Um Modelo de Hepatócito Competente Examinando a Entrada do Vírus da Hepatite B através do Polipeptídeo Cotransportador de Taurocolato de Sódio como Alvo Terapêutico

Apresentamos um protocolo para triagem de compostos anti-vírus da hepatite B (HBV) visando estágios do ciclo de vida pré e pós-entrada viral, usando calorimetria de titulação isotérmica para medir a afinidade de ligação (K_D) com o polipeptídeo cotransportador de taurocolato de sódio do hospedeiro. A eficácia antiviral foi determinada através da supressão de marcadores do ciclo de vida viral (formação, transcrição e montagem viral do cccDNA).

A infecção pelo vírus da hepatite B (HBV) tem sido considerada um fator de risco crucial para o carcinoma hepatocelular. O tratamento atual só pode diminuir a carga viral, mas não resultar em remissão completa. Um modelo eficiente de hepatócitos para a infecção pelo HBV ofereceria um ciclo de vida viral realista que seria crucial para a triagem de agentes terapêuticos. A maioria dos agentes anti-HBV disponíveis tem como alvo os estágios do ciclo de vida após a entrada viral, mas não antes da entrada viral. Este protocolo detalha a geração de um modelo de hepatócitos competente, capaz de rastrear agentes terapêuticos visando os estágios do ciclo de vida pré-entrada viral e pós-entrada viral. Isso inclui o direcionamento da ligação do polipeptídeo de cotransporte de taurocolato de sódio (NTCP), formação de cccDNA, transcrição e montagem viral com base em imHC ou HepaRG como células hospedeiras. Aqui, o ensaio de inibição de entrada do HBV usou curcumina para inibir as funções de ligação e transporte do HBV via NTCP. Os inibidores foram avaliados quanto à afinidade de ligação (K_D) com o NTCP usando calorimetria de titulação isotérmica (ITC) - uma ferramenta universal para triagem de drogas do HBV com base em parâmetros termodinâmicos.

A infecção pelo vírus da hepatite B (HBV) é considerada uma doença com risco de vida em todo o mundo. A infecção crônica pelo VHB é carregada de risco de cirrose hepática e carcinoma hepatocelular¹. O tratamento anti-HBV atual concentra-se principalmente na entrada pós-viral usando análogos de nucleos(t)ide (NAs) e interferon-alfa (IFN-α)^2,3. A descoberta de um inibidor da entrada do VHB, o Myrcludex B, identificou um novo alvo para os agentes anti-VHB⁴. A combinação de inibidores de entrada e NAs no HBV crônico diminuiu significativamente a carga viral em comparação com aqueles que visam apenas a replicação viral ^5,6. No entanto, o modelo clássico de hepatócitos para a triagem de inibidores da entrada do HBV é limitado por baixos níveis de receptores virais (polipeptídeo cotransportador de taurocolato de sódio, NTCP). A superexpressão de hNTCP em células de hepatoma (ou seja, HepG2 e Huh7) melhora a infectividade do HBV ^7,8. No entanto, essas linhagens celulares expressam baixos níveis de enzimas metabolizadoras de drogas de fase I e II e apresentam instabilidade genética⁹. Modelos de hepatócitos que podem ajudar a direcionar mecanismos distintos de compostos anti-HBV candidatos, como entrada pré-viral, ligação ao NTCP e entrada viral, agilizariam a identificação e o desenvolvimento de regimes de combinação eficazes. O estudo para a atividade anti-HBV da curcumina elucidou a inibição da entrada viral como um novo mecanismo, além da interrupção da entrada pós-viral. Este protocolo detalha um modelo hospedeiro para a triagem de moléculas de entrada anti-HBV¹⁰.

O objetivo deste método é explorar compostos anti-HBV candidatos para inibição da entrada viral, especialmente bloqueando a ligação e o transporte de NTCP. Como a expressão de NTCP é um fator crítico para a entrada e infecção pelo HBV, otimizamos o protocolo de maturação de hepatócitos para maximizar os níveis de NTCP¹¹. Além disso, esse protocolo pode diferenciar o efeito inibitório sobre a entrada do HBV como inibição da ligação do HBV versus inibição da internalização. O ensaio de captação de ácido taurocólico (TCA) também foi modificado usando um método baseado em ELISA em vez de um radioisótopo para representar o transporte de NTCP^12,13. A interação receptor e ligante foi confirmada por suas estruturas 3D^14,15. A inibição da função NTCP pode ser avaliada pela mensuração da atividade de captação do TCA¹⁶. No entanto, esta técnica não forneceu evidências diretas de ligação do NTCP aos inibidores candidatos. Portanto, a ligação pode ser investigada usando várias técnicas, como ressonância plasmônica^{de superfície 17}, ELISA, ensaio de deslocamento térmico baseado em fluorescência (FTSA)¹⁸, FRET¹⁹, AlphaScreen e vários outros métodos²⁰. Dentre essas técnicas, a ITC é um padrão de meta na análise de ligação, pois pode observar absorção ou emissão de calor em quase todas as reações²¹. A afinidade de ligação (K_D) do NTCP e dos compostos candidatos foi avaliada diretamente por meio do ITC; esses valores de afinidade foram mais precisos do que os obtidos por meio do modelo de predição in silico ²².

Este protocolo abrange técnicas de maturação de hepatócitos, infecção por HBV e triagem para inibidor de entrada de HBV. Resumidamente, um modelo de hepatócitos foi desenvolvido com base em linhagens celulares imHC e HepaRG. As células cultivadas foram diferenciadas em hepatócitos maduros dentro de 2 semanas. A regulação positiva dos níveis de NTCP foi detectada por PCR em tempo real, western blot e citometria de fluxo¹¹. O virion da hepatite B (HBVcc) foi produzido e coletado da HepG2.2.15. O imHC ou HepaRG diferenciado (d-imHC, d-HepaRG) foi tratado profilaticamente com os candidatos anti-HBV 2 h antes da inoculação com virion HBV. O resultado esperado do experimento foi a identificação dos agentes que diminuem o HBV celular e a infectividade. A atividade anti-NTCP foi avaliada usando o ensaio de captação de TCA. A atividade do NTCP pode ser suprimida pelos agentes que vincularam especificamente o NTCP. A técnica ITC foi empregada para investigar a viabilidade de ligações interativas que pudessem predizer inibidores e suas proteínas-alvo, determinando a afinidade de ligação (K_D) do ligante pelo receptor via interações não covalentes do complexo biomolecular^23,24. Por exemplo, K D ≥ 1 × 10³ mM representa ligação fraca, K D ≥ 1 × 10⁶ μM representa ligação moderada e K _D ≤ 1 × 10⁹ nM representa ligação forte. O ΔG está diretamente correlacionado com as interações de ligação. Em particular, uma reação com ΔG negativo é uma reação exergônica, indicando que a ligação é um processo espontâneo. Uma reação com um ΔH negativo indica que os processos de ligação dependem da ligação de hidrogênio e das forças de Van der Waals. Tanto a aceitação do TCA quanto os dados do ITC podem ser usados para rastrear agentes de entrada anti-HBV. Os resultados desses protocolos podem fornecer uma base não apenas para a triagem anti-HBV, mas também para a interação com o NTCP, conforme avaliado por meio da afinidade de ligação e da função de transporte. Este trabalho descreve a preparação e caracterização da célula hospedeira, o desenho experimental e a avaliação da entrada anti-HBV, juntamente com a afinidade de ligação do NTCP.

NOTA: Os seguintes procedimentos devem ser realizados num exaustor de fluxo de risco biológico de classe II ou num exaustor de fluxo laminar. O manuseio do HBV foi eticamente aprovado pelo IRB (MURA2020/1545). Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes sobre todas as soluções, reagentes, equipamentos e linhas celulares usadas neste protocolo.

1. Preparação das células hospedeiras (hepatócitos maduros)

1. Cultivar hepatócitos (3,75 × 10⁵ células HepaRG ou imHC) e manter em frasco de cultura de 75 cm 2 com 10 mL de meio DMEM/F12 suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS), 1% de L-glutamina, 100 U/mL^de penicilina e 100 μg/mL de estreptomicina. Espere que as células atinjam 80% a 90% de confluência (dentro de 1 semana).
2. Eliminar o meio velho do balão e lavar as células com 4 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS).
3. Aspirar o PBS e adicionar 4 mL de tripsina-EDTA a 0,05%.
4. Incubar o balão na incubadora de 37 °C durante 2-3 min e verificar as células aderentes utilizando um microscópio invertido com uma lente objetiva de 10x. Certifique-se de que a monocamada se desprendeu da superfície de cultivo.
5. Inibir a tripsina adicionando 4 mL do meio de cultura suplementado com FBS a 10% ao balão e ressuspender cuidadosamente as células colhidas. Transferir a suspensão celular para um tubo cónico de 15 ml e centrífuga durante 3 minutos a 300 × g, 25 °C.
6. Aspirar o sobrenadante do pellet celular e ressuspender com 1-2 mL do meio de cultura pré-aquecido suplementado com 10% de FBS e antibióticos.
7. Misture 10 μL cada uma das suspensões celulares e azul de tripano e conte as células utilizando um hemacitômetro. Certifique-se de que a viabilidade da célula é superior a 90% antes de prosseguir para a próxima etapa.
8. A semente 1 × 10 6 células por 2 mL em cada poço de uma placa de⁶ poços e manter em meio DME/F12 completo até que as células atinjam 100% de confluência.
9. Para a maturação hepática, prepare o meio de maturação hepática (meio E de Williams suplementado com FBS a 10%, penicilina 100 U/mL, estreptomicina 100 μg/mL, insulina 5 μg/mL, hidrocortisona 50 μM, L-glutamina 2 mM e DMSO a 2%).
10. Substitua o meio de cultura 2x por semana.
11. Mantenha os hepatócitos em meio de maturação por 2 semanas para obter hepatócitos maduros prontos para a infecção pelo HBV.

2. Quantificação do NTCP celular

1. Medindo a expressão NTCP usando PCR em tempo real
   1. Recolher o pellet de hepatócitos maduros através de tripsinização (ver Passos 1.2-1.5).
   2. Extraia o RNA total do pellet celular usando um kit de extração de RNA com tratamento com DNase I.
   3. Sintetizar cDNA a partir de 200 ng de RNA total usando um primer oligo-dT e um sistema de transcrição reversa seguindo as instruções do fabricante.
   4. Dilua o cDNA para 50 ng/μL e use-o como um modelo para a reação de PCR. Misturar 2 μL do cDNA diluído com os reagentes de mistura mestre de PCR contendo a solução do Kit qRT-PCR verde SYBR com primers específicos para NTCP de 5 μM (5'-GGACATGAACCTCAGCATTGTG-3' e 5'-ATCATAGATCCCCCTGGAGTAGAT-3').
   5. Para normalização, use GAPDH como um gene de limpeza com primers específicos (5'-GAAATCCCATCACCATCTTCC-3' e 5'-AAATGAGCCCCCCCCTTCTC-3').
   6. Amplificar as amostras de cDNA utilizando um termociclador nas seguintes condições de temperatura: 1 ciclo de 3 min a 95 °C (desnaturação inicial); 40 ciclos de 30 s a 95 °C (desnaturação), 30 s a 60 °C a 65 °C (recozimento), 30 s a 72 °C (extensão); 1 ciclo de 5 min a 72 °C (extensão final).
   7. Calcular a mudança da prega NTCP em hepatócitos maduros sobre células indiferenciadas usando GAPDH como um gene calibrador baseado no método ^2-ΔΔCT .
2. Quantificando NTCP usando a análise de western blot
   1. Colher hepatócitos utilizando um raspador de células e centrifugar-os a 300 x g, 25 °C durante 5 min para recolher o pellet celular.
   2. Siga as instruções do fabricante do tampão RIPA para extrair a proteína celular com 100 μL de tampão RIPA contendo 1x inibidor de protease.
   3. Meça a concentração de proteína total usando o método do ácido bicinchonínico (BCA).
   4. Misture 12,5 μL de proteína com corante de carga 2x em uma proporção de 1:1 por volume.
   5. Ferva a mistura proteica e a escada padrão a 95 °C durante 5 min.
   6. Adicione 1x tampão de corrida à câmara de eletroforese.
   7. Carregar 5 μL da escada padrão de proteína ou 20 μL da mistura de proteínas cozidas em um gel de poliacrilamida a 10% (p/v).
   8. Realizar eletroforese em gel: 50 V por 30 min seguido de 90 V por 1 h à temperatura ambiente.
   9. Prepare uma membrana de PVDF mergulhando-a em metanol por 30 s, lave-a com água destilada duas vezes por 1-2 min e mergulhe-a junto com dois pedaços de papel de filtro em buffer de transferência por 10 min ou até o uso.
   10. Coloque o papel de filtro na placa de ânodo de uma célula de transferência semi-seca; em seguida, coloque a membrana PVDF, o gel e o papel de filtro por cima, nessa ordem.
   11. Transfira as proteínas do gel para a membrana PVDF a 10 V durante 25 min à temperatura ambiente.
   12. Bloquear a membrana com solução de bloqueio de WB durante 1 h à temperatura ambiente.
   13. Incubar a membrana com polipeptídeo cotransportador de taurocolato anti-sódio (anti-NTCP) (diluição 1:100) a 4 °C durante a noite.
   14. Lave a membrana 3 x 10 min com TBST.
   15. Incubar a membrana com anticorpo anti-coelho conjugado com peroxidase de rábano (HRP) (diluição 1:10.000) durante 1 h à temperatura ambiente.
   16. Lave a membrana 3 x 10 min com TBST e depois 1 x 5 min com TBS.
   17. Detecte NTCP usando um substrato HRP (consulte a Tabela de Materiais).
   18. Adicione pelo menos 0,1 mL de solução de substrato de HRP/cm² da membrana e incube a membrana por 3-5 min no escuro.
   19. Visualize o NTCP usando um Sistema de Documentação de Gel no modo de quimioluminescência, selecione a opção de marcador para a membrana, ajuste o tempo de exposição com o modo cumulativo a cada 1 min e tire a foto com vários tempos de exposição por 5 min.
   20. Retire e sonde o borra com anticorpo anti-GAPDH do rato (diluição de 1:200.000) e anticorpo secundário anti-rato de cabra conjugado com HRP (diluição de 1:10.000).
3. Medindo o nível de NTCP usando citometria de fluxo
   1. Coletar os pellets celulares de hepatócitos maduros incubando as células com EDTA de 8 mM por 15 min.
      NOTA: Evite usar tripsina ou outras proteases que possam perturbar os receptores da superfície celular. Como o NTCP é uma proteína receptora da superfície celular, os danos devido à tripsinização podem dar resultados negativos.
   2. Fixar os hepatócitos com 300 μL de paraformaldeído a 3,7% em 1x PBS por 15 min. Transferir a suspensão celular para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml e centrífuga durante 10 minutos a 300 × g, 25 °C.
   3. Lavar as células 2x com 700 μL de 1x PBS com 1% FBS (v/v), centrifugar por 10 min a 300 × g, 25 °C, adicionar 300 μL de 0,05% de Triton X-100 em PBS ao pellet celular e incubar as células à temperatura ambiente por 20 min para permeabilizá-las.
   4. Centrifugar durante 10 min a 300 × g, a 25 °C, lavar o pellet de célula 3 x 1 min com 700 μL de PBS contendo 1% de FBS (v/v). Incubar as células com o anticorpo primário contra NTCP (diluição 1:100) a 4 °C durante 30 min. Lavar as células 3 x 1 min com tampão Perm/Wash e centrifugar durante 10 min a 300 × g, a 25 °C.
   5. Coloração das células com anticorpo secundário conjugado ao Alexa Fluor 488 a 4 °C durante 30 min. Lavar as células 3 x 1 min com tampão Perm/Wash e centrifugar durante 10 min a 300 × g, 25 °C. Ressuscite o pellet celular com 200 μL de PBS com 1% de FBS (v/v).
   6. Ligue o citômetro de fluxo, aqueça o laser por 15 minutos e realize a limpeza de rotina.
   7. Selecione os parâmetros de medição, incluindo dispersão direta (FSC), dispersão lateral (SSC) e isotiocianato de fluoresceína (FITC) ou ficoeritrina (PE), e defina o ajuste de compensação automática pelo software. Inclua as amostras de controle de compensação: controle não corado, controle corado por FITC e controle corado por PE.
      NOTA: Os parâmetros FSC e SSC são usados para determinar o tamanho e a granularidade de células individuais para selecionar a população de células para análise de bloqueio. O detector de canal de fluorescência tem canais FITC e PE . Para este protocolo, selecione o canal FITC para detectar o Alexa Fluor 488.
   8. Execute a amostra não corada com vazão fluídica média (60 μL/min), ajuste o limiar de FSC e SSC até que cubram a população celular de interesse, marque a região do portão nessa área e aplique a todos os controles de compensação.
   9. Ajuste o tubo fotomultiplicador de fluorescência (PMT) usando o controle não corado e ajuste a tensão PMT do FITC ou PE no quadrante negativo. Execute a amostra corada positiva e ajuste o FITC ou PE na escala do quadrante positivo. Execute os controles não corados, manchados por FITC ou PE, calcule a compensação e aplique-a às configurações da amostra. Execute a amostra de hepatócitos para medir o nível de NTCP.
   10. Analise os hepatócitos corados usando o software de citômetro de fluxo (consulte a Tabela de Materiais).
       1. Em janelas BD FACSuite, clique no tubo de controle na guia Fontes de Dados e aguarde até que os dados brutos apareçam.
       2. Na guia Planilha do lado direito, clique no botão Ellipse Gate , selecione a população de células no SSC e o gráfico de pontos FSC usando o cursor do mouse e aguarde até que o círculo P1 apareça.
       3. Clique no botão Interval Gate e marque a região no histograma FITC, começando pelo maior valor de intensidade de fluorescência para o lado direito. Observe a linha P2 que aparece.
       4. Clique no tubo de experimento e observe que os dados na guia Planilha são alterados. Clique no botão Estatísticas e, em seguida, no espaço vazio na planilha. Observe os valores estatísticos da população NTCP que aparecem.

3. Produção das partículas de VHB derivadas da cultura celular (HBVcc)

1. Cultura HepG2.2.15 em meio completo (DMEM suplementado com 10% de FBS, 100 U/mL de penicilina e 100 μg/mL de estreptomicina) em uma placa de Petri de 10 cm por 24 h.
2. Substitua o meio completo suplementado com 380 μg/mL de geneticina (G418) quando o HepG2.2.15 atingir 60%-70% de confluência. Colha o meio condicionado a cada 2 dias; conservar o meio que contém VHB a 4 °C.
3. Remova os detritos celulares centrifugando o sobrenadante a 5.000 × g, 4 °C por 20 min. Recolher o meio condicionado utilizando uma seringa de 20 ml e filtrá-lo através de um filtro de baixa ligação a proteínas de 0,45 μm para remover os detritos celulares.
4. Para concentrar o VHB, diluir 1 volume de concentrador com 3 volumes do sobrenadante filtrado da Etapa 3.3 num tubo de centrífuga cónica e misturar cuidadosamente a solução por inversão do tubo. Colocar a mistura a 4 °C durante 1 h. Centrifugar a solução durante 1 h a 1.500 × g, 4 °C e assegurar a visibilidade de um pellet esbranquiçado.
   NOTA: Para cada 30 mL de sobrenadante filtrado da Etapa 3.3, adicione 10 mL do concentrador para atingir 40 mL de volume total.
5. Avaliar o título de HBV (genoma equivalente) com o replicon WT de 1,3 mer do HBV como uma curva padrão variando de 1 × 10² a 1 × 10¹⁰ usando PCR absoluta em tempo real, conforme descrito anteriormente¹¹.
6. Reconstituir suavemente o pellet na FBS e conservar durante até 1 ano a -80 °C em alíquotas de utilização única.

4. Ensaio de entrada anti-HBV

1. Manter 100% de imHC ou HepaRG confluentes em placas de 6 poços em meio de maturação (2% de DMSO em meio E de Williams, 10% de FBS, 100 U/mL de penicilina, 100 μg/mL de estreptomicina, 5 μg/mL de insulina, 50 μM de hidrocortisona e 2 mM de L-glutamina) por 2 semanas e trocar o meio 2x por semana.
2. Aspirar o meio e, em seguida, adicionar a curcumina (10-30 μM) ou 4 μM de ciclosporina A (CsA) diluída com o meio E de William por 2 h. Aspirar o inibidor de entrada do HBV candidato e substituí-lo por 1 mL de meio E de William contendo 4% de polietilenoglicol.
3. Adicionar partículas de VHB ao meio de cultura a uma multiplicidade de infecção (MOI) de 100 por poço e incubar a 37 °C durante 18 h. Descarte o sobrenadante, adicione 2 mL de PBS frio e gire suavemente para enxaguar o meio antigo com HBV não ligado.
4. Adicione 2 mL de meio E de William completo e cultura por 7 dias. Aspirar o meio, lavar as células com 1x PBS e fixar as células com paraformaldeído a 3,7% em PBS por 15 min à temperatura ambiente. Permeabilizar e bloquear as células infectadas com solução bloqueadora de FI (Triton X-100 a 0,2% e albumina sérica bovina a 3% em PBS) e incubá-las por 60 min à temperatura ambiente.
5. Adicionar o anticorpo primário (anti-VHB core antigen) à diluição de 1:200 na solução de bloqueio e incubar durante a noite a 4 °C. Lave as células 3 x 1 min com solução de lavagem (0,5% Tween 20 em PBS).
6. Adicionar anticorpo secundário (diluição 1:500) à solução de bloqueio de FI, incubar durante 1 h à temperatura ambiente e lavar as células 3 x 1 min com solução de lavagem.
7. Monte a amostra com um meio de montagem antifade com 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) e cubra com uma folha de vidro. Detectar o sinal de fluorescência usando um microscópio de fluorescência equipado com um filtro DAPI (Ex 352-402 nM e Em 417-477) e um filtro PE (Ex 542-582 e Em 604-644), juntamente com uma lente objetiva de 20x, e determinar a atividade de entrada anti-HBV dos compostos candidatos.

5. Ensaio de ligação de células HBV

1. Manter 100% de imHC ou HepaRG confluentes em placas de 6 poços em meio de maturação (2% de DMSO em meio E de Williams, 10% de FBS, 100 U/mL de penicilina, 100 μg/mL de estreptomicina, 5 μg/mL de insulina, 50 μM de hidrocortisona e 2 mM de L-glutamina) por 2 semanas e trocar o meio 2x por semana.
2. Aspirar o meio e, em seguida, adicionar curcumina (10-30 μM) ou ciclosporina A (4 μM) diluída no meio E de William por 2 h. Aspirar o inibidor de entrada do VHB e substituí-lo por 1 mL de meio E de William contendo 4% de polietilenoglicol.
3. Adicionar partículas de VHB ao meio de cultura a um MOI de 100 por alvéolo e incubar a 4 °C durante 2 h para permitir a ligação do VHB aos hepatócitos. Descarte o meio que contém HBV não ligado, adicione 2 mL de PBS frio e gire suavemente para remover vestígios do meio gasto.
4. Colha as células infectadas usando um raspador de células e interrompa as células com tampão de lise. Transfira o lisado para um tubo de coleta e extraia DNA total para avaliar o DNA do HBV usando PCR em tempo real com primers específicos para HBV (primer avançado: 5'- GTT GCC CGT TTG TCC TCT AATTC-3', e primer reverso: 5'- GGA GGG ATA CAT AGA GGT TCC TTG A-3') usando PRNP (primer para frente: 5'- GACCAATTTATGCCTACAGC-3', primer reverso: 5'- TTTATGCCTACAGCCTCCTA-3') como controle interno.
5. Amplificar os produtos de PCR num termociclador utilizando as condições de temperatura descritas na Etapa 2.1.
6. Calcular os níveis relativos de DNA do HBV/1 × 10⁶ células em tratamento versus controle usando PRNP como o gene calibrador com base no método ^2-ΔΔCT .

6. Ensaio de absorção do ácido taurocólico (TCA)

1. Manter células imHC e HepaRG 100% confluentes em meio de maturação por 14 dias.
2. Aspirar o meio e lavar os hepatócitos com 1x PBS. Adicione curcumina ou ciclosporina A (10-50 μM) diluída no meio E de William por 2 h. Substitua o meio pela solução de ácido taurocólico de sódio (hidrato de taurocolato de sódio 0,5 M em 1x HEPES) e incube durante 15 min à temperatura ambiente.
3. Aspirar a solução de ácido taurocólico sódico e lavar 3x com HEPES 1x frio. Adicione 300-500 μL de 1x HEPES frios e colha as células com raspadores de células no gelo.
4. Homogeneizar as células por ultrassom a uma frequência de 20 kHz por 20 s e incubar no gelo por 5 min. Centrifugar os lisados a 10.000 × g durante 20 minutos para precipitar os detritos celulares. Recolher o sobrenadante e avaliar a concentração intracelular de ácido taurocólico utilizando um kit de ensaio TCA ELISA (ver Tabela de Materiais).

7. Determinação das interações proteína-ligante utilizando calorimetria de titulação isotérmica

NOTA: Este sistema de ensaio foi desenvolvido com base no MicroCal PEAQ-ITC (software ITC).

1. Prepare o tampão (tampão Tris-HCl de 50 mM, pH 7,0).
2. Prepare 15 μM de NTCP no buffer.
3. Preparar 150 μM de soluções candidatas a inibidor de entrada do VHB no tamponante.
4. Lave a célula de amostra, a célula de referência e a seringa no instrumento ITC utilizando o tampão (Etapa 7.1.).
   1. Inicie o software ITC clicando duas vezes no ícone de software em sistemas Windows. Na guia Executar realce do experimento, selecione Método microCal para 19 Injection.itcm e clique em abrir. Quando uma nova janela for aberta, clique na guia Limpar e, na janela Método de limpeza, selecione o botão Lavar para Método de limpeza de células e o botão Enxaguar para Método de limpeza de seringas. Clique em Avançar e siga as instruções na tela.
      NOTA: A etapa de lavagem pode levar 1,4 h para ser concluída.
5. Carregar a amostra no ITC; na guia Executar experimento , clique no botão Carregar e leia as instruções na tela. Clique em Avançar e siga as instruções em vídeo até que esta etapa de carregamento seja concluída.
   1. Encha a célula de referência com tampão de solução utilizando uma seringa. Encha a célula da amostra com NTCP de 15 μM em buffer utilizando uma seringa e remova o excesso de solução NTCP sobre a célula da amostra. Encha a seringa com solução de 150 μM da curcumina (ligante), evitando bolhas de ar na seringa.
6. Execute o exemplo e, na guia Executar experimento , clique no botão Executar . Observe as janelas do lado esquerdo mostrando informações experimentais e ambiente experimental. Insira as concentrações de ligantes e proteínas como 150 μM em [ Syr], 15 μM em [Cell] e 25 °C em temperatura.
7. No software, clique em iniciar para realizar o processo de injeção e aguarde 1,4 h para que a interação proteína-ligante seja concluída.
   Observação : O botão de análise desbotado aparece sob as janelas de software.
8. Observe que o botão de análise acende após a conclusão da injeção. Clique no botão de análise no software de controle para analisar os dados brutos usando o software de análise . Clique na visão geral para exibir os dados brutos e escolha o modelo de ajuste como Um Conjunto de Site de Vinculação.
9. Certifique-se de que o status de vinculação mostre os dados experimentais (dados de ligação, sem ligação, controle ou verificação) e que os valores do experimento (K_D, ΔG, ΔH, TΔS e N) sejam apresentados no painel do software.
10. Exporte os parâmetros termodinâmicos que predizem a ligação de interação, incluindo ligação de hidrogênio, ligação de van der Waals e interação hidrofóbica para o formato tif ou jpeg.
11. Após a conclusão do experimento, lave a célula da amostra seguindo a Etapa 7.4.

8. Análise estatística

1. Realizar todos os experimentos em três repetições independentes (n = 3).
2. Apresentar os dados experimentais como meio ± DP e realizar análises estatísticas utilizando o software de análise estatística desejado.
3. Use um teste t de Student não pareado bicaudal para comparar entre dois valores médios ou aplicar a análise de variância unidirecional (ANOVA) com Dunnett para comparações múltiplas entre vários valores a um valor de controle. Fixou o nível de significância em p ≤ 0,05.

Foram observadas características de maturação hepática, incluindo células binucleadas e morfologia poligonal (Figura 1), especialmente no estágio diferenciado do imHC (Figura 1A). Um grande aumento na expressão de NTCP foi medido em d-HepaRG e d-imHC em 7 e 40 vezes, respectivamente (Figura 1B). A forma altamente glicosilada do NTCP, postulada para conferir suscetibilidade à entrada do HBV, foi detectada mais no d-imHC do que no d-HepaRG (Figura 1C). O imHC diferenciado continha níveis de NTCP 65,9% maiores do que as células indiferenciadas (Figura 1D).

A Figura 2A apresenta um resumo do tratamento profilático. A Figura 2B mostra a coloração por imunofluorescência do VHB realizada para avaliar as atividades de entrada no anti-VHB no 7º dia pós-infecção, enquanto a Figura 2C descreve o protocolo do ensaio de ligação ao VHB. O nível de ligação do HBV no receptor da superfície celular foi avaliado por PCR em tempo real (Figura 2D). Para determinar se o NTCP era o receptor para a ligação do HBV, a captação de TCA foi determinada para os inibidores de ligação candidatos (Figura 2E). Com base nesse modelo, a suposta atividade inibitória de compostos candidatos diminuiu a ligação do HBV através do NTCP.

A alteração calorimétrica foi detectada com injeções contínuas na célula da amostra (Figura 3). Uma regressão padrão de mínimos quadrados não lineares foi plotada com base em um local de ligação ajustado bem aos dados. A linha sólida indicou o melhor ajuste aos valores experimentais (Figura 3A,B). A Tabela 1 mostra os parâmetros termodinâmicos correlacionados com a ligação do NTCP com a ciclosporina A (CsA) ou um composto candidato.

Figura 1: Maturação hepática do HepaRG e do imHC com caracterização do PNCT. Ambas as linhagens celulares foram cultivadas em meio de maturação hepática por 2 semanas. (A) Características dos hepatócitos como células binucleadas e morfologia em forma poligonal foram observadas exclusivamente no estágio de maturação do imHC. Barras de escala = 50 μm. (B) A expressão de NTCP foi regulada positivamente tanto no HepaRG quanto no imHC. O NTCP normalizado com GAPDH foi maior no imHC do que no HepaRG. (C) Uma forma altamente glicosilada de NTCP foi observada após a maturação. (D) A porcentagem de elevação do NTCP no d-imHC foi avaliada por citometria de fluxo. Os dados são apresentados como média ± DP. *, **, e *** representam diferença estatística com p < 0,05, p < 0,01 e p < 0,001, respectivamente. Abreviaturas: NTCP = polipeptídeo cotransportador de taurocolato de sódio; GAPDH = gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase; NTCP-FITC = NTCP marcado com isotiocianato de fluoresceína. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: O tratamento profilático com MCC diminuiu a entrada viral, o DNA intracelular do HBV e a atividade de captação do TCA. (A) d-imHC foram pré-tratados com CCM por 2 h antes da inoculação com HBV. (B) A atividade de entrada do anti-VHB foi determinada pela coloração por imunofluorescência no 7º dia pós-infecção. (C) Um cronograma esquemático do protocolo de ligação do HBV é apresentado. (D) O nível de DNA do HBV ligado nos hepatócitos foi avaliado e comparado com 4 μM de CsA e o inibidor clássico de entrada do HBV 25 unidades/mL de heparina. (E) O efeito do CCM 10-30 μM na inibição da captação do TCA foi mediado pelo receptor NTCP. Abreviaturas: CCM = curcumina; HBV = vírus da hepatite B; ATC = ácido taurocólico; d-imHC = imHC diferenciado; CsA = ciclosporina A; HP = heparina. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: A afinidade do NTCP com moléculas individuais (CsA ou composto candidato) foi demonstrada usando ITC. O perfil ITC para a combinação de NTCP com (A) CsA ou (B) curcumina foi gerado a partir da injeção sequencial de um composto (150 μM CsA ou candidato) na solução NTCP (15 μM de NTCP, pH 7,0, 25 °C). Os dados calorimétricos brutos entre potência diferencial (μcal/s) e tempo (min) foram plotados. Os dados foram analisados com base em um modelo de ligação de um único local, onde as linhas sólidas indicaram os melhores resultados de ajuste. Durante a injeção de ligantes (CSA ou curcumina) na solução de NTCP, a entalpia (ΔH) mudou após um aumento na concentração de ligantes na célula da amostra. Esses dados indicam que a reação de ligação ocorreu. Abreviaturas: CsA = ciclosporina A; NTCP = polipeptídeo cotransportador de taurocolato de sódio; ITC = calorimetria de titulação isotérmica; DP = potência diferencial. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Parâmetros termodinâmicos resultantes da interação entre NTCP e compostos individuais (CCM e TCA) utilizando ITC. Abreviaturas: NTCP = polipeptídeo cotransportador de taurocolato de sódio; CCM = curcumina; ATC = ácido taurocólico; ITC = calorimetria de titulação isotérmica.

A infecção pelo VHB é iniciada via ligação de baixa afinidade aos proteoglicanos do sulfato de heparano (HSPGs) nos hepatócitos²⁵, seguida pela ligação ao NTCP com subsequente internalização por endocitose²⁶. Como o NTCP é um receptor crucial para a entrada no HBV, a segmentação da entrada no HBV pode ser clinicamente traduzida para diminuir a infecção de novo, a transmissão de mãe para filho (MTCT) e a recorrência após o transplante hepático. Interromper a entrada viral seria uma alternativa viável para a infecção crônica pelo HBV.

Algumas etapas críticas no protocolo acima mencionado estão resumidas aqui. Ao preparar as células hospedeiras, certifique-se de que os hepatócitos atinjam 100% de confluência antes de adicionar o meio de maturação com 2% de DMSO. A cultura de hepatócitos subconfluentes em DMSO a 2% levará à morte celular e ao descolamento. O período de maturação pode ser estendido até 4 semanas para maximizar a expressão de NTCP^27,28, embora um período de maturação de 2 semanas seja recomendado.

Três técnicas foram propostas para a quantificação da expressão celular de NTCP. Recomenda-se que os usuários selecionem a técnica com a qual estão mais familiarizados; aqui, preferimos a citometria de fluxo à análise de western blot porque é conveniente, rápida e fácil.

Para a produção das partículas de HBV derivadas da cultura celular (HBVcc), a HepG2.2.15 foi derivada da HepG2 por transfecção transitória com genoma de comprimento total do HBV, juntamente com o gene de resistência à geneticina (G418)²⁹. O meio de cultura deve conter 380-500 μg/mL de genética, caso contrário, as células não produzirão HBVcc. O filtro de 0,45 μm de baixa ligação às proteínas deve ser usado para esclarecer o sobrenadante para evitar a perda do rendimento do HBV. Para a concentração do HBV, utilizou-se polietilenoglicol (PEG) com centrífuga padrão. As partículas de HBV também podem ser concentradas usando um gradiente de sacarose e ultracentrifugação. Múltiplos ciclos de congelamento e descongelamento devem ser evitados, uma vez que a infecciosidade será diminuída.

No ensaio de entrada anti-VHB, os hepatócitos devem atingir 100% de confluência antes da indução da maturação. Este protocolo foi desenvolvido com base no tratamento profilático. As células hospedeiras foram expostas aos compostos candidatos por 2 h antes da infecção pelo HBV¹². Após 7 dias após a infecção, a infectividade do HBV foi avaliada por imunofluorescência. Todos os componentes, concentrações da solução bloqueadora, anticorpos primários e secundários e etapas de lavagem devem ser otimizados para alcançar o melhor resultado com o mínimo de coloração não específica. Aqui, fornecemos concentrações e técnicas otimizadas.

O protocolo de ensaio de captação de TCA descreve o padrão-ouro para a inibição do transporte NTCP. Modificamos o protocolo para evitar o TCA radioativo. As etapas críticas para o ensaio de captação de TCA são a lavagem e a colheita de células. Todos esses procedimentos devem ser realizados no gelo o tempo todo para evitar uma maior atividade celular-internalização do composto. Depois de homogeneizar as células e peletizar os detritos celulares, o sobrenadante deve ser suavemente aspirado sem interromper o pellet. Se a instalação do usuário permitir o uso da técnica de cintilação líquida, o ácido ³H-taurocólico é comumente usado em estudos de transporte e captação de TCA. Como validamos a captação de TCA usando ELISA, essa técnica alternativa pode substituir o uso do composto radioativo.

O ITC é um método biofísico amplamente utilizado para determinar os parâmetros termodinâmicos ligados às interações entre proteínas solúveis e ligantes de pequeno peso molecular^30,31. Esta técnica pode ser usada para investigar a interação de vários ligantes com uma pequena molécula ou proteína. O ITC é um método direto e não invasivo, sem etapas adicionais para detecção de sinal, sem limitações de peso molecular e sem marcação, imobilização ou qualquer outra modificação química. A limitação do ITC é o pré-requisito de altas concentrações dos materiais que interagem. A proteína e o ligante devem ser altamente purificados e suficientemente solúveis em água (10-100 μM) a 25 °C durante 1 h com agitação. A solução proteica instável pode ser detectada através da mudança do sinal de calor em função do tempo.

Os hepatócitos humanos com NTCP aprimorado fornecem um modelo alternativo para o estudo in vitro da infecção pelo HBV, mas são semelhantes ao HepaRG e aos hepatócitos humanos primários. Esses modelos de hospedeiros são prejudicados por sua confiabilidade e suscetibilidade limitadas ^8,33. A propagação ineficiente do HBV em células HepG2-NTCP ou Huh7-NTCP foi evidenciada pelo baixo inóculo do HBV derivado de células produtoras de HBVcc. Em vários estudos, o HBV foi usado para infectar as células-alvo a um MOI de 1.000^33,34. As partículas subvirais no HBVcc contêm proteína do envelope do HBV (L/M/S) e se ligam competitivamente ao NTCP, resultando em diminuição da infectividade³⁵. Para superar essa limitação, este protocolo modificou a cultura HepaRG ou imHC com um protocolo de maturação para maximizar os níveis de NTCP. O HBVcc derivado de HepG2.2.15 foi concentrado antes de ser usado como inóculo. A infectividade do HBV foi superior a 80% no imHC diferenciado com base na medida do antígeno central do HBV¹¹.

Descrevemos a identificação de compostos anti-HBV visando o NTCP para interromper a entrada viral e adotamos um procedimento de maturação hepática para aumentar os níveis de NTCP. Para identificar os inibidores de entrada, os hepatócitos foram pré-tratados com compostos candidatos por 2 h antes da infecção pelo HBV a 4 °C para permitir a ligação viral, mas não a entrada. A diminuição da infecciosidade do VHB foi avaliada no 7º dia pós-infecção. Os dados representativos incluíram a ciclosporina A, um inibidor clássico do NTCP, como controle positivo para validar o modelo.

Como o NTCP facilita as funções de endocitose mediadas pelo transportador e pelo receptor, os inibidores de entrada do HBV podem atingir pelo menos um desses mecanismos. A inibição do transporte de NTCP pode ser avaliada por meio de um ensaio de captação de TCA baseado em ELISA, eliminando o TCA radioativo do protocolo clássico³⁶. A afinidade entre o NTCP e o inibidor de entrada foi medida usando o ITC. Esta técnica forneceu parâmetros termodinâmicos essenciais, incluindo a estequiometria (n), constante de dissociação (K_D), mudança na energia livre (ΔG), entalpia (ΔH), entropia (ΔS) e capacidade térmica de ligação (ΔCp). Vários agentes anti-HBV foram identificados por acoplamento molecular, como quercetina, rutina, hesperidina e luperol, que poderiam se ligar especificamente à transcriptase reversa do HBV comparável à lamivudina, um análogo de nucleosídeo. Os compostos foram investigados usando ITC e exibiram energia de Gibb negativa (−ΔG) variando de −9,3 a −5,2 kcal/mol e K_D de 1 × 10-6 a 1 × ^10-3 M com HBV polimerase³⁷. Tomados em conjunto, os dados obtidos a partir desses ensaios acima mencionados ajudarão a rastrear a eficácia antiviral de compostos candidatos que atuam como inibidores da entrada do HBV. O protocolo estabelecido será útil para descobrir novos antagonistas/inibidores do NTCP. A supressão da entrada viral pode ser útil no tratamento profilático e terapêutico.

Os autores declaram que a pesquisa foi conduzida na ausência de quaisquer relações comerciais ou financeiras que pudessem ser interpretadas como um potencial conflito de interesses.

Este projeto de pesquisa é apoiado pela Universidade Mahidol e pela Tailândia Science Research and Innovation (TSRI) separadamente concedido a A. Wongkajornsilp e K. Sa-ngiamsuntorn. Este trabalho foi apoiado financeiramente pelo Gabinete do Conselho Nacional de Política de Investigação e Inovação em Ciências do Ensino Superior através da Unidade de Gestão do Programa para a Competitividade (número de subvenção C10F630093). A. Wongkajornsilp é um destinatário de uma bolsa Chalermprakiat da Faculdade de Medicina Hospital Siriraj, Universidade Mahidol. Os autores gostariam de agradecer à Srta. Sawinee Seemakhan (Excelente Centro de Descoberta de Drogas, Faculdade de Ciências, Universidade Mahidol) por sua assistência com a técnica ITC.