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我们提出了一种针对病毒进入前和进入生命周期阶段的抗乙型肝炎病毒(HBV)化合物的协议,使用等温滴定量热法测量与宿主牛磺胆酸钠共转运多肽的结合亲和力(KD)。通过抑制病毒生命周期标志物(cccDNA形成,转录和病毒组装)来确定抗病毒功效。
乙型肝炎病毒(HBV)感染被认为是肝细胞癌的关键危险因素。目前的治疗只能减轻病毒载量,但不能完全缓解。HBV感染的有效肝细胞模型将提供真实的病毒生命周期,这对于筛选治疗剂至关重要。大多数可用的抗HBV药物针对病毒进入后的生命周期阶段,而不是病毒进入之前。该协议详细说明了能够筛选针对病毒进入前和病毒进入后生命周期阶段的治疗剂的感受态肝细胞模型的生成。这包括靶向牛磺胆酸钠共转运多肽(NTCP)结合,cccDNA形成,转录和基于imHC或HepaRG作为宿主细胞的病毒组装。在这里,HBV进入抑制测定使用姜黄素通过NTCP抑制HBV结合和转运功能。使用等温滴定量热法(ITC)评估抑制剂与NTCP的结合亲和力(KD),ITC是一种基于热力学参数的HBV药物筛选通用工具。
乙型肝炎病毒(HBV)感染在世界范围内被认为是一种危及生命的疾病。慢性HBV感染有肝硬化和肝细胞癌的风险1。目前的抗HBV治疗主要集中在使用核苷(酸)类似物(NAs)和干扰素-α(IFN-α)进入病毒后2,3。HBV进入抑制剂Myrcludex B的发现确定了抗HBV药物的新靶点4。与仅靶向病毒复制的抑制剂相比,慢性HBV中进入抑制剂和NAs的组合显着降低了病毒载量5,6。然而,用于筛选HBV进入抑制剂的经典肝细胞模型受到低病毒受体水平(牛磺胆酸钠共转运多肽,NTCP)的限制。hNTCP在肝癌细胞(即HepG2和Huh7)中的过表达可提高HBV感染性7,8。然而,这些细胞系表达低水平的I期和II期药物代谢酶,并表现出遗传不稳定性9。肝细胞模型可以帮助靶向候选抗HBV化合物的不同机制,如病毒前进入,NTCP结合和病毒进入,将加快有效联合方案的鉴定和开发。姜黄素抗HBV活性的研究阐明了抑制病毒进入作为病毒进入后中断的新机制。该协议详细介绍了用于筛选抗HBV进入分子的宿主模型10。
该方法的目标是探索用于抑制病毒进入的候选抗HBV化合物,特别是阻断NTCP结合和转运。由于NTCP表达是HBV进入和感染的关键因素,我们优化了肝细胞成熟方案,以最大限度地提高NTCP水平11。此外,该方案可以将对HBV进入的抑制作用区分为抑制HBV附着与抑制内化。牛磺胆酸(TCA)摄取测定也使用基于ELISA的方法而不是放射性同位素进行修饰,以表示NTCP转运12,13。受体和配体的相互作用通过它们的3D结构14,15得到证实。NTCP功能的抑制可以通过测量TCA摄取活性来评估16。然而,该技术并未提供NTCP与候选抑制剂结合的直接证据。因此,可以使用各种技术来研究结合,例如表面等离子体共振17,ELISA,基于荧光的热移位测定(FTSA)18,FRET19,AlphaScreen和各种其他方法20。在这些技术中,ITC是结合分析的目标标准,因为它几乎可以观察每个反应中的吸热或发射21。使用ITC直接评估NTCP和候选化合物的结合亲和力(KD);这些亲和力值比使用 计算机 预测模型22获得的值更精确。
该协议涵盖了肝细胞成熟,HBV感染和HBV进入抑制剂筛查的技术。简而言之,基于imHC和HepaRG细胞系开发了肝细胞模型。培养的细胞在2周内分化为成熟的肝细胞。使用实时荧光定量PCR、蛋白质印迹和流式细胞术检测NTCP水平的上调11。乙型肝炎病毒粒子(HBVcc)是从HepG2.2.15中产生和收集的。分化的imHC或HepaRG(d-imHC,d-HepaRG)在接种HBV病毒粒子前2小时用抗HBV候选物预防性处理。实验的预期结果是鉴定降低细胞HBV和感染性的药物。使用TCA摄取测定法评估抗NTCP活性。NTCP活性可以被特异性结合NTCP的代理抑制。采用ITC技术研究了可以预测抑制剂及其靶蛋白的交互式结合的可行性,通过生物分子复合物23,24的非共价相互作用确定配体对受体的结合亲和力(KD)。例如,K D ≥ 1 × 103 mM代表弱结合,K D ≥ 1 × 10 6 μM代表中等结合,K D ≤ 1 ×10 9 nM代表强结合。ΔG与结合相互作用直接相关。特别是,负ΔG的反应是用力反应,表明结合是一个自发过程。负ΔH的反应表明结合过程取决于氢键和范德华力。TCA摄取和ITC数据都可用于筛查抗HBV进入剂。这些方案的结果不仅可以为抗HBV筛查提供基础,还可以通过结合亲和力和转运功能评估与NTCP的相互作用。本文描述了宿主细胞的制备和表征、实验设计以及抗HBV条目以及NTCP结合亲和力的评估。
注意:以下程序必须在II类生物危害流罩或层流罩中执行。乙肝病毒的处理得到了IRB的道德批准(MURA2020/1545)。有关本协议中使用的所有溶液、试剂、设备和细胞系的详细信息,请参阅 材料表 。
1. 制备宿主细胞(成熟肝细胞)
2. 细胞NTCP的定量
3. 生产细胞培养衍生的HBV颗粒(HBVcc)
4. 抗乙肝病毒进入检测
5. HBV细胞结合试验
6. 牛磺胆酸 (TCA) 摄取测定
7. 使用等温滴定量热法测定蛋白质-配体相互作用
注意:该检测系统是基于MicroCal PEAQ-ITC(ITC软件)开发的。
8. 统计分析
观察到肝脏成熟特征,包括双核细胞和多边形形态(图1),特别是在imHC的分化阶段(图1A)。在d-HepaRG和d-imHC中分别以7倍和40倍测量NTCP表达的大幅增加(图1B)。高度糖基化的NTCP形式,假设赋予HBV进入的敏感性,在d-imHC中检测到的比在d-HepaRG中检测到的更多(图1C)。分化的imHC含有比未分化细胞高65.9%的NTCP水平(图1D)。
图2A 显示了预防性治疗的摘要。图 2B 显示了HBV免疫荧光染色,用于评估感染后第7天的抗HBV进入活性,而 图2C 概述了HBV结合测定方案。通过实时荧光定量PCR评估HBV在细胞表面受体上的结合水平(图2D)。为了确定NTCP是否是HBV附着的受体,确定了候选结合抑制剂的TCA摄取(图2E)。基于该模型,候选化合物的假定抑制活性降低了通过NTCP的HBV结合。
通过连续向样品池进样来检测量热变化(图3)。基于一个与数据拟合良好的结合位点绘制标准非线性最小二乘回归。实线表示最适合实验值(图3A,B)。 表1 显示了与NTCP与环孢菌素A(CsA)或候选化合物结合相关的热力学参数。
图 1:具有 NTCP 表征的 HepaRG 和 imHC 的肝脏成熟。两种细胞系均在肝成熟培养基中培养2周。(A)在imHC的成熟阶段仅观察到肝细胞特征,例如双核细胞和多边形形态。比例尺 = 50 μm. (B)NTCP的表达在HepaRG和imHC中均上调。使用GAPDH标准化的NTCP在imHC中高于HepaRG。(C)成熟后观察到高度糖基化的NTCP形式。(D)使用流式细胞术评估d-imHC中NTCP升高的百分比。数据以平均值表示,±标准偏差*、**和***分别表示p<0.05、p <0.01和p <0.001 的统计差异。缩写:NTCP =牛磺胆酸钠共转运多肽;GAPDH = 甘油醛 3-磷酸脱氢酶;NTCP-FITC = 异硫氰酸荧光素标记的 NTCP。请点击此处查看此图的大图。
图 2:预防性 CCM 治疗可降低病毒进入、细胞内 HBV DNA 和 TCA 摄取活性 。 (A)d-imHC在接种HBV之前用CCM预处理2小时。(B)在感染后第7天通过免疫荧光染色测定抗HBV进入活性。(C)给出了HBV结合方案的示意图。(D)评估肝细胞上结合的HBV DNA水平,并与4μM CsA和经典HBV进入抑制剂25单位/mL肝素进行比较。(E)10-30μM CCM对TCA摄取抑制的影响是通过NTCP受体介导的。缩写:CCM = 姜黄素;HBV = 乙型肝炎病毒;TCA = 牛磺胆酸;d-imHC = 分化 imHC;CsA = 环孢素 A;HP=肝素。 请点击此处查看此图的大图。
图 3:使用 ITC 证明了 NTCP 对单个分子(CsA 或候选化合物)的亲和力。 NTCP与(A)CsA或(B)姜黄素组合的ITC曲线是通过将化合物(150μM CsA或候选化合物)顺序注入NTCP溶液(15μMNTCP,pH 7.0,25°C)中产生的。绘制了差分功率(μcal/s)和时间(min)之间的量热原始数据。基于单位点结合模型分析数据,其中实线表示最佳拟合结果。在将配体(CSA或姜黄素)注入NTCP溶液期间,样品池中配体浓度增加后焓(ΔH)发生变化。这些数据表明发生了结合反应。缩写:CsA = 环孢菌素 A;NTCP = 牛磺胆酸钠共转运多肽;ITC = 等温滴定量热法;DP = 差分功率。 请点击此处查看此图的大图。
蛋白 | 配体 | 结合常数 (KD) | 焓变 (ΔH) | 熵变化 (ΔTΔS) | 吉布斯自由能变化 (ΔG) | 装订类型 |
(M-1) | (千卡/摩尔) | (千卡/摩尔) | (千卡/摩尔) | |||
人类NTCP (SLA10A1) | CCM | 1.21 ×10-6 | -1 | 0.6 | -0.39 | 氢键 |
人类NTCP (SLA10A1) | 三甲酸 | 1 ×10-9 | 80 | -96 | -16 | 疏水相互作用 |
表1:使用ITC的NTCP与单个化合物(CCM和TCA)相互作用产生的热力学参数。 缩写:NTCP =牛磺胆酸钠共转运多肽;CCM = 姜黄素;TCA = 牛磺胆酸;ITC = 等温滴定量热法。
HBV感染通过与肝细胞25上的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(HSPG)的低亲和力结合而引发,然后与NTCP结合,随后通过内吞作用26内化。由于NTCP是HBV进入的关键受体,因此靶向HBV进入可以在临床上转化为减少 新发 感染,母婴传播(MTCT)和肝移植后的复发。阻断病毒进入将是慢性HBV感染的可行替代疗法。
这里总结了上述协议中的一些关键步骤。在制备宿主细胞时,在加入含有2%DMSO的成熟培养基之前,确保肝细胞达到100%汇合。在2%DMSO中培养亚融合肝细胞将导致细胞死亡和脱离。成熟期可以延长至4周,以最大限度地提高NTCP表达27,28,但建议成熟期为2周。
已经提出了三种技术来量化细胞NTCP表达。建议用户选择他们最熟悉的技术;在这里,我们更喜欢流式细胞术而不是蛋白质印迹分析,因为它方便、快速且简单。
为了生产细胞培养来源的HBV颗粒(HBVcc),HepG2.2.15通过瞬时转染与HBV全长基因组和遗传素(G418)抗性基因29一起来源于HepG2。培养基应含有380-500μg/mL的遗传素,否则细胞不会产生HBVcc。应使用低蛋白结合的0.45μm过滤器澄清上清液,以避免HBV产量损失。为了浓缩HBV,聚乙二醇(PEG)与标准离心机一起使用。HBV颗粒也可以使用蔗糖梯度和超速离心进行浓缩。应避免多次冻融循环,因为传染性会降低。
在抗HBV进入测定中,肝细胞在诱导成熟之前必须达到100%汇合。该方案是基于预防性治疗开发的。在感染HBV12之前,将宿主细胞暴露于候选化合物2小时。感染后7天后,使用免疫荧光评估HBV感染性。必须优化所有组分、封闭溶液浓度、一抗和二抗以及洗涤步骤,以尽量减少非特异性染色获得最佳结果。在这里,我们提供了优化的浓度和技术。
TCA摄取测定方案描述了抑制NTCP转运的金标准。我们修改了协议以避免放射性TCA。TCA摄取测定的关键步骤是细胞洗涤和收获。所有这些程序必须始终在冰上进行,以防止化合物的进一步细胞活性内化。在均质化细胞和沉淀细胞碎片后,必须在不破坏沉淀的情况下轻轻吸出上清液。如果用户的设施允许使用液体闪烁 技术,则3 H-牛磺胆酸通常用于TCA转运和摄取研究。当我们使用ELISA验证TCA吸收时,这种替代技术可以替代放射性化合物的使用。
ITC是一种生物物理方法,广泛用于确定与可溶性蛋白质和小分子量配体30,31之间的相互作用相关的热力学参数。该技术可用于研究各种配体与小分子或蛋白质的相互作用。ITC是一种直接且无创的方法,无需额外的信号检测步骤,没有分子量限制,也没有标记,固定或任何其他化学修饰。ITC的局限性是高浓度相互作用材料的先决条件。蛋白质和配体必须高度纯化,并在25°C下搅拌下充分溶于水(10-100μM)1小时。不稳定的蛋白质溶液可以通过热信号随时间的变化来检测。
人增强NTCP肝细胞为HBV感染的 体外 研究提供了另一种模型,但与HepaRG和原代人肝细胞相似。这些主机模型受到其有限的可靠性和敏感性的阻碍8,33.HBV在HepG2-NTCP或Huh7-NTCP细胞中的低效繁殖由来自HBVcc产生细胞的低HBV接种物证明。在几项研究中,HBV用于感染靶细胞,MOI为1,00033,34。HBVcc中的亚病毒颗粒含有HBV包膜蛋白(L/M/S)并竞争性结合NTCP,导致感染性降低35。为了克服这一限制,该协议用成熟方案修改了HepaRG或imHC培养物,以最大限度地提高NTCP水平。来源于HepG2.2.15的HBVcc在用作接种物之前被浓缩。根据HBV核心抗原11的测量,分化imHC的HBV感染率高于80%。
我们已经描述了靶向NTCP的抗HBV化合物的鉴定,以中断病毒进入,并采用了肝脏成熟程序来提高NTCP水平。为了鉴定进入抑制剂,在4°C下用HBV感染之前,用候选化合物预处理肝细胞2小时,以允许病毒结合但不能进入。在感染后第7天评估HBV感染性的降低。代表性数据包括环孢素A,一种经典的NTCP抑制剂,作为阳性对照来验证模型。
由于NTCP促进转运蛋白和受体介导的内吞功能,HBV进入抑制剂可以靶向这些机制中的至少一种。NTCP转运的抑制可以使用基于ELISA的TCA摄取测定来评估,从而从经典方案中消除放射性TCA36。使用ITC测量NTCP与进入抑制剂之间的亲和力。该技术提供了基本的热力学参数,包括化学计量(n),解离常数(KD),自由能(ΔG),焓(ΔH),熵(ΔS)和结合热容(ΔCp)。通过分子对接已经鉴定出各种抗HBV药物,如槲皮素、芦丁、橙皮苷和羽哌罗尔,它们可以特异性结合HBV逆转录酶,可与核苷类似物拉米夫定相媲美。使用ITC研究了这些化合物,其吉布负能量(−ΔG)范围为-9.3至-5.2 kcal/mol,KD为1 × 10-6至1 × 10-3 M,HBV聚合酶37。综上所述,从上述测定中获得的数据将有助于筛选作为HBV进入抑制剂的候选化合物的抗病毒功效。已建立的方案将有助于发现新的NTCP拮抗剂/抑制剂。抑制病毒进入可能有助于预防和治疗。
作者声明,这项研究是在没有任何商业或财务关系的情况下进行的,这些关系可以解释为潜在的利益冲突。
该研究项目由玛希隆大学和泰国科学研究与创新(TSRI)分别授予A. Wongkajornsilp和K. Sa-ngiamsuntorn。这项工作由国家高等教育科学研究和创新政策委员会办公室通过竞争力项目管理单位(批准号C10F630093)提供财政支持。A. Wongkajornsilp是玛希隆大学医学院Siriraj医院Chalermprakiat赠款的获得者。作者要感谢Sawinee Seemakan小姐(玛希隆大学理学院药物发现优秀中心)对ITC技术的帮助。
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Cell lines | |||
HepaRG Cells, Cryopreserved | Thermo Fisher Scientific | HPRGC10 | |
Hep-G2/2.2.15 Human Hepatoblastoma Cell Line | Merck | SCC249 | |
Reagents | |||
4% Paraformadehyde Phosphate Buffer Solution | FUJIFLIM Wako chemical | 163-20145 | |
BD Perm/Wash buffer | BD Biosciences | 554723 | Perm/Wash buffer |
Cyclosporin A | abcam | 59865-13-3 | |
EDTA | Invitrogen | 15575-038 | 8 mM |
G 418 disulfate salt | Merck | 108321-42-2 | |
Halt Protease Inhibitor Cocktail EDTA-free (100x) | Thermo Scientific | 78425 | |
HEPES | Merck | 7365-45-9 | |
illustraTM RNAspin Mini RNA isolation kits | GE Healthcare | 25-0500-71 | |
illustra RNAspin Mini RNA Isolation Kit | GE Healthcare | 25-0500-71 | |
ImProm-II Reverse Transcription System | Promega | A3800 | |
KAPA SYBR FAST qPCR Kit | Kapa Biosystems | KK4600 | |
Lenti-X Concentrator | Takara bio | PT4421-2 | concentrator |
Luminata crescendo Western HRP substrate | Merck | WBLUR0100 | |
Master Mix (2x) Universal | Kapa Biosystems | KK4600 | |
Nucleospin DNA extraction kit | macherey-nagel | 1806/003 | |
Phosphate buffered saline | Merck | P3813 | |
Polyethylene glycol 8000 | Merck | 25322-68-3 | |
ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo scientific | P36930 | |
Recombinant NTCP | Cloud-Clone | RPE421Hu02 | |
RIPA Lysis Buffer (10x) | Merck | 20-188 | |
TCA | Sigma | 345909-26-4 | |
TCA Elisa kit | Mybiosource | MB2033685 | |
Triton X-100 | Merck | 9036-19-5 | |
Trypsin-EDTA | Gibco | 25200072 | Dilute to 0.125% |
Antibodies | |||
Anti-NTCP1 antibody | Abcam | ab131084 | 1:100 dilution |
Anti-GAPDH antibody | Thermo Fisher Scientific | AM4300 | 1:200,000 dilution |
HRP-conjugated goat anti-rabbit antibody | Abcam | ab205718 | 1:10,000 dilution |
HRP goat anti-mouse secondary antibody | Abcam | ab97023 | 1:10,000 dilution |
Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11008 | 1:500 dilution |
Reagent composition | |||
1° Antibody dilution buffer | |||
1x TBST | |||
3% BSA | Sigma | A7906-100G | Working concentration: 3% |
Sodium azide | Sigma | 199931 | Working concentration: 0.05% |
Hepatocyte Growth Medium | |||
DME/F12 | Gibco | 12400-024 | |
10% FBS | Sigma Aldrich | F7524 | |
1% Pen/Strep | HyClon | SV30010 | |
1% GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | |
Hepatic maturation medium | |||
Williams’ E medium | Sigma Aldrich | W4125-1L | |
10% FBS | Sigma Aldrich | F7524 | |
1% Pen/Strep | HyClon | SV30010 | |
1% GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | |
5 µg/mL Insulin | Sigma Aldrich | 91077C-100MG | |
50 µM hydrocotisone | Sigma Aldrich | H0888-1g | |
2% DMSO | PanReac AppliChem | A3672-250ml | |
IF Blocking solution | |||
1x PBS | Gibco | 21300-058 | |
3% BSA | Sigma | A7906-100G | Working concentration: 3% |
0.2% Triton X-100 | Sigma | T8787 | Working concentration: 0.2% |
RIPA Lysis Buffer Solution | Merck | 20-188 | Final concentration: 1X |
Protease Inhibitor Cocktail | Thermo Scientific | 78425 | Final concentration: 1X |
Na3VO4 | Final concentration: 1 mM | ||
PMSF | Final concentration: 1 mM | ||
NaF | Final concentration: 10 mM | ||
Western blot reagent | |||
10x Tris-buffered saline (TBS) | Bio-Rad | 170-6435 | Final concentration: 1X |
Tween 20 | Merck | 9005-64-5 | |
1x TBST | 0.1% Tween 20 | ||
1x PBS | Gibco | 21300-058 | |
Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | A53225 | |
Polyacrylamide gel | Bio-Rad | 161-0183 | |
Ammonium Persulfate (APS) | Bio-Rad | 161-0700 | Final concentration: 0.05% |
TEMED | Bio-Rad | 161-0800 | Stacker gel: 0.1%, Resolver gel: 0.05% |
2x Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 161-0737 | Final concentration: 1X |
Precision Plus Protein Dual Color Standards | Bio-Rad | 161-0374 | |
WB Blocking solution/ 2° Antibody dilution buffer | |||
1x TBST | |||
5% Skim milk (nonfat dry milk) | Bio-Rad | 170-6404 | Working concentration: 5% |
1x Running buffer 1 L | |||
10x Tris-buffered saline (TBS) | Bio-Rad | 170-6435 | Final concentration: 1X |
Glycine | Sigma | G8898 | 14.4 g |
SDS | Merck | 7910 | Working concentration: 0.1% |
Blot transfer buffer 500 mL | |||
10x Tris-buffered saline (TBS) | Bio-Rad | 170-6435 | Final concentration: 1X |
Glycine | Sigma | G8898 | 7.2 g |
Methanol | Merck | 106009 | 100 mL |
Mild stripping solution 1 L | Adjust pH to 2.2 | ||
Glycine | Sigma | G8898 | 15 g |
SDS | Merck | 7910 | 1 g |
Tween 20 | Merck | 9005-64-5 | 10 mL |
Equipments | |||
15 mL centrifuge tube | Corning | 430052 | |
50 mL centrifuge tube | Corning | 430291 | |
Airstream Class II | Esco | 2010621 | Biological safety cabinet |
CelCulture CO2 Incubator | Esco | 2170002 | Humidified tissue culture incubator |
CFX96 Touch Real-Time PCR Detector | Bio-Rad | 1855196 | |
FACSVerse Flow Cytometer | BD Biosciences | 651154 | |
Graduated pipettes (10 mL) | Jet Biofil | GSP010010 | |
Graduated pipettes (5 mL) | Jet Biofil | GSP010005 | |
MicroCal PEAQ-ITC | Malvern | Isothermal titration calorimeters | |
Mini PROTEAN Tetra Cell | Bio-Rad | 1658004 | Electrophoresis chamber |
Mini Trans-blot absorbent filter paper | Bio-Rad | 1703932 | |
Omega Lum G Imaging System | Aplegen | 8418-10-0005 | |
Pipette controller | Eppendorf | 4430000.018 | Easypet 3 |
PowerPac HC | Bio-Rad | 1645052 | Power supply |
PVDF membrane | Merck | IPVH00010 | |
T-75 cell culture flask | Corning | 431464U | |
Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell | Bio-Rad | 1703940 | Semi-dry transfer cell |
Ultrasonic processor (Vibra-Cell VCX 130) | Sonics & Materials | ||
Versati Tabletop Refrigerated Centrifuge | Esco | T1000R | Centrifuge with swinging bucket rotar |
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