: C.M.T. aşağıdaki patent başvurularına sahiptir US20200164026, US20190142915 ve US20150165061. C.M.T. ve S.S.'nin ABD 20140024597 patent başvurusu var. C.M.T., A.M.P. ve M.I.A.'nın US2020058683 patent başvurusu vardır. C.M.T. ve Y.Y.J.'nin WO2018013519 patent başvurusu vardır. M.I.A ve C.M.T, New York Şehrindeki Columbia Üniversitesi Mütevelli Heyeti tarafından yapılan WO/2020/223212 patent başvurusunda mucit olarak listelenmiştir. Geri kalan yazarlar rakip çıkarlar olmadığını beyan ederler.
Bu çalışma, Ulusal Bilim Vakfı Lisansüstü Araştırma Burs Programı (NSF-GRFP) hibe DGE - 1644869 ve Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) Ulusal Nörolojik Bozukluklar ve İnme Enstitüsü (NINDS), ödül numarası F99NS124180 NIH NINDS Çeşitlilik İhtisas F99 (CKCO'ya), Ulusal Göz Enstitüsü (NEI) 5T32EY013933 (AMP'ye), Ulusal Nörolojik Bozukluklar ve İnme Enstitüsü (RO1 NS081333, R03 NS099920'den CMT'ye) ve Savunma Bakanlığı Ordu/Hava Kuvvetleri (DURIP'ten CMT'ye).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
anti-Caspase-7 488 | Novus Biologicals | NB-56529AF488 | use at 1:150 |
anti-cl-Caspase-9 | Cell Signaling | 9505-S | use at 1:800 |
anti-CD31 | BD Pharmingen | 553370 | use at 1:50 |
Confocal Spinning Disc Microscope | Biovision | ||
FIJI 2.3.0 | open source | ||
Fluormount G | Fisher | 50-187-88 | |
Forcep | Roboz | RS-5015 | |
iCasp9FL/FL X VECad-CreERT2 mice | lab generated | see Avrutsky 2020 | |
Isolectin (594, 649) | Vector | DL-1207 | use at 1:200 |
Ketamine Hydrochloride | Henry Schein | NDC: 11695-0702-1 | |
Perfusion pump | Masterflex | ||
Pen1-XBir3 | lab generated | see Avrutsky 2020 | |
Prism 9.1 | GraphPad | ||
Tissue-Tek O.C.T. | Fisher | 14-373-65 | |
Vis-a-View 4.0 | Visitron Systems | ||
Xylazine | Akorn | NDCL 59399-110-20 |
Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi
Izin talebiThis article has been published
Video Coming Soon
JoVE Hakkında
Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır