Kahverengi Yağ Dokusunda De Novo Yağ Asidi Sentezinin Döteryum Oksit Kullanılarak Kantitatif Tayini

Burada, in vivo kahverengi yağ dokusunda toplam yağ asidi de novo lipogenezinin analizi için döteryum oksit ve gaz kromatografisi kütle spektrometrisi (GCMS) kullanan ucuz bir kantitatif yöntem sunuyoruz.

Yağ asidi sentezi, tüm vücut metabolik homeostazının ve diğer fizyolojik ve patolojik süreçlerin kontrolünde önemli fonksiyonel rollere sahip karmaşık ve yüksek enerji gerektiren bir metabolik yoldur. Glikoz imhası gibi diğer önemli metabolik yolların aksine, yağ asidi sentezi rutin olarak işlevsel olarak değerlendirilmez ve bu da metabolik durumun eksik yorumlanmasına yol açar. Buna ek olarak, bu alanda yeni gelenler için uygun, kamuya açık ayrıntılı protokollerin eksikliği vardır. Burada, in vivo kahverengi yağ dokusunda toplam yağ asidi de novo sentezinin analizi için döteryum oksit ve gaz kromatografisi kütle spektrometrisi (GCMS) kullanan ucuz bir kantitatif yöntemi açıklıyoruz. Bu yöntem, bir karbon kaynağından bağımsız olarak yağ asidi sentaz ürünlerinin sentezini ölçer ve herhangi bir fare modelinde ve herhangi bir dış bozulma altında hemen hemen her doku için potansiyel olarak yararlıdır. GCMS için numune hazırlama ve sonraki hesaplamalar ile ilgili ayrıntılar verilmiştir. Yüksek seviyelerde de novo yağ asidi sentezi ve metabolik homeostazın korunmasındaki kritik rolleri nedeniyle kahverengi yağın analizine odaklanıyoruz.

Obezite ve buna bağlı metabolik hastalıklar, şimdiki ve gelecek nesilleri tehlikeye atan bir salgındır ^1,2. Enerji alımı ve harcaması arasındaki dengesizliğin bir sonucu olarak yaygın olarak basitleştirilen obezite ile ilişkili metabolik düzensizlik, çevresel ve endojen faktörler tarafından kontrol edilen çok sayıda metabolik yolu etkiler³. Bununla birlikte, metabolik düzensizliğin hayvan modellerinde sadece birkaç yol rutin olarak test edilir.

Örnek olarak, glikoz imhası, muhtemelen taşınabilir glikoz monitörlerinin kullanımının basitliği nedeniyle, rutin olarak glikoz ve insülin tolerans testleri ile ölçülür⁴. Tüm vücut glukoz ve lipid oksidasyon nispi oranları da dolaylı kalorimetri testlerinden ^5,6 elde edilen solunum değişim oranına dayalı olarak rutin olarak tahmin edilmektedir. Bununla birlikte, metabolizmanın diğer tüm yönlerinin çoğunluğu rutin olarak işlevsel olarak değerlendirilmez. Bu, metabolik durumun eksik yorumlanmasına ve terapötik seçeneklerin kaçırılmasına yol açar. Bu tür ana yollardan biri de novo lipogenezdir.

De novo lipogenez (DNL), öncüllerden yeni yağ asitlerinin üretildiği süreçtir. Glikoz, tüm vücut DNL^7'ye katkıda bulunan ana öncü olarak kabul edilir, ancak asetat, fruktoz, laktat ve dallı zincirli amino asitler gibi diğer öncülerin, mekansal ve duruma bağlı bir şekilde ilgili karbon kaynakları olduğu gösterilmiştir 8,9,10,11,12. DNL, metabolik homeostaza önemli bir katkıda bulunur ve normal gelişim için gereklidir¹³. Ek olarak, DNL'deki değişiklikler kanser 14,15 ve metabolik 16,17,18 ve kardiyovasküler hastalıklar ^19,20 ile ilişkilendirilmiştir.

DNL yolu, esas olarak 16 karbonlu doymuş bir yağ asidi olan palmitat üreten çekirdek enzimatik bileşenler ATP sitrat liyaz (ACLY), asetil-CoA karboksilaz (ACC1/2) ve yağ asidi sentazdan (FAS) oluşur. Bununla birlikte, tek zincirli ve dallı zincirli yağ asitleri de daha düşük oranlarda üretilebilir⁹. Uzamalar ve desatürazlar, bu yağ asitlerini daha da değiştirerek, çeşitli işlevler için yararlı olan çok çeşitli yağ asitleri türleri yaratır (örneğin, uzun süreli enerji depolama ve membran akışkanlığının manipülasyonu).

DNL enzimatik mekanizmasının ekspresyonu, kısa sayıda transkripsiyon faktörü tarafından kontrol edilir. Bugüne kadar en iyi tanımlananlar arasında sterol düzenleyici element bağlayıcı protein (SREBP) ailesi, karbonhidrat yanıt elemanı bağlayıcı protein (ChREBP) ve karaciğer X reseptörü (LXR)21,22,23,24,25,26 bulunur. İşlevlerinde belirgin bir örtüşmeye rağmen, hücre tipi baskınlığına ve fizyolojik veya patolojik koşullara dayalı bireysel düzenlemeler bildirilmiştir^21,22,27,28.

Dikkat çekici bir şekilde, DNL yolunun seçilen adımları için bir dizi inhibitör klinik kullanım için onaylanmıştır veya obezite, alkolsüz yağlı karaciğer hastalığı / alkolsüz steatohepatit (NAFLD / NASH) ve kardiyovasküler hastalık dahil olmak üzere bir dizi hastalık için klinik öncesi veya klinik gelişim aşamalarındadır²⁹. Bu çabalar, DNL'nin sağlık ve hastalıkla olan ilişkisini vurgulamaktadır.

Son yıllarda, de novo yağ asidi sentezini kantitatif olarak değerlendirmek için yöntemlerin kullanımı artmıştır³⁰. Bunu değerlendirmek için en yaygın yöntem, ağır etiketli hidrojenin sentez sırasında hem doğrudan hem de dolaylı olarak, DNL substratları NAPDH, asetil-CoA ve malonil-CoA'nın hidrojenleri ile döteryum değişimi yoluyla asil zincirlerine dahil edildiği ağır etiketli suyun (_D2O) kullanılmasıdır. Bu yaklaşım popülerlik kazanmasına rağmen, bu alanda yeni gelenler için uygun, kamuya açık ayrıntılı protokollerin eksikliği vardır. Burada, daha önce Lee ve ^ark.31 tarafından geliştirilen hesaplamalarla, D_2Ove gaz kromatografisi kütle spektrometrisi (GCMS) kullanarak FAS ürünlerinin de novo sentezini nicel olarak değerlendirmek için bir yöntemin ana hatlarını çiziyoruz. Bu yöntem, bir karbon kaynağından bağımsız olarak de novo yağ asidi sentezini ölçer ve herhangi bir fare modelinde ve herhangi bir dış bozulma altında hemen hemen her doku için potansiyel olarak yararlıdır. Burada, yüksek DNL seviyeleri ve metabolik homeostazın korunmasındaki kritik rolleri nedeniyle kahverengi yağ dokusunun (BAT) analizine odaklanıyoruz.

Tüm deneyler, Cincinnati Çocuk Hastanesi Tıp Merkezi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylandı.

1. D₂O'nun Hazırlanması

NOT: Deneysel varyasyonu önlemek için, deney süresince tüm fareler için yeterli çözelti/içme suyu hazırlayın.

1. İntraperitoneal enjeksiyon için: D₂O litresi başına 9 g NaCl çözerek% 0.9 w / v salin D 2 O üretin Sterilize etmek için pirojenik olmayan_0.2μm filtreden süzün.
2. D 2 O-su içmek için: 920 mL normal içme suyuna 80 mL D₂O karıştırarak içme suyu olarak kullanılmak üzere %8 v / v D₂O ile zenginleştirilmiş su üretir. Fare tesisinden düzenli içme suyu elde edilebilir. Sterilize etmek için pirojenik olmayan 0,2 μm filtreden süzün.

2. BAT aktivitesinin sıcaklık iklimlendirmesi ile modülasyonu

1. Fareleri, sıcaklık alıştırmasının başlamasından 2 hafta önce kafes başına iki fare olacak şekilde ayırın. Farelerin uyum sağlaması ve tüm kafesleri 22 °C'de tutması için su beslemesini su şişeleriyle değiştirin.
2. Uygun sıcaklıkları ayarlayarak sıcaklığa alışmaya başlamadan 1 hafta önce fare çevre odalarını hazırlayın: termonötralite için 30 °C, oda sıcaklığı için 22 °C ve soğuğa maruz kalma için 18 °C.
3. Sıcaklık iklimlendirmesinin başlangıcında, kafesleri çevresel zenginleştirme olmadan yenileriyle değiştirin (yuvaları önlemek için). Kafesleri ilgili sıcaklıklara getirin.
   NOT: Termonötraliteye atanan kafesler 4 hafta boyunca 30 °C'de kalacaktır. Oda sıcaklığına atanan kafesler 4 hafta boyunca 22 °C'de kalacaktır. Soğuğa maruz kalmaya atanan kafesler haftalık bir programda giderek daha soğuk hale gelecektir: ilk hafta 18 °C, ikinci hafta 14 °C, üçüncü hafta 10 °C ve dördüncü hafta 6 °C.
4. Tüm koşullar için kirli kafesleri haftalık olarak değiştirin. Ek olarak, yiyecek ve su şişelerini en az 24 saat boyunca uygun sıcaklıkta önceden uyarlanmış yenileriyle değiştirin.
   NOT: Normal koşullara kıyasla önemli ölçüde daha fazla miktarda yiyecek tüketeceklerinden, özellikle soğuktaki fareler için her hafta eklenen yiyecek miktarlarına dikkat edin. Yiyecek ad libitum sağlayın.

3. D₂O'nun Yönetimi

1. Her hayvana, 1 mL şırınga ve 26 G iğne kullanarak intraperitoneal enjeksiyon yoluyla, doku toplamadan 12 saat-3 gün önce, 35 μL / g vücut ağırlığında% 0.9 w / v salin-D₂O enjekte edin.
   NOT: Uygun bir etiketleme süresinin seçilmesi hakkında daha fazla bilgi için lütfen tartışma bölümüne bakın.
2. Su şişelerini %8 v/v D₂O ile zenginleştirilmiş içme suyu içeren şişelerle değiştirin.

4. Plazma ve doku toplama, işleme ve depolama

1. Deneyin sonunda, onaylanmış metodolojileri kullanarak fareleri feda edin (örneğin, aşırı dozda karbondioksit ve ardından servikal çıkık).
   1. Ötenaziden önce sonuçları etkileyebilecek ani sıcaklık değişikliklerini önlemek için ısıtma/soğutma pedleri veya başka yöntemler kullanın. Onaylanmış metodolojileri izleyerek farelere ötenazi yapın. Hemen kan ve doku alımına geçin.
2. 26 G'lik bir iğne kullanarak kardiyak ponksiyon yoluyla kan toplayın ve bir etilendiamintetraasetik asit kan alma tüpünde saklayın. Daha fazla işlenene kadar kanı buz üzerinde tutun.
3. Derinin altındaki dokuları etkilememek için cildi yukarı çekerken, farenin sırtının orta çizgisi boyunca cildi göğüs boşluğunun alt bölgesinden boynun üst bölgesine kadar kesin. İnterskapular BAT, ince bir beyaz yağ dokusu tabakası altında omuz bıçakları arasında bulunur ve iki piramidal şekilli lobdan oluşur.
   1. Buz gibi soğuk fosfat tamponlu salin (PBS) içinde yıkayarak dokuyu temizleyin. Fazla sıvıyı gidermek için bir kağıt havluya sürün, analitik bir ölçekte tartın ve bir mikrotüpte toplayın.
   2. Sıvı nitrojen kullanarak dokuyu hemen dondurun. Diğer BAT depoları da toplanabilir.
4. Kan örneklerini 10.000 x g'da 4 °C'de 10 dakika santrifüjleyin. Santrifüjlemeden sonra, kırmızı kan hücresi peletini bozmadan plazmayı dikkatlice toplayın. Yeni bir buz gibi soğuk mikrotüpe aktarın ve sıvı nitrojen içinde hızlı dondurun.
5. Kahverengi yağ ve plazma örneklerini kullanana kadar -80 °C'de saklayın.

5. Yağ dokusundan lipit ekstraksiyonu

1. Ekstraksiyona başlamadan önce
   1. Bir cam şişede metanol içinde 1 mM'lik bir hekzadekenoik-d₃₁ asit çözeltisi hazırlayın. Bu, iç yağ asidi standardı olarak hizmet edecektir.
   2. Gerekli miktarda kloroform (_CHCl3) ve metanolü (_CH3OH) -80 °C'lik bir dondurucuda veya kuru buzda önceden soğutun.
      NOT: Antioksidan di-tert-butil-4-metilfenol (BHT), doymamış yağ asitlerinde çift bağların oksidasyonunu önlemek için %0.01 w/v (2.5 mg/25 mL)_{konsantrasyonda} CHCl3'e eklenebilir.
   3. Her doku örneği için önceden etiketlenmiş mikrosantrifüj tüpleri ve boş ekstraksiyon için kullanılacak ekstra bir tüp.
      DİKKAT:_CH3OHve_CHCl3 solunduğunda oldukça uçucu ve toksiktir. Sadece çeker ocaklarda kullanın.
      NOT: Farklı marka mikrosantrifüj tüpleri, solvent sızıntısını önleme açısından farklı seviyelerde arka plan palmitat ve yeteneklere sahiptir. Solvent sızıntısının önlendiğinden ve tüplerin minimum düzeyde kirletici palmitat içerdiğinden emin olmak için önce çeşitli tüplerin test edilmesini öneririz. Daha fazla tartışma için lütfen Yao ve ^ark.32'ye bakın.
2. Numuneleri dondurucudan çıkarın ve kuru buz üzerine koyun.
3. Önceden etiketlenmiş mikrosantrifüj tüpünü bir analitik teraziye yerleştirin ve terazinin darasını alın. Cımbız ve neşter/çelik tıraş bıçağını soğuması için 10-20 saniye kuru buz üzerine yerleştirin.
   1. Dondurulmuş doku örneğini tüpten çıkarmak için cımbız kullanın ve plastik bir tartım teknesine yerleştirin. Kantar, düz bir kuru buz bloğuna veya önceden soğutulmuş başka bir yüzeye yerleştirilebilir.
   2. Neşter veya çelik tıraş bıçağı kullanarak, dokunun 5-15 mg ağırlığa eşdeğer küçük bir kısmını inceleyin. Mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin ve tam ağırlığı kaydedin. Her örnek için tekrarlayın. Numuneler bu noktada dondurucuda saklanabilir veya lipid ekstraksiyonu için aşağıdaki adımlara ilerletilebilir.
      NOT: Numuneler arasında neşterin %70 etanol ile uygun şekilde temizlendiğinden ve her numune arasında yeni bir tartım teknesi kullanıldığından emin olun.
4. Her numuneye 1 μL/mg 10 mM heksadekenoik-d 31(C16:0-d₃₁) asit ekleyin.
   DİKKAT: Çözücülerin solunması riski nedeniyle aşağıdaki adımlar (5.4 ila 5.8) çeker ocak altında gerçekleştirilmelidir.
5. Üç adet 5 mm paslanmaz çelik boncuk ile her numuneye 250 μL_CH3OH, 250 μL_H2Ove 500 μL_CHCl3 ekleyin. Tüpleri bir öğütme değirmeninin önceden soğutulmuş bir bloğuna yerleştirin ve numuneleri 5 dakika boyunca 25 Hz'lik bir titreşim frekansında karıştırın veya doku numuneleri için üretici tarafından önerilen yönergeleri kullanın. Bir mıknatıs kullanarak boncukları çıkarın.
6. Numuneleri 12.000 x g'da 4 °C'de 10 dakika santrifüjleyin.
   NOT: Santrifüjlemeden sonra, polar metabolitleri içeren üst sulu faz ve lipitleri ve yağ asitleri içeren alt organik faz ile net bir bifazik ayrım gözlenmelidir. Herhangi bir ayrılma görülmezse, 250 μL_H2Oekleyin ve vorteks ve santrifüjleme adımlarını tekrarlayın.
7. Bir mikropipet kullanarak, her numunenin alt fazından uygun şekilde etiketlenmiş mikrosantrifüj tüplerine sabit bir hacim alın.
8. Kalan örneğe 500 μL CHCl₃ ekleyin ve 5.6-5.7 adımlarını tekrarlayın.
9. Numuneleri nitrojen gazı altına veya tamamen kuruyana kadar 4 °C'de CHCl_3'e dayanıklı soğutmalı santrifüj vakuma yerleştirin. Kurutulmuş numuneler, türevlendirmeye hazır olana kadar -20 °C'de saklanabilir.
   NOT: Polar metabolitleri analiz etmek için her numunenin üst tabakası da bu noktada toplanabilir ve adım 5.9'daki gibi kurutulabilir.

6. Yağ asidi metil esterlerinin (FAME'ler) hazırlanması ve GCMS analizi

1. FAME'leri hazırlamak için asit katalizli esterleştirme ve transesterifikasyon
   DİKKAT: Solventlerin solunma riski nedeniyle aşağıdaki adımlar çeker ocak altında gerçekleştirilmelidir.
   1. Numuneler dondurucuda saklanmışsa, su bulunmadığından emin olmak için nitrojen altında 5 dakika kurutun.
   2. MS sınıfı çözücüler kullanarak, 98 mL susuz_CH3OH'yi bir cam ortam şişesine pipetleyin. CH_{3 OH'de}%2 H 2_S04yapmak için çeker ocakta yavaşça 2 mL susuz sülfürik asit ekleyin. Kapalı şişeyi döndürerek karıştırın.
   3. Her numuneye 500 μL %2_H2S04CH3OHçözeltisi ekleyin ve kısaca vorteksleyin.
   4. Numuneleri bir ısı bloğunda 50 °C'de 2 saat inkübe edin.
   5. Numuneleri ısı bloğundan çıkarın ve her numuneye 100 μL doymuş NaCl çözeltisi ve 500 μL heksan ekleyin.
   6. Numuneleri oda sıcaklığında 1 dakika kuvvetlice vorteksleyin. Numuneleri 1 dakika bekletin; Bundan sonra iki aşama belirgin olmalıdır.
   7. Üst fazı yeni bir mikrosantrifüj tüpünde toplayın (mikrosantrifüj tüpünün uygun seçimi için bölüm 5.1.3'teki nota bakın).
   8. Verimi en üst düzeye çıkarmak için, ikinci numuneyi aynı etiketli tüplere toplayarak 6.1.5-6.1.7 adımlarını tekrarlayın.
   9. Numuneleri oda sıcaklığında nitrojen gazı altında kurutun.
   10. Numuneleri orijinal doku ağırlığına göre 20 μL/mg hekzan içinde yeniden süspanse edin ve hemen bir cam insert ile cam GC şişesine aktarın.
       NOT: Buharlaşmayı en aza indirmek için numuneleri aktarırken hızlı çalışın.
2. GCMS analizi
   1. FAME izotopologlarının bolluğunu belirlemek için, numuneleri tek bir dört kutuplu gaz kromatografisi kütle spektrometresine (GCMS) enjekte edin.
      NOT: Palmitatı tespit etmek için birçok kolon tipi kullanılabilirken, Malzeme Tablosunda ayrıntılı olarak açıklandığı gibi, yağ asidi cis/trans izomerlerinin ayrılması için geliştirilmiş bir GCMS kolonu için aşağıdaki sıcaklık programı oluşturulmuştur. Bu kolon 50 m uzunluğa ve 0,25 mm iç çapa sahiptir.
   2. Taşıyıcı gaz olarak helyum kullanarak, 1 mL/dk'da akan 270 °C'lik bir giriş sıcaklığında bölünmüş/ayrılmamış bir girişe 1 μL numune enjekte edin. Toplam akışı 19 mL/dk, septum tahliyesi 3 mL/dk ve 0,75 dk'da 15 mL/dk'lık ayrık havalandırmaya temizleme akışı ile düşük bol miktarda yağ asitleri için bölünmemiş bir enjeksiyon kullanın. Palmitat ve oleat gibi yüksek miktarda yağ asitleri için 10: 1-40: 1'lik bir bölme oranı kullanın.
   3. Aşağıdaki fırın parametrelerini kullanın: 80 °C'lik bir başlangıç sıcaklığı; 20 °C/dk'lık artışlarla 170 °C'ye çıkarmak; 1 °C/dk'lık artışlarla 204 °C'ye çıkarmak; 20 °C/dk'lık artışlarla 250 °C'ye çıkarmak; ve ardından 250 °C'de 10 dakika tutun.
   4. Aşağıdaki kütle seçici dedektör (MSD) parametrelerini kullanın: 70 eV'lik bir elektron darbeli iyonizasyon modu ve 1.562 (u/s) tarama hızı ve 4,1 tarama/s frekansı ile 50-400 m/z aralığında tarama. 280 °C'de bir transfer hattı, 230 °C'de bir iyon kaynağı ve 150 °C'de bir dört kutuplu kullanın.
      NOT: Diğer sütunlar kullanılabilir, ancak sıcaklık programı değişiklik gösterecektir.
   5. Numune dizisi: Enjeksiyon numune sırasını rastgele hale getirin ve dizinin başında, dizi içindeki her beşinci numuneden sonra ve dizinin sonunda iki veya üç heksan boşluğu enjekte edin.
   6. Her bir yağ asidi metil esteri için Tablo 1'deki iyonları entegre etmek için cihaza özel yazılım veya Metabolit-Dedektör³³ gibi ücretsiz açık erişimli yazılım kullanın.
      NOT: Tablo 1'de M1-M5 izotopologlarını kapsayan iyonları özetledik ve bu etiketleme penceresi ile döteryum dahil etme miktarını kapsadığını bulduk. Bununla birlikte, de novo akı önemli ölçüde daha yüksekse ve/veya daha uzun bir etiketleme süresi kullanılıyorsa, bunun genişletilmesi gerekebilir.
   7. İyon yoğunluklarının kesirli bolluğa dönüştürülebildiği bir kütle izotopomer dağılımı oluşturmak için her entegre iyonun bolluğunu kullanın, böylece kütle izotopomer dağılımının toplamı bire eşittir. Lütfen Ek Dosya'daki örnek elektronik tabloya bakın.
      NOT: Döteryum katılımını doğru bir şekilde belirlemek için, ¹³C, ¹⁵N ve ²H gibi doğal olarak oluşan izotopların varlığına izin vermek için doğal izotop bolluğunun düzeltilmesi kullanılmalıdır. Bu, Fernandez ve ^ark.34,35 tarafından belirtildiği gibi bir düzeltme matrisi uygulanarak gerçekleştirilir ve etiketli bir metabolitten etiketlenmemiş ölçülen bir metabolitin MID'sinin çıkarılmasıyla gerçekleştirilemez. Uygulamada, ham verileri fraksiyonel MID'lere dönüştürmek için fluxfix³⁶, polyMID 37 veya IsoCor³⁸ gibi ücretsiz olarak temin edilebilen yazılımların kullanılmasını öneriyoruz ve Tablo 1'de FAS'ın metil ester ürünleri için izotop düzeltmesi formülünü sağladık.
   8. Mevcut palmitat miktarını belirlemek için aşağıdaki formülü kullanın:
       
      iyon sayısı, Tablo 1 ve C16: 0-d 31'e entegre edilmiş tüm palmitat izotopologlarının toplamını ifade ederken, dahili standart hekzadekenoik-d_31'i ifade eder. İç standart, endojen palmitatınkinden ayrı bir tepe oluşturur. Diğer yağ asitlerinin nispi bolluğu da belirlenebilir, ancak tam kantitasyon için yağ asidine özgü izotop iç standartlarının (_D2Odahil edilmesinden gözlemlenenden daha büyük kütle kaymaları ile) veya harici standart eğrilerin kullanılması gerekebilir. Arka plan palmitat miktarını belirlemek için boş ekstrakte edilmiş numuneyi kullanın ve bunu nihai doku değerinden çıkarın.
   9. Palmitatın molar zenginleşmesini (ME) aşağıdaki denklemle hesaplayın:
      
      burada_M, bir palmitat izotopologunun normalleştirilmiş, kesirli bolluğudur ve n, olası palmitat izotopologlarının sayısıdır. Örneğin, aşağıdaki fraksiyonel dağılıma sahip bir palmitat molekülünün ME'si, M1 = 0.25, M2 = 0.08, M3 = 0.02, şöyledir: (0.025 * 1) + (0.08 * 2) + (0.02 * 3) = 0.245 ( Ek Dosyaya Bakınız).

7. Vücut suyu zenginleştirmesini belirlemek için plazma örneklerinin döteryum aseton değişimi

1. Tepkime
   1. Suda% 0-9 v / v arasında değişen 10 döteryum standardı hazırlayın.
   2. Adım 5.1.1'deki standartlar da dahil olmak üzere, numune başına 4 μL'ye izin veren %5 v/v aseton/asetonitril çözeltisi hazırlayın.
   3. Etiketli, güvenli kilitli mikrosantrifüj tüplerinde, her plazma örneğinden veya standarttan 10 μL, 4 μL 10 M NaOH ve 4 μL %5 aseton/asetonitril'i birleştirin. Bunu her örnek için üç kopya halinde gerçekleştirin.
   4. Numuneleri pipetleme ile nazikçe karıştırın. Numunelerin gece boyunca oda sıcaklığında inkübe edilmesine izin verin.
2. Çıkarma
   1. İnkübasyondan sonra, her numuneye 450-550 mg_Na2S04ekleyin.
   2. Çeker ocakta, her tüpe 600 μL CHCl₃ ekleyin ve 15 saniye boyunca kuvvetlice girdap yapın.
   3. Numuneleri 300 x g'da 2 dakika santrifüjleyin.
   4. Bir çeker ocak altında, her numuneden süpernatantın üç kopyalı, 80 μL'lik alikotlarını cam ekleri ve kapağı olan etiketli, cam GCMS şişelerine aktarın.
3. GCMS analizi
   1. Numuneleri bir kolon üzerinde (30 m, 0,25 mm i.d, Agilent DB-35MS) ayırın ve ekli kütle spektrometresinde analiz edin.
      1. 40:1 bölme oranı, 1 mL/dak helyum akışı ve 270 °C giriş sıcaklığı ile bölünmüş/bölmesiz bir girişe 1 μL numune enjekte edin.
      2. Aşağıdaki fırın parametrelerini kullanın: 60 °C'lik bir başlangıç sıcaklığı, 20 °C/dk'lık artışlarla 100 °C'ye, 50 °C/dk'lık artışlarla 220 °C'ye yükseltin ve ardından 220 °C'de 1 dakika tutun.
      3. Aşağıdaki kütle seçici dedektör (MSD) parametrelerini kullanın: 58 ve 59 m/z seçili iyon izleme ile 70 eV'de elektron darbeli iyonizasyon modu. 280 °C'de bir transfer hattı, 230 °C'de bir iyon kaynağı ve 150 °C'de bir dört kutuplu kullanın.
         NOT: Diğer düşük boşaltmalı, yapıştırılmış, çapraz bağlı, orta polariteli sütunlar kullanılabilir, ancak sıcaklık programı değişecektir.
   2. Sıvı örnekleyici yöntemini, bir_CHCl 3 yıkaması ve ardından her altı örnekte bir ek CHCl₃ yıkama adımları da dahil olmak üzere rastgele bir numune dizisi ile başlayacak şekilde ayarlayın.
      NOT: Otomatik numune alma cihazı için iğne yıkama olarak aseton kullanılıyorsa, CHCl 3 veya hekzan ile değiştirin ve kromatogramda herhangi bir kirletici aseton zirvesi artık belirgin olmayana kadar birden fazla boş_{CHCl 3} numunesi enjekte edin.
   3. Bu yöntemi kullanarak, bir aseton zirvesi yaklaşık 1.25 dakikada yükselir. Tablo 1'de gösterildiği gibi 58-60'lık bir m/z oranı içeren tepe noktalarını analiz etmek için bir ayarlama ile 6.2.6-6.2.7 adımlarını izleyerek verileri entegre edin ve aseton zenginleştirmesinin kesirli bolluğunu hesaplayın.
   4. Asetonun fraksiyonel zenginleşmesine dayalı olarak, test numunelerinin vücut suyu zenginleştirme (p) yüzdesini belirlemek için standart bir eğri oluşturmak için standartları kullanın.

8. İn vivo de novo lipogenez hesaplamaları

1. Her numunede FAS'ın doğrudan ürünleri olan yeni sentezlenmiş yağ asitlerinin (FNS) fraksiyonunu (yani, palmitat, tek zincirli yağ asitleri ve mmBCFA'lar) aşağıdaki denklemle hesaplayın:
   
   burada ME, bir palmitat molekülünün ortalama molar zenginleşmesidir (adım 6.2.9), p, karşılık gelen plazma örneğinden sudaki döteryum zenginleştirmesidir (adım 7.3.4) ve N, bir döteryumun dahil edilebileceği palmitat üzerindeki değiştirilebilir hidrojen atomlarının sayısıdır.
2. Lee ve ^ark.31 tarafından kurulan aşağıdaki denklemi kullanarak N'yi belirleyin:
   
3. Yeni sentezlenen yağ asitlerinin (MNS) molar miktarını şu şekilde belirleyin:
   MNS = FNS x toplam yağ asidi miktarı (nmol/mg doku).
   NOT: Örneğin, 0.245'lik bir palmitat molar zenginleştirme (ME), 0.045'lik bir vücut suyunda (p) bir döteryum zenginleştirmesi ve hesaplanan bir N sayısı 22 elde edilirse, palmitatın fraksiyonel sentezi 0.247'dir. Dokuda bulunan palmitat miktarı 2 mmol / mg ise, yeni sentezlenen palmitatın mmol 0.494 mmol / mg'dır (Ek Dosyaya bakınız).

Adım 1'de açıklanan_D2Odozuna dayanarak, tipik olarak vücut suyunun %2,5 ila %6 aralığında zenginleştirildiğini ve vücut suyunda temel bir döteryum zenginleştirme seviyesinin 1 saat içinde hızla elde edildiğini ve çalışma süresince %8 zenginleştirilmiş içme suyu ile korunduğunu bulduk (Şekil 1). Sürekli kararlı durum vücut suyu zenginleştirme, 6. adımda kullanılan hesaplamaların bir varsayımıdır ve bu nedenle yeni deneysel modellerde vücut suyu zenginleştirme kinetiğinin deneysel olarak doğrulanmasını öneriyoruz.

De novo sentezlenen yağ asitlerinin miktarının, BAT'deki termonötraliteye göre oda sıcaklığında arttığını bulduk (Şekil 2). 3 günlük_D2Ouygulamasından sonra termonötralite ve oda sıcaklığında farelerden BAT'de palmitatın kütle izotopolog dağılımı, oda sıcaklığında bulunan daha yüksek bir M1 ve M2 döteryum zenginleşmesi gösterir (Şekil 2A). Bu daha soğuk sıcaklık zenginleşmesi sadece palmitatta değil, aynı zamanda BAT'ta çok çeşitli yağ asitlerinde de meydana gelir (Şekil 2B). Oda sıcaklığında farelerin BAT'sinde toplam palmitat bolluğu da artar ve fraksiyonel sentez oranını toplam palmitat seviyeleri ile birleştirerek, oda sıcaklığında farelerde toplam palmitat sentezinin arttığını bulduk (Şekil 2C, D). Özellikle, plazma toplam yağ asidi zenginleştirmesi BAT ile aynı eğilimi izlemez, bunun yerine termonötralite ile yağ asidi zenginleştirmesi artar (Şekil 2E). Burada açıklandığı gibi, endojen sentezden potansiyel alımın dekonvolüsyon edilmesi, bir_D2Otek zaman noktası yaklaşımıyla mümkün değildir, ancak bu karşıt eğilimler, BAT'deki yağ asidi zenginleştirme modelinin yağ asidi alımı tarafından yönlendirilmediğini göstermektedir.

Şekil 1: 0.035 ml / g vücut ağırlığı% 0.9 NaCl_D2Oile enjeksiyonu ve içme suyunun% 8 D 2 O ile zenginleştirilmiş su ile değiştirilmesini takiben, farelerin plazmasında birden fazla zaman noktasında D₂O zenginleştirme yüzdesi. Çubuk grafikler ortalama ± SD'yi temsil eder. n = 9. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: 3 günlük D2O uygulamasından sonra farelerde kahverengi yağ dokusunda temsili sonuçlar. (A) Oda sıcaklığında (RT) ve termonötritede (TN) 3 günlük_D2Ouygulamasından sonra BAT'de palmitatın kütle izotopolog dağılımı. (B) Oda sıcaklığında ve termonötritede 3 günlük_D2Ouygulamasından sonra bir dizi yağ asidinin BAT molar zenginleştirilmesi. (C) Toplam bolluk ve (D) de novo oda sıcaklığında ve termonötritede 3 günlük_D2Ouygulamasından sonra kahverengi yağ dokusunda palmitat sentezlendi. (E) Oda sıcaklığında ve termonötritede 3 günlük_D2Ouygulamasından sonra bir dizi yağ asidinin plazma molar zenginleştirilmesi. Çubuk grafikler ortalama ± SD'yi temsil eder. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001. n = 6 olur. İstatistiksel analiz iki kuyruklu Student t-testi ile belirlendi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: Entegre edilecek GCMS bileşik parça iyonları. Bu tablo, memeli yağ asidi sentazı tarafından üretilen bir dizi yağ asidini kapsar, ancak birincil ürün C16:0'dır. Tüm bekletme süreleri, 7. adımda ayrıntılı olarak açıklanan aseton dışında 6. adımda ayrıntılı olarak açıklanan GCMS yöntemi içindir.

Ek Dosya: Örnek elektronik tablo hesaplaması. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Karmaşık metabolik yolaklar arasındaki dengeyi ve etkileşimi anlamak, metabolik ilişkili hastalıkların biyolojik temelini anlamak için vazgeçilmez bir adımdır. Burada, de novo yağ asidi sentezindeki değişiklikleri belirlemek için invaziv olmayan ve ucuz bir metodoloji gösteriyoruz. Bu yöntem, yağ asidi döteryum zenginleştirmesinden³¹ de novo sentez akısını tahmin etmek ve vücut suyundaki_D2O'nunnispi yüzdesini belirlemek için döteryum-aseton değişimini kullanmak için hesaplamalar geliştiren daha önce yayınlanmış yöntemlerden^{uyarlanmıştır 39}. Son yıllarda, burada açıklanan yöntemi aldık ve yağ depolarında, beyinde, karaciğerde ve tümörlerde^çeşitli yağ asitlerinin sentezindeki değişiklikleri ortaya çıkarmak için uyguladık ^9,22,40. Bu protokolün bir dizi kritik adımı ve değiştirilebilir yönü vardır. Bunlar, genel deneysel tasarımın yanı sıra bu yöntemde kullanılan analitik yaklaşım ve hesaplamalarla ilgilidir. Kararlı izotop izleyicilerden de novo yağ asidi sentezini hesaplamak için alternatif yaklaşımlar da yaygın olarak kullanılmaktadır. Bunlar arasında Hellerstein ve ark.41,42 tarafından geliştirilen alternatif kütle izotopomer dağılım analizi (MIDA) yaklaşımı, Kelleher ve ^ark.43,44 tarafından geliştirilen izotopomer spektral analizi (ISA) ve yağ asidi kaynak analizi (FASA) gibi daha uzun zincirli yağ asitlerinin sentezini modellemek için geliştirilen daha yeni yaklaşımlar yer ^{almaktadır45}. Buradaki yöntemin yararı, ücretsiz olarak kullanılabilen yazılım ve bir elektronik tablo kullanımı ile kolayca uygulanabilir olmasıdır. Bununla birlikte, vücut suyu zenginleştirmesinin (BWE) sabit bir durumda olması ihtiyacı, N parametresinin kullanımıyla ilgili uyarılar (aşağıda tartışılmıştır) ve yalnızca esas olarak palmitat olan FAS'ın doğrudan ürünleri için geçerli olması ile sınırlıdır.

Kahverengi yağ DNL ve sıcaklık iklimlendirme
DNL, tüm vücut metabolik regülasyonunun ana nodülü olarak yükselmiştir ve normal gelişim için gereklidir^13,29. Doku hedefli delesyon ve metabolomik analiz, yağ dokusunda DNL'yi kontrol eden birkaç önemli enzimatik ve transkripsiyonel oyuncuyu ve tüm vücut yağ birikimini ve normal metabolik homeostazı nasıl kontrol ettiğini belirlemiştir 21,28,46,47,48,49. Daha az takdir edilmesine rağmen, BAT, diğer dokuların çoğundan daha yüksek çekirdek vücut DNL enzim mekanizmasının (acly, acaca, fasn) ekspresyonu ve daha yüksek lipojenik aktiviteleri ile DNL'de oldukça aktif bir dokudur 22,50,51,52,53,54,55. Bununla birlikte, BAT, alt termonötr sıcaklıklara alışmanın aynı anda BAT ^22,54,56'da DNL ve yağ asidi oksidasyon aktivitesini indüklemesi anlamında benzersizdir. İlişkili mekanizmalar tam olarak açık olmamakla birlikte, BAT'ın, normal BAT aktivitesi^53,55 için gerekli olan lipid sentezi için DNL'ye yönelik olanlar da dahil olmak üzere besinler için metabolik bir lavabo olduğu kabul edilmektedir. Bu nedenle, aktivite seviyelerini değerlendirmek için BAT'ın tüm metabolik gelirlerini ve sonuçlarını hesaba katabilmek önemlidir. Bununla birlikte, DNL genellikle sadece gen ekspresyonuna dayalı olarak ölçülür ve sayılan durumlarda işlevsel olarak değerlendirilir. Burada önerilen protokol, metabolik durumun daha eksiksiz bir şekilde yorumlanmasına izin vererek DNL'nin fonksiyonel değerlendirmesine izin verir.

D₂O dozu, zamanlama ve vücut suyu zenginleştirme ölçümü
Tasarımdaki birincil kritik adımlardan biri, D₂O uygulamasının dozu ve zamanlamasıdır. Bu protokolde, kararlı durum BWE'nin hızlı bir şekilde elde edilmesine ve sürdürülmesine yol açtığını bulduğumuz bir doz ve uygulama yaklaşımı (bolus enjeksiyonu ve ardından içme suyu zenginleştirme) kullanıyoruz. Yağ asidi sentezini belirlemek için kullanılan hesaplamalar, kararlı durum BWE varsayımına dayanmaktadır; Bu nedenle, bunun yeni deneysel modellerde doğrulanması çok önemlidir. Bu kombine dozlama yaklaşımının kullanılmasıyla ilgili sorunlar nedeniyle kararlı durum zenginleştirmesi mümkün değilse, okuyucu, hesaplamalardaki değişikliklerin buna izin verdiği diğer yayınlara yönlendirilir³⁹. Bunun hızlı bir şekilde başarılmasını amaçlayan bir dozlama yaklaşımı kullanıldığında tolere edilebilecek kararlı durumdan sapma derecesi birçok faktöre bağlıdır. BWE, hesaplama için kullanılan değerin üzerinde sürekli ani artışlarda artırılırsa, buradaki yaklaşım kullanılarak DNL fazla tahmin edilecektir. BWE, sürekli süreler için hesaplama için kullanılan değerden önemli ölçüde düşükse, DNL hafife alınacaktır. Ortalama etrafında bazı küçük farklılıklar beklense de, en kritik faktör, BWE'nin bir deney grubunda diğerinden daha fazla farklılık göstermemesidir, bu da hesaplanan DNL'de BWE'deki varyasyon tarafından yönlendirilen farklılıklara yol açabilir. Her iki deney grubu da zaman içinde küçük ama benzer farklılıklar gösteriyorsa, bunun toleransı, araştırmacının ölçümün gerçekleştirmesini istediği doğruluk ve kesinliğin yanı sıra deney grupları arasında beklenen farklılıklara bağlı olacaktır. Örneğin, burada örnek olarak verilen oda sıcaklığına karşı termonötraliteye maruz kalan kahverengi yağ dokusu durumunda, mevcut de novo sentezlenmiş yağ asidi miktarındaki fark %50'den fazladır; bu nedenle, BWE'deki küçük değişikliklerin sonuçları gizlemesi olası değildir.

Kararlı durumun dikkate alınmasına ek olarak, bu protokolün bir başka değiştirilebilir yönü de BWE seviyesidir. Artan BWE, potansiyel olarak yağ asitleri üzerinde daha fazla etiket transferine izin verir ve bu nedenle, daha düşük cirolu yağ asidi havuzları daha kısa sürede daha kolay tespit edilebilir. Bu, araştırmacının DNL'deki akut yanıtlarla ilgilendiği durumlarda bir avantaj olabilir. Bununla birlikte, vücut suyundaki artan_D2Oseviyeleri istenmeyen fizyolojik etkilere neden olabilir ve bu nedenle dikkatli olunmalıdır⁵⁷. Tipik olarak yaklaşık% 0.5 civarında BWE seviyelerine ulaşmak için daha düşük D₂O seviyelerinin uygulanması, D₂O uygulamasıyla ilişkili maliyet nedeniyle insan çalışmalarında yaygın olarak kullanılır. Bu durumda, BWE ve yağ asidi zenginleştirmesini ölçmek için artan duyarlılığa sahip yöntemlere ihtiyaç duyulabilir. BWE için bu, iyon oranı kütle spektrometrisi⁵⁸ veya modifiye edilmiş bir aseton değişim protokolü⁵⁹ ile elde edilebilir. Yağ asidi analizi için, yüksek çözünürlüklü bir GCMS cihazının kullanılmasının son zamanlarda yağ asitlerinde döteryum ölçümünün hassasiyetini arttırdığı ve böylece çok kısa zaman periyotları ve/veya düşük BWE^60'ın ardından DNL'nin miktarının belirlenmesine izin verdiği gösterilmiştir. CHCl3 ile ekstrakte etmek ve sıvı enjeksiyonu yapmak yerine, adım 7.1.5'te üretilen asetonun üst boşluk analizlerini kullanarak, BWE'nin ölçüldüğü verimi artırmak için alternatif yöntemler de kullanılabilir. Bu, metot çalışma süresini azaltır ve birden fazla transfer adımını önler, böylece numune hazırlama süresini azaltır. Bir tepe boşluğu enjektörüne erişim varsa, bu yöntem şiddetle tavsiye edilir⁶¹.

Miktar tayini için yağ asidi havuzu seçimi ve analitik yaklaşım
Bu protokolde yöntem, lipid sınıfından bağımsız olarak doku veya plazmadaki toplam yağ asidi havuzunu ölçmek için tasarlanmıştır. Bununla birlikte, lipid sınıfları, FAME üretiminden önce, ince tabaka kromatografisi veya sıvı kromatografisi gibi yöntemlerle ayrılabilir. Ek olarak, serum veya plazma analiz edilirken, çok düşük yoğunluklu lipoprotein (VLDL) gibi spesifik lipoprotein fraksiyonlarından lipitler ultrasantrifüjleme yoluyla izole edilebilir⁵⁸. Bu yöntem, VLDL'de de novo yapılan yağ asitlerinin birincil kaynağı olması muhtemel olan hepatik DNL'yi tespit etmek için insan çalışmalarında yaygın olarak kullanılmaktadır. Lipid ekstraksiyonu ve türevlendirme protokolü, belirli sınıfların⁶² izolasyonunu arttırmak için de değiştirilebilir. Son olarak, lipid hidrojenlerin döteryum zenginleşmesi, kütle spektrometrisi yerine ²H NMR spektroskopisi kullanılarak da ölçülebilir. Bu yöntem MS'den daha az hassas olmasına ve bu nedenle daha fazla malzeme gerektirmesine rağmen, avantajı, uzama ve desatürasyon oranlarını daha iyi tahmin etmek için kullanılabilecek konumsal zenginleştirme bilgisi vermesidir⁶³.

Hesaplama
Bu protokoldeki hesaplamalar, kararlı durum BWE'yi, yağ asidi zenginleştirmesini ve yağ asitleri³¹ üzerindeki değiştirilebilir hidrojen sayısını hesaba katan önceki hesaplamalara dayanmaktadır. Herhangi bir hesaplamada olduğu gibi, bu yaklaşımdan elde edilen sonuçları uygularken ve yorumlarken göz önünde bulundurulması gereken bir takım sınırlamalar ve varsayımlar vardır. Dikkat edilmesi gereken birincil noktalardan biri, yöntemin 8. bölümünde N için kullanılan değerdir. Yağ asidi sentezi sırasında,_D2O'dan ²H, asil zincirine dahil edilir ve ayrıca dolaylı olarak NADPH, asetil-CoA ve malonil-CoA^64,65 üzerindeki hidrojenlerle değişim yoluyla. Önceki çalışmalar bu değişimin eksik olduğunu göstermiştir^31,66; bu nedenle, hesaplama bu^65'e izin vermek için bir düzeltme faktörü (N) içerir. 22'nin N'si birçok çalışma için yaygın olarak kullanılır, çünkü daha önce bunun adım 6 ^31,66'da özetlenen denklemi kullanan bir dizi doku için uygun olduğu bulunmuştur. Bununla birlikte, bu, deneysel pertürbasyona ve hayvan modeline bağlı olarak değişebilir⁶⁵; Bu nedenle, araştırmacıları bunu dikkate almaya çağırıyoruz. Daha düşük bir N, toplam sentez akısını arttırır ve çalışmalar veya laboratuvarlar arasındaki ölçümleri karşılaştırırken bu parametre için kullanılan değer dikkate alınmalıdır. Burada kullanılan yaklaşımın bir sınırlaması, yalnızca çok daha düşük miktarlarda tek zincirli yağ asitleri ve mono-metil dallı zincirli yağ asitleri⁹ ile esas olarak palmitat olan FAS'ın doğrudan ürünlerinin analizi ile ilgili olmasıdır. Tüm yağ asitlerinin döteryumla zenginleştirilmesi tespit edilebilse de, burada kullanılan formül, etiketlenmemiş yağ asidinin alımına ve bu^67'nin uzamasına izin vermediğinden, C18:0 gibi daha uzun zincirli yağ asitlerinin sentezini belirlemek için uygun değildir. Benzer şekilde, desatürasyon oranları da hafife alınabilir.

Genel sınırlamalar
Yağ asitlerini ölçmek için_D2O'nunkullanılması, fizyolojik homeostazda DNL'nin önemi hakkında önemli bilgiler sağlamış olsa da, bu metodoloji ile ilişkili bir takım sınırlamalar vardır. İlk olarak, burada özetlenen zamanlamaya dayanarak, yeni sentezlenen yağ asitlerinin menşe dokusundan tamamen emin olmak mümkün değildir. Belirli bir dokunun DNL'den yağ asitleri ürettiği ve daha sonra bunların diğer dokulara taşındığı bir senaryo hayal etmek kolaydır. _D2Otedavisinden sonra yapılan ince zaman seyri deneyleri, yeni sentezlenen yağ asitleri için orijin dokusunun çözünürlüğünü artırabilir ve dokular arası kontaminasyonu azaltabilir. Temsili sonuçlar için kullanılan 3 günlük zaman noktası, hem termonötritede (akı daha düşük olduğunda) hem de oda sıcaklığında bir dizi yağ asidinde döteryum zenginleşmesini tespit etmek için tasarlanmıştır. Palmitatın birincil hedef olduğu D₂O uygulamasından sonra daha kısa zaman noktaları, dokular arası yağ asidi taşınmasını en aza indirir ve bu nedenle avantajlı olabilir. Çok daha kısa zaman noktaları (örneğin, 12 saat), soğuk koşullarda fareler düşünüldüğünde ve termonötralite deneysel tasarıma dahil edilmediğinde ideal olacaktır. İkincisi, bu yöntem yeni yağ asitlerinin menşe substratı hakkında bilgi sağlamaz. Belirli durumlarda kullanılan belirli alt tabakaların tanımlanması, DNL'nin düzenleyici haritasının tam olarak anlaşılması için gerekli olan ek bir bilgi katmanı olabilir. Bu, kararlı izotoplarla etiketlenmiş substratlarla yapılabilir.

Fayda -ları
Bu metodolojinin özel bir yararı, hayvanların prosedür sırasında kısıtlanmamış (ilk D₂O enjeksiyonu hariç) ve bilinçli olmaları, hayvanların doğal olarak davranması için düşük stresli bir ortamı teşvik etmesi, istenen ambulasyon ve gerekirse spesifik diyet tedavisine izin veren bir beslenme düzeni ve miktarı da dahil olmak üzere olmasıdır. D₂O'nun uygulanması da oldukça kolaydır. Diğer izleyicilerin sıvı çözeltilerinin aksine (örneğin, ¹³C-U-glikoz),_D2O, su tüketimini etkilemesi muhtemel belirgin lezzetli özelliklere sahip değildir. Kararlı izotop izleyicilerinin ötesinde, en yaygın kullanılan diğer yöntem radyoizotoplardır. Radyoizotopların potansiyel avantajı, tespit için ekipman seçimidir. Kararlı izotoplar için bir kütle spektrometresi gerekirken, radyoizotoplar daha kolay erişilebilen bir sintilasyon sayacı kullanılarak tespit edilebilir. Bununla birlikte, güvenlik ve etik sorunlar nedeniyle radyoizotoplarla ilişkili bir takım dezavantajlar vardır. Ek olarak, radyoizotop genellikle glikoz üzerindedir ve bu nedenle yalnızca DNL'deki değişiklikleri değil, glikozdan türetilen DNL'deki değişiklikleri yansıtır. Ek olarak, tek tek yağ asitlerinin sentezinin belirlenmesi mümkün değildir. _D2O, izotop etiketli spesifik substratlara kıyasla tüm dokularda daha hızlı dengelenir⁶⁸.

DNL, her biri gelişim, metabolizma ve hastalık durumlarını bağımsız olarak etkileyen bir dizi enzim ve transkripsiyon faktörü tarafından kontrol edilen metabolik homeostazın önemli bir bileşenidir. Bu nedenle, DNL, araştırma ve tedavi geliştirmede daha geniş bir şekilde sorgulanması gereken önemli bir metabolik yol olmaya mahkumdur. Bu protokol, DNL analizinin metabolik fenotiplemeye rutin olarak dahil edilmesinde ilk adım olarak kullanılabilir.

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yoktur.

Değerli tartışmalar için Sanchez-Gurmaches ve Wallace laboratuvar üyelerine teşekkür ederiz. Bu çalışma, Amerikan Kalp Derneği (18CDA34080527'den JSG'ye ve 19POST34380545'ten RM'ye), NIH (JSG'ye R21OD031907), CCHMC Mütevelli Ödülü, CCHMC Pediatrik Genomik Merkezi Ödülü ve CCHMC Mendel Genomik ve Terapötik Merkezi Ödülü'nden alınan hibelerle desteklenmiştir. Bu çalışma kısmen Cincinnati'deki Sindirim Hastalıkları Araştırma Çekirdek Merkezi'nin NIH P30 DK078392 tarafından desteklenmiştir. İçerik yalnızca yazarların sorumluluğundadır ve Ulusal Sağlık Enstitüleri'nin resmi görüşlerini temsil etmeyebilir. RT ve MW, UCD Ad Astra Bursu tarafından desteklendi.