Determinación cuantitativa de la síntesis de ácidos grasos de novo en tejido adiposo marrón mediante óxido de deuterio

Aquí, presentamos un método cuantitativo de bajo costo que utiliza óxido de deuterio y cromatografía de gases (GCMS) para el análisis de la lipogénesis total de novo de ácidos grasos en tejido adiposo marrón in vivo.

La síntesis de ácidos grasos es una vía metabólica compleja y altamente exigente en energía con importantes funciones en el control de la homeostasis metabólica de todo el cuerpo y otros procesos fisiológicos y patológicos. A diferencia de otras vías metabólicas clave, como la eliminación de glucosa, la síntesis de ácidos grasos no se evalúa funcionalmente de forma rutinaria, lo que lleva a interpretaciones incompletas del estado metabólico. Además, hay una falta de protocolos detallados disponibles públicamente adecuados para los recién llegados al campo. Aquí, describimos un método cuantitativo de bajo costo que utiliza óxido de deuterio y cromatografía de gases y espectrometría de masas (GCMS) para el análisis de la síntesis total de novo de ácidos grasos en tejido adiposo marrón in vivo. Este método mide la síntesis de los productos de la sintasa de ácidos grasos independientemente de una fuente de carbono, y es potencialmente útil para prácticamente cualquier tejido, en cualquier modelo de ratón y bajo cualquier perturbación externa. Se proporcionan detalles sobre la preparación de la muestra para GCMS y los cálculos posteriores. Nos centramos en el análisis de la grasa parda debido a sus altos niveles de síntesis de ácidos grasos de novo y su papel fundamental en el mantenimiento de la homeostasis metabólica.

La obesidad y las enfermedades metabólicas asociadas son una pandemia que pone en peligro a las generaciones presentes y futuras ^1,2. Comúnmente simplificada como consecuencia del desequilibrio entre la ingesta y el gasto energético, la desregulación metabólica asociada a la obesidad afecta a un gran número de vías metabólicas controladas por factores ambientales y endógenos³. Sin embargo, solo unas pocas vías se prueban de forma rutinaria en modelos animales de desregulación metabólica.

A modo de ejemplo, la eliminación de glucosa se mide de forma rutinaria mediante pruebas de tolerancia a la glucosa y a la insulina, probablemente debido a la simplicidad del uso de monitores portátiles de glucosa⁴. Las tasas relativas de glucosa en el cuerpo entero y de oxidación de lípidos también se estiman de forma rutinaria en función de la relación de intercambio respiratorio de los ensayos de calorimetría indirecta ^5,6. Sin embargo, la mayoría de todos los demás aspectos del metabolismo no se evalúan funcionalmente de forma rutinaria. Esto conduce a interpretaciones incompletas del estado metabólico y a la pérdida de opciones terapéuticas. Una de las principales vías de este tipo es la lipogénesis de novo.

La lipogénesis de novo (DNL) es el proceso mediante el cual se generan nuevos ácidos grasos a partir de precursores. Se considera que la glucosa es el principal precursor que contribuye a la DNL⁷ de todo el cuerpo, sin embargo, otros precursores, como el acetato, la fructosa, el lactato y los aminoácidos de cadena ramificada, han demostrado ser fuentes de carbono relevantes de manera espacial y dependiente de la condición 8,9,10,11,12. La DNL es un contribuyente clave a la homeostasis metabólica y es esencial para el desarrollo normal¹³. Además, las alteraciones en la DNL se han asociado con cáncer 14,15 y metabólico 16,17,18 y enfermedades cardiovasculares ^19,20.

La vía DNL está compuesta por los componentes enzimáticos centrales ATP citrato liasa (ACLY), acetil-CoA carboxilasa (ACC1/2) y ácidos grasos sintasa (FAS) que producen principalmente palmitato, un ácido graso saturado de 16 carbonos. Sin embargo, los ácidos grasos de cadena impar y cadena ramificada también se pueden producir a tasas más bajas⁹. Las elongasas y desaturasas modifican aún más estos ácidos grasos, creando una amplia gama de especies de ácidos grasos útiles para una variedad de funciones (por ejemplo, almacenamiento de energía a largo plazo y manipulación de la fluidez de la membrana).

La expresión de la maquinaria enzimática de DNL está controlada por un número reducido de factores de transcripción. Las más descritas hasta la fecha incluyen la familia de proteínas de unión a elementos reguladores de esteroles (SREBP), la proteína de unión a elementos de respuesta a carbohidratos (ChREBP) y el receptor X hepático (LXR)21,22,23,24,25,26. A pesar de una aparente superposición en sus funciones, se han descrito regulaciones individuales basadas en la dominancia del tipo celular y en condiciones fisiológicas o patológicas^21,22,27,28.

Sorprendentemente, una serie de inhibidores para pasos seleccionados de la vía DNL han sido aprobados para uso clínico o se encuentran en las etapas preclínicas o clínicas de desarrollo para una serie de enfermedades, incluida la obesidad, la enfermedad del hígado graso no alcohólico/esteatohepatitis no alcohólica (NAFLD/NASH) y las enfermedades cardiovasculares²⁹. Estos esfuerzos ponen de relieve la importancia de la DNL en la salud y la enfermedad.

En los últimos años, el empleo de métodos para evaluar cuantitativamente la síntesis de novo de ácidos grasos ha aumentado³⁰. El método más común para evaluar esto es el uso de agua marcada pesada (D₂O), donde el hidrógeno marcado pesado se incorpora a las cadenas de acilo durante la síntesis, tanto directa como indirectamente, a través del intercambio de deuterio con los hidrógenos de los sustratos DNL NAPDH, acetil-CoA y malonil-CoA. Aunque este enfoque está ganando popularidad, hay una falta de protocolos detallados disponibles públicamente adecuados para los recién llegados al campo. En este trabajo se describe un método para evaluar cuantitativamente la síntesis de novo de productos de FAS utilizando D₂O y espectrometría de masas por cromatografía de gases (GCMS), con cálculos desarrollados previamente por Lee et ^al.31. Este método mide la síntesis de ácidos grasos de novo independientemente de una fuente de carbono, y es potencialmente útil para prácticamente cualquier tejido, en cualquier modelo de ratón y bajo cualquier perturbación externa. Aquí, nos centramos en el análisis del tejido adiposo marrón (BAT) debido a sus altos niveles de DNL y su papel crítico en el mantenimiento de la homeostasis metabólica.

Todos los experimentos fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Centro Médico del Hospital Infantil de Cincinnati.

1. Preparación de D₂O

NOTA: Para evitar la variación experimental, prepare suficiente solución/agua potable para todos los ratones durante la duración del experimento.

1. Para inyección intraperitoneal: generar solución salina al 0,9% p/v D 2 O disolviendo 9 g de NaCl por litro de D 2 O. Filtrara través de un filtro no pirogénico de_0,2μm para esterilizar.
2. Para beber agua D2 O: generar un 8% v/v de agua enriquecida con D₂O-O para ser utilizada como agua potable mezclando 80 mL de_D2O por 920 mL de agua potable normal. Se puede obtener agua potable regular de la instalación de ratones. Filtrar a través de un filtro no pirogénico de 0,2 μm para esterilizar.

2. Modulación de la actividad MTD mediante la aclimatación a la temperatura

1. Separe los ratones para que haya dos ratones por jaula 2 semanas antes del inicio de la aclimatación a la temperatura. Cambie el suministro de agua a botellas de agua para que los ratones se adapten y mantengan todas las jaulas a 22 °C.
2. Prepare las cámaras ambientales del ratón 1 semana antes de comenzar la aclimatación a la temperatura ajustando las temperaturas adecuadas: 30 °C para la termoneutralidad, 22 °C para la temperatura ambiente y 18 °C para la exposición al frío.
3. Al comienzo de la aclimatación a la temperatura, reemplace las jaulas por otras nuevas sin enriquecimiento ambiental (para evitar nidos). Mueva las jaulas a sus respectivas temperaturas.
   NOTA: Las jaulas asignadas a termoneutralidad permanecerán a 30 °C durante 4 semanas. Las jaulas asignadas a temperatura ambiente permanecerán a 22 °C durante 4 semanas. Las jaulas asignadas a la exposición al frío se enfriarán progresivamente en un horario semanal: 18 °C durante la primera semana, 14 °C durante la segunda semana, 10 °C durante la tercera semana y 6 °C durante la cuarta semana.
4. Cambie las jaulas sucias semanalmente para todas las condiciones. Además, sustituya las botellas de comida y agua por otras nuevas preadaptadas a la temperatura adecuada durante al menos 24 h.
   NOTA: Tenga en cuenta las cantidades de comida que se agregan cada semana, especialmente para los ratones en el frío, ya que consumirán una cantidad significativamente mayor de comida en comparación con las condiciones normales. Proporcionar alimentos ad libitum.

3. Administración de D₂O

1. Inyectar a cada animal con solución salina D₂O al 0,9% p/v a 35 μL/g de peso corporal, 12 h-3 días antes de la recogida de tejido, mediante inyección intraperitoneal con una jeringa de 1 ml y una aguja de 26 G.
   NOTA: Consulte la sección de discusión para obtener más información sobre cómo seleccionar un tiempo de etiquetado adecuado.
2. Cambie las botellas de agua por botellas que contengan un 8% v/v de agua potable enriquecida con D₂O.

4. Recolección, procesamiento y almacenamiento de plasma y tejidos

1. Al final del experimento, sacrifique a los ratones utilizando metodologías aprobadas (por ejemplo, sobredosis de dióxido de carbono seguida de dislocación cervical).
   1. Use almohadillas calientes/frías u otros métodos para evitar cambios bruscos de temperatura antes de la eutanasia que puedan afectar los resultados. Sacrificar a los ratones siguiendo metodologías aprobadas. Proceda inmediatamente a la extracción de sangre y tejidos.
2. Recolectar sangre a través de una punción cardíaca con una aguja de 26 G y almacenarla en un tubo de extracción de sangre de ácido etilendiaminotetraacético. Mantenga la sangre en hielo hasta que se procese más.
3. Corta la piel a lo largo de la línea media de la parte posterior del ratón desde la zona inferior de la cavidad torácica hasta la zona superior del cuello, mientras tiras de la piel hacia arriba para evitar afectar a los tejidos que se encuentran debajo de la piel. El BAT interescapular se encuentra entre los omóplatos bajo una fina capa de tejido adiposo blanco, y está compuesto por dos lóbulos de forma piramidal.
   1. Limpie el pañuelo lavándolo con solución salina tamponada con fosfato (PBS) helada. Aplique una toalla de papel para eliminar el exceso de líquido, péselo en una báscula analítica y recolóquelo en un microtubo.
   2. Congele inmediatamente el tejido con nitrógeno líquido. También se pueden recoger otros depósitos de MTD.
4. Centrifugar las muestras de sangre a 10.000 x g durante 10 min a 4 °C. Después de la centrifugación, recoja cuidadosamente el plasma sin alterar el gránulo de glóbulos rojos. Transfiéralo a un nuevo microtubo helado y congélelo rápidamente en nitrógeno líquido.
5. Almacenar las muestras de grasa parda y plasma a -80 °C hasta su uso.

5. Extracción de lípidos del tejido adiposo

1. Antes de comenzar la extracción
   1. Prepare una solución de 1 mM de ácido hexadecenoico-d₃₁ en metanol en un vial de vidrio. Esto servirá como el estándar interno de ácidos grasos.
   2. Enfriar previamente la cantidad necesaria de cloroformo (CHCl 3) y metanol (CH₃OH) en un congelador a -80 °C o en hielo seco.
      NOTA: El antioxidante di-terc-butil-4-metilfenol (BHT) puede añadirse al CHCl₃ a una concentración de 0,01% p/v (2,5 mg/25 ml) para evitar la oxidación de los dobles enlaces en los ácidos grasos insaturados.
   3. Etiquete previamente los tubos de microcentrífuga para cada muestra de tejido y un tubo adicional que se utilizará para una extracción en blanco.
      PRECAUCIÓN: El CH 3OH y el CHCl₃ son altamente volátiles y tóxicos si se inhalan. Úselo solo en campanas extractoras.
      NOTA: Las diferentes marcas de tubos de microcentrífuga tienen diferentes niveles de palmitato de fondo y capacidades en términos de prevención de fugas de solvente. Recomendamos que primero se analicen una variedad de tubos, para garantizar que se eviten fugas de solventes y que los tubos tengan niveles mínimos de palmitato contaminante. Véase Yao et ^al.32 para una discusión más detallada.
2. Saque las muestras del congelador y colóquelas sobre hielo seco.
3. Coloque el tubo de microcentrífuga preetiquetado en una balanza analítica y tara la balanza. Coloque unas pinzas y una hoja de afeitar de bisturí o acero sobre hielo seco durante 10-20 segundos para que se enfríe.
   1. Use las pinzas para sacar la muestra de tejido congelado del tubo y colocarla en un bote de pesaje de plástico. El bote de pesaje se puede colocar sobre un bloque plano de hielo seco u otra superficie preenfriada.
   2. Con el bisturí o la hoja de afeitar de acero, diseccione una pequeña porción del tejido, equivalente a 5-15 mg de peso. Coloque en el tubo de microcentrífuga y registre el peso exacto. Repita para cada espécimen. Las muestras se pueden almacenar en el congelador en este punto o se pueden avanzar a los pasos a continuación para la extracción de lípidos.
      NOTA: Asegúrese de que el bisturí se limpie adecuadamente con etanol al 70% entre las muestras y que se utilice un bote de pesaje nuevo entre cada muestra.
4. Añadir 1 μL/mg de 10 mM de ácido hexadecenoico-d 31(C16:0-d₃₁) a cada muestra.
   PRECAUCIÓN: Los siguientes pasos (5.4 a 5.8) deben llevarse a cabo bajo una campana extractora debido al riesgo de inhalación de los disolventes.
5. Añadir 250 μL de CH 3 OH,250 μL de_H2O y 500 μL de_{CHCl 3} a cada muestra con tres perlas de acero inoxidable de 5 mm. Coloque los tubos en un bloque preenfriado de un molino de molienda y mezcle las muestras a una frecuencia vibratoria de 25 Hz durante 5 minutos, o utilice las pautas recomendadas por el fabricante para las muestras de tejido. Retire las cuentas con un imán.
6. Centrifugar las muestras a 12.000 x g durante 10 min a 4 °C.
   NOTA: Después de la centrifugación, debe observarse una clara separación bifásica con la fase acuosa superior que contiene metabolitos polares y la fase orgánica inferior que contiene lípidos y ácidos grasos. Si no se observa ninguna separación, añadir 250 μL de_H2O y repetir los pasos de vórtice y centrifugación.
7. Con una micropipeta, tome un volumen fijo de la fase inferior de cada muestra en tubos de microcentrífuga marcados correspondientemente.
8. Añadir 500 μL de CHCl₃ a la muestra restante y repetir los pasos 5.6-5.7.
9. Coloque las muestras bajo gas nitrógeno o en un vacío centrífugo refrigerado resistente a CHCl₃ a 4 °C hasta que estén completamente secas. Las muestras secas pueden almacenarse a -20 °C hasta que estén listas para la derivatización.
   NOTA: La capa superior de cada muestra también puede recogerse en este punto y secarse como en el paso 5.9 para analizar los metabolitos polares.

6. Preparación de ésteres metílicos de ácidos grasos (FAME) y análisis GCMS

1. Esterificación y transesterificación catalizadas por ácido para preparar FAME
   PRECAUCIÓN: Los siguientes pasos deben llevarse a cabo bajo una campana extractora debido al riesgo de inhalación de los disolventes.
   1. Si las muestras se han almacenado en el congelador, séquelas con nitrógeno durante 5 minutos para asegurarse de que no haya agua.
   2. Con disolventes de grado MS, pipetee 98 ml de CH₃OH anhidro en un frasco de vidrio para medios. Agregue lentamente 2 ml de ácido sulfúrico anhidro en la campana extractora para producir 2% H₂SO₄ en CH₃OH. Mezcle girando la botella cerrada.
   3. Añadir 500 μL de solución de H 2 SO₄ al₂% en solución de CH₃OH a cada muestra y vórtice brevemente.
   4. Incubar las muestras en un bloque térmico a 50 °C durante 2 h.
   5. Retire las muestras del bloque térmico y agregue 100 μL de solución saturada de NaCl y 500 μL de hexano a cada muestra.
   6. Agite vigorosamente las muestras a temperatura ambiente durante 1 min. Deje reposar las muestras durante 1 minuto; Dos fases deberían ser evidentes después de esto.
   7. Recoger la fase superior en un tubo de microcentrífuga nuevo (véase la nota de la sección 5.1.3 para la selección adecuada del tubo de microcentrífuga).
   8. Para maximizar el rendimiento, repita los pasos 6.1.5-6.1.7, recogiendo la segunda muestra en los mismos tubos etiquetados.
   9. Secar las muestras a temperatura ambiente bajo nitrógeno gaseoso.
   10. Vuelva a suspender las muestras en 20 μL/mg de hexano, en relación con el peso original del tejido, y transfiéralas inmediatamente a un vial de vidrio GC con un inserto de vidrio.
       NOTA: Trabaje rápidamente mientras transfiere muestras para minimizar la evaporación.
2. Análisis GCMS
   1. Para determinar la abundancia de isótopos FAME, inyecte las muestras en un espectrómetro de masas de cromatografía de gases de un solo cuadrupolo (GCMS).
      NOTA: Si bien se pueden usar muchos tipos de columnas para detectar palmitato, se estableció el siguiente programa de temperatura para una columna GCMS que se ha desarrollado para la separación de isómeros cis/trans de ácidos grasos, como se detalla en la Tabla de materiales. Esta columna tiene una longitud de 50 m con un diámetro interior de 0,25 mm.
   2. Inyectar 1 μL de muestra en una entrada dividida/no dividida a una temperatura de entrada de 270 °C, utilizando helio como gas portador, fluyendo a 1 mL/min. Utilice una inyección sin división para ácidos grasos de baja abundancia con un flujo total de 19 ml/min, una purga septal de 3 ml/min y un flujo de purga a ventilación dividida de 15 ml/min a 0,75 min. Utilice una proporción dividida de 10:1-40:1 para ácidos grasos de alta abundancia como palmitato y oleato.
   3. Utilice los siguientes parámetros del horno: una temperatura inicial de 80 °C; incrementar en incrementos de 20 °C/min hasta 170 °C; aumentar en incrementos de 1 °C/min hasta 204 °C; aumentar en incrementos de 20 °C/min hasta 250 °C; y luego mantener a 250 °C durante 10 min.
   4. Utilice los siguientes parámetros del detector selectivo de masas (MSD): un modo de ionización por impacto de electrones de 70 eV y escanee en el rango de 50-400 m/z con una velocidad de escaneo de 1.562 (u/s) y una frecuencia de 4,1 escaneos/s. Utilice una línea de transferencia a 280 °C, una fuente de iones a 230 °C y un cuadrupolo a 150 °C.
      NOTA: Se pueden usar otras columnas, pero el programa de temperatura variará.
   5. Secuencia de la muestra: Aleatorice el orden de la muestra de inyección e inyecte al menos dos o tres blancos de hexano al principio de la secuencia, después de cada quinta muestra dentro de la secuencia, y dos o tres al final de la secuencia.
   6. Utilice un software específico del instrumento, o un software gratuito de acceso abierto como Metabolite-Detector³³, para integrar los iones de la Tabla 1 para cada éster metílico de ácidos grasos.
      NOTA: Hemos descrito los iones que cubren los isótopos M1-M5 en la Tabla 1 que hemos encontrado que cubren la cantidad de incorporación de deuterio con esta ventana de etiquetado. Sin embargo, es posible que sea necesario ampliarlo si el flujo de novo es significativamente mayor y/o se utiliza un tiempo de etiquetado más largo.
   7. Utilice la abundancia de cada ion integrado para generar una distribución de isótopos de masa, donde las intensidades de iones se pueden convertir en abundancia fraccionaria de modo que la suma de la distribución de isótopos de masa sea igual a uno. Consulte la hoja de cálculo de ejemplo en el archivo complementario.
      NOTA: Para determinar con precisión la incorporación de deuterio, se debe emplear la corrección de la abundancia de isótopos naturales para tener en cuenta la presencia de isótopos naturales como ¹³C, ¹⁵N y ²H. Esto se realiza mediante la aplicación de una matriz de corrección como la descrita por Fernández et al.34,35^, y no se puede realizar restando la MID de un metabolito medido no marcado de un metabolito marcado. En la práctica, recomendamos el uso de software de libre acceso como fluxfix³⁶, polyMID³⁷ o IsoCor³⁸ para convertir los datos brutos en MID fraccionarios, y hemos proporcionado la fórmula para la corrección de isótopos para los productos de éster metílico de FAS en la Tabla 1.
   8. Para determinar la cantidad de palmitato presente, utilice la siguiente fórmula:
       
      donde el recuento de iones se refiere a la suma de todos los isótopos palmitatos integrados en la Tabla 1 y C16:0-d 31 se refiere al patrón interno hexadecenoico-d₃₁. El patrón interno forma un pico separado al del palmitato endógeno. También se puede determinar la abundancia relativa de otros ácidos grasos, pero puede ser necesario emplear patrones internos de isótopos específicos de ácidos grasos (con desplazamientos de masa mayores que los observados a partir de la incorporación de_D2O) o curvas estándar externas para una cuantificación completa. Utilice la muestra extraída en blanco para determinar la cantidad de palmitato de fondo y restarla del valor final del tejido.
   9. Calcule el enriquecimiento molar (EM) del palmitato mediante la siguiente ecuación:
      
      donde M_i es la abundancia fraccionaria normalizada de un isótopo palmitado, y n es el número de posibles isótopos palmitados. Por ejemplo, la EM de una molécula de palmitato con la siguiente distribución fraccionaria, M1 = 0,25, M2 = 0,08, M3 = 0,02, es: (0,025*1) + (0,08*2) + (0,02*3) = 0,245 (Ver Archivo Suplementario).

7. Intercambio de acetona de deuterio de muestras de plasma para determinar el enriquecimiento de agua corporal

1. Reacción
   1. Prepare 10 patrones de deuterio en agua, que van desde 0-9% v/v.
   2. Preparar una solución de acetona/acetonitrilo al 5 % v/v que permita 4 μl por muestra, incluidos los patrones del paso 5.1.1.
   3. En tubos de microcentrífuga marcados y con cierre seguro, combine 10 μl de cada muestra de plasma o patrón, 4 μl de NaOH 10 M y 4 μl de acetona/acetonitrilo al 5 %. Realice esto por triplicado para cada muestra.
   4. Mezcle las muestras suavemente pipeteando. Deje que las muestras se incuben a temperatura ambiente durante la noche.
2. Extracción
   1. Después de la incubación, añadir 450-550 mg de Na₂SO₄ a cada muestra.
   2. En la campana extractora, añadir 600 μL de CHCl₃ a cada tubo y vórtice vigorosamente durante 15 s.
   3. Centrifugar las muestras a 300 x g durante 2 min.
   4. Bajo una campana extractora, transfiera por triplicado 80 μL de alícuotas del sobrenadante de cada muestra a viales de vidrio GCMS etiquetados con insertos de vidrio y tapa hermética.
3. Análisis GCMS
   1. Separe las muestras en una columna (30 m, 0,25 mm de diámetro interior, Agilent DB-35MS) y analícelas en el espectrómetro de masas adjunto.
      1. Inyectar 1 μL de muestra en una entrada dividida/no dividida, con una relación de división de 40:1, un flujo de helio de 1 mL/min y una temperatura de entrada de 270 °C.
      2. Utilice los siguientes parámetros del horno: una temperatura inicial de 60 °C, aumente en incrementos de 20 °C/min hasta 100 °C, aumente en incrementos de 50 °C/min hasta 220 °C y, a continuación, manténgalo a 220 °C durante 1 min.
      3. Utilice los siguientes parámetros del detector selectivo de masas (MSD): modo de ionización por impacto de electrones a 70 eV con monitoreo de iones seleccionados de 58 y 59 m/z. Utilice una línea de transferencia a 280 °C, una fuente de iones a 230 °C y un cuadrupolo a 150 °C.
         NOTA: Se pueden usar otras columnas de polaridad media, de bajo sangrado, adheridas, reticuladas, pero el programa de temperatura variará.
   2. Configure el método del muestreador de líquidos para que comience con un lavado CHCl 3 y luego una secuencia aleatoria de las muestras, incluidos pasos adicionales de lavado CHCl₃ cada seis muestras.
      NOTA: Si se usa acetona como lavado con aguja para el muestreador automático, reemplácelo con CHCl 3 o hexano e inyecte varias muestras de CHCl₃ en blanco hasta que ya no sea evidente ningún pico de acetona contaminante en el cromatograma.
   3. Con este método, un pico de acetona eluye alrededor de 1,25 min. Integre los datos y calcule la abundancia fraccionaria de enriquecimiento de acetona siguiendo los pasos 6.2.6-6.2.7, con un ajuste para analizar los picos que contienen una relación m/z de 58-60 como se indica en la Tabla 1.
   4. Utilice los patrones para generar una curva estándar para determinar el porcentaje de enriquecimiento de agua corporal (p) de las muestras de prueba, basado en el enriquecimiento fraccionado de acetona.

8. Cálculos de lipogénesis in vivo de novo

1. Calcule la fracción de ácidos grasos recién sintetizados (FNS) que son productos directos de FAS (es decir, palmitato, ácidos grasos de cadena impar y mmBCFA) en cada muestra con la siguiente ecuación:
   
   donde ME es el enriquecimiento molar medio de una molécula de palmitato (paso 6.2.9), p es el enriquecimiento de deuterio en agua de la muestra de plasma correspondiente (paso 7.3.4) y N es el número de átomos de hidrógeno intercambiables en el palmitato en el que se puede incorporar un deuterio.
2. Determine N utilizando la siguiente ecuación establecida por Lee et ^al.31:
   
3. Determinar la cantidad molar de ácidos grasos recién sintetizados (MNS) mediante:
   MNS = FNS x cantidad total de ácidos grasos (nmol/mg tisular).
   NOTA: Por ejemplo, si se obtiene un enriquecimiento molar de palmitato (EM) de 0,245, un enriquecimiento de deuterio en agua corporal (p) de 0,045 y un número N calculado de 22, la síntesis fraccional de palmitato es de 0,247. Si la cantidad de palmitato presente en el tejido es de 2 mmol/mg, entonces el mmol del palmitato recién sintetizado es de 0,494 mmol/mg (ver Ficha Suplementaria).

Basándonos en la dosificación de_D2O descrita en el paso 1, normalmente encontramos que el agua corporal está enriquecida en el rango del 2,5% al 6%, y que un nivel basal de enriquecimiento de deuterio en el agua corporal se alcanza rápidamente en 1 h y se mantiene durante la duración del estudio a través del agua potable enriquecida al 8% (Figura 1). El enriquecimiento continuo de agua corporal en estado estacionario es una suposición de los cálculos utilizados en el paso 6, por lo que recomendamos la validación experimental de la cinética del enriquecimiento de agua corporal en nuevos modelos experimentales.

Hemos encontrado que la cantidad de ácidos grasos sintetizados de novo aumenta a temperatura ambiente, en relación con los de termoneutralidad en MTD (Figura 2). La distribución isotópica de masas del palmitato en MTD de ratones a termoneutralidad y temperatura ambiente después de 3 días de administración de D2O muestra un mayor enriquecimiento de deuterio M1 y_M2a temperatura ambiente (Figura 2A). Este enriquecimiento a temperaturas más frías no solo se produce en el palmitato, sino también en una amplia gama de ácidos grasos en las MTD (figura 2B). La abundancia total de palmitato también aumenta en BAT de ratones a temperatura ambiente, y combinando la tasa de síntesis fraccional con los niveles totales de palmitato, encontramos que la síntesis total de palmitato aumentó en ratones a temperatura ambiente (Figura 2C, D). En particular, el enriquecimiento plasmático de ácidos grasos totales no sigue la misma tendencia que el de las MTD, sino que aumenta con la termoneutralidad (Figura 2E). La absorción potencial deconvolutada de la síntesis endógena no es posible con un enfoque de punto temporal único D₂O, como se describe aquí, pero estas tendencias opuestas indican que el patrón de enriquecimiento de ácidos grasos en las MTD no está siendo impulsado por la absorción de ácidos grasos.

Figura 1: Porcentaje de enriquecimiento de D2-O en plasma de ratones en múltiples puntos de tiempo, después de la inyección con 0,035 ml/g de peso corporal 0,9% de NaCl_D2O yla sustitución del agua potable con agua enriquecida con 8% de_D2O. Los gráficos de barras representan la media ± DE. n = 9. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Resultados representativos en el tejido adiposo marrón de ratones después de 3 días de administración de_D2O. (A) Distribución isotópica masiva de palmitato en MTD después de 3 días de administración de_D2Oa temperatura ambiente (RT) y termoneutralidad (TN). (B) Enriquecimiento molar de MTD de una serie de ácidos grasos después de 3 días de administración de_D2Oa temperatura ambiente y termoneutralidad. (C) Abundancia total y (D) palmitato sintetizado de novo en tejido adiposo marrón después de 3 días de administración de_D2Oa temperatura ambiente y termoneutralidad. (E) Enriquecimiento molar plasmático de una variedad de ácidos grasos después de 3 días de administración de_D2Oa temperatura ambiente y termoneutralidad. Los gráficos de barras representan la media ± DE. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. n = 6. El análisis estadístico se determinó mediante la prueba t de dos colas de Student. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: Iones de fragmentos compuestos GCMS a integrar. Esta tabla cubre una gama de ácidos grasos producidos por la sintasa de ácidos grasos de mamíferos, pero C16:0 es el producto principal. Todos los tiempos de retención son para el método GCMS detallado en el paso 6, excepto la acetona, que se detalla en el paso 7.

Archivo complementario: Ejemplo de cálculo de hoja de cálculo. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Comprender el equilibrio y la interacción entre vías metabólicas complejas es un paso indispensable hacia la comprensión de las bases biológicas de las enfermedades relacionadas con el metabolismo. Aquí, mostramos una metodología no invasiva y económica para determinar los cambios en la síntesis de novo de ácidos grasos. Este método es una adaptación de métodos publicados anteriormente que desarrollaron cálculos para estimar el flujo de síntesis de novo a partir del enriquecimiento de deuterio de ácidos grasos 31 y para utilizar el intercambio deuterio-acetona para determinar el porcentaje relativo de D₂O en el agua corporal³⁹. En los últimos años, hemos tomado el método aquí descrito y lo hemos aplicado para descubrir cambios en la síntesis de diversos ácidos grasos en depósitos adiposos, el cerebro, el hígado y los tumores ^9,22,40. Hay una serie de pasos críticos y aspectos modificables de este protocolo. Estos están relacionados con el diseño experimental general, así como con el enfoque analítico y los cálculos utilizados en este método. También se utilizan ampliamente enfoques alternativos para calcular la síntesis de ácidos grasos de novo a partir de trazadores de isótopos estables. Estos incluyen el enfoque de análisis de distribución de isótopos de masa alternativa (MIDA) desarrollado por Hellerstein et al.41,42, el análisis espectral de isótopos (ISA) desarrollado por Kelleher et al.43,44 y enfoques más nuevos que se han desarrollado para modelar la síntesis de ácidos grasos de cadena más larga^, como el análisis de fuentes de ácidos grasos (FASA)⁴⁵. La ventaja del método aquí es que se puede implementar fácilmente con un software disponible gratuitamente y el uso de una hoja de cálculo. Sin embargo, está limitado por la necesidad de que el enriquecimiento de agua corporal (BWE) se encuentre en un estado estacionario, advertencias asociadas con la utilización del parámetro N (discutido más adelante) y que solo es aplicable a productos directos de FAS que es principalmente palmitato.

Grasa parda DNL y aclimatación a la temperatura
La DNL se ha convertido en un nódulo principal de la regulación metabólica de todo el cuerpo y es esencial para el desarrollo normal^13,29. La deleción dirigida al tejido y el análisis metabolómico han identificado varios actores enzimáticos y transcripcionales clave que controlan el DNL en el tejido adiposo, y cómo controla la acumulación de grasa en todo el cuerpo y la homeostasis metabólica normal 21,28,46,47,48,49. Aunque menos apreciado, BAT es un tejido altamente activo en DNL, con una mayor expresión de la maquinaria enzimática DNL del cuerpo central (acly, acaca, fasn) que la mayoría de los otros tejidos y una mayor actividad lipogénica 22,50,51,52,53,54,55. Sin embargo, la MTD es única, en el sentido de que la aclimatación a temperaturas subtermoneutras induce simultáneamente la actividad de oxidación de DNL y ácidos grasos en la MTD 22,54,56. Aunque los mecanismos asociados no están del todo claros, se acepta que la MTD es un sumidero metabólico de nutrientes, incluidos los destinados a la DNL para la síntesis de lípidos, que son esenciales para la actividad normal de la MTD^53,55. Por lo tanto, es pertinente poder contabilizar todos los ingresos y resultados metabólicos de las MTD para evaluar sus niveles de actividad. Sin embargo, la DNL generalmente solo se mide en función de la expresión génica y se evalúa funcionalmente en ocasiones contadas. El protocolo aquí propuesto permite la evaluación funcional de la DNL, lo que permite una interpretación más completa del estado metabólico.

D₂Medición de la dosis, el momento y el enriquecimiento del agua corporal
Uno de los principales pasos críticos en el diseño es la dosis y el momento de la administración de_D2O. En este protocolo, empleamos un enfoque de dosis y administración (inyección en bolo seguida de enriquecimiento en agua potable) que, según hemos encontrado, conduce a un rápido logro y mantenimiento de BWE en estado estacionario. Los cálculos utilizados para determinar la síntesis de ácidos grasos se basan en la suposición de BWE en estado estacionario; Por lo tanto, es crucial que esto se valide en nuevos modelos experimentales. Si el enriquecimiento en estado estacionario no es posible debido a problemas con el uso de este enfoque de dosificación combinada, se remite al lector a otras publicaciones donde las alteraciones en los cálculos lo permitan³⁹. El grado de variación del estado estacionario que se puede tolerar, cuando se emplea un enfoque de dosificación que apunta a un rápido logro de esto, depende de muchos factores. Si BWE aumenta en picos sostenidos por encima del valor utilizado para el cálculo, entonces, al usar el enfoque aquí, DNL se sobrestimará. Si el BWE es significativamente más bajo que el valor utilizado para el cálculo durante períodos de tiempo sostenidos, el DNL se subestimará. Si bien se espera una ligera variación en torno a la media, el factor más crítico es que la BWE no varía más en un grupo experimental que en el otro, lo que podría dar lugar a que las diferencias en el DNL calculado sean impulsadas por la variación en la BWE. Si ambos grupos experimentales muestran alguna variación leve pero similar a lo largo del tiempo, la tolerancia de esta dependerá de la exactitud y precisión con la que el investigador requiera que se realice la medición, así como de las diferencias esperadas entre los grupos experimentales. Por ejemplo, en el caso del tejido adiposo marrón expuesto a la termoneutralidad frente a la temperatura ambiente, que se proporcionó como ejemplo aquí, la diferencia en la cantidad de ácido graso sintetizado de novo presente es superior al 50%; por lo tanto, es poco probable que pequeñas variaciones en BWE oscurezcan los resultados.

Además de la consideración del estado estacionario, otro aspecto modificable de este protocolo es el nivel de BWE. El aumento de BWE permite potencialmente una mayor transferencia de etiquetas a los ácidos grasos y, por lo tanto, los grupos de ácidos grasos con menor rotación pueden ser más fácilmente detectables en un período de tiempo más corto. Esto podría ser una ventaja en situaciones en las que el investigador está interesado en las respuestas agudas en la DNL. Sin embargo, el aumento de los niveles de_D2Oen el agua corporal puede causar efectos fisiológicos no deseados, por lo que se debe tener precaución⁵⁷. La administración de niveles más bajos de D2-O para alcanzar los niveles de BWE, típicamente alrededor del 0,5%, se emplea comúnmente en estudios en humanos debido al costo asociado con la administración de_D2-O. En este caso, pueden ser necesarios métodos con mayor sensibilidad para cuantificar el BWE y el enriquecimiento de ácidos grasos. En el caso de BWE, esto puede lograrse mediante espectrometría de masas de relación iónica⁵⁸ o un protocolo de intercambio de acetona modificado⁵⁹. Para el análisis de ácidos grasos, se ha demostrado recientemente que el uso de un instrumento GCMS de alta resolución aumenta la sensibilidad de la medición de deuterio en ácidos grasos y, por lo tanto, permite la cuantificación de DNL después de períodos de tiempo muy cortos y/o BWE⁶⁰ bajo. También se pueden utilizar métodos alternativos para aumentar el rendimiento con el que se mide BWE, utilizando análisis de espacio de cabeza de la acetona generada en el paso 7.1.5 en lugar de extraerla con CHCl3 y realizar la inyección de líquido. Esto disminuye el tiempo de ejecución del método y evita múltiples pasos de transferencia, lo que reduce el tiempo de preparación de la muestra. Si se dispone de acceso a un inyector de espacio de cabeza, se recomienda encarecidamente este método⁶¹.

Elección del grupo de ácidos grasos para cuantificar y enfoque analítico
En este protocolo, el método está diseñado para medir la reserva total de ácidos grasos en el tejido o plasma, independientemente de la clase lipídica. Sin embargo, las clases de lípidos pueden separarse antes de la generación de FAME, a través de métodos como la cromatografía en capa fina o la cromatografía líquida. Además, cuando se analizan suero o plasma, se pueden aislar lípidos de fracciones específicas de lipoproteínas, como las lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL), mediante ultracentrifugación⁵⁸. Este método se emplea comúnmente en estudios en humanos para determinar la DNL hepática, que es probable que sea la fuente principal de ácidos grasos de novo en VLDL. El protocolo de extracción y derivatización de lípidos también puede modificarse para mejorar el aislamiento de clases específicas⁶². Por último, el enriquecimiento de deuterio de hidrógenos lipídicos también puede medirse mediante espectroscopia de RMN ²H en lugar de espectrometría de masas. Aunque este método es menos sensible que la EM y, por lo tanto, requiere más material, su ventaja es que proporciona información de enriquecimiento posicional, que se puede utilizar para estimar mejor las tasas de elongación y desaturación⁶³.

Cálculo
Los cálculos de este protocolo se basan en cálculos previos que tienen en cuenta el BWE en estado estacionario, el enriquecimiento de ácidos grasos y el número de hidrógenos intercambiables en los ácidos grasos³¹. Al igual que con cualquier cálculo, hay una serie de limitaciones y supuestos que deben tenerse en cuenta al aplicar e interpretar los resultados de este enfoque. Una de las consideraciones principales es el valor utilizado para N en la sección 8 del método. Durante la síntesis de ácidos grasos, ²H de_D2Ose incorporan a la cadena de acilo, así como indirectamente a través del intercambio con hidrógenos en NADPH, acetil-CoA y malonil-CoA^64,65. Estudios previos han demostrado que este intercambio es incompleto ^31,66; por lo tanto, el cálculo incorpora un factor de corrección (N) para tener en cuenta este⁶⁵. Un N de 22 se usa comúnmente para muchos estudios, ya que previamente se ha encontrado que esto es apropiado para una variedad de tejidos utilizando la ecuación descrita en el paso 6^31,66. Sin embargo, esto puede variar en función de la perturbación experimental y del modelo animal⁶⁵; Por lo tanto, instamos a los investigadores a que tengan esto en cuenta. Un N más bajo aumenta el flujo total de síntesis, y el valor empleado para este parámetro debe tenerse en cuenta al comparar las mediciones entre estudios o laboratorios. Una limitación del enfoque utilizado aquí es que solo es relevante para el análisis de productos directos de FAS, que es principalmente palmitato, con cantidades mucho más bajas de ácidos grasos de cadena impar y ácidos grasos de cadena ramificada mono-metilo⁹. Aunque se puede detectar el enriquecimiento de deuterio de todos los ácidos grasos, la fórmula utilizada aquí no es apropiada para determinar la síntesis de ácidos grasos de cadena más larga, como C18:0, ya que no permite la absorción de ácidos grasos no marcados y la elongación de estos⁶⁷. Del mismo modo, las tasas de desaturación también pueden estar subestimadas.

Limitaciones generales
Aunque el uso de_D2Opara medir los ácidos grasos ha generado una visión crucial de la importancia de la DNL en la homeostasis fisiológica, existen una serie de limitaciones asociadas con esta metodología. En primer lugar, sobre la base del tiempo descrito aquí, no es posible confiar completamente en el tejido de origen de los ácidos grasos recién sintetizados. Es fácil imaginar un escenario en el que un determinado tejido genera ácidos grasos a partir de DNL, y luego estos son transportados a otros tejidos. Los experimentos de curso de tiempo fino después del tratamiento con_D2O podrían aumentar la resolución del tejido de origen de los ácidos grasos recién sintetizados, disminuyendo la contaminación entre tejidos. El punto de tiempo de 3 días que se utilizó para los resultados representativos se diseñó para detectar el enriquecimiento de deuterio en una variedad de ácidos grasos tanto en termoneutralidad (cuando el flujo es menor) como a temperatura ambiente. Los puntos de tiempo más cortos después de la administración de_D2O, donde el palmitato es el objetivo principal, minimizan el transporte de ácidos grasos entre tejidos y, por lo tanto, pueden ser ventajosos. Puntos de tiempo mucho más cortos (por ejemplo, 12 h) serían ideales cuando se consideran ratones en condiciones frías y cuando la termoneutralidad no está incluida en el diseño experimental. En segundo lugar, este método no proporciona información sobre el sustrato de origen de los nuevos ácidos grasos. La identificación de los sustratos específicos utilizados en circunstancias particulares puede ser una capa adicional de información necesaria para la plena comprensión del mapa regulatorio de DNL. Esto se puede hacer con sustratos marcados con isótopos estables.

Beneficios
Un beneficio particular de esta metodología es que los animales no están sujetos (excepto por la inyección inicial de_D2O) y están conscientes durante el procedimiento, lo que promueve un entorno de bajo estrés para que los animales se comporten de forma natural, incluida la deambulación deseada y un patrón y cantidad de alimentación que permita un tratamiento dietético específico si es necesario. D₂O también es muy fácil de administrar. A diferencia de las soluciones líquidas de otros trazadores (por ejemplo, ¹³C-U-glucosa), la_D2Ono tiene características palatables distintivas que puedan afectar el consumo de agua. Más allá de los trazadores de isótopos estables, el otro método más utilizado son los radioisótopos. La ventaja potencial de los radioisótopos es la elección del equipo para la detección. Se requiere un espectrómetro de masas para los isótopos estables, mientras que los radioisótopos se pueden detectar utilizando un contador de centelleo, que puede ser más fácilmente accesible. Sin embargo, hay una serie de desventajas asociadas con los radioisótopos debido a cuestiones éticas y de seguridad. Además, el radioisótopo se encuentra generalmente en la glucosa y, por lo tanto, no refleja únicamente los cambios en la DNL, sino más bien los cambios en la DNL derivada de la glucosa. Además, no es posible determinar la síntesis de ácidos grasos individuales. El D₂O se equilibra más rápidamente en todos los tejidos en comparación con sustratos específicos con marcadores isotópicos⁶⁸.

La DNL es un componente clave de la homeostasis metabólica controlada por una serie de enzimas y factores de transcripción que afectan de forma independiente al desarrollo, el metabolismo y los estados de enfermedad. Por lo tanto, la DNL está destinada a ser una vía metabólica importante, que deberá ser examinada de manera más amplia en la investigación y el desarrollo de terapias. Este protocolo puede utilizarse como un primer paso adelante en la incorporación rutinaria del análisis de DNL en el fenotipado metabólico.

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecemos a los miembros del laboratorio Sanchez-Gurmaches y Wallace por sus valiosas discusiones. Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la Asociación Americana del Corazón (18CDA34080527 a JSG y 19POST34380545 a RM), los NIH (R21OD031907 a JSG), un Premio del Consejo de Administración del CCHMC, un Premio del Centro de Genómica Pediátrica del CCHMC y un Premio del Centro de Genómica y Terapéutica Mendeliana del CCHMC. Este trabajo fue financiado en parte por el DK078392 P30 de los NIH del Centro Central de Investigación de Enfermedades Digestivas en Cincinnati. El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente los puntos de vista oficiales de los Institutos Nacionales de Salud. RT y MW contaron con el apoyo de una beca UCD Ad Astra.