Détermination quantitative de la synthèse d’acides gras de novo dans le tissu adipeux brun à l’aide d’oxyde de deutérium

Nous présentons ici une méthode quantitative peu coûteuse utilisant l’oxyde de deutérium et la chromatographie en phase gazeuse par spectrométrie de masse (GCMS) pour l’analyse de la lipogenèse de novo des acides gras totaux dans le tissu adipeux brun in vivo.

La synthèse des acides gras est une voie métabolique complexe et très énergivore qui joue un rôle fonctionnel important dans le contrôle de l’homéostasie métabolique du corps entier et d’autres processus physiologiques et pathologiques. Contrairement à d’autres voies métaboliques clés, telles que l’élimination du glucose, la synthèse des acides gras n’est pas systématiquement évaluée fonctionnellement, ce qui conduit à des interprétations incomplètes de l’état métabolique. De plus, il n’existe pas de protocoles détaillés accessibles au public et adaptés aux nouveaux arrivants dans le domaine. Nous décrivons ici une méthode quantitative peu coûteuse utilisant l’oxyde de deutérium et la chromatographie en phase gazeuse par spectrométrie de masse (GCMS) pour l’analyse de la synthèse de novo d’acides gras totaux dans le tissu adipeux brun in vivo. Cette méthode mesure la synthèse des produits de la synthase d’acide gras indépendamment d’une source de carbone, et elle est potentiellement utile pour pratiquement tous les tissus, dans n’importe quel modèle de souris, et sous n’importe quelle perturbation externe. Des détails sur la préparation de l’échantillon pour le SMGC et les calculs en aval sont fournis. Nous nous concentrons sur l’analyse de la graisse brune en raison de ses niveaux élevés de synthèse d’acides gras de novo et de son rôle essentiel dans le maintien de l’homéostasie métabolique.

L’obésité et les maladies métaboliques associées sont une pandémie qui met en danger les générations actuelles et futures ^1,2. Communément simplifié comme la conséquence du déséquilibre entre l’apport et la dépense énergétique, le dérèglement métabolique associé à l’obésité affecte un grand nombre de voies métaboliques contrôlées par des facteurs environnementaux et^endogènes3. Cependant, seules quelques voies sont systématiquement testées dans des modèles animaux de dérégulation métabolique.

À titre d’exemple, l’élimination du glucose est régulièrement mesurée par des tests de tolérance au glucose et à l’insuline, probablement en raison de la simplicité d’utilisation des glucomètres portables⁴. Les taux relatifs d’oxydation du glucose et des lipides dans l’ensemble du corps sont également estimés de manière routinière sur la base du rapport d’échange respiratoire à partir d’essais calorimétriques indirects ^5,6. Cependant, la majorité de tous les autres aspects du métabolisme ne sont pas systématiquement évalués fonctionnellement. Cela conduit à des interprétations incomplètes de l’état métabolique et à des options thérapeutiques manquées. L’une de ces principales voies est la lipogenèse de novo.

La lipogenèse de novo (DNL) est le processus par lequel de nouveaux acides gras sont générés à partir de précurseurs. Le glucose est considéré comme le principal précurseur contribuant à la DNL⁷ du corps entier, mais d’autres précurseurs, tels que l’acétate, le fructose, le lactate et les acides aminés à chaîne ramifiée, se sont avérés être des sources de carbone pertinentes d’une manière dépendante de l’espace et de l’état 8,9,10,11,12. Le DNL est un contributeur clé à l’homéostasie métabolique et est essentiel au développement normal¹³. De plus, des altérations de la DNL ont été associées au cancer 14,15 et métabolique 16,17,18 et aux maladies cardiovasculaires ^19,20.

La voie DNL est composée des composants enzymatiques de base ATP citrate lyase (ACLY), acétyl-CoA carboxylase (ACC1/2) et acide gras synthase (FAS) qui produisent principalement du palmitate, un acide gras saturé à 16 carbones. Cependant, les acides gras à chaîne impaire et à chaîne ramifiée peuvent également être produits à des taux plus faibles⁹. Les élongases et les désaturases modifient davantage ces acides gras, créant une gamme diversifiée d’espèces d’acides gras utiles à diverses fonctions (par exemple, le stockage d’énergie à long terme et la manipulation de la fluidité membranaire).

L’expression de la machinerie enzymatique DNL est contrôlée par un petit nombre de facteurs de transcription. Les plus bien décrites à ce jour comprennent la famille des protéines de liaison aux éléments régulateurs des stérols (SREBP), la protéine de liaison aux éléments de réponse glucidique (ChREBP) et le récepteur X du foie (LXR)21,22,23,24,25,26. Malgré un chevauchement apparent de leurs fonctions, des régulations individuelles basées sur la dominance du type cellulaire et les conditions physiologiques ou pathologiques ont été rapportées^21,22,27,28.

Fait remarquable, un certain nombre d’inhibiteurs de certaines étapes de la voie DNL ont été approuvés pour une utilisation clinique ou sont à des stades précliniques ou cliniques de développement pour un certain nombre de maladies, notamment l’obésité, la stéatose hépatique non alcoolique/stéatohépatite non alcoolique (NAFLD/NASH) et les maladies cardiovasculaires²⁹. Ces efforts mettent en évidence la pertinence de la DNL dans le domaine de la santé et de la maladie.

Au cours des dernières années, l’utilisation de méthodes d’évaluation quantitative de la synthèse des acides gras de novo a augmenté³⁰. La méthode la plus courante pour évaluer cela est l’utilisation d’eau lourde marquée (D₂O), où l’hydrogène lourd marqué est incorporé dans des chaînes acyle lors de la synthèse à la fois directement et indirectement, via l’échange de deutérium avec les hydrogènes des substrats DNL NAPDH, acétyl-CoA et malonyl-CoA. Bien que cette approche gagne en popularité, il y a un manque de protocoles détaillés accessibles au public et adaptés aux nouveaux arrivants dans le domaine. Nous décrivons ici une méthode d’évaluation quantitative de la synthèse de novo des produits du SAF à l’aide du D₂O et de la chromatographie en phase gazeuse par spectrométrie de masse (GCMS), avec des calculs précédemment développés par Lee et ^al.31. Cette méthode mesure la synthèse d’acides gras de novo indépendamment d’une source de carbone, et elle est potentiellement utile pour pratiquement tous les tissus, dans n’importe quel modèle murin et sous n’importe quelle perturbation externe. Ici, nous nous concentrons sur l’analyse du tissu adipeux brun (BAT) en raison de ses niveaux élevés de DNL et de son rôle essentiel dans le maintien de l’homéostasie métabolique.

Toutes les expériences ont été approuvées par le comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux du centre médical de l’hôpital pour enfants de Cincinnati.

1. Préparation du D₂O

REMARQUE : Pour éviter les variations expérimentales, préparez suffisamment de solution / d’eau potable pour toutes les souris pendant toute la durée de l’expérience.

1. Pour l’injection intrapéritonéale : générer 0,9 % p/v de solution saline D 2 O en dissolvant 9 g de NaCl par litre deD 2 O. Filtrer à travers un filtre apyrogène de_0,2μm pour stériliser.
2. Pour boire de l’eau D 2 O : produire 8 % v/v d 2 d’eau enrichie en O à utiliser comme eau potable en mélangeant 80 mL deD₂O par 920 mL d’eau potable ordinaire. De l’eau potable ordinaire peut être obtenue auprès de l’installation de souris. Filtrer à travers un filtre apyrogène de 0,2 μm pour stériliser.

2. Modulation de l’activité des MTD par acclimatation à la température

1. Séparez les souris de manière à ce qu’il y ait deux souris par cage 2 semaines avant le début de l’acclimatation à la température. Changez l’alimentation en eau pour que les souris s’adaptent et maintiennent toutes les cages à 22 °C.
2. Préparez les chambres environnementales de la souris 1 semaine avant le début de l’acclimatation à la température en réglant les températures appropriées : 30 °C pour la thermoneutralité, 22 °C pour la température ambiante et 18 °C pour l’exposition au froid.
3. Au début de l’acclimatation à la température, remplacez les cages par des cages neuves sans enrichissement de l’environnement (pour éviter les nids). Déplacez les cages à leurs températures respectives.
   REMARQUE : Les cages affectées à la thermoneutralité resteront à 30 °C pendant 4 semaines. Les cages assignées à la température ambiante resteront à 22 °C pendant 4 semaines. Les cages affectées à l’exposition au froid deviendront progressivement plus froides selon un horaire hebdomadaire : 18 °C pour la première semaine, 14 °C pour la deuxième semaine, 10 °C pour la troisième semaine et 6 °C pour la quatrième semaine.
4. Changez les cages souillées chaque semaine pour toutes les conditions. De plus, remplacez les bouteilles de nourriture et d’eau par des bouteilles neuves préadaptées à la température appropriée pendant au moins 24 h.
   REMARQUE : Faites attention aux quantités de nourriture ajoutées chaque semaine, en particulier pour les souris froides, car elles consommeront une quantité de nourriture nettement plus importante par rapport aux conditions normales. Fournir de la nourriture ad libitum.

3. Administration du D₂O

1. Injecter à chaque animal une solution saline à 0,9 % p/v-D₂O à 35 μL/g de poids corporel, 12 h à 3 jours avant le prélèvement tissulaire, par injection intrapéritonéale à l’aide d’une seringue de 1 mL et d’une aiguille de 26 G.
   REMARQUE : Veuillez consulter la section de discussion pour plus d’informations sur le choix d’un moment d’étiquetage approprié.
2. Remplacez les bouteilles d’eau par des bouteilles contenant 8 % v/_{v d’eau}potable enrichie en O D2.

4. Prélèvement, traitement et stockage du plasma et des tissus

1. À la fin de l’expérience, sacrifiez les souris en utilisant des méthodologies approuvées (par exemple, surdosage de dioxyde de carbone suivi d’une luxation cervicale).
   1. Utilisez des coussinets chauffants ou froids ou d’autres méthodes pour éviter les changements brusques de température avant l’euthanasie qui pourraient affecter les résultats. Euthanasier les souris selon les méthodologies approuvées. Procéder immédiatement au prélèvement de sang et de tissus.
2. Prélever du sang par ponction cardiaque à l’aide d’une aiguille de 26 G et le conserver dans un tube de prélèvement sanguin à base d’acide éthylènediaminetétraacétique. Gardez le sang sur la glace jusqu’à ce que le traitement soit terminé.
3. Coupez la peau le long de la ligne médiane du dos de la souris, de la zone inférieure de la cavité thoracique jusqu’à la zone supérieure du cou, tout en tirant la peau vers le haut pour éviter d’affecter les tissus sous la peau. La MTD interscapulaire est située entre les omoplates sous une fine couche de tissu adipeux blanc, et elle est composée de deux lobes de forme pyramidale.
   1. Nettoyez le tissu en le lavant dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) glacée. Tamponnez sur une serviette en papier pour éliminer l’excès de liquide, pesez sur une balance analytique et collectez dans un microtube.
   2. Congeler immédiatement les tissus à l’aide d’azote liquide. D’autres dépôts BAT peuvent également être collectés.
4. Centrifuger les échantillons de sang à 10 000 x g pendant 10 min à 4 °C. Après la centrifugation, prélevez soigneusement le plasma sans perturber la pastille de globules rouges. Transférez-le dans un nouveau microtube glacé et congelez-le rapidement dans de l’azote liquide.
5. Conservez les échantillons de graisse brune et de plasma à -80 °C jusqu’à utilisation.

5. Extraction des lipides du tissu adipeux

1. Avant de commencer l’extraction
   1. Préparer une solution de 1 mM d’acide hexadénoïque-d₃₁ dans du méthanol dans un flacon en verre. Cela servira d’étalon interne d’acides gras.
   2. Pré-refroidir la quantité requise de chloroforme (_CHCl 3) et de méthanol (CH₃OH) dans un congélateur à -80 °C ou sur de la glace carbonique.
      REMARQUE : Le di-tert-butyl-4-méthylphénol (BHT) antioxydant peut être ajouté au_{CHCl 3} à une concentration de 0,01 % p/v (2,5 mg/25 mL) pour prévenir l’oxydation des doubles liaisons dans les acides gras insaturés.
   3. Pré-étiqueter les tubes de microcentrifugation pour chaque échantillon de tissu et un tube supplémentaire à utiliser pour une extraction à blanc.
      ATTENTION : Le CH 3OH et le CHCl₃ sont très volatils et toxiques s’ils sont inhalés. Utiliser uniquement dans les hottes.
      REMARQUE : Différentes marques de tubes de microcentrifugation ont des niveaux différents de palmitate de fond et des capacités en termes de prévention des fuites de solvant. Nous recommandons qu’une variété de tubes soient d’abord testés, afin de s’assurer que les fuites de solvant sont évitées et que les tubes ont des niveaux minimaux de palmitate contaminant. Voir Yao et ^al.32 pour plus de détails.
2. Sortez les échantillons du congélateur et placez-les sur de la glace sèche.
3. Placez le tube de microcentrifugation pré-étiqueté sur une balance d’analyse et tarez la balance. Placez une pince à épiler et un scalpel/lame de rasoir en acier sur de la glace carbonique pendant 10 à 20 s pour refroidir.
   1. Utilisez la pince à épiler pour retirer l’échantillon de tissu congelé du tube et placez-le sur un bateau de pesée en plastique. Le bateau de pesée peut être placé sur un bloc plat de glace carbonique ou sur une autre surface pré-refroidie.
   2. À l’aide du scalpel ou de la lame de rasoir en acier, disséquez une petite partie du tissu, équivalant à 5 à 15 mg de poids. Placez-le dans le tube de la microcentrifugeuse et notez le poids exact. Répétez l’opération pour chaque échantillon. Les échantillons peuvent être conservés au congélateur à ce stade ou peuvent être avancés aux étapes ci-dessous pour l’extraction des lipides.
      REMARQUE : Assurez-vous que le scalpel est correctement nettoyé avec de l’éthanol à 70% entre les échantillons et qu’un nouveau bateau de pesée est utilisé entre chaque échantillon.
4. Ajouter 1 μL/mg d’acide hexadécénoïque-d 31(C16 :0-j₃₁) de 10 mM à chaque échantillon.
   ATTENTION : Les étapes suivantes (5.4 à 5.8) doivent être effectuées sous une hotte en raison du risque d’inhalation des solvants.
5. Ajouter 250 μL de_CH3OH, 250 μL de H₂O et 500 μL de CHCl₃ à chaque échantillon à l’aide de trois billes d’acier inoxydable de 5 mm. Placez les tubes dans un bloc pré-refroidi d’un broyeur et mélangez les échantillons à une fréquence de vibration de 25 Hz pendant 5 min, ou utilisez les directives recommandées par le fabricant pour les échantillons de tissus. Retirez les perles à l’aide d’un aimant.
6. Centrifuger les échantillons à 12 000 x g pendant 10 min à 4 °C.
   REMARQUE : Après centrifugation, une séparation biphasique claire doit être observée avec la phase aqueuse supérieure contenant des métabolites polaires et la phase organique inférieure contenant des lipides et des acides gras. Si aucune séparation n’est observée, ajouter 250 μL de H₂O et répéter les étapes de vortex et de centrifugation.
7. À l’aide d’une micropipette, prélevez un volume fixe de la phase inférieure de chaque échantillon dans des tubes de microcentrifugation étiquetés en conséquence.
8. Ajouter 500 μL de CHCl₃ au reste de l’échantillon et répéter les étapes 5.6 à 5.7.
9. Placez les échantillons sous azote gazeux ou dans un vide centrifuge réfrigéré résistant au CHCl₃ à 4 °C jusqu’à ce qu’ils soient complètement secs. Les échantillons séchés peuvent être conservés à -20 °C jusqu’à ce qu’ils soient prêts à être dérivés.
   REMARQUE : La couche supérieure de chaque échantillon peut également être prélevée à ce stade et séchée comme à l’étape 5.9 afin d’analyser les métabolites polaires.

6. Préparation des esters méthyliques d’acides gras (EMAG) et analyse du SMGC

1. Estérification et transestérification catalysées par l’acide pour préparer les EMAG
   ATTENTION : Les étapes suivantes doivent être effectuées sous une hotte en raison du risque d’inhalation des solvants.
   1. Si les échantillons ont été conservés au congélateur, séchez-les sous azote pendant 5 minutes pour vous assurer qu’il n’y a pas d’eau.
   2. À l’aide de solvants de qualité MS, pipeter 98 mL de CH₃OH anhydre dans un flacon en verre. Ajouter lentement 2 mL d’acide sulfurique anhydre dans la hotte pour obtenir 2 % H₂SO₄ dans CH₃OH. Mélangez en faisant tourner la bouteille fermée.
   3. Ajouter 500 μL de solution 2% H₂SO₄ dans CH₃OH à chaque échantillon et tourbillonner brièvement.
   4. Incuber les échantillons sur un bloc chauffant à 50 °C pendant 2 h.
   5. Retirez les échantillons du bloc chauffant et ajoutez 100 μL de solution saturée de NaCl et 500 μL d’hexane à chaque échantillon.
   6. Faire tourner les échantillons vigoureusement à température ambiante pendant 1 min. Laisser reposer les échantillons pendant 1 min ; Deux phases devraient être apparentes après cela.
   7. Recueillir la phase supérieure dans un nouveau tube de microcentrifugation (voir la note de la section 5.1.3 pour le choix approprié du tube de microcentrifugation).
   8. Pour maximiser le rendement, répétez les étapes 6.1.5 à 6.1.7, en prélevant le deuxième échantillon dans les mêmes tubes étiquetés.
   9. Séchez les échantillons à température ambiante sous azote gazeux.
   10. Remettre les échantillons en suspension dans 20 μL/mg d’hexane, par rapport au poids du tissu d’origine, et transférer immédiatement dans un flacon de GC en verre avec un insert en verre.
       REMARQUE : Travaillez rapidement lors du transfert des échantillons pour minimiser l’évaporation.
2. Analyse du SMGC
   1. Pour déterminer l’abondance des isotopologues de l’EMAG, injecter les échantillons sur un seul spectromètre de masse quadripolaire de chromatographie en phase gazeuse (GCMS).
      NOTA : Bien que de nombreux types de colonnes puissent être utilisés pour détecter le palmitate, le programme de température suivant a été établi pour une colonne GCMS qui a été développée pour la séparation des isomères cis/trans d’acides gras, comme indiqué dans le tableau des matériaux. Cette colonne a une longueur de 50 m avec un diamètre intérieur de 0,25 mm.
   2. Injecter 1 μL d’échantillon dans une entrée fendue/non fendue à une température d’entrée de 270 °C, en utilisant de l’hélium comme gaz porteur, s’écoulant à 1 mL/min. Utiliser une injection sans fente pour les acides gras peu abondants avec un débit total de 19 mL/min, une purge du septum de 3 mL/min et un débit de purge vers l’évent fendu de 15 mL/min à 0,75 min. Utilisez un rapport de répartition de 10 :1-40 :1 pour les acides gras très abondants tels que le palmitate et l’oléate.
   3. Utiliser les paramètres suivants du four : une température initiale de 80 °C ; augmenter par incréments de 20 °C/min jusqu’à 170 °C ; augmenter par incréments de 1 °C/min jusqu’à 204 °C ; augmenter par incréments de 20 °C/min jusqu’à 250 °C ; puis maintenir à 250 °C pendant 10 min.
   4. Utilisez les paramètres de détecteur sélectif de masse (MSD) suivants : un mode d’ionisation par impact d’électrons de 70 eV et balayez sur une plage de 50 à 400 m/z avec une vitesse de balayage de 1 562 (u/s) et une fréquence de 4,1 balayages/s. Utilisez une ligne de transfert à 280 °C, une source d’ions à 230 °C et un quadripôle à 150 °C.
      REMARQUE : D’autres colonnes peuvent être utilisées, mais le programme de température variera.
   5. Séquence d’échantillonnage : Randomiser l’ordre d’injection de l’échantillon et injecter au moins deux ou trois blancs d’hexane au début de la séquence, après chaque cinquième échantillon dans la séquence, et deux ou trois à la fin de la séquence.
   6. Utilisez un logiciel spécifique à l’instrument, ou un logiciel gratuit en libre accès tel que Metabolite-Detector³³, pour intégrer les ions du tableau 1 pour chaque ester méthylique d’acide gras.
      REMARQUE : Nous avons décrit les ions qui couvrent les isotopologues M1-M5 dans le tableau 1 qui, selon nous, couvre la quantité d’incorporation de deutérium avec cette fenêtre d’étiquetage. Cependant, il peut être nécessaire de l’étendre si le flux de novo est significativement plus élevé et/ou si un temps d’étiquetage plus long est utilisé.
   7. Utilisez l’abondance de chaque ion intégré pour générer une distribution isotopomère de masse, où les intensités ioniques peuvent être converties en abondance fractionnaire de sorte que la somme de la distribution isotopomère de masse soit égale à un. Veuillez consulter l’exemple de feuille de calcul dans le fichier supplémentaire.
      NOTA : Afin de déterminer avec précision l’incorporation du deutérium, il faut ensuite corriger l’abondance des isotopes naturels pour tenir compte de la présence d’isotopes naturels tels que ¹³C, ¹⁵N et ²H. Ceci est réalisé en appliquant une matrice de correction comme indiqué par Fernandez et al.34,35^, et ne peut pas être effectué en soustrayant le MID d’un métabolite mesuré non marqué d’un métabolite marqué. En pratique, nous recommandons l’utilisation de logiciels disponibles gratuitement tels que fluxfix 36, polyMID³⁷ ou IsoCor³⁸ pour transformer les données brutes en MID fractionnaires, et nous avons fourni la formule de correction isotopique pour les produits à base d’ester méthylique du SAF dans le tableau 1.
   8. Pour déterminer la quantité de palmitate présente, utilisez la formule suivante :
       
      où le nombre d’ions fait référence à la somme de tous les isotopologues du palmitate intégrés dans le tableau 1 et C16 :0-d 31 fait référence à l’étalon interne hexadénoïque-d₃₁. L’étalon interne forme un pic distinct de celui du palmitate endogène. L’abondance relative d’autres acides gras peut également être déterminée, mais il peut être nécessaire d’utiliser des étalons internes d’isotopes spécifiques aux acides gras (avec des décalages de masse supérieurs à ceux observés lors de l’incorporation de D₂O) ou des courbes d’étalons externes pour une quantification complète. Utilisez l’échantillon vierge extrait pour déterminer la quantité de palmitate de fond et soustrayez-la de la valeur tissulaire finale.
   9. Calculer l’enrichissement molaire (EM) du palmitate par l’équation suivante :
      
      où M_i est l’abondance fractionnaire normalisée d’un isotopologue palmité, et n est le nombre d’isotopologues palmités possibles. Par exemple, l’EM d’une molécule de palmitate avec la distribution fractionnaire suivante, M1 = 0,25, M2 = 0,08, M3 = 0,02, est : (0,025*1) + (0,08*2) + (0,02*3) = 0,245 (voir le fichier supplémentaire).

7. Échange d’acétone de deutérium d’échantillons de plasma pour déterminer l’enrichissement en eau corporelle

1. Réaction
   1. Préparer 10 étalons de deutérium dans l’eau, allant de 0 à 9 % v/v.
   2. Préparer une solution d’acétone/acétonitrile à 5 % v/v en tenant compte de 4 μL par échantillon, y compris les étalons de l’étape 5.1.1.
   3. Dans des tubes de microcentrifugation étiquetés et sécurisés, mélanger 10 μL de chaque échantillon de plasma ou étalon, 4 μL de NaOH 10 M et 4 μL d’acétone/acétonitrile à 5 %. Effectuez cette opération en trois exemplaires pour chaque échantillon.
   4. Mélangez délicatement les échantillons par pipetage. Laissez les échantillons incuber à température ambiante pendant la nuit.
2. Extraction
   1. Après incubation, ajouter 450 à 550 mg de Na₂SO₄ à chaque échantillon.
   2. Dans la hotte, ajouter 600 μL de CHCl₃ dans chaque tube et faire tourbillonner vigoureusement pendant 15 s.
   3. Centrifuger les échantillons à 300 x g pendant 2 min.
   4. Sous une hotte, transférer en trois exemplaires des aliquotes de 80 μL du surnageant de chaque échantillon dans des flacons GCMS en verre étiquetés avec des inserts en verre et un bouchon hermétique.
3. Analyse du SMGC
   1. Séparez les échantillons sur une colonne (30 m, 0,25 mm de diamètre intérieur, Agilent DB-35MS) et analysez-les sur le spectromètre de masse attaché.
      1. Injecter 1 μL d’échantillon dans une entrée divisée/non divisée, avec un rapport de division de 40 :1, un débit d’hélium de 1 mL/min et une température d’entrée de 270 °C.
      2. Utilisez les paramètres suivants du four : une température initiale de 60 °C, augmenter par incréments de 20 °C/min jusqu’à 100 °C, augmenter de 50 °C/min jusqu’à 220 °C, puis maintenir à 220 °C pendant 1 min.
      3. Utilisez les paramètres de détecteur sélectif de masse (MSD) suivants : mode d’ionisation par impact d’électrons à 70 eV avec surveillance ionique sélective de 58 et 59 m/z. Utilisez une ligne de transfert à 280 °C, une source d’ions à 230 °C et un quadripôle à 150 °C.
         REMARQUE : D’autres colonnes à faible purge, collées, réticulées et à polarité moyenne peuvent être utilisées, mais le programme de température variera.
   2. Réglez la méthode de l’échantillonneur liquide pour commencer par un lavage CHCl 3, puis une séquence aléatoire des échantillons, y compris des étapes de lavage_{CHCl 3} supplémentaires tous les six échantillons.
      REMARQUE : Si l’acétone est utilisée comme lavage à l’aiguille pour l’échantillonneur automatique, remplacez-la par du CHCl 3 ou de l’hexane et injectez plusieurs échantillons blancs de_{CHCl 3} jusqu’à ce que tout pic d’acétone contaminant ne soit plus évident dans le chromatogramme.
   3. En utilisant cette méthode, un pic d’acétone élue à environ 1,25 min. Intégrer les données et calculer l’abondance fractionnaire de l’enrichissement en acétone en suivant les étapes 6.2.6 à 6.2.7, avec un ajustement pour analyser les pics contenant un rapport m/z de 58-60 comme indiqué dans le tableau 1.
   4. Utilisez les étalons pour générer une courbe standard afin de déterminer le pourcentage d’enrichissement en eau corporelle (p) des échantillons d’essai, en fonction de l’enrichissement fractionné de l’acétone.

8. Calculs de lipogenèse in vivo de novo

1. Calculer la fraction d’acides gras nouvellement synthétisés (FNS) qui sont des produits directs du SAF (c.-à-d. palmitate, acides gras à chaîne impaire et mmBCFA) dans chaque échantillon à l’aide de l’équation suivante :
   
   où ME est l’enrichissement molaire moyen d’une molécule de palmitate (étape 6.2.9), p est l’enrichissement en deutérium dans l’eau à partir de l’échantillon de plasma correspondant (étape 7.3.4) et N est le nombre d’atomes d’hydrogène échangeables sur le palmitate où un deutérium peut être incorporé.
2. Déterminer N à l’aide de l’équation ci-dessous qui a été établie par Lee et ^al.31 :
   
3. Déterminer la quantité molaire d’acides gras nouvellement synthétisés (MNS) en :
   MNS = FNS x quantité totale d’acides gras (nmol/mg de tissu).
   REMARQUE : Par exemple, si l’on obtient un enrichissement molaire en palmitate (EM) de 0,245, un enrichissement en deutérium dans l’eau corporelle (p) de 0,045 et un nombre N calculé de 22, la synthèse fractionnée du palmitate est de 0,247. Si la quantité de palmitate présente dans le tissu est de 2 mmol/mg, alors la mmol du palmitate nouvellement synthétisé est de 0,494 mmol/mg (voir Fichier supplémentaire).

Sur la base de la dose de D 2 O décrite à l’étape 1, nous constatons généralement que l’eau corporelle est enrichie de l’ordre de_2,5% à 6 % et qu’un niveau de base d’enrichissement en deutérium dans l’eau corporelle est rapidement atteint en 1 h et maintenu pendant toute la durée de l’étude via de l’eau potable enrichie à 8 % (Figure 1). L’enrichissement continu en eau corporelle à l’état d’équilibre est une hypothèse des calculs utilisés à l’étape 6, et nous recommandons donc la validation expérimentale de la cinétique de l’enrichissement en eau corporelle dans de nouveaux modèles expérimentaux.

Nous avons constaté que la quantité d’acides gras synthétisés de novo est augmentée à température ambiante, par rapport à ceux à la thermoneutralité dans la MTD (Figure 2). La distribution isotopologique de masse du palmitate dans la MTD de souris à la thermoneutralité et à température ambiante après 3 jours d’administration de D2 O montre un enrichissement en deutérium M1 et_M2plus élevé à température ambiante (Figure 2A). Cet enrichissement à des températures plus froides ne se produit pas seulement dans le palmitate, mais aussi dans une large gamme d’acides gras dans les MTD (Figure 2B). L’abondance totale des palmitates est également augmentée dans les MTD des souris à température ambiante, et en combinant le taux de synthèse fractionnaire avec les niveaux totaux de palmitate, nous avons constaté que la synthèse totale des palmitates était augmentée chez les souris à température ambiante (Figure 2C, D). Notamment, l’enrichissement plasmatique en acides gras totaux ne suit pas la même tendance que la MTD, mais au contraire, l’enrichissement en acides gras augmente avec la thermoneutralité (Figure 2E). Il n’est pas possible de déconvoluer l’absorption potentielle de la synthèse endogène avec une approche à point temporel unique_D2O, comme décrit ici, mais ces tendances opposées indiquent que le modèle d’enrichissement en acides gras dans la MTD n’est pas déterminé par l’absorption des acides gras.

Figure 1 : Pourcentage d’enrichissement en D 2 O dans le plasma de souris sur plusieurs points temporels, après injection de 0,035 ml/g de poids corporel à 0,9 % de NaCl D2 O et remplacement de l’eau potable par de l’eau enrichie à 8 % de D₂O. Les diagrammes à barres représentent la moyenne ±écart-type. n = 9. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Résultats représentatifs chez la souris du tissu adipeux brun après 3 jours d’administration de D 2 O. (A) Distribution isotopologue de masse du palmitate dans la MTD après 3 jours d’administration de D₂O à température ambiante (RT) et thermoneutralité (TN). (B) Enrichissement molaire BAT d’une gamme d’acides gras après 3 jours d’administration de D₂O à température ambiante et thermoneutralité. (C) Abondance totale et palmitate synthétisé de novo (D) dans le tissu adipeux brun après 3 jours d’administration de D ₂O à température ambiante et thermoneutralité. (E) Enrichissement molaire plasmatique d’une gamme d’acides gras après 3 jours d’administration de D₂O à température ambiante et thermoneutralité. Les diagrammes à barres représentent la moyenne ±écart-type. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. n = 6. L’analyse statistique a été déterminée par le test t bilatéral de Students. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Tableau 1 : Ions de fragments composés du SMGC à intégrer. Ce tableau couvre une gamme d’acides gras produits par la synthase d’acides gras de mammifères, mais le C16 :0 est le produit principal. Tous les temps de conservation sont pour la méthode du SMGC détaillée à l’étape 6, à l’exception de l’acétone, qui est détaillée à l’étape 7.

Fichier supplémentaire : Exemple de calcul de feuille de calcul. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Comprendre l’équilibre et l’interaction entre des voies métaboliques complexes est une étape indispensable pour comprendre les bases biologiques des maladies métaboliques. Ici, nous montrons une méthodologie non invasive et peu coûteuse pour déterminer les changements dans la synthèse des acides gras de novo. Cette méthode est adaptée de méthodes publiées antérieurement qui ont mis au point des calculs pour estimer le flux de synthèse de novo à partir de l’enrichissement en deutérium d’acides gras³¹ et pour utiliser l’échange deutérium-acétone pour déterminer le pourcentage relatif de_D2O dans l’eau corporelle³⁹. Au cours des dernières années, nous avons pris la méthode décrite ici et l’avons appliquée pour découvrir des changements dans la synthèse de divers acides gras dans les dépôts adipeux, le cerveau, le foie et les tumeurs ^9,22,40. Il y a un certain nombre d’étapes critiques et d’aspects modifiables de ce protocole. Ceux-ci sont liés à la conception expérimentale globale ainsi qu’à l’approche analytique et aux calculs utilisés dans cette méthode. D’autres approches pour calculer la synthèse d’acides gras de novo à partir de traceurs d’isotopes stables sont également largement utilisées. Il s’agit notamment de l’approche d’analyse de la distribution des isotopomères de masse alternative (MIDA) développée par Hellerstein et al.41,42, de l’analyse spectrale des isotopomères (ISA) développée par Kelleher et al.43,44, et d’approches plus récentes qui ont été développées pour modéliser la synthèse d’acides gras à chaîne plus longue^, telles que l’analyse de la source d’acides gras (FASA)⁴⁵. L’avantage de la méthode ici est qu’elle est facilement réalisable avec un logiciel disponible gratuitement et l’utilisation d’un tableur. Cependant, il est limité par la nécessité que l’enrichissement en eau corporelle (BWE) soit à un état stable, les mises en garde associées à l’utilisation du paramètre N (voir ci-dessous) et le fait qu’il ne s’applique qu’aux produits directs du SAF qui sont principalement des palmitates.

DNL de graisse brune et acclimatation à la température
Le DNL est devenu un nodule principal de la régulation métabolique de l’ensemble du corps et est essentiel au développement normal^13,29. La délétion ciblée tissulaire et l’analyse métabolomique ont permis d’identifier plusieurs acteurs enzymatiques et transcriptionnels clés qui contrôlent le DNL dans le tissu adipeux, et comment il contrôle l’accrétion de graisse corporelle entière et l’homéostasie métabolique normale 21,28,46,47,48,49. Bien que moins apprécié, le BAT est un tissu très actif dans le DNL, avec une expression plus élevée de la machinerie enzymatique DNL du corps central (acly, acaca, fasn) que la plupart des autres tissus et des activités lipogéniques plus élevées 22,50,51,52,53,54,55. La MTD est cependant unique, en ce sens que l’acclimatation à des températures sub-thermoneutres induit simultanément une activité d’oxydation de la DNL et des acides gras dans la MTD 22,54,56. Bien que les mécanismes associés ne soient pas tout à fait clairs, il est admis que la MTD est un puits métabolique pour les nutriments, y compris ceux destinés à DNL pour la synthèse des lipides, qui sont essentiels à l’activité normale de la MTD^53,55. En tant que tel, il est pertinent de pouvoir prendre en compte tous les revenus métaboliques et les résultats de la MTD pour évaluer ses niveaux d’activité. Cependant, la DNL n’est généralement mesurée que sur la base de l’expression des gènes et évaluée fonctionnellement à des occasions comptées. Le protocole proposé ici permet l’évaluation fonctionnelle de la DNL, permettant une interprétation plus complète de l’état métabolique.

D₂O Mesure de la dose, du moment et de l’enrichissement en eau corporelle
L’une des principales étapes critiques de la conception est la dose et le moment de l’administration de_D2O. Dans ce protocole, nous utilisons une approche de dose et d’administration (injection en bolus suivie d’un enrichissement en eau potable) qui, selon nous, conduit à l’obtention et au maintien rapides de l’EBE à l’état d’équilibre. Les calculs utilisés pour déterminer la synthèse des acides gras sont basés sur l’hypothèse d’une BWE à l’état d’équilibre ; Il est donc crucial que cela soit validé dans de nouveaux modèles expérimentaux. Si l’enrichissement en régime permanent n’est pas possible en raison de problèmes liés à l’utilisation de cette méthode de dosage combiné, le lecteur est renvoyé à d’autres publications où des modifications apportées aux calculs le^permettent. Le degré de variation par rapport à l’état d’équilibre qui peut être toléré lors de l’utilisation d’une approche de dosage qui vise à atteindre rapidement cet objectif dépend de nombreux facteurs. Si l’on augmente l’EBB par pics soutenus au-dessus de la valeur utilisée pour le calcul, alors en utilisant l’approche ici, DNL sera surestimée. Si l’EBB est significativement inférieure à la valeur utilisée pour le calcul d’une durée prolongée, le DNL sera sous-estimé. Bien que l’on s’attende à une légère variation autour de la moyenne, le facteur le plus important est que l’EBE ne varie pas plus dans un groupe expérimental que dans l’autre, ce qui pourrait entraîner des différences dans la DNL calculée en raison de la variation de l’EBE. Si les deux groupes expérimentaux présentent des variations légères mais similaires au fil du temps, la tolérance de celle-ci dépendra de l’exactitude et de la précision avec lesquelles l’investigateur exige que la mesure soit effectuée, ainsi que des différences attendues entre les groupes expérimentaux. Par exemple, dans le cas du tissu adipeux brun exposé à la thermoneutralité par rapport à la température ambiante, qui a été fourni à titre d’exemple ici, la différence dans la quantité d’acide gras synthétisé de novo présente est supérieure à 50 % ; par conséquent, il est peu probable que de petites variations de l’EBE obscurcissent les résultats.

En plus de la prise en compte de l’état stationnaire, un autre aspect modifiable de ce protocole est le niveau de BWE. L’augmentation de l’EBB permet potentiellement un transfert accru de l’étiquette sur les acides gras, et par conséquent, les pools d’acides gras avec un renouvellement plus faible peuvent être plus facilement détectables dans un laps de temps plus court. Cela pourrait être un avantage dans les situations où le chercheur s’intéresse aux réponses aiguës dans le DNL. Cependant, l’augmentation des niveaux de_D2O dans l’eau corporelle peut provoquer des effets physiologiques indésirables, et il convient donc de faire preuve de prudence⁵⁷. L’administration de niveaux inférieurs de D 2 O pour atteindre des niveaux d’EBE, généralement autour de 0,5 %, est couramment utilisée dans les études humaines enraison du coût associé à l’administration de D₂O. Dans ce cas, des méthodes avec une sensibilité accrue peuvent être nécessaires pour quantifier l’EBAT et l’enrichissement en acides gras. Dans le cas de l’EBE, cela peut être réalisé par spectrométrie de masse à rapport ionique⁵⁸ ou par un protocole d’échange d’acétone modifié⁵⁹. Pour l’analyse des acides gras, il a récemment été démontré que l’utilisation d’un instrument GCMS à haute résolution augmente la sensibilité de la mesure du deutérium dans les acides gras, et permet ainsi de quantifier le DNL après des périodes de temps très courtes et/ou un faible BWE⁶⁰. D’autres méthodes peuvent également être utilisées pour augmenter le débit avec lequel l’ECB est mesurée, en utilisant des analyses de l’espace de tête de l’acétone générée à l’étape 7.1.5 au lieu de l’extraire avec du CHCl3 et d’effectuer une injection de liquide. Cela réduit le temps d’exécution de la méthode et évite les multiples étapes de transfert, réduisant ainsi le temps de préparation des échantillons. Si l’accès à un injecteur d’espace de tête est disponible, cette méthode est fortement recommandée⁶¹.

Choix du pool d’acides gras à quantifier et approche analytique
Dans ce protocole, la méthode est conçue pour mesurer le pool total d’acides gras dans le tissu ou le plasma, quelle que soit la classe de lipides. Cependant, les classes de lipides peuvent être séparées avant la génération d’EMAG, via des méthodes telles que la chromatographie sur couche mince ou la chromatographie liquide. De plus, lors de l’analyse du sérum ou du plasma, les lipides de fractions lipoprotéiques spécifiques, telles que les lipoprotéines de très basse densité (VLDL), peuvent être isolés par ultracentrifugation⁵⁸. Cette méthode est couramment employée dans les études humaines afin de déterminer le DNL hépatique, qui est susceptible d’être la principale source d’acides gras fabriqués de novo dans le VLDL. Le protocole d’extraction et de dérivation des lipides peut également être modifié pour améliorer l’isolement de classes spécifiques⁶². Enfin, l’enrichissement en deutérium des hydrogènes lipidiques peut également être mesuré par spectroscopie RMN ²H plutôt que par spectrométrie de masse. Bien que cette méthode soit moins sensible que la spectrométrie de masse et nécessite donc plus de matière, son avantage est qu’elle donne des informations d’enrichissement positionnel, qui peuvent être utilisées pour mieux estimer les taux d’allongement et de désaturation⁶³.

Calcul
Les calculs de ce protocole sont basés sur des calculs antérieurs qui prennent en compte l’état d’équilibre de l’eau de bois, l’enrichissement en acides gras et le nombre d’hydrogènes échangeables sur les acides gras³¹. Comme pour tout calcul, il y a un certain nombre de limites et d’hypothèses qui doivent être prises en compte lors de l’application et de l’interprétation des résultats de cette approche. L’une des principales considérations est la valeur utilisée pour N dans la section 8 de la méthode. Lors de la synthèse des acides gras, le 2 H du D₂O est incorporé dans la chaîne acyle, ainsi qu’indirectement par échange avec des hydrogènes sur le NADPH, l’acétyl-CoA et le malonyl-CoA^64,65. Des études antérieures ont montré que cet échange est incomplet^31,66 ; par conséquent, le calcul intègre un facteur de correction (N) pour tenir compte de ce⁶⁵. Un N de 22 est couramment utilisé pour de nombreuses études, car il a déjà été constaté qu’il est approprié pour une gamme de tissus en utilisant l’équation décrite à l’étape 6^31,66. Cependant, cela peut varier en fonction de la perturbation expérimentale et du modèle animal⁶⁵ ; Nous exhortons donc les enquêteurs à en tenir compte. Une N plus faible augmente le flux total de synthèse, et la valeur utilisée pour ce paramètre doit être prise en compte lors de la comparaison des mesures entre les études ou les laboratoires. L’une des limites de l’approche utilisée ici est qu’elle n’est pertinente que pour l’analyse des produits directs du SAF, qui est principalement le palmitate, avec des quantités beaucoup plus faibles d’acides gras à chaîne impaire et d’acides gras à chaîne ramifiée monométhylique⁹. Bien que l’enrichissement en deutérium de tous les acides gras puisse être détecté, la formule utilisée ici n’est pas appropriée pour déterminer la synthèse d’acides gras à chaîne plus longue, tels que C18 :0, car elle ne permet pas l’absorption d’acides gras non marqués et l’allongement de ces⁶⁷. De même, les taux de désaturation peuvent également être sous-estimés.

Limitations générales
Bien que l’utilisation du_D2O pour mesurer les acides gras ait permis de mieux comprendre l’importance de la DNL dans l’homéostasie physiologique, cette méthodologie présente un certain nombre de limites. Tout d’abord, sur la base de la chronologie décrite ici, il n’est pas possible d’être complètement confiant dans le tissu d’origine des acides gras nouvellement synthétisés. Il est facile d’imaginer un scénario dans lequel un certain tissu génère des acides gras à partir de DNL, puis ceux-ci sont transportés vers d’autres tissus. Des expériences d’évolution de temps fin après un traitement à la D₂O pourraient augmenter la résolution du tissu d’origine pour les acides gras nouvellement synthétisés, diminuant ainsi la contamination des tissus croisés. Le point de temps de 3 jours qui a été utilisé pour les résultats représentatifs a été conçu pour détecter l’enrichissement en deutérium dans une gamme d’acides gras à la fois à la thermoneutralité (lorsque le flux est plus faible) et à température ambiante. Des points de temps plus courts après l’administration de D₂O, où le palmitate est la cible principale, minimisent le transport des acides gras à travers les tissus et peuvent donc être avantageux. Des points de temps beaucoup plus courts (p. ex., 12 h) seraient idéaux lorsque l’on considère des souris dans des conditions froides et lorsque la thermoneutralité n’est pas incluse dans le plan expérimental. Deuxièmement, cette méthode ne fournit pas d’informations sur le substrat d’origine des nouveaux acides gras. L’identification des substrats spécifiques utilisés dans des circonstances particulières peut constituer une couche supplémentaire d’information nécessaire à une compréhension complète de la carte réglementaire des LND. Cela peut être fait avec des substrats marqués avec des isotopes stables.

Avantages
Un avantage particulier de cette méthodologie est que les animaux sont libres (à l’exception de l’injection initiale de D₂O) et conscients pendant la procédure, ce qui favorise un environnement peu stressant pour que les animaux se comportent naturellement, y compris la déambulation souhaitée et un mode et une quantité d’alimentation permettant un traitement alimentaire spécifique si nécessaire. Le D₂O est également remarquablement facile à administrer. Contrairement aux solutions liquides d’autres traceurs (p. ex., ¹³C-U-glucose), le_D2O n’a pas de caractéristiques appétissantes distinctes susceptibles d’avoir un impact sur la consommation d’eau. Au-delà des traceurs d’isotopes stables, l’autre méthode la plus couramment utilisée est celle des radio-isotopes. L’avantage potentiel des radio-isotopes est le choix de l’équipement de détection. Un spectromètre de masse est nécessaire pour les isotopes stables, tandis que les radio-isotopes peuvent être détectés à l’aide d’un compteur à scintillation, qui peut être plus facilement accessible. Cependant, il existe un certain nombre d’inconvénients associés aux radio-isotopes en raison de problèmes de sécurité et d’éthique. De plus, le radio-isotope se trouve généralement sur le glucose et ne reflète donc pas uniquement les changements de DNL, mais plutôt les changements de DNL dérivé du glucose. De plus, la détermination de la synthèse des acides gras individuels n’est pas possible. D₂O s’équilibre plus rapidement dans tous les tissus par rapport à des substrats spécifiques avec des marqueurs isotopiques⁶⁸.

La DNL est un élément clé de l’homéostasie métabolique contrôlée par un certain nombre d’enzymes et de facteurs de transcription qui affectent chacun indépendamment le développement, le métabolisme et les états pathologiques. Ainsi, le DNL est voué à être une voie métabolique majeure, qui devra être interrogée plus largement dans la recherche et le développement de thérapies. Ce protocole peut être utilisé comme un premier pas en avant dans l’intégration de l’analyse DNL en routine dans le phénotypage métabolique.

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Nous remercions les membres du laboratoire Sanchez-Gurmaches et Wallace pour leurs précieuses discussions. Ce travail a été soutenu par des subventions de l’American Heart Association (18CDA34080527 à JSG et 19POST34380545 à RM), du NIH (R21OD031907 à JSG), d’un prix du CCHMC Trustee, d’un prix du Centre de génomique pédiatrique du CCHMC et d’un prix du Centre de génomique et de thérapeutique mendélienne du CCHMC. Ce travail a été soutenu en partie par le NIH P30 DK078392 du Centre central de recherche sur les maladies digestives à Cincinnati. Le contenu relève de la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les opinions officielles des National Institutes of Health. RT et MW ont été soutenus par une bourse Ad Astra de l’UCD.