Method Article
Konakçı sodyum taurokolat birlikte taşınan polipeptit ile bağlanma afinitesini (KD) ölçmek için izotermal titrasyon kalorimetrisini kullanarak, viral giriş öncesi ve sonrası yaşam döngüsü aşamalarını hedefleyen anti-hepatit B virüsü (HBV) bileşiklerini taramak için bir protokol sunuyoruz. Antiviral etkinlik, viral yaşam döngüsü belirteçlerinin (cccDNA oluşumu, transkripsiyon ve viral montaj) baskılanması yoluyla belirlendi.
Hepatit B virüsü (HBV) enfeksiyonu hepatosellüler karsinom için çok önemli bir risk faktörü olarak kabul edilmiştir. Mevcut tedavi sadece viral yükü azaltabilir, ancak tam remisyon ile sonuçlanmaz. HBV enfeksiyonu için etkili bir hepatosit modeli, terapötik ajanların taranması için çok önemli olacak gerçek bir viral yaşam döngüsü sunacaktır. Mevcut anti-HBV ajanlarının çoğu, viral girişten sonraki yaşam döngüsü aşamalarını hedefler, ancak viral girişten önce değil. Bu protokol, viral giriş öncesi ve viral giriş sonrası yaşam döngüsü aşamalarını hedefleyen terapötik ajanları tarayabilen yetkin bir hepatosit modelinin oluşturulmasını detaylandırmaktadır. Bu, sodyum taurokolat kotransporting polipeptit (NTCP) bağlanmasının, cccDNA oluşumunun, transkripsiyonun ve konakçı hücreler olarak imHC veya HepaRG'ye dayalı viral montajın hedeflenmesini içerir. Burada, HBV giriş inhibisyon testi, HBV bağlama ve NTCP aracılığıyla taşıma işlevlerini inhibe etmek için kurkumin kullandı. İnhibitörler, termodinamik parametrelere dayalı HBV ilaç taraması için evrensel bir araç olan izotermal titrasyon kalorimetrisi (ITC) kullanılarak NTCP ile bağlanma afinitesi (KD) açısından değerlendirildi.
Hepatit B virüsü (HBV) enfeksiyonu tüm dünyada hayatı tehdit eden bir hastalık olarak kabul edilmektedir. Kronik HBV enfeksiyonu karaciğer sirozu ve hepatosellüler karsinom riski taşır1. Mevcut anti-HBV tedavisi çoğunlukla nükleos(t)ide analogları (NA'lar) ve interferon-alfa (IFN-α)2,3 kullanılarak viral giriş sonrası çalışmalara odaklanmaktadır. Bir HBV giriş inhibitörü olan Myrcludex B'nin keşfi, anti-HBV ajanları4 için yeni bir hedef belirlemiştir. Kronik HBV'de giriş inhibitörleri ve NA'ların kombinasyonu, tek başına viral replikasyonu hedefleyenlere kıyasla viral yükü önemli ölçüde azaltmıştır 5,6. Bununla birlikte, HBV giriş inhibitörlerinin taranması için klasik hepatosit modeli, düşük viral reseptör seviyeleri (sodyum taurokolat kotransportan polipeptit, NTCP) ile sınırlıdır. Hepatoma hücrelerinde (yani, HepG2 ve Huh7) hNTCP'nin aşırı ekspresyonu, HBV enfeksiyonunu 7,8 geliştirir. Bununla birlikte, bu hücre hatları düşük faz I ve II ilaç metabolize edici enzimleri eksprese eder ve genetik instabilitesergiler 9. Previral giriş, NTCP bağlama ve viral giriş gibi aday anti-HBV bileşiklerinin farklı mekanizmalarını hedeflemeye yardımcı olabilecek hepatosit modelleri, etkili kombinasyon rejimlerinin tanımlanmasını ve geliştirilmesini hızlandıracaktır. Kurkuminin anti-HBV aktivitesi için yapılan çalışma, viral giriş kesintisine ek olarak yeni bir mekanizma olarak viral girişin inhibisyonunu aydınlatmıştır. Bu protokol, anti-HBV giriş molekülleri10'un taranması için bir konak modelini detaylandırır.
Bu yöntemin amacı, viral giriş inhibisyonu için aday anti-HBV bileşiklerini araştırmak, özellikle NTCP bağlanmasını ve taşınmasını engellemektir. NTCP ekspresyonu HBV girişi ve enfeksiyonu için kritik bir faktör olduğundan, NTCP seviyeleri11'i en üst düzeye çıkarmak için hepatosit olgunlaşma protokolünü optimize ettik. Ek olarak, bu protokol HBV girişi üzerindeki inhibitör etkiyi HBV ekinin inhibisyonu ve içselleştirmenin inhibisyonu olarak ayırt edebilir. Taurokolik asit (TCA) alım testi, NTCP transport12,13'ü temsil etmek için radyoizotop yerine ELISA bazlı bir yöntem kullanılarak da modifiye edildi. Reseptör ve ligand etkileşimi 3D yapıları14,15 ile doğrulandı. NTCP fonksiyonunun inhibisyonu, TCA alım aktivitesi16 ölçülerek değerlendirilebilir. Bununla birlikte, bu teknik, NTCP'nin aday inhibitörlere bağlandığına dair doğrudan kanıt sağlamamıştır. Bu nedenle, yüzey plazmon rezonansı17, ELISA, floresan bazlı termal kayma testi (FTSA) 18, FRET19, AlphaScreen ve diğer çeşitli yöntemler20 gibi çeşitli teknikler kullanılarak bağlanma araştırılabilir. Bu teknikler arasında ITC, bağlanma analizinde bir hedef standarttır, çünkü hemen hemen her reaksiyonda ısı emilimini veya emisyonu gözlemleyebilir21. NTCP ve aday bileşiklerin bağlanma afinitesi (KD) doğrudan ITC kullanılarak değerlendirildi; Bu afinite değerleri, in silico tahmin modeli22 kullanılarak elde edilenlerden daha kesindi.
Bu protokol hepatosit matürasyonu, HBV enfeksiyonu ve HBV giriş inhibitörü taramasındaki teknikleri kapsar. Kısaca imHC ve HepaRG hücre hatlarına dayalı bir hepatosit modeli geliştirilmiştir. Kültürlenmiş hücreler 2 hafta içinde olgun hepatositlere farklılaştırıldı. NTCP düzeylerinin yukarı regülasyonu gerçek zamanlı PCR, western blot ve flow sitometri11 kullanılarak tespit edildi. Hepatit B virion (HBVcc) HepG2.2.15'ten üretildi ve toplandı. Diferansiye imHC veya HepaRG (d-imHC, d-HepaRG), HBV virion ile aşılamadan 2 saat önce anti-HBV adayları ile profilaktik olarak tedavi edildi. Deneyin beklenen sonucu, hücresel HBV ve infektiviteyi azaltan ajanların tanımlanmasıydı. Anti-NTCP aktivitesi TCA alım testi kullanılarak değerlendirildi. NTCP etkinliği, NTCP'yi özel olarak bağlayan aracılar tarafından bastırılabilir. ITC tekniği, inhibitörleri ve hedef proteinlerini tahmin edebilen etkileşimli bağlanmanın fizibilitesini araştırmak, biyomoleküler kompleksin kovalent olmayan etkileşimleri yoluyla reseptör için ligandın bağlanma afinitesini (KD) belirlemek için kullanıldı23,24. Örneğin, K D ≥ 1 × 103 mM zayıf bağlanmayı, K D ≥ 1 × 106 μM orta derecede bağlanmayı ve K D ≤ 1 × 109 nM güçlü bağlanmayı temsil eder. ΔG, bağlanma etkileşimleri ile doğrudan ilişkilidir. Özellikle, negatif ΔG'li bir reaksiyon, bağlanmanın kendiliğinden bir süreç olduğunu gösteren ekzergonik bir reaksiyondur. Negatif bir ΔH ile reaksiyon, bağlanma işlemlerinin hidrojen bağlarına ve Van der Waals kuvvetlerine bağlı olduğunu gösterir. Hem TCA alımı hem de ITC verileri, anti-HBV giriş ajanlarını taramak için kullanılabilir. Bu protokollerin sonuçları sadece anti-HBV taraması için değil, aynı zamanda bağlanma afinitesi ve taşıma fonksiyonu ile değerlendirilen NTCP ile etkileşim için de bir temel sağlayabilir. Bu yazıda konakçı hücre hazırlığı ve karakterizasyonu, deneysel tasarım ve anti-HBV girişinin NTCP bağlanma afinitesi ile birlikte değerlendirilmesi anlatılmaktadır.
NOT: Aşağıdaki prosedürler Sınıf II biyolojik tehlike akış davlumbazında veya laminer akışlı davlumbazda gerçekleştirilmelidir. HBV'nin kullanımı IRB (MURA2020/1545) tarafından etik olarak onaylanmıştır. Bu protokolde kullanılan tüm çözümler, reaktifler, ekipman ve hücre hatları hakkında ayrıntılar için Malzeme Tablosu'na bakın.
1. Konakçı hücrelerin hazırlanması (olgun hepatositler)
2. Hücresel NTCP'nin nicelleştirilmesi
3. Hücre kültürü kaynaklı HBV parçacıklarının üretimi (HBVcc)
4. Anti-HBV giriş testi
5. HBV-hücre bağlama testi
6. Taurokolik asit (TCA) alım testi
7. İzotermal titrasyon kalorimetrisi kullanılarak protein-ligand etkileşimlerinin belirlenmesi
NOT: Bu tahlil sistemi MicroCal PEAQ-ITC (ITC yazılımı) temel alınarak geliştirilmiştir.
8. İstatistiksel analiz
Özellikle imHC'nin diferansiye aşamasında binüklee hücreler ve poligonal şekilli morfoloji (Şekil 1) dahil olmak üzere hepatik olgunlaşma özellikleri gözlenmiştir (Şekil 1A). NTCP ekspresyonunda büyük bir artış d-HepaRG ve d-imHC'de sırasıyla 7 kat ve 40 kat olarak ölçülmüştür (Şekil 1B). HBV girişine duyarlılık kazandırdığı varsayılan NTCP'nin yüksek glikozile formu, d-imHC'de d-HepaRG'ye göre daha fazla saptandı (Şekil 1C). Diferansiye imHC, farklılaşmamış hücrelere göre% 65.9 daha yüksek NTCP seviyeleri içeriyordu (Şekil 1D).
Şekil 2A , profilaktik tedavinin bir özetini göstermektedir. Şekil 2B, enfeksiyon sonrası 7. günde anti-HBV giriş aktivitelerini değerlendirmek için yapılan HBV immünofloresan boyamasını gösterirken, Şekil 2C , HBV bağlama testi protokolünü özetlemektedir. Hücre yüzey reseptörü üzerindeki HBV bağlanma düzeyi gerçek zamanlı PCR ile değerlendirildi (Şekil 2D). NTCP'nin HBV ataşmanı için reseptör olup olmadığını belirlemek için, aday bağlayıcı inhibitörler için TCA alımı belirlendi (Şekil 2E). Bu modele dayanarak, aday bileşiklerin varsayılan inhibitör aktivitesi, NTCP yoluyla HBV bağlanmasını azaltmıştır.
Kalorimetrik değişiklik, numune hücresine sürekli enjeksiyonlarla tespit edildi (Şekil 3). Standart bir doğrusal olmayan en küçük kareler regresyonu, verilere iyi oturmuş bir bağlama bölgesine dayanarak çizildi. Düz çizgi, deneysel değerlere en uygun olanı gösterdi (Şekil 3A, B). Tablo 1 , NTCP'nin siklosporin A (CsA) veya aday bir bileşik ile bağlanması ile ilişkili termodinamik parametreleri göstermektedir.
Şekil 1: NTCP karakterizasyonu ile HepaRG ve imHC'nin hepatik olgunlaşması. Her iki hücre hattı da 2 hafta boyunca hepatik olgunlaşma ortamında kültürlendi. (A) Binüklee hücreler ve poligonal şekilli morfoloji gibi hepatosit özellikleri sadece imHC'nin olgunlaşma aşamasında gözlenmiştir. Ölçek çubukları = 50 μm. (B) NTCP ekspresyonu hem HepaRG hem de imHC'de yukarı regüle edildi. GAPDH ile normalize edilen NTCP, imHC'de HepaRG'den daha yüksekti. (C) Olgunlaşmadan sonra NTCP'nin yüksek glikozile edilmiş bir formu gözlendi. (D) d-imHC'de NTCP yükselme yüzdesi akım sitometrisi kullanılarak değerlendirildi. *, ** ve *** sırasıyla p ± 0.05, p < 0.01 ve p < 0.001 ile istatistiksel farkı temsil <. Kısaltmalar: NTCP = sodyum taurokolat birlikte taşınan polipeptit; GAPDH = gliseraldehit 3-fosfat dehidrojenaz; NTCP-FITC = floresein izotiyosiyanat etiketli NTCP. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Profilaktik CCM tedavisi viral girişi, hücre içi HBV DNA'sını ve TCA alım aktivitesini azalttı. (A) d-imHC, HBV ile aşılamadan önce 2 saat boyunca CCM ile ön tedavi edildi. (B) Anti-HBV giriş aktivitesi, enfeksiyon sonrası 7. günde immünofloresan boyama ile belirlendi. (C) HBV bağlama protokolünün şematik bir zamanlaması sunulur. (D) Hepatositler üzerindeki bağlı HBV DNA düzeyi değerlendirildi ve 4 μM CsA ve klasik HBV giriş inhibitörü 25 ünite/mL heparin ile karşılaştırıldı. (E) 10-30 μM CCM'nin TCA alım inhibisyonu üzerindeki etkisine NTCP reseptörü aracılığıyla aracılık edildi. Kısaltmalar: CCM = curcumin; HBV = hepatit B virüsü; TCA = taurokolik asit; d-imHC = farklılaşmış imHC; CsA = siklosporin A; HP = heparin. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: NTCP'nin bireysel moleküllere (CsA veya aday bileşik) afinitesi ITC kullanılarak gösterilmiştir. NTCP'nin (A) CsA veya (B) kurkumin ile kombinasyonu için ITC profili, NTCP çözeltisine (15 μM NTCP, pH 7.0, 25 ° C) bir bileşiğin (150 μM CsA veya aday) sıralı enjeksiyonundan üretilmiştir. Diferansiyel güç (μcal/s) ve zaman (min) arasındaki kalorimetrik ham veriler çizildi. Veriler, katı çizgilerin en uygun sonuçları gösterdiği tek bölgeli bir bağlama modeline dayanarak analiz edildi. NTCP çözeltisine ligandların (CSA veya kurkumin) enjeksiyonu sırasında, entalpi (ΔH), numune hücresindeki ligand konsantrasyonunda bir artıştan sonra değişti. Bu veriler bağlanma reaksiyonunun oluştuğunu göstermektedir. Kısaltmalar: CsA = siklosporin A; NTCP = sodyum taurokolat birlikte taşıyan polipeptit; ITC = izotermal titrasyon kalorimetrisi; DP = diferansiyel güç. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Protein | Ligand | Bağlama sabiti (KD) | Entalpi değişimi (ΔH) | Entropi değişimi (ΔTΔS) | Gibbs Serbest Enerji değişimi (ΔG) | Bağlama türü |
(M-1) | (kcal/mol) | (kcal/mol) | (kcal/mol) | |||
İnsan NTCP'si (SLA10A1) | CCM | 1.21 ×10-6 | -1 | 0.6 | -0.39 | Hidrojen bağı |
İnsan NTCP'si (SLA10A1) | TCA | 1 ×10-9 | 80 | -96 | -16 | Hidrofobik etkileşim |
Tablo 1: NTCP ile ITC kullanılarak bireysel bileşikler (CCM ve TCA) arasındaki etkileşimden kaynaklanan termodinamik parametreler. Kısaltmalar: NTCP = sodyum taurokolat birlikte taşınan polipeptit; CCM = kurkumin; TCA = taurokolik asit; ITC = izotermal titrasyon kalorimetrisi.
HBV enfeksiyonu, hepatositler25 üzerindeki heparan sülfat proteoglikanlarına (HSPG'ler) düşük afiniteli bağlanma ile başlatılır, ardından endositoz26 yoluyla daha sonra içselleştirme ile NTCP'ye bağlanır. NTCP, HBV girişi için çok önemli bir reseptör olduğundan, HBV girişini hedeflemek, de novo enfeksiyonu, anneden çocuğa bulaşmayı (MTCT) ve karaciğer nakli sonrası nüksünü azaltmak için klinik olarak çevrilebilir. Viral girişin kesilmesi, kronik HBV enfeksiyonu için uygulanabilir bir alternatif tedavi olacaktır.
Yukarıda belirtilen protokoldeki bazı kritik adımlar burada özetlenmiştir. Konakçı hücreleri hazırlarken,% 2 DMSO ile olgunlaşma ortamını eklemeden önce hepatositlerin% 100 akıcılığa ulaştığından emin olun. Subkonfluent hepatositlerin %2 DMSO'da kültürlenmesi hücre ölümüne ve dekolmanı ile sonuçlanacaktır. NTCP ekspresyonu27,28'i en üst düzeye çıkarmak için olgunlaşma süresi 4 haftaya kadar uzatılabilir, ancak 2 haftalık bir olgunlaşma süresi önerilir.
Hücresel NTCP ekspresyonunun nicelleştirilmesi için üç teknik önerilmiştir. Kullanıcıların en aşina oldukları tekniği seçmeleri önerilir; Burada batı leke analizine göre akış sitometrisini tercih ettik çünkü kullanışlı, hızlı ve kolay.
Hücre kültüründen türetilmiş HBV parçacıklarının (HBVcc) üretimi için HepG2.2.15, genetikin (G418) direnç geni29 ile birlikte HBV tam uzunlukta genom ile geçici transfeksiyon yoluyla HepG2'den türetilmiştir. Kültür ortamı 380-500 μg / mL genetikin içermelidir, aksi takdirde hücreler HBVcc üretmez. Düşük protein bağlayan, 0.45 μm filtre, HBV verimini kaybetmemek için süpernatantı netleştirmek için kullanılmalıdır. HBV'yi konsantre etmek için, standart bir santrifüj ile polietilen glikol (PEG) kullanıldı. HBV parçacıkları ayrıca bir sakkaroz gradyanı ve ultrasantrifüjleme kullanılarak konsantre edilebilir. Enfeksiyon azalacağı için çoklu donma ve çözülme döngülerinden kaçınılmalıdır.
Anti-HBV giriş testinde, hepatositler olgunlaşma indüksiyonundan önce% 100 birleşime ulaşmalıdır. Bu protokol profilaktik tedaviye dayalı olarak geliştirilmiştir. Konakçı hücreler, HBV12 ile enfeksiyondan önce 2 saat boyunca aday bileşiklere maruz bırakıldı. Enfeksiyondan 7 gün sonra, HBV enfeksiyonu immünofloresan kullanılarak değerlendirildi. Tüm bileşenler, blokaj çözeltisinin konsantrasyonları, birincil ve ikincil antikorlar ve yıkama adımları, minimum spesifik olmayan lekelenme ile en iyi sonucu elde etmek için optimize edilmelidir. Burada, optimize edilmiş konsantrasyonlar ve teknikler sağladık.
TCA alım testi protokolü, NTCP transportunun inhibisyonu için altın standardı tanımlamaktadır. Radyoaktif TCA'yı önlemek için protokolü değiştirdik. TCA alım testi için kritik adımlar hücre yıkama ve hasattır. Tüm bu prosedürler, bileşiğin daha fazla hücresel aktivitesini-içselleşmesini önlemek için her zaman buz üzerinde yapılmalıdır. Hücreleri homojenize ettikten ve hücre kalıntılarını peletledikten sonra, süpernatant pelet bozulmadan nazikçe aspire edilmelidir. Kullanıcının tesisi sıvı sintilasyon tekniğinin kullanımına izin veriyorsa, TCA taşıma ve alım çalışmalarında 3H-taurokolik asit yaygın olarak kullanılır. ELISA kullanarak TCA alımını doğruladığımız için, bu alternatif teknik radyoaktif bileşiğin kullanımının yerini alabilir.
ITC, çözünür proteinler ile küçük moleküler ağırlıklı ligandlar arasındaki etkileşimlere bağlı termodinamik parametreleri belirlemek için yaygın olarak kullanılan biyofiziksel bir yöntemdir30,31. Bu teknik, çeşitli ligandların küçük bir molekül veya protein ile etkileşimini araştırmak için kullanılabilir. ITC, sinyal tespiti için ek adımlar, moleküler ağırlık sınırlamaları ve etiketleme, immobilizasyon veya başka herhangi bir kimyasal modifikasyon içermeyen doğrudan ve invaziv olmayan bir yöntemdir. ITC'nin sınırlandırılması, etkileşime giren malzemelerin yüksek konsantrasyonlarının ön koşuludur. Protein ve ligand, karıştırılarak 1 saat boyunca 25 °C'de suda (10-100 μM) yüksek oranda arıtılmalı ve yeterince çözünür olmalıdır. Kararsız protein çözeltisi, zamanın bir fonksiyonu olarak ısı sinyali değişimi yoluyla tespit edilebilir.
İnsan tarafından geliştirilmiş NTCP hepatositleri, HBV enfeksiyonunun in vitro çalışması için alternatif bir model sağlar, ancak HepaRG ve primer insan hepatositlerine benzer. Bu konakçı modeller, sınırlı güvenilirlikleri ve duyarlılıklarınedeniyle engellenmektedir 8,33. HepG2-NTCP veya Huh7-NTCP hücrelerinde verimsiz HBV yayılımı, HBVcc üreten hücrelerden türetilen düşük HBV inokülümü ile kanıtlanmıştır. Birkaç çalışmada, HBV, hedef hücreleri 1.00033,34'lük bir MOI'de enfekte etmek için kullanıldı. HBVcc'deki subviral parçacıklar HBV zarf proteini (L / M / S) içerir ve NTCP'yi rekabetçi bir şekilde bağlar, bu da enfeksiyonun azalmasına neden olur35. Bu sınırlamanın üstesinden gelmek için, bu protokol NTCP seviyelerini en üst düzeye çıkarmak için HepaRG veya imHC kültürünü bir olgunlaşma protokolü ile değiştirdi. HepG2.2.15'ten türetilen HBVcc, inokülum olarak kullanılmadan önce konsantre edildi. HBV kor antijeni11'in ölçümüne bağlı olarak diferansiye imHC'de HBV infektivitesi %80'den yüksekti.
Viral girişi kesmek için NTCP'yi hedef alan anti-HBV bileşiklerinin tanımlanmasını tanımladık ve NTCP seviyelerini artırmak için hepatik olgunlaşma prosedürünü benimsedik. Giriş inhibitörlerini tanımlamak için, hepatositler, viral bağlanmaya izin vermek için 4 ° C'de HBV ile enfeksiyondan önce 2 saat boyunca aday bileşiklerle ön işlemden geçirildi, ancak girişe izin verilmedi. HBV infektivitesindeki azalma enfeksiyon sonrası 7. günde değerlendirildi. Temsili veriler, modeli doğrulamak için pozitif bir kontrol olarak klasik bir NTCP inhibitörü olan siklosporin A'yı içeriyordu.
NTCP hem taşıyıcı hem de reseptör aracılı endositoz fonksiyonlarını kolaylaştırdığından, HBV giriş inhibitörleri bu mekanizmalardan en az birini hedefleyebilir. NTCP transportunun inhibisyonu, ELISA'ya dayalı bir TCA alım testi kullanılarak değerlendirilebilir ve radyoaktif TCA'yı klasik protokol36'dan elimine eder. NTCP ve giriş inhibitörü arasındaki afinite ITC kullanılarak ölçüldü. Bu teknik, stokiyometri (n), ayrışma sabiti (KD), serbest enerjideki değişim (ΔG), entalpi (ΔH), entropi (ΔS) ve bağlanmanın ısı kapasitesi (ΔCp) dahil olmak üzere temel termodinamik parametreleri sağlamıştır. Çeşitli anti-HBV ajanları, bir nükleozid analoğu olan lamivudin ile karşılaştırılabilir HBV ters transkriptazı spesifik olarak bağlayabilen quercetin, rutin, hesperidin ve luperol gibi moleküler kenetlenme ile tanımlanmıştır. Bileşikler ITC kullanılarak araştırıldı ve HBV polimeraz37 ile -9.3 ila -5.2 kcal / mol arasında değişen negatif Gibb enerjisi (-ΔG) ve 1 × 10-6 ila 1 × 10-3 M KD sergiledi. Birlikte ele alındığında, yukarıda belirtilen bu testlerden elde edilen veriler, HBV giriş inhibitörleri olarak işlev gören aday bileşiklerin antiviral etkinliğinin taranmasına yardımcı olacaktır. Oluşturulan protokol, yeni NTCP antagonistlerini / inhibitörlerini keşfetmek için yararlı olacaktır. Viral girişin baskılanması profilaktik ve terapötik tedavide yararlı olabilir.
Yazarlar, araştırmanın potansiyel bir çıkar çatışması olarak yorumlanabilecek herhangi bir ticari veya finansal ilişkinin yokluğunda yapıldığını beyan etmektedir.
Bu araştırma projesi, Mahidol Üniversitesi ve Tayland Bilim Araştırma ve İnovasyon (TSRI) tarafından ayrı ayrı A. Wongkajornsilp ve K. Sa-ngiamsuntorn'a verilen desteklenmektedir. Bu çalışma, Ulusal Yüksek Öğretim Bilim Araştırma ve İnovasyon Politikası Konseyi Ofisi tarafından Rekabet Edebilirlik Program Yönetim Birimi (hibe numarası C10F630093) aracılığıyla finansal olarak desteklenmiştir. A. Wongkajornsilp Mahidol Üniversitesi Siriraj Hastanesi Tıp Fakültesi Chalermprakiat hibesi sahibidir. Yazarlar, ITC tekniğindeki yardımları için Bayan Sawinee Seemakhan'a (Mahidol Üniversitesi Fen Fakültesi, İlaç Keşfi Mükemmel Merkezi) teşekkür eder.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Cell lines | |||
HepaRG Cells, Cryopreserved | Thermo Fisher Scientific | HPRGC10 | |
Hep-G2/2.2.15 Human Hepatoblastoma Cell Line | Merck | SCC249 | |
Reagents | |||
4% Paraformadehyde Phosphate Buffer Solution | FUJIFLIM Wako chemical | 163-20145 | |
BD Perm/Wash buffer | BD Biosciences | 554723 | Perm/Wash buffer |
Cyclosporin A | abcam | 59865-13-3 | |
EDTA | Invitrogen | 15575-038 | 8 mM |
G 418 disulfate salt | Merck | 108321-42-2 | |
Halt Protease Inhibitor Cocktail EDTA-free (100x) | Thermo Scientific | 78425 | |
HEPES | Merck | 7365-45-9 | |
illustraTM RNAspin Mini RNA isolation kits | GE Healthcare | 25-0500-71 | |
illustra RNAspin Mini RNA Isolation Kit | GE Healthcare | 25-0500-71 | |
ImProm-II Reverse Transcription System | Promega | A3800 | |
KAPA SYBR FAST qPCR Kit | Kapa Biosystems | KK4600 | |
Lenti-X Concentrator | Takara bio | PT4421-2 | concentrator |
Luminata crescendo Western HRP substrate | Merck | WBLUR0100 | |
Master Mix (2x) Universal | Kapa Biosystems | KK4600 | |
Nucleospin DNA extraction kit | macherey-nagel | 1806/003 | |
Phosphate buffered saline | Merck | P3813 | |
Polyethylene glycol 8000 | Merck | 25322-68-3 | |
ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo scientific | P36930 | |
Recombinant NTCP | Cloud-Clone | RPE421Hu02 | |
RIPA Lysis Buffer (10x) | Merck | 20-188 | |
TCA | Sigma | 345909-26-4 | |
TCA Elisa kit | Mybiosource | MB2033685 | |
Triton X-100 | Merck | 9036-19-5 | |
Trypsin-EDTA | Gibco | 25200072 | Dilute to 0.125% |
Antibodies | |||
Anti-NTCP1 antibody | Abcam | ab131084 | 1:100 dilution |
Anti-GAPDH antibody | Thermo Fisher Scientific | AM4300 | 1:200,000 dilution |
HRP-conjugated goat anti-rabbit antibody | Abcam | ab205718 | 1:10,000 dilution |
HRP goat anti-mouse secondary antibody | Abcam | ab97023 | 1:10,000 dilution |
Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11008 | 1:500 dilution |
Reagent composition | |||
1° Antibody dilution buffer | |||
1x TBST | |||
3% BSA | Sigma | A7906-100G | Working concentration: 3% |
Sodium azide | Sigma | 199931 | Working concentration: 0.05% |
Hepatocyte Growth Medium | |||
DME/F12 | Gibco | 12400-024 | |
10% FBS | Sigma Aldrich | F7524 | |
1% Pen/Strep | HyClon | SV30010 | |
1% GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | |
Hepatic maturation medium | |||
Williams’ E medium | Sigma Aldrich | W4125-1L | |
10% FBS | Sigma Aldrich | F7524 | |
1% Pen/Strep | HyClon | SV30010 | |
1% GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | |
5 µg/mL Insulin | Sigma Aldrich | 91077C-100MG | |
50 µM hydrocotisone | Sigma Aldrich | H0888-1g | |
2% DMSO | PanReac AppliChem | A3672-250ml | |
IF Blocking solution | |||
1x PBS | Gibco | 21300-058 | |
3% BSA | Sigma | A7906-100G | Working concentration: 3% |
0.2% Triton X-100 | Sigma | T8787 | Working concentration: 0.2% |
RIPA Lysis Buffer Solution | Merck | 20-188 | Final concentration: 1X |
Protease Inhibitor Cocktail | Thermo Scientific | 78425 | Final concentration: 1X |
Na3VO4 | Final concentration: 1 mM | ||
PMSF | Final concentration: 1 mM | ||
NaF | Final concentration: 10 mM | ||
Western blot reagent | |||
10x Tris-buffered saline (TBS) | Bio-Rad | 170-6435 | Final concentration: 1X |
Tween 20 | Merck | 9005-64-5 | |
1x TBST | 0.1% Tween 20 | ||
1x PBS | Gibco | 21300-058 | |
Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | A53225 | |
Polyacrylamide gel | Bio-Rad | 161-0183 | |
Ammonium Persulfate (APS) | Bio-Rad | 161-0700 | Final concentration: 0.05% |
TEMED | Bio-Rad | 161-0800 | Stacker gel: 0.1%, Resolver gel: 0.05% |
2x Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 161-0737 | Final concentration: 1X |
Precision Plus Protein Dual Color Standards | Bio-Rad | 161-0374 | |
WB Blocking solution/ 2° Antibody dilution buffer | |||
1x TBST | |||
5% Skim milk (nonfat dry milk) | Bio-Rad | 170-6404 | Working concentration: 5% |
1x Running buffer 1 L | |||
10x Tris-buffered saline (TBS) | Bio-Rad | 170-6435 | Final concentration: 1X |
Glycine | Sigma | G8898 | 14.4 g |
SDS | Merck | 7910 | Working concentration: 0.1% |
Blot transfer buffer 500 mL | |||
10x Tris-buffered saline (TBS) | Bio-Rad | 170-6435 | Final concentration: 1X |
Glycine | Sigma | G8898 | 7.2 g |
Methanol | Merck | 106009 | 100 mL |
Mild stripping solution 1 L | Adjust pH to 2.2 | ||
Glycine | Sigma | G8898 | 15 g |
SDS | Merck | 7910 | 1 g |
Tween 20 | Merck | 9005-64-5 | 10 mL |
Equipments | |||
15 mL centrifuge tube | Corning | 430052 | |
50 mL centrifuge tube | Corning | 430291 | |
Airstream Class II | Esco | 2010621 | Biological safety cabinet |
CelCulture CO2 Incubator | Esco | 2170002 | Humidified tissue culture incubator |
CFX96 Touch Real-Time PCR Detector | Bio-Rad | 1855196 | |
FACSVerse Flow Cytometer | BD Biosciences | 651154 | |
Graduated pipettes (10 mL) | Jet Biofil | GSP010010 | |
Graduated pipettes (5 mL) | Jet Biofil | GSP010005 | |
MicroCal PEAQ-ITC | Malvern | Isothermal titration calorimeters | |
Mini PROTEAN Tetra Cell | Bio-Rad | 1658004 | Electrophoresis chamber |
Mini Trans-blot absorbent filter paper | Bio-Rad | 1703932 | |
Omega Lum G Imaging System | Aplegen | 8418-10-0005 | |
Pipette controller | Eppendorf | 4430000.018 | Easypet 3 |
PowerPac HC | Bio-Rad | 1645052 | Power supply |
PVDF membrane | Merck | IPVH00010 | |
T-75 cell culture flask | Corning | 431464U | |
Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell | Bio-Rad | 1703940 | Semi-dry transfer cell |
Ultrasonic processor (Vibra-Cell VCX 130) | Sonics & Materials | ||
Versati Tabletop Refrigerated Centrifuge | Esco | T1000R | Centrifuge with swinging bucket rotar |
Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi
Izin talebiThis article has been published
Video Coming Soon
JoVE Hakkında
Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır