Un modello di epatociti competente che esamina l'ingresso del virus dell'epatite B attraverso il taurococolato di sodio che trasporta il polipeptide come bersaglio terapeutico

Presentiamo un protocollo per lo screening dei composti del virus anti-epatite B (HBV) mirati alle fasi del ciclo di vita di ingresso pre e post-virale, utilizzando la calorimetria isotermica di titolazione per misurare l'affinità di legame (K_D) con il polipeptide cotrasportante del taurocolato di sodio ospite. L'efficacia antivirale è stata determinata attraverso la soppressione dei marcatori del ciclo di vita virale (formazione del cccDNA, trascrizione e assemblaggio virale).

L'infezione da virus dell'epatite B (HBV) è stata considerata un fattore di rischio cruciale per il carcinoma epatocellulare. Il trattamento attuale può solo ridurre la carica virale ma non provocare una remissione completa. Un modello epatocitario efficiente per l'infezione da HBV offrirebbe un ciclo di vita virale realistico che sarebbe cruciale per lo screening degli agenti terapeutici. La maggior parte degli agenti anti-HBV disponibili si rivolge alle fasi del ciclo di vita dopo l'ingresso virale, ma non prima dell'ingresso virale. Questo protocollo descrive in dettaglio la generazione di un modello di epatociti competente in grado di selezionare gli agenti terapeutici mirati alle fasi del ciclo di vita dell'ingresso pre-virale e post-virale. Ciò include il targeting del legame del polipeptide cotrasportatore di taurocolato di sodio (NTCP), la formazione del cccDNA, la trascrizione e l'assemblaggio virale basato su imHC o HepaRG come cellule ospiti. Qui, il test di inibizione dell'ingresso HBV ha utilizzato la curcumina per inibire il legame e le funzioni di trasporto dell'HBV tramite NTCP. Gli inibitori sono stati valutati per l'affinità di legame (K_D) con NTCP utilizzando la calorimetria isotermica di titolazione (ITC), uno strumento universale per lo screening dei farmaci HBV basato su parametri termodinamici.

L'infezione da virus dell'epatite B (HBV) è considerata una malattia pericolosa per la vita in tutto il mondo. L'infezione cronica da HBV è carica di un rischio di cirrosi epatica e carcinoma epatocellulare¹. L'attuale trattamento anti-HBV si concentra principalmente sull'ingresso post-virale utilizzando analoghi nucleos(t)ide (NAs) e interferone-alfa (IFN-α)^2,3. La scoperta di un inibitore dell'ingresso dell'HBV, Myrcludex B, ha identificato un nuovo bersaglio per gli agenti anti-HBV⁴. La combinazione di inibitori di ingresso e NA nell'HBV cronico ha ridotto significativamente la carica virale rispetto a quelli mirati alla sola replicazione virale ^5,6. Tuttavia, il modello classico di epatociti per lo screening degli inibitori dell'ingresso dell'HBV è limitato da bassi livelli di recettori virali (polipeptide di cotrasporto del taurocolato di sodio, NTCP). La sovraespressione di hNTCP nelle cellule di epatoma (cioè HepG2 e Huh7) migliora l'infettività dell'HBV ^7,8. Tuttavia, queste linee cellulari esprimono bassi livelli di enzimi che metabolizzano i farmaci di fase I e II e mostrano instabilità genetica⁹. I modelli di epatociti che possono aiutare a colpire meccanismi distinti di composti anti-HBV candidati come l'ingresso previrale, il legame NTCP e l'ingresso virale accelererebbero l'identificazione e lo sviluppo di regimi di combinazione efficaci. Lo studio per l'attività anti-HBV della curcumina ha chiarito l'inibizione dell'ingresso virale come un nuovo meccanismo oltre all'interruzione post-ingresso virale. Questo protocollo descrive un modello ospite per lo screening delle molecole di ingresso anti-HBV¹⁰.

L'obiettivo di questo metodo è quello di esplorare i composti anti-HBV candidati per l'inibizione dell'ingresso virale, in particolare bloccando il legame e il trasporto NTCP. Poiché l'espressione di NTCP è un fattore critico per l'ingresso e l'infezione da HBV, abbiamo ottimizzato il protocollo di maturazione degli epatociti per massimizzare i livelli di NTCP¹¹. Inoltre, questo protocollo può differenziare l'effetto inibitorio sull'ingresso dell'HBV come inibizione dell'attaccamento dell'HBV rispetto all'inibizione dell'internalizzazione. Anche il test di assorbimento dell'acido taurocolico (TCA) è stato modificato utilizzando un metodo basato su ELISA anziché un radioisotopo per rappresentare il trasporto NTCP^12,13. L'interazione tra recettore e ligando è stata confermata dalle loro strutture 3D^14,15. L'inibizione della funzione NTCP può essere valutata misurando l'attività di captazione del TCA¹⁶. Tuttavia, questa tecnica non ha fornito prove dirette del legame NTCP ai candidati inibitori. Pertanto, il legame può essere studiato utilizzando varie tecniche, come la risonanza plasmonica di superficie 17, ELISA, saggio di spostamento termico basato sulla fluorescenza (FTSA) ¹⁸, FRET¹⁹, AlphaScreen e vari altri metodi²⁰. Tra queste tecniche, l'ITC è uno standard obiettivo nell'analisi di legame perché può osservare l'assorbimento o l'emissione di calore in quasi tutte le reazioni²¹. L'affinità di legame (K_D) di NTCP e composti candidati è stata valutata direttamente utilizzando ITC; Questi valori di affinità erano più precisi di quelli ottenuti utilizzando il modello di previsione in silico ²².

Questo protocollo copre le tecniche di maturazione degli epatociti, l'infezione da HBV e lo screening per l'inibitore dell'ingresso dell'HBV. In breve, è stato sviluppato un modello di epatociti basato su linee cellulari imHC e HepaRG. Le cellule coltivate sono state differenziate in epatociti maturi entro 2 settimane. La sovraregolazione dei livelli di NTCP è stata rilevata utilizzando la PCR in tempo reale, il western blot e la citometria a flusso¹¹. Il virione dell'epatite B (HBVcc) è stato prodotto e raccolto da HepG2.2.15. L'imHC differenziato o HepaRG (d-imHC, d-HepaRG) è stato trattato profilatticamente con i candidati anti-HBV 2 ore prima dell'inoculazione con il virione HBV. Il risultato atteso dell'esperimento era l'identificazione degli agenti che riducono l'HBV cellulare e l'infettività. L'attività anti-NTCP è stata valutata utilizzando il test di assorbimento TCA. L'attività NTCP potrebbe essere soppressa dagli agenti che hanno associato specificamente NTCP. La tecnica ITC è stata impiegata per studiare la fattibilità di un legame interattivo che potrebbe prevedere gli inibitori e le loro proteine bersaglio, determinando l'affinità di legame (K_D) del ligando per il recettore attraverso interazioni non covalenti del complesso biomolecolare^23,24. Ad esempio, K D ≥ 1 × 10³ mM rappresenta il legame debole, K D ≥ 1 × 10⁶ μM rappresenta un legame moderato e K _D ≤ 1 × 10⁹ nM rappresenta un legame forte. Il ΔG è direttamente correlato con le interazioni di legame. In particolare, una reazione con ΔG negativo è una reazione esoergonica, che indica che il legame è un processo spontaneo. Una reazione con un ΔH negativo indica che i processi di legame dipendono dal legame idrogeno e dalle forze di Van der Waals. Sia l'assorbimento del TCA che i dati ITC potrebbero essere utilizzati per lo screening degli agenti di ingresso anti-HBV. I risultati di questi protocolli possono fornire una base non solo per lo screening anti-HBV, ma anche per l'interazione con NTCP valutata attraverso l'affinità di legame e la funzione di trasporto. Questo articolo descrive la preparazione e la caratterizzazione della cellula ospite, il disegno sperimentale e la valutazione dell'ingresso anti-HBV insieme all'affinità di legame NTCP.

NOTA: Le seguenti procedure devono essere eseguite in una cappa di flusso di pericolo biologico di classe II o in una cappa a flusso laminare. La gestione dell'HBV è stata eticamente approvata dall'IRB (MURA2020/1545). Vedere la tabella dei materiali per i dettagli su tutte le soluzioni, i reagenti, le apparecchiature e le linee cellulari utilizzate in questo protocollo.

1. Preparazione delle cellule ospiti (epatociti maturi)

1. Epatociti di coltura (3,75 × 10⁵ cellule HepaRG o imHC) e mantenere in un matraccio di coltura di 75 cm² con 10 ml di terreno DMEM/F12 integrato con siero bovino fetale (FBS) al 10%, all'1% di L-glutammina, a 100 U/mL di penicillina e a 100 μg/mL di streptomicina. Attendere che le cellule raggiungano l'80% -90% di confluenza (entro 1 settimana).
2. Eliminare il vecchio mezzo dal matraccio e lavare le cellule con 4 ml di soluzione salina tamponata fosfato (PBS).
3. Aspirare il PBS e aggiungere 4 ml di tripsina-EDTA allo 0,05%.
4. Incubare il pallone nell'incubatore a 37 °C per 2-3 minuti e controllare le cellule aderenti utilizzando un microscopio invertito con una lente obiettivo 10x. Assicurarsi che il monostrato si sia staccato dalla superficie di coltura.
5. Inibire la tripsina aggiungendo 4 ml di terreno di coltura integrato con FBS al 10% al pallone e risospendere accuratamente le cellule raccolte. Trasferire la sospensione cellulare in un tubo conico da 15 mL e centrifugare per 3 minuti a 300 × g, 25 °C.
6. Aspirare il surnatante dal pellet cellulare e risospendere con 1-2 ml di terreno di coltura preriscaldato integrato con FBS al 10% e antibiotici.
7. Mescolare 10 μL ciascuna delle sospensioni cellulari e del blu tripano e contare le cellule utilizzando un emocitometro. Assicurarsi che la vitalità cellulare sia superiore al 90% prima di procedere alla fase successiva.
8. Seminare 1 × 10 6 cellule per 2 ml in ciascun pozzetto di una piastra a⁶ pozzetti e mantenere in DME / F12 mezzo completo fino a quando le cellule raggiungono il 100% di confluenza.
9. Per la maturazione epatica, preparare il terreno di maturazione epatica (mezzo E di Williams integrato con 10% FBS, 100 U / mL di penicillina, 100 μg / mL di streptomicina, 5 μg / mL di insulina, 50 μM di idrocortisone, 2 mM di L-glutammina e 2% di DMSO).
10. Sostituire il terreno di coltura 2 volte a settimana.
11. Mantenere gli epatociti nel mezzo di maturazione per 2 settimane per ottenere epatociti maturi pronti per l'infezione da HBV.

2. Quantificazione delle NTCP cellulari

1. Misurazione dell'espressione NTCP mediante PCR in tempo reale
   1. Raccogliere il pellet di epatociti maturi attraverso tripsinizzazione (vedere Passi 1.2-1.5).
   2. Estrarre l'RNA totale dal pellet cellulare utilizzando un kit di estrazione dell'RNA con trattamento con DNasi I.
   3. Sintetizzare il cDNA da 200 ng di RNA totale utilizzando un primer oligo-dT e un sistema di trascrizione inversa seguendo le istruzioni del produttore.
   4. Diluire il cDNA a 50 ng/μL e usarlo come modello per la reazione PCR. Miscelare 2 μL di cDNA diluito con i reagenti master mix PCR contenenti la soluzione SYBR green qRT-PCR Kit con primer specifici per NTCP da 5 μM (5'-GGACATGAACCTCAGCATTGTG-3' e 5'-ATCATAGATCCCCCTGGAGTAGAT-3').
   5. Per la normalizzazione, utilizzare GAPDH come gene housekeeping con primer specifici (5'-GAAATCCCATCACCATCTTCC-3' e 5'-AAATGAGCCCCAGCCCTCTC-3').
   6. Amplificare i campioni di cDNA utilizzando un termociclatore nelle seguenti condizioni di temperatura: 1 ciclo di 3 min a 95 °C (denaturazione iniziale); 40 cicli di 30 s a 95 °C (denaturazione), 30 s a 60 °C a 65 °C (ricottura), 30 s a 72 °C (estensione); 1 ciclo di 5 min a 72 °C (estensione finale).
   7. Calcolare la variazione del fold NTCP negli epatociti maturi su cellule indifferenziate usando GAPDH come gene calibratore basato sul metodo ^2-ΔΔCT .
2. Quantificazione di NTCP mediante l'analisi western blot
   1. Raccogliere gli epatociti utilizzando un raschietto cellulare e centrifugarli a 300 x g, 25 °C per 5 minuti per raccogliere il pellet cellulare.
   2. Seguire le istruzioni del produttore del tampone RIPA per estrarre la proteina cellulare con 100 μL di tampone RIPA contenente 1x inibitore della proteasi.
   3. Misurare la concentrazione proteica totale utilizzando il metodo dell'acido bicinconinico (BCA).
   4. Mescolare 12,5 μL di proteine con colorante caricante 2x in un rapporto 1:1 in volume.
   5. Far bollire la miscela proteica e la scala standard a 95 °C per 5 minuti.
   6. Aggiungere 1x buffer di corsa alla camera di elettroforesi.
   7. Caricare 5 μL della scala proteica standard o 20 μL della miscela proteica bollita in un gel di poliacrilammide al 10% (p/v).
   8. Eseguire l'elettroforesi su gel: 50 V per 30 minuti seguita da 90 V per 1 ora a temperatura ambiente.
   9. Preparare una membrana PVDF immergendola in metanolo per 30 secondi, lavarla con acqua bidistillata per 1-2 minuti e immergerla insieme a due pezzi di carta da filtro nel tampone di trasferimento per 10 minuti o fino all'uso.
   10. Posizionare la carta da filtro sulla piastra anodica di una cella di trasferimento semi-secca; quindi, posizionare la membrana PVDF, il gel e la carta da filtro sopra, in questo ordine.
   11. Trasferire le proteine dal gel alla membrana PVDF a 10 V per 25 minuti a temperatura ambiente.
   12. Bloccare la membrana con la soluzione di blocco WB per 1 ora a temperatura ambiente.
   13. Incubare la membrana con polipeptide cotrasportante taurocolato anti-sodio (anti-NTCP) (diluizione 1:100) a 4 °C durante la notte.
   14. Lavare la membrana 3 x 10 minuti con TBST.
   15. Incubare la membrana con anticorpo anti-coniglio di capra coniugato con perossidasi di rafano (HRP) (diluizione 1:10.000) per 1 ora a temperatura ambiente.
   16. Lavare la membrana 3 x 10 minuti con TBST e poi 1 x 5 minuti con TBS.
   17. Rilevare NTCP utilizzando un substrato HRP (vedere la tabella dei materiali).
   18. Aggiungere almeno 0,1 ml di soluzione di substrato HRP/cm² della membrana e incubare la membrana per 3-5 minuti al buio.
   19. Visualizza NTCP utilizzando un sistema di documentazione su gel in modalità chemiluminescenza, seleziona l'opzione marcatore per la membrana, regola il tempo di esposizione con modalità cumulativa ogni 1 minuto e scatta la foto con vari tempi di esposizione per 5 minuti.
   20. Strisciare e sondare la macchia con l'anticorpo anti-GAPDH del topo (diluizione 1:200.000) e l'anticorpo secondario anti-topo coniugato con HRP (diluizione 1:10.000).
3. Misurazione del livello NTCP mediante citometria a flusso
   1. Raccogliere i pellet cellulari degli epatociti maturi incubando le cellule con 8 mM EDTA per 15 minuti.
      NOTA: Evitare l'uso di tripsina o altre proteasi che possono disturbare i recettori della superficie cellulare. Poiché NTCP è una proteina del recettore della superficie cellulare, il danno dovuto alla tripsinizzazione può dare risultati negativi.
   2. Fissare gli epatociti con 300 μL di paraformaldeide al 3,7% in 1x PBS per 15 minuti. Trasferire la sospensione cellulare in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL e centrifugare per 10 minuti a 300 × g, 25 °C.
   3. Lavare le celle 2x con 700 μL di 1x PBS con 1% FBS (v/v), centrifugare per 10 minuti a 300 × g, 25 °C, aggiungere 300 μL di Triton X-100 allo 0,05% in PBS al pellet cellulare e incubare le cellule a temperatura ambiente per 20 minuti per permeabilizzarle.
   4. Centrifugare per 10 min a 300 × g, 25 °C, lavare il pellet cellulare 3 x 1 min con 700 μL di PBS contenente 1% FBS (v/v). Incubare le cellule con l'anticorpo primario contro NTCP (diluizione 1:100) a 4 °C per 30 minuti. Lavare le celle 3 x 1 min con tampone permanente/lavabile e centrifugare per 10 minuti a 300 × g, 25 °C.
   5. Colorare le cellule con anticorpo secondario coniugato ad Alexa Fluor 488 a 4 °C per 30 min. Lavare le celle 3 x 1 min con tampone permanente/lavaggio e centrifugare per 10 minuti a 300 × g, 25 °C. Risospendere il pellet cellulare con 200 μL di PBS con 1% FBS (v/v).
   6. Accendere il citometro a flusso, riscaldare il laser per 15 minuti ed eseguire la pulizia di routine.
   7. Selezionare i parametri di misurazione, tra cui forward scatter (FSC), side scatter (SSC) e isotiocianato di fluoresceina (FITC) o ficoeritrina (PE), e impostare la regolazione automatica della compensazione da parte del software. Includere i campioni di controllo della compensazione: controllo non colorato, controllo colorato con FITC e controllo colorato con PE.
      NOTA: i parametri FSC e SSC vengono utilizzati per determinare la dimensione e la granularità delle singole celle per selezionare la popolazione cellulare per l'analisi gating. Il rilevatore di canali di fluorescenza ha canali FITC e PE . Per questo protocollo, selezionare il canale FITC per rilevare Alexa Fluor 488.
   8. Eseguire il campione non colorato con portata fluidica media (60 μL/min), regolare la soglia di FSC e SSC fino a coprire la popolazione cellulare di interesse, contrassegnare la regione del gate in quest'area e applicare a tutti i controlli di compensazione.
   9. Impostare il tubo fotomoltiplicatore a fluorescenza (PMT) utilizzando il controllo non colorato e regolare la tensione PMT di FITC o PE nel quadrante negativo. Eseguire il campione colorato positivo e regolare FITC o PE nella scala del quadrante positivo. Eseguire i controlli non colorati, FITC o PE, calcolare la compensazione e applicarla alle impostazioni del campione. Eseguire il campione di epatociti per misurare il livello NTCP.
   10. Analizzare gli epatociti colorati utilizzando il software di citometro a flusso (vedere la tabella dei materiali).
       1. Nelle finestre BD FACSuite, fare clic sul tubo di controllo nella scheda Origini dati e attendere che vengano visualizzati i dati grezzi.
       2. Nella scheda Foglio di lavoro sul lato destro, fare clic sul pulsante Ellipse Gate , selezionare la popolazione di celle in SSC e il dot plot FSC utilizzando il cursore del mouse e attendere che venga visualizzato il cerchio P1.
       3. Fare clic sul pulsante Interval Gate e contrassegnare la regione nell'istogramma FITC, partendo dal valore di intensità di fluorescenza più alto sul lato destro. Osservare la riga P2 che appare.
       4. Fare clic sulla provetta dell'esperimento e osservare che i dati nella scheda Foglio di lavoro cambiano. Fare clic sul pulsante Statistiche e quindi sullo spazio vuoto nel foglio di lavoro. Osservare i valori statistici della popolazione NTCP che appaiono.

3. Produzione delle particelle HBV derivate da colture cellulari (HBVcc)

1. Coltura HepG2.2.15 in terreno completo (DMEM integrato con 10% FBS, 100 U / mL penicillina e 100 μg / mL streptomicina) in una capsula di Petri di 10 cm per 24 h.
2. Sostituire il terreno completo integrato con 380 μg/mL di geneticina (G418) quando l'HepG2.2.15 raggiunge il 60%-70% di confluenza. Raccogliere il terreno condizionato ogni 2 giorni; conservare il terreno contenente HBV a 4 °C.
3. Rimuovere i detriti cellulari centrifugando il surnatante a 5.000 × g, 4 °C per 20 minuti. Raccogliere il mezzo condizionato utilizzando una siringa da 20 ml e filtrarlo attraverso un filtro a basso legame proteico da 0,45 μm per rimuovere i detriti cellulari.
4. Per concentrare l'HBV, diluire 1 volume di concentratore con 3 volumi di surnatante filtrato dal punto 3.3 in una provetta conica da centrifuga e miscelare accuratamente la soluzione mediante inversione del tubo. Introdurre la miscela a 4 °C per 1 ora. Centrifugare la soluzione per 1 ora a 1.500 × g, 4 °C e assicurarsi che sia visibile un pellet bianco sporco.
   NOTA: Per ogni 30 mL di surnatante filtrato dal Passo 3.3, aggiungere 10 mL del concentratore per raggiungere 40 mL di volume totale.
5. Valutare il titolo HBV (genoma equivalente) con HBV 1.3-mer WT replicon come curva standard compresa tra 1 × 10² e 1 × 10^{10 utilizzando} la PCR assoluta in tempo reale, come descritto in precedenza¹¹.
6. Ricostituire delicatamente il pellet in FBS e conservare fino a 1 anno a -80 °C in aliquote monouso.

4. Test di ingresso anti-HBV

1. Mantenere il 100% confluente imHC o HepaRG in piastre a 6 pozzetti nel mezzo di maturazione (2% DMSO nel mezzo E di Williams, 10% FBS, 100 U / mL penicillina, 100 μg / mL streptomicina, 5 μg / mL di insulina, 50 μM di idrocortisone e 2 mM di L-glutammina) per 2 settimane e cambiare il terreno 2 volte a settimana.
2. Aspirare il mezzo, quindi aggiungere la curcumina (10-30 μM) o 4 μM ciclosporina A (CsA) diluita con il mezzo E di William per 2 ore. Aspirare il candidato inibitore dell'ingresso dell'HBV e sostituirlo con 1 mL di mezzo E di William contenente il 4% di glicole polietilenico.
3. Aggiungere particelle di HBV al terreno di coltura ad una molteplicità di infezione (MOI) di 100 per pozzetto e incubare a 37 °C per 18 ore. Eliminare il surnatante, aggiungere 2 ml di PBS freddo e ruotare delicatamente per risciacquare il vecchio mezzo con HBV non legato.
4. Aggiungere 2 ml di mezzo completo William's E e coltura per 7 giorni. Aspirare il mezzo, lavare le cellule con 1x PBS e fissare le cellule con paraformaldeide al 3,7% in PBS per 15 minuti a temperatura ambiente. Permeabilizzare e bloccare le cellule infette con una soluzione bloccante IF (0,2% Triton X-100 e 3% albumina sierica bovina in PBS) e incubarle per 60 minuti a temperatura ambiente.
5. Aggiungere l'anticorpo primario (antigene anti-HBV core) alla diluizione 1:200 nella soluzione bloccante e incubare per una notte a 4 °C. Lavare le celle 3 x 1 min con soluzione di lavaggio (0,5% Tween 20 in PBS).
6. Aggiungere l'anticorpo secondario (diluizione 1:500) alla soluzione bloccante IF, incubare per 1 ora a temperatura ambiente e lavare le cellule 3 x 1 min con la soluzione di lavaggio.
7. Montare il campione con un supporto di montaggio antisbiadimento con 4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) e coprire con un vetrino. Rilevare il segnale di fluorescenza utilizzando un microscopio a fluorescenza dotato di un filtro DAPI (Ex 352-402 nM ed Em 417-477) e un filtro PE (Ex 542-582 ed Em 604-644), insieme a una lente obiettivo 20x, e determinare l'attività di ingresso anti-HBV dei composti candidati.

5. Saggio di legame delle cellule HBV

1. Mantenere il 100% confluente imHC o HepaRG in piastre a 6 pozzetti nel mezzo di maturazione (2% DMSO nel mezzo E di Williams, 10% FBS, 100 U / mL penicillina, 100 μg / mL streptomicina, 5 μg / mL di insulina, 50 μM di idrocortisone e 2 mM di L-glutammina) per 2 settimane e cambiare il terreno 2 volte a settimana.
2. Aspirare il mezzo, quindi aggiungere la curcumina (10-30 μM) o la ciclosporina A (4 μM) diluita nel mezzo E di William per 2 ore. Aspirare l'inibitore di ingresso dell'HBV e sostituirlo con 1 mL di mezzo E di William contenente il 4% di glicole polietilenico.
3. Aggiungere particelle di HBV al terreno di coltura con un MOI di 100 per pozzetto e incubare a 4 °C per 2 ore per consentire il legame dell'HBV agli epatociti. Eliminare il mezzo contenente HBV non legato, aggiungere 2 ml di PBS freddo e agitare delicatamente per rimuovere le tracce del mezzo esaurito.
4. Raccogliere le cellule infette usando un raschietto cellulare e interrompere le cellule con tampone di lisi. Trasferire il lisato in una provetta di raccolta ed estrarre il DNA totale per valutare il DNA dell'HBV utilizzando la PCR in tempo reale con primer specifici per HBV (primer in avanti: 5'- GTT GCC CGT TTG TCC TCT AATTC-3', e primer inverso: 5'- GGA GGG ATA CAT AGA GGT TCC TTG A-3') utilizzando PRNP (primer diretto: 5'- GACCAATTTATGCCTACAGC-3', primer inverso: 5'- TTTATGCCTACTACCCTCCTA-3') come controllo interno.
5. Amplificare i prodotti PCR in un termociclatore utilizzando le condizioni di temperatura descritte al Passo 2.1.
6. Calcolare i livelli relativi di HBV DNA/1 × 10⁶ cellule in trattamento rispetto al controllo utilizzando PRNP come gene calibratore basato sul metodo ^2-ΔΔCT .

6. Saggio di assorbimento dell'acido taurocolico (TCA)

1. Mantenere le cellule imHC e HepaRG confluenti al 100% nel mezzo di maturazione per 14 giorni.
2. Aspirare il mezzo e lavare gli epatociti con 1x PBS. Aggiungere la curcumina o la ciclosporina A (10-50 μM) diluita nel mezzo E di William per 2 ore. Sostituire il terreno con la soluzione di acido taurocolico di sodio (0,5 M di sodio taurocolato idrato in 1x HEPES) e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente.
3. Aspirare la soluzione di acido taurocolico di sodio e lavare 3 volte con freddo 1x HEPES. Aggiungere 300-500 μL di 1x HEPES freddo e raccogliere le cellule con raschietti cellulari su ghiaccio.
4. Omogeneizzare le cellule mediante ultrasuoni ad una frequenza di 20 kHz per 20 s e incubare su ghiaccio per 5 minuti. Centrifugare i lisati a 10.000 × g per 20 minuti per precipitare i detriti cellulari. Raccogliere il surnatante e valutare la concentrazione intracellulare di acido taurocolico utilizzando un kit di analisi TCA ELISA (vedere la tabella dei materiali).

7. Determinazione delle interazioni proteina-ligando mediante calorimetria isotermica di titolazione

NOTA: Questo sistema di analisi è stato sviluppato sulla base del software MicroCal PEAQ-ITC (ITC).

1. Preparare il tampone (tampone Tris-HCl da 50 mM, pH 7,0).
2. Preparare 15 μM di NTCP nel buffer.
3. Preparare soluzioni di inibitori di ingresso HBV candidati da 150 μM nel tampone.
4. Lavare la cella del campione, la cella di riferimento e la siringa nello strumento ITC utilizzando il tampone (Passo 7.1.).
   1. Avviare il software ITC facendo doppio clic sull'icona del software nei sistemi Windows. Nella scheda Esegui evidenziazione esperimento, selezionare Metodo microCal per 19 Injection.itcm e fare clic su Apri. Quando si apre una nuova finestra, fare clic sulla scheda Pulisci e, nella finestra Metodo di pulizia, selezionare il pulsante Lava per Metodo di pulizia cellulare e il pulsante Risciacquo per Metodo di pulizia siringa. Fare clic su Avanti e seguire le istruzioni visualizzate.
      NOTA: il completamento della fase di lavaggio può richiedere 1,4 ore.
5. Caricare il campione nell'ITC; nella scheda Esegui esperimento , fai clic sul pulsante Carica e leggi le istruzioni visualizzate. Fare clic su Avanti e seguire le istruzioni video fino al completamento di questa fase di caricamento.
   1. Riempire la cella di riferimento con tampone di soluzione usando una siringa. Riempire la cella del campione con 15 μM NTCP in tampone usando una siringa e rimuovere la soluzione NTCP in eccesso sulla cella del campione. Riempire la siringa con una soluzione da 150 μM di curcumina (ligando), evitando bolle d'aria nella siringa.
6. Esegui l'esempio e, nella scheda Esegui esperimento , fai clic sul pulsante Esegui . Osservare le finestre sul lato sinistro che mostrano informazioni sperimentali e impostazioni sperimentali. Inserire le concentrazioni di ligando e proteine come 150 μM in [ Syr], 15 μM in [Cell], e 25 °C in temperatura.
7. Nel software, fare clic su Start per eseguire il processo di iniezione e attendere 1,4 ore per il completamento dell'interazione proteina-ligando.
   NOTA: il pulsante di analisi sbiadito viene visualizzato sotto le finestre del software.
8. Osservare che il pulsante di analisi si illumina al termine dell'iniezione. Fare clic sul pulsante di analisi nel software di controllo per analizzare i dati grezzi utilizzando il software di analisi . Fare clic su Panoramica per visualizzare i dati grezzi e scegliere il modello di raccordo come Un insieme di siti di associazione.
9. Assicurarsi che lo stato di associazione mostri i dati sperimentali (associazione, nessuna associazione, controllo o dati di controllo) e che i valori dell'esperimento (K_D, ΔG, ΔH, TΔS e N) siano presentati nel pannello software.
10. Esportare i parametri termodinamici che prevedono il legame di interazione, inclusi il legame idrogeno, il legame di van der Waals e l'interazione idrofobica in formato tif o jpeg.
11. Al termine dell'esperimento, lavare la cella del campione seguendo il passaggio 7.4.

8. Analisi statistica

1. Eseguire tutti gli esperimenti in tre repliche indipendenti (n = 3).
2. Presentare i dati sperimentali come mezzi ± SD ed eseguire analisi statistiche utilizzando il software di analisi statistica desiderato.
3. Utilizzare un test t di Students' unpaired a due code per confrontare due valori medi o applicare l'analisi unidirezionale della varianza (ANOVA) con Dunnett per confronti multipli tra più valori e un valore di controllo. Impostare il livello di significatività a p ≤ 0,05.

Sono state osservate caratteristiche di maturazione epatica, tra cui cellule binucleate e morfologia di forma poligonale (Figura 1), specialmente nello stadio differenziato di imHC (Figura 1A). Un grande aumento dell'espressione di NTCP è stato misurato in d-HepaRG e d-imHC rispettivamente a 7 volte e 40 volte (Figura 1B). La forma altamente glicosilata di NTCP, postulata per conferire suscettibilità all'ingresso dell'HBV, è stata rilevata più in d-imHC che in d-HepaRG (Figura 1C). L'imHC differenziato conteneva livelli di NTCP superiori del 65,9% rispetto alle cellule indifferenziate (Figura 1D).

La figura 2A mostra un riassunto del trattamento profilattico. La Figura 2B mostra la colorazione con immunofluorescenza dell'HBV eseguita per valutare le attività di ingresso anti-HBV il giorno 7 dopo l'infezione, mentre la Figura 2C delinea il protocollo di test di legame dell'HBV. Il livello di legame dell'HBV sul recettore della superficie cellulare è stato valutato mediante real-time PCR (Figura 2D). Per determinare se NTCP fosse il recettore per l'attaccamento dell'HBV, è stata determinata l'assorbimento del TCA per i candidati inibitori leganti (Figura 2E). Sulla base di questo modello, la presunta attività inibitoria dei composti candidati ha ridotto il legame con l'HBV attraverso NTCP.

L'alterazione calorimetrica è stata rilevata con iniezioni continue alla cellula campione (Figura 3). Una regressione standard non lineare dei minimi quadrati è stata tracciata sulla base di un sito di legame adattato bene ai dati. La linea continua indicava la migliore corrispondenza ai valori sperimentali (Figura 3A,B). La tabella 1 mostra i parametri termodinamici correlati con il legame di NTCP con la ciclosporina A (CsA) o un composto candidato.

Figura 1: Maturazione epatica di HepaRG e imHC con caratterizzazione NTCP. Entrambe le linee cellulari sono state coltivate in terreno di maturazione epatica per 2 settimane. (A) Le caratteristiche degli epatociti come le cellule binucleate e la morfologia di forma poligonale sono state osservate esclusivamente nella fase di maturazione di imHC. Barre di scala = 50 μm. (B) L'espressione di NTCP è stata sovraregolata sia in HepaRG che in imHC. NTCP normalizzato con GAPDH era più alto in imHC che in HepaRG. (C) Una forma altamente glicosilata di NTCP è stata osservata dopo la maturazione. (D) La percentuale di aumento di NTCP in d-imHC è stata valutata utilizzando la citometria a flusso. I dati sono presentati come media ± DS. *, ** e *** rappresentano la differenza statistica con p < 0,05, p < 0,01 e p < 0,001, rispettivamente. Abbreviazioni: NTCP = sodio taurocolato cotrasportante polipeptide; GAPDH = gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi; NTCP-FITC = NTCP marcato con isotiocianato di fluoresceina. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 2: Il trattamento profilattico con CCM ha ridotto l'ingresso virale, l'attività intracellulare di HBV DNA e l'attività di captazione del TCA. (A) d-imHC sono stati pretrattati con CCM per 2 ore prima dell'inoculazione con HBV. (B) L'attività di ingresso anti-HBV è stata determinata dalla colorazione con immunofluorescenza il giorno 7 dopo l'infezione. (C) Viene presentato uno schema del protocollo di legame HBV. (D) Il livello di HBV DNA legato sugli epatociti è stato valutato e confrontato con 4 μM CsA e il classico inibitore dell'ingresso dell'HBV 25 unità/mL di eparina. (E) L'effetto del CCM 10-30 μM sull'inibizione dell'assorbimento del TCA è stato mediato attraverso il recettore NTCP. Abbreviazioni: CCM = curcumina; HBV = virus dell'epatite B; TCA = acido taurocolico; d-imHC = imHC differenziato; CsA = ciclosporina A; HP = eparina. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 3: L'affinità di NTCP con singole molecole (CsA o composto candidato) è stata dimostrata utilizzando ITC. Il profilo ITC per la combinazione di NTCP con (A) CsA o (B) curcumina è stato generato dall'iniezione sequenziale di un composto (150 μM CsA o candidato) nella soluzione NTCP (15 μM di NTCP, pH 7,0, 25 °C). Sono stati tracciati i dati calorimetrici grezzi tra potenza differenziale (μcal/s) e tempo (min). I dati sono stati analizzati sulla base di un modello di associazione a un sito in cui le linee continue indicavano i risultati più adatti. Durante l'iniezione di ligandi (CSA o curcumina) nella soluzione NTCP, l'entalpia (ΔH) è cambiata dopo un aumento della concentrazione del ligando nella cellula campione. Questi dati indicano che si è verificata la reazione di legame. Abbreviazioni: CsA = ciclosporina A; NTCP = polipeptide di trasporto co-taurocolato di sodio; ITC = calorimetria isotermica di titolazione; DP = potenza differenziale. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Tabella 1: Parametri termodinamici risultanti dall'interazione tra NTCP e singoli composti (CCM e TCA) mediante ITC. Abbreviazioni: NTCP = sodio taurocolato cotrasportante polipeptide; CCM = curcumina; TCA = acido taurocolico; ITC = calorimetria isotermica di titolazione.

L'infezione da HBV viene avviata attraverso il legame a bassa affinità ai proteoglicani dell'eparan solfato (HSPG) sugli epatociti²⁵, seguito dal legame a NTCP con successiva internalizzazione attraverso l'endocitosi²⁶. Poiché NTCP è un recettore cruciale per l'ingresso dell'HBV, l'ingresso mirato all'HBV può essere clinicamente tradotto per ridurre l'infezione de novo , la trasmissione madre-figlio (MTCT) e la recidiva dopo trapianto di fegato. Interrompere l'ingresso virale sarebbe una cura alternativa fattibile per l'infezione cronica da HBV.

Alcuni passaggi critici nel protocollo sopra menzionato sono riassunti qui. Durante la preparazione delle cellule ospiti, assicurarsi che gli epatociti raggiungano il 100% di confluenza prima di aggiungere il mezzo di maturazione con DMSO al 2%. La coltura di epatociti subconfluenti in DMSO al 2% porterà alla morte e al distacco delle cellule. Il periodo di maturazione può essere esteso fino a 4 settimane per massimizzare l'espressione di NTCP^27,28, sebbene sia raccomandato un periodo di maturazione di 2 settimane.

Sono state proposte tre tecniche per la quantificazione dell'espressione cellulare di NTCP. Si consiglia agli utenti di selezionare la tecnica con cui hanno più familiarità; Qui, abbiamo preferito la citometria a flusso all'analisi Western Blot perché è comoda, veloce e facile.

Per la produzione delle particelle HBV derivate da colture cellulari (HBVcc), HepG2.2.15 è stato derivato da HepG2 mediante trasfezione transitoria con genoma HBV a lunghezza intera insieme al gene di resistenza alla genetina (G418)²⁹. Il terreno di coltura deve contenere 380-500 μg/mL di geneticina, altrimenti le cellule non produrranno HBVcc. Il filtro a basso legame proteico da 0,45 μm deve essere utilizzato per chiarire il surnatante per evitare di perdere la resa di HBV. Per concentrare l'HBV, il glicole polietilenico (PEG) è stato utilizzato con una centrifuga standard. Le particelle di HBV possono anche essere concentrate utilizzando un gradiente di saccarosio e ultracentrifugazione. Cicli multipli di congelamento e disgelo dovrebbero essere evitati poiché l'infettività sarà ridotta.

Nel test di ingresso anti-HBV, gli epatociti devono raggiungere il 100% di confluenza prima dell'induzione della maturazione. Questo protocollo è stato sviluppato sulla base del trattamento profilattico. Le cellule ospiti sono state esposte ai composti candidati per 2 ore prima dell'infezione da HBV¹². Dopo 7 giorni dall'infezione, l'infettività dell'HBV è stata valutata utilizzando l'immunofluorescenza. Tutti i componenti, le concentrazioni della soluzione bloccante, gli anticorpi primari e secondari e le fasi di lavaggio devono essere ottimizzati per ottenere il miglior risultato con una colorazione minima non specifica. Qui, abbiamo fornito concentrazioni e tecniche ottimizzate.

Il protocollo di analisi dell'assorbimento TCA descrive il gold standard per l'inibizione del trasporto NTCP. Abbiamo modificato il protocollo per evitare il TCA radioattivo. I passaggi critici per il test di assorbimento del TCA sono il lavaggio e la raccolta delle cellule. Tutte queste procedure devono essere eseguite sul ghiaccio tutto il tempo per prevenire un'ulteriore internalizzazione dell'attività cellulare del composto. Dopo aver omogeneizzato le cellule e i detriti cellulari di pellet, il surnatante deve essere aspirato delicatamente senza interrompere il pellet. Se la struttura dell'utente consente l'uso della tecnica di scintillazione liquida, l'acido ³H-taurocolico è comunemente usato negli studi di trasporto e assorbimento del TCA. Poiché abbiamo convalidato l'assorbimento del TCA utilizzando ELISA, questa tecnica alternativa può sostituire l'uso del composto radioattivo.

L'ITC è un metodo biofisico ampiamente utilizzato per determinare i parametri termodinamici legati alle interazioni tra proteine solubili e ligandi a piccolo peso molecolare^30,31. Questa tecnica può essere utilizzata per studiare l'interazione di vari ligandi con una piccola molecola o proteina. ITC è un metodo diretto e non invasivo senza passaggi aggiuntivi per il rilevamento del segnale, nessuna limitazione di peso molecolare e nessuna etichettatura, immobilizzazione o qualsiasi altra modifica chimica. La limitazione dell'ITC è il prerequisito di alte concentrazioni dei materiali interagenti. Le proteine e il ligando devono essere altamente purificati e sufficientemente solubili in acqua (10-100 μM) a 25 °C per 1 ora con agitazione. La soluzione proteica instabile può essere rilevata attraverso la variazione del segnale di calore in funzione del tempo.

Gli epatociti umani potenziati-NTCP forniscono un modello alternativo per lo studio in vitro dell'infezione da HBV, ma sono simili a HepaRG e agli epatociti umani primari. Questi modelli host sono ostacolati dalla loro limitata affidabilità e suscettibilità ^8,33. L'inefficiente propagazione dell'HBV nelle cellule HepG2-NTCP o Huh7-NTCP è stata evidenziata da un basso inoculo di HBV derivato da cellule produttrici di HBVcc. In diversi studi, l'HBV è stato utilizzato per infettare le cellule bersaglio a un MOI di 1.000^33,34. Le particelle subvirali in HBVcc contengono la proteina dell'involucro HBV (L/M/S) e legano competitivamente NTCP, con conseguente diminuzione dell'infettività³⁵. Per superare questa limitazione, questo protocollo ha modificato la coltura HepaRG o imHC con un protocollo di maturazione per massimizzare i livelli NTCP. HBVcc derivato da HepG2.2.15 è stato concentrato prima di essere utilizzato come inoculo. L'infettività dell'HBV è risultata superiore all'80% nell'imHC differenziato sulla base della misurazione dell'antigene core¹¹ dell'HBV.

Abbiamo descritto l'identificazione di composti anti-HBV mirati a NTCP per interrompere l'ingresso virale e adottato una procedura di maturazione epatica per aumentare i livelli di NTCP. Per identificare gli inibitori dell'ingresso, gli epatociti sono stati pretrattati con composti candidati per 2 ore prima dell'infezione da HBV a 4 °C per consentire il legame virale ma non l'ingresso. La diminuzione dell'infettività dell'HBV è stata valutata il giorno 7 dopo l'infezione. I dati rappresentativi includevano la ciclosporina A, un inibitore NTCP classico, come controllo positivo per convalidare il modello.

Poiché NTCP facilita le funzioni di endocitosi mediata sia dal trasportatore che dal recettore, gli inibitori dell'ingresso dell'HBV potrebbero colpire almeno uno di questi meccanismi. L'inibizione del trasporto NTCP può essere valutata utilizzando un test di captazione TCA basato su ELISA, eliminando il TCA radioattivo dal protocollo classico³⁶. L'affinità tra NTCP e l'inibitore di ingresso è stata misurata utilizzando ITC. Questa tecnica forniva parametri termodinamici essenziali, tra cui la stechiometria (n), la costante di dissociazione (K_D), la variazione dell'energia libera (ΔG), l'entalpia (ΔH), l'entropia (ΔS) e la capacità termica di legame (ΔCp). Vari agenti anti-HBV sono stati identificati mediante docking molecolare, come quercetina, rutina, esperidina e luperolo, che potrebbero legare specificamente la trascrittasi inversa dell'HBV paragonabile alla lamivudina, un analogo nucleosidico. I composti sono stati studiati utilizzando ITC e hanno mostrato energia di Gibb negativa (-ΔG) compresa tra -9,3 e -5,2 kcal / mol e K_D di 1 × 10-6 a 1 × ^10-3 M con HBV polimerasi³⁷. Nel loro insieme, i dati ottenuti da questi test di cui sopra aiuteranno a schermare l'efficacia antivirale dei composti candidati che agiscono come inibitori dell'ingresso dell'HBV. Il protocollo stabilito sarà utile per scoprire nuovi antagonisti/inibitori NTCP. La soppressione dell'ingresso virale potrebbe essere utile nel trattamento profilattico e terapeutico.

Gli autori dichiarano che la ricerca è stata condotta in assenza di relazioni commerciali o finanziarie che potrebbero essere interpretate come un potenziale conflitto di interessi.

Questo progetto di ricerca è supportato dalla Mahidol University e dalla Thailand Science Research and Innovation (TSRI) assegnati separatamente ad A. Wongkajornsilp e K. Sa-ngiamsuntorn. Questo lavoro è stato sostenuto finanziariamente dall'Office of National Higher Education Science Research and Innovation Policy Council attraverso il Program Management Unit for Competitiveness (numero di sovvenzione C10F630093). A. Wongkajornsilp ha ricevuto una borsa di studio Chalermprakiat della Facoltà di Medicina Siriraj Hospital, Mahidol University. Gli autori desiderano ringraziare Miss Sawinee Seemakhan (Excellent Center for Drug Discovery, Faculty of Science, Mahidol University) per la sua assistenza con la tecnica ITC.