Quantificazione della caspasi-9 immunocolorata nel tessuto retinico

Qui è presentato un protocollo immunoistochimico dettagliato per identificare, convalidare e indirizzare le caspasi funzionalmente rilevanti nei tessuti complessi.

La famiglia delle caspasi è nota per mediare molti percorsi cellulari oltre la morte cellulare, tra cui la differenziazione cellulare, il pathfinding assonale e la proliferazione. Dall'identificazione della famiglia delle proteasi di morte cellulare, c'è stata una ricerca di strumenti per identificare ed espandere la funzione di specifici membri della famiglia negli stati di sviluppo, salute e malattia. Tuttavia, molti degli strumenti di caspasi attualmente disponibili in commercio che sono ampiamente utilizzati non sono specifici per la caspasi mirata. In questo rapporto, delineiamo l'approccio che abbiamo utilizzato per identificare, convalidare e indirizzare la caspasi-9 nel sistema nervoso utilizzando un nuovo inibitore e approcci genetici con letture immunoistochimiche. In particolare, abbiamo utilizzato il tessuto neuronale retinico come modello per identificare e convalidare la presenza e la funzione delle caspasi. Questo approccio consente l'interrogazione delle funzioni apoptotiche e non apoptotiche specifiche della caspasi-9 del tipo cellulare e può essere applicato ad altri tessuti complessi e caspasi di interesse. Comprendere le funzioni delle caspasi può aiutare ad ampliare le attuali conoscenze in biologia cellulare e può anche essere vantaggioso per identificare potenziali bersagli terapeutici a causa del loro coinvolgimento nella malattia.

Le caspasi sono una famiglia di proteasi che regolano la morte cellulare dello sviluppo, le risposte immunitarie e la morte cellulare aberrante nella malattia ^1,2. Mentre è ben noto che i membri della famiglia delle caspasi sono indotti in una varietà di malattie neurodegenerative, capire quale caspasi guida la patologia della malattia è più difficile³. Tali studi richiedono strumenti per identificare, caratterizzare e convalidare la funzione dei singoli membri della famiglia delle caspasi. L'analisi delle singole caspasi rilevanti è importante sia da un punto di vista meccanicistico che terapeutico, poiché la letteratura ha molteplici studi che forniscono prove dei diversi ruoli delle caspasi ^4,5. Pertanto, se l'obiettivo è quello di indirizzare una caspasi in una malattia per un beneficio terapeutico, è fondamentale avere un targeting specifico dei membri della famiglia rilevanti. Le tecniche tradizionali per rilevare i livelli di caspasi nei tessuti includono western blotting e approcci enzimatici e fluorometrici ^3,6. Tuttavia, nessuna di queste misure consente il rilevamento specifico delle cellule dei livelli di caspasi e, in alcuni scenari, le caspasi scisse spesso non possono essere rilevate dalle tradizionali misure di analisi delle proteine. È noto che le caspasi possono svolgere diversi ruoli apoptotici e non apoptotici nello stesso tessuto⁷, pertanto è necessaria un'attenta caratterizzazione dei livelli di caspasi cellulo-specifici per una comprensione accurata dei percorsi di sviluppo e malattia.

Questo studio mostra l'attivazione e la funzione delle caspasi in un modello di ipossia neurovascolare-ischemia - occlusione venosa retinica (RVO)^7,8. In un tessuto complesso come la retina, ci sono più tipi di cellule che possono essere influenzate dall'ipossia-ischemia indotta nella RVO, comprese le cellule gliali, i neuroni e la vascolarizzazione⁷. Nella retina del topo adulto, c'è pochissima espressione di caspasi evidente nel tessuto sano, misurata dall'immunoistochimica (IHC)⁷, ma questo non è il caso durante lo sviluppo⁹ o nei modelli di malattia retinica^10,11. L'IHC è una tecnica ben consolidata nella ricerca biomedica che ha permesso la validazione di bersagli patologici e patologici, l'identificazione di nuovi ruoli attraverso la localizzazione spaziale e la quantificazione delle proteine. Nei casi in cui i prodotti di caspasi scissa non possono essere rilevati mediante western blot o analisi fluorometrica, né la posizione cellulare specifica di caspasi distinte o l'interrogazione delle vie di segnalazione della caspasi attraverso la localizzazione, allora IHC dovrebbe essere utilizzato.

Al fine di determinare le caspasi funzionalmente rilevanti nella RVO, IHC è stato utilizzato con anticorpi convalidati per caspasi e marcatori cellulari. Gli studi precedenti condotti in laboratorio hanno dimostrato che la caspasi-9 è stata rapidamente attivata in un modello di ictus ischemico e inibizione della caspasi-9 con un inibitore altamente specifico protetto dalla disfunzione neuronale e dalla morte¹². Poiché la retina fa parte del sistema nervoso centrale (SNC), funge da sistema modello per interrogare e studiare ulteriormente il ruolo della caspasi-9 nelle lesioni neurovascolari¹³. A tal fine, il modello murino di RVO è stato utilizzato per studiare la posizione e la distribuzione specifiche delle cellule della caspasi-9 e la sua implicazione nel danno neurovascolare. RVO è una causa comune di cecità negli adulti in età lavorativa che deriva da lesioni vascolari¹⁴. È stato scoperto che la caspasi-9 era espressa in modo non apoptotico nelle cellule endoteliali, ma non nei neuroni.

Come tessuto, la retina ha il vantaggio di essere visualizzata come un flatmount, che consente l'apprezzamento delle reti vascolari, o come sezioni trasversali, che evidenzia gli strati retinici neuronali. La quantificazione dell'espressione della proteina caspasi nelle sezioni trasversali fornisce il contesto per quanto riguarda quale caspasi è potenzialmente critica nella connettività neuronale retinica e nella funzione di visione identificando la localizzazione delle caspasi nella retina. Dopo l'identificazione e la convalida, il targeting della caspasi di interesse viene ottenuto utilizzando la delezione inducibile cellulo-specifica della caspasi identificata. Per potenziali indagini terapeutiche, la rilevanza delle caspasi di interesse è stata testata utilizzando strumenti specifici per inibire la caspasi attivata. Per la caspasi-9 una cellula comprendeva inibitore altamente selettivo ^7,15, Pen1-XBIR3 è stato utilizzato. Per questo rapporto, sono stati utilizzati ceppi C57BL/6J maschili di 2 mesi e ceppo knockout endoteliale inducibile da tamoxifene-9 (iEC Casp9KO) con sfondo C57BL/6J. Questi animali sono stati esposti al modello murino di RVO e C57BL/6J sono stati trattati con l'inibitore selettivo della caspasi-9, Pen1-XBir3. La metodologia descritta può essere applicata ad altri modelli di malattia nei sistemi centrale e periferico ^7,15.

Questo protocollo segue la dichiarazione dell'Associazione per la ricerca in visione e oftalmologia (ARVO) per l'uso di animali nella ricerca oftalmica e visiva. Gli esperimenti sui roditori sono stati approvati e monitorati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) della Columbia University.

1. Preparazione del tessuto retinico e criosezione

1. Eutanasia degli animali mediante somministrazione di anestesia intraperitoneale (ketamina (80-100 mg/kg) e xilazina (5-10 mg/kg)), e perfondere i topi sottoposti a RVO (vedi⁸ per i dettagli) con paraformaldeide al 4% (PFA) usando una pompa peristaltica.
   NOTA: pizzicare l'animale per confermare la profondità dell'anestesia prima di procedere con l'eutanasia e la perfusione. I dettagli sulla perfusione possono essere trovati in¹⁶.
2. Raccogliere gli occhi con un'attenta enucleazione con una pinza e mettere il globo in 1 ml di PFA al 4%. Lasciare gli occhi per una notte a 4 °C. Lavare gli occhi tre volte per 10 minuti, aggiungendo 1 mL di 1x PBS e mettendoli nello shaker.
3. Immergere gli occhi in 1 ml di saccarosio al 30% per 3 giorni, fino a quando non si depositano sul fondo del tubo, indicando l'assorbimento del saccarosio.
4. Riempire gli occhi con un composto a temperatura di taglio ottimale utilizzando una siringa da 30 G, fino a quando l'occhio ha un aspetto arrotondato (circa 50 μL).
5. Incorporare gli occhi in un criomold con composto a temperatura di taglio ottimale fino a coprire gli occhi e congelare a -80 °C fino al momento della criosezione.
6. Sezione incorporata gli occhi a 20 μm su vetrini usando un criostato.
   1. Rimuovere il blocco composto della temperatura di taglio ottimale dal criostampo.
   2. Posizionalo sul mandrino del criostato aggiungendo un composto di temperatura di taglio ottimale e posizionando il blocco sul mandrino. Lasciarlo all'interno del criostato fino a quando non si congela.
   3. Procedere a tagliare il blocco a 20 μm fino a quando non si vede il tessuto retinico.
      NOTA: Questo può essere confermato con un microscopio ottico con ingrandimento 30x (obiettivo 3x, oculari 10x). I tessuti possono essere distinti dai terreni OCT per colore e forma.
   4. Raccogliere il tessuto retinico in vetrini da microscopio in una serie di quattro sezioni per vetrino.
      NOTA: Vedere la Figura 1A per il posizionamento suggerito delle sezioni retiniche.
7. Etichettare le diapositive con un ID che de-identifichi il trattamento e il genotipo.
8. Conservare i vetrini a -20 °C fino alla colorazione.

2. Immunoistochimica

NOTA: Utilizzare tessuto crioconservato fisso per l'immunoistochimica per mantenere la morfologia cellulare. Scegli le sezioni che si trovano a livello delle immagini di tomografia a coerenza ottica (OCT) acquisite in vivo⁷. Utilizzare le prime due serie di vetrini raccolti dal criostato o sezioni da 150 μm nel tessuto retinico.

1. Posizionare i vetrini in una camera di scorrimento buia e umida.
2. Permeabilizzazione e blocco: lavare le sezioni trasversali retiniche con 300 μL di 1x PBS per 5 minuti per rimuovere l'OCT e scartare dopo.
3. Permeabilizzare il tessuto aggiungendo 300 μL di 1x PBS con Triton X-100 allo 0,1% per 2 ore a temperatura ambiente (RT) e scartare dopo.
4. Bloccare il tessuto aggiungendo 300 μL di tampone bloccante (10% siero di capra normale (NGS), 1% albumina sierica bovina (BSA) in 1x PBS, filtrato) e lasciare per una notte a 4 °C.
5. Anticorpi primari: diluire gli anticorpi primari nel tampone bloccante. Gli anticorpi primari utilizzati includono anti-cl-caspasi-9 a 1:800, anti-CD31 a 1:50 e anti-caspasi-7-488 (anticorpo marcato direttamente) a 1:150.
   NOTA: Seguire le raccomandazioni del produttore per la diluizione appropriata degli anticorpi primari.
   1. Versare le sezioni tampone bloccanti e applicare 100 μL del cocktail di anticorpi primari sui vetrini retinici.
   2. Incubare le sezioni trasversali per una notte a 4 °C.
6. Lavare le sezioni quattro volte per 5 minuti con 300 μL di 1x PBS.
   NOTA: Se le sezioni di tessuto sono molto fragili, i lavaggi devono essere rimossi utilizzando l'azione capillare applicando un fazzoletto all'angolo del vetrino per evitare di spostare le sezioni retiniche.
7. Per evitare l'etichettatura incrociata degli anticorpi primari generati nella stessa specie ospite, completare la colorazione con anticorpi secondari prima di applicare gli anticorpi direttamente marcati.
8. Anticorpi secondari: diluire gli anticorpi secondari nel tampone bloccante ad una concentrazione dello 0,1%. Ad esempio, per rilevare anti-cl-caspasi-9, un anticorpo allevato nel coniglio, utilizzare capra-anti-coniglio-568 secondario.
   1. Applicare 200 μL del cocktail di anticorpi secondari sulle retine.
   2. Incubare il tessuto per 2 ore a RT.
   3. Lavare le sezioni quattro volte per 5 minuti con 300 μL di 1x PBS.
   4. Colorare i nuclei per 5 minuti con 300 μL di DAPI ad una diluizione dello 0,02%.
9. Lavare una volta per 5 minuti con 300 μL di 1x PBS.
10. Posizionare un coprivetrino sulle sezioni retiniche utilizzando 500 μL di mezzo fluoromount-G, che preserva il segnale fluorescente, e posizionare con attenzione il coprivetrino sulla parte superiore del vetrino, evitando bolle.

3. Imaging confocale

1. Acquisire immagini delle sezioni colorate con microscopia confocale.
   1. Accendere il microscopio confocale.
   2. Posizionare la diapositiva sullo stage.
   3. Regolare la messa a fuoco per vedere chiaramente la sezione retinica.
      NOTA: Scatta almeno quattro immagini per sezione e un'immagine quattro sezioni per retina. Vedere lo schema di imaging retinico per le aree di imaging suggerite (Figura 1B, C).
2. Colorazione caspasi, vascolare e nucleare dell'immagine utilizzando un microscopio confocale con acquisizione Z-stack, utilizzando un obiettivo 20x o 40x.
   NOTA: i parametri di imaging e la configurazione del software devono essere costanti per tutte le immagini in un esperimento. L'obiettivo 20x fornisce una panoramica degli strati retinici, che sono ben definiti dalla colorazione nucleare. L'obiettivo 40x fornisce maggiori dettagli cellulari.
   1. Impostare i tempi di esposizione e intensità laser appropriati per canale facendo clic su acquisisci impostazioni.
   2. Impostare lo stack Z per visualizzare l'intera sezione facendo clic su Serie Z e impostare i parametri su e giù per coprire la profondità del tessuto.
3. Salvare le immagini seguendo l'ID mascherato assegnato durante la criosezione.

4. Quantificazione dei livelli di caspasi

1. Trascina i file immagine dei canali 405, 470, 555 e 640 sulla console delle FIJI.
2. Fare clic su Immagine > Colore > Unisci canali.
3. Assegnare i colori ai file come segue: rosso a 555, verde a 470, grigio a 405, ciano a 640.
4. Comprimere lo stack Z facendo clic su Immagine > Stack > Progetto Z.
5. Fare clic su Tipo di proiezione: Intensità massima.
6. Aprire l'interfaccia Canali facendo clic su Immagine > Strumento Canali colore.
7. Apri l'interfaccia Luminosità e contrasto .
8. Selezionare i parametri per canale.
   1. Vai su Canali e seleziona un canale.
   2. Posizionare il cursore sopra la cella caspasi espressa e annotare il valore in pixel.
   3. Posiziona il cursore sopra lo sfondo e annota il valore in pixel.
9. Parametri di prova
   1. Vai all'interfaccia Luminosità e contrasto.
   2. Fare clic su Seleziona.
   3. Inserire il valore minimo visualizzato (valore in pixel annotato della cella espressa in caspasi).
   4. Inserire il valore massimo visualizzato (valore in pixel annotato dello sfondo).
   5. Fare clic su OK.
10. Ripetere i passaggi 4.8-4.9 per tutti i canali.
11. Testare i parametri scegliendo immagini casuali da tessuto cieco.
    NOTA: modificare i parametri di luminosità e contrasto solo se il valore di sfondo non è adeguato per altre immagini.
12. Una volta impostati i parametri, aprire i file di immagine e comprimere lo Z-stack.
13. Aggiungere i parametri di luminosità e contrasto per il canale caspasi e l'isolectina, canale marcatore vascolare.
14. Utilizzare lo strumento puntuale per quantificare il numero di aree vascolari positive utilizzando la colocalizzazione del marcatore vascolare con espressione caspasi come lettura delle aree positive.
15. Ripetere il punto 4.14 ma usando Hoechst come marcatore di aree neuronali positive.
16. Annotare i valori su un foglio di calcolo per immagine.
17. Calcola la media dei valori per sezione.
18. Calcola la media dei valori delle sezioni: questa sarà la lettura per occhio.

5. Conferma genetica della rilevanza della cellula endoteliale caspasi-9

1. Utilizzare retine ottenute dai topi Casp9FL/FL-VECad-CreERT2 sottoposti a RVO⁷.
2. Colorare le retine per caspasi-9 (caspasi eliminata), caspasi-7 (caspasi effettrice a valle), marcatori vascolari e DAPI come descritto sopra nel paragrafo 2.
3. Immagine e quantificazione come descritto sopra nelle sezioni 3 e 4.

6. Targeting della caspasi-9 in RVO

1. Ottenere gli occhi dai topi sottoposti a RVO seguito dall'applicazione dell'inibitore della caspasi-9 Pen1-XBir3 per via topica agli occhi come in⁷.
2. Immunocolorare le retine per la caspasi-7 (una caspasi effettrice a valle), i marcatori vascolari e il DAPI come descritto sopra nel paragrafo 2.
3. Immagine e quantificazione come descritto sopra nelle sezioni 3 e 4.

Il protocollo descritto consente all'utente di analizzare e quantificare i livelli di caspasi-9 nel tessuto retinico. Inoltre, presenta strumenti per identificare ulteriormente, convalidare e indirizzare specificamente la caspasi-9 e i substrati a valle. I passaggi riassunti consentono un'analisi quantificabile dei livelli di caspasi e della specificità cellulare nelle fotomicrografie fluorescenti. Tutte le cifre mostrano fotomicrografie rappresentative e quantificazione dei livelli di caspasi indicati nella retina totale, nelle cellule endoteliali e nei neuroni nelle sezioni trasversali della retina P-RVO non lese e di 1 giorno. La sezione trasversale retinica consente la visualizzazione dei nuclei retinici nello strato gangliare retinico (RGL), nello strato nucleare interno (INL) e nello strato nucleare esterno (ONL) quando colorato con Hoechst. Inoltre, i vasi sanguigni retinici sono visibili negli strati plessiformi retinici o tra RGL e INL e tra INL e ONL. A causa della natura istologica dei vasi sanguigni, quando la retina è sezionata, i vasi sanguigni appariranno come scollegati e separati, fornendo gli strati plessiformi. La Figura 2 identifica la caspasi-9 come P-RVO a 1 giorno altamente regolata. La Figura 3 convalida la rilevanza funzionale della caspasi endoteliale-9 utilizzando topi knockout inducibili con cellule endoteliali. La figura 4 mostra che il targeting farmacologico della caspasi-9 attiva blocca farmacologicamente l'induzione di un bersaglio a valle della caspasi-9-caspasi-7. Il protocollo identifica la localizzazione cellulare delle caspasi e degli strati retinici neuronali in cui le caspasi sono espresse.

Figura 1: Schema di imaging della retina . (A) Posizionamento raccomandato delle sezioni retiniche nel vetrino del microscopio. (B) Panoramica delle aree di imaging nella retina. (C) Rappresentazione della vista retinica con obiettivo 20x. Strati retinici: RGL = strato gangliare retinico, INL = strato nucleare interno, ONL = strato nucleare esterno. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 2: RVO induce caspasi-9 nelle cellule endoteliali e nei neuroni. (A) Sezioni trasversali retiniche rappresentative da indenni e 1 giorno colorato con P-RVO colorato con cl-caspasi-9 1:800 (verde), isolectina 1:200 (rosso) e DAPI (bianco). (B) Quantificazione del numero di neuroni con cl-caspasi-9 (vedere Tabella dei materiali per i dettagli sugli anticorpi). (C) Quantificazione del numero di cellule endoteliali con cl-caspasi-9. (D) Numero totale di cellule che esprimono cl-caspasi-9. illeso, n = 6; 1 giorno P-RVO, n = 5. Le barre di errore rappresentano la media ± SEM; Anova a senso unico, il test LSD di Fisher. Barra di scala = 50 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 3: La delezione delle cellule endoteliali della caspasi-9 endoteliale blocca l'induzione RVO della caspasi-7. (A) Sezioni trasversali retiniche rappresentative di topi compagni di cucciolata iEC Casp9WT e iEC Casp9KO 1 giorno colorati con caspasi-7 (verde), cl-caspasi-9 (blu), CD31, un marcatore vascolare (rosso) e DAPI (bianco). (B) Quantificazione del numero di cellule nella retina interna con cl-caspasi-9 e con caspasi-7. (C) Quantificazione del numero di cellule endoteliali con cl-caspasi-9 e con caspasi-7. (D) Numero totale di cellule che esprimono cl-caspasi-9 o caspasi-7. iEC Casp9WT, n = 6-12; iEC Casp9KO, n = 3-8. Le barre di errore rappresentano la media ± SEM; Anova a senso unico, il test LSD di Fisher. Barra di scala = 50 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 4: L'inibizione dell'attività della caspasi-9 inibisce l'espressione della caspasi-7 P-RVO. (A) Sezioni trasversali retiniche rappresentative da pazienti illesi e P-RVO di 1 giorno trattati o non trattati con Pen1-XBIR3 colorato con caspasi-7 (verde), isolectina (rosso) e DAPI (bianco). (B) Quantificazione del numero di cellule endoteliali con caspasi-7. (C) Quantificazione del numero di leucociti con caspasi-7. (D) Quantificazione del numero di neuroni per strato neuronale con caspasi-7. (E) Numero totale di cellule che esprimono caspasi-7. Pen1 soluzione salina illesa, n = 6; Pen1-XBIR3 illeso, n = 5; 1 giorno P-RVO Pen1 soluzione salina, n = 5; 1 giorno P-RVO Pen1-XBIR3, n = 3. Le barre di errore rappresentano la media ± SEM; Anova a senso unico, il test LSD di Fisher. Abbreviazioni: RGL = strato gangliare retinico, INL = strato nucleare interno e ONL = strato nucleare esterno. Barra di scala = 50 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Le caspasi sono una famiglia multi-membro di proteasi meglio studiata per i loro ruoli nella morte cellulare e nell'infiammazione; Tuttavia, più recentemente sono state scoperte una varietà di funzioni non di morte per alcuni membri della famiglia ^4,5. Gran parte della nostra comprensione della funzione delle caspasi deriva dal lavoro sulla coltura cellulare e dai dati inferenziali delle malattie umane. Mentre è apprezzato che vi sia un'induzione, attivazione o inattivazione aberrante delle caspasi nella malattia, è stato difficile determinare funzionalmente se le caspasi stanno guidando la patologia della malattia. Molti strumenti utilizzati per valutare caspasi specifiche rilevano più membri della famiglia, riducendo la rilevanza funzionale dei dati ottenuti con questi reagenti¹⁷. Qui forniamo un protocollo per studiare le caspasi nei tessuti complessi, usando la retina come esempio. Nel sistema nervoso, l'espressione delle caspasi è down-regolata pre e postnatale. Ciò consente l'uso di anticorpi specifici per testare i cambiamenti nei livelli di caspasi in un modello di malattia.

Mentre il focus del protocollo è sull'elaborazione e l'analisi delle immagini, il successo della tecnica si basa anche su un'attenta preparazione dei tessuti, nonché IHC e imaging microscopico per garantire coerenza, validità e affidabilità dei dati. È necessario prestare attenzione a utilizzare gli stessi parametri per visualizzare un intero set di dati. Immagini di scarsa qualità, basso contrasto e messa a fuoco sfocata non forniranno dati affidabili. Durante il sezionamento e l'imaging delle regioni P-RVO della retina, le lacrime e il ripiegamento devono essere evitati in quanto queste aree possono causare artefatti. Anche le aree di danno diretto dovrebbero essere evitate. Lo sperimentatore che esegue l'imaging deve essere cieco al trattamento del tessuto. Per l'analisi, si raccomanda che due osservatori indipendenti, in cieco al gruppo di trattamento, eseguano l'analisi. Inoltre, gli anticorpi primari del topo non devono essere utilizzati nei modelli di lesioni del topo poiché gli anticorpi secondari si legano in modo non specifico alla vascolarizzazione. Un'alternativa è quella di utilizzare anticorpi primari coniugati direttamente.

Un approccio alternativo al conteggio delle cellule è la quantificazione della percentuale dell'area di espressione. Questo può essere usato quando il conteggio delle cellule non è possibile (ad esempio, se l'espressione della caspasi è localizzata nei processi neuronali o nei segmenti dei fotorecettori). La retina centrale e periferica sono influenzate in modo differenziale in vari modelli di lesioni. Il metodo può essere adattato per analizzare specificamente diverse regioni retiniche. Se si esegue BRVO, le sezioni devono essere selezionate dalla parte lesa dell'occhio. Il protocollo prevede anche la colorazione di diversi marcatori cellulari per identificare dove viene espressa la caspasi.

I limiti del metodo includono che non distingue tra alti e bassi livelli di segnale caspasi in una determinata cella. Inoltre, l'uso di una colorazione nucleare per identificare gli strati neuronali è conveniente ma non indica definitivamente l'espressione neuronale (glia e leucociti sono presenti anche in questi strati). Ulteriori marcatori neuronali possono essere utilizzati per convalidare l'espressione neuronale. Ci sono anche una varietà di anticorpi disponibili per valutare l'espressione delle caspasi; Questi sono stati meglio definiti per la caspasi-9 umana, dove ci sono anticorpi per la caspasi-9 a lunghezza intera / scissa (Cl), la caspasi autoscissa-9 e la caspasi-3-scissa caspasi-9.

L'intensità media del segnale IHC è spesso riportata come metodo di quantificazione. Tuttavia, il rumore di fondo o l'autofluorescenza dei globuli rossi possono produrre risultati imprecisi. La quantificazione specifica della cella consente la determinazione e la discriminazione dello sfondo, della colorazione non specifica e dell'autofluorescenza.

Questo protocollo può essere utilizzato per misurare i cambiamenti a livello tissutale nell'espressione delle singole caspasi, i cambiamenti nell'espressione in un tipo specifico di cellula, come una cellula endoteliale, e i cambiamenti in specifici tipi di cellule in posizioni specifiche, come i neuroni in diversi strati retinici. Questa flessibilità consente allo sperimentatore di interrogarsi su come lo stato della malattia sta alterando i singoli livelli di caspasi. I metodi esistenti / alternativi utilizzano l'analisi western blotting per il confronto semiquantitativo della segnalazione delle caspasi, sebbene i metodi non forniscano la chiara separazione della localizzazione cellulare che questo protocollo ottiene. In particolare, nella Figura 3D, l'inibizione della caspasi-9 è più efficace nel ridurre la caspasi-9 neuronale nell'INL e nell'ONL, rispetto all'RGL. Questo tipo di risoluzione è difficile da raggiungere con altri metodi. Inoltre, quando un intero tessuto viene analizzato biochimicamente, i livelli di caspasi che cambiano possono essere troppo bassi per essere raccolti, poiché ci sono molti tipi di cellule diverse in un tessuto complesso.

Gli anticorpi, che devono essere validati dall'utente, forniscono specificità per la caspasi sondata. Le caspasi possono agire a cascata (cioè l'iniziatore che attiva l'effettore e quindi porta al risultato - morte, infiammazione, segnalazione cellulare). Questo protocollo può essere utilizzato in campioni raccolti in diversi punti temporali post-danno; negli esempi qui presentati, i campioni vengono raccolti in momenti diversi dopo la RVO. In lavori pubblicati in precedenza, è stato riscontrato che la caspasi-9 era aumentata entro 1 ora dopo RVO⁷, il che ha portato a ulteriori studi di convalida e targeting. Dopo aver identificato la caspasi-9 endoteliale come potenziale driver della patologia RVO, è stato utilizzato un topo con caspasi-9KO a cellule endoteliali inducibili per convalidare la caspasi-9 endoteliale. L'uso di topi caspasi specifici per cellule inducibili KO fornisce un altro livello di specificità ed evita la morte dello sviluppo osservata con la caspasi-9KO¹⁸ costitutiva. Evita anche cambiamenti compensativi in altri membri della famiglia che hanno dimostrato di verificarsi nei topi KO caspasi costitutivi¹⁹. Inoltre, l'uso di topi caspasi ininducibili KO cellula-specifici consente l'identificazione del tipo di cellula in cui la caspasi sta regolando la patologia nel tessuto. Il protocollo fornisce anche i passaggi per interrogare l'efficacia di un approccio terapeutico, mirato alla caspasi-9 attiva nella RVO. Questo approccio può essere applicato anche ad altri tessuti, incluso il cervello.

Gli autori dichiarano i seguenti interessi concorrenti: C.M.T. ha le seguenti domande di brevetto US20200164026, US20190142915 e US20150165061. C.M.T. e S.S. hanno una domanda di brevetto US 20140024597. C.M.T., A.M.P. e M.I.A. hanno una domanda di brevetto US2020058683. C.M.T. e Y.Y.J. hanno una domanda di brevetto WO2018013519. M.I.A e CMT sono elencati come inventori su una domanda di brevetto WO / 2020 / 223212 dagli amministratori della Columbia University nella città di New York. Gli altri autori non dichiarano interessi concorrenti.

Questo lavoro è stato supportato dalla sovvenzione National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program (NSF-GRFP) DGE - 1644869 e dal National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS) del National Institutes of Health (NIH), numero di premio F99NS124180 NIH NINDS Diversity Specialized F99 (a CKCO), National Eye Institute (NEI) 5T32EY013933 (a AMP), National Institute of Neurological Disorders and Stroke (RO1 NS081333, R03 NS099920 a CMT), e il Dipartimento della Difesa Esercito/Aeronautica (da DURIP a CMT).