Temas Aşırı Duyarlılığının Bir Fare Modelinde Granülosit-Makrofaj Koloni Uyarıcı Faktör Üreten T Yardımcı Hücrelerinin Analizi

Burada, granülosit-makrofaj koloni uyarıcı faktör üreten T yardımcı alt kümesini in vivo olarak analiz etmek için basit ve standartlaştırılmış bir yöntem sunuyoruz.

Geleneksel Th1 / Th2 / Th17 / Treg soylarına paralel olarak, granülosit-makrofaj koloni uyarıcı faktör üreten T yardımcı (Th-GM) hücreleri, T yardımcı hücrelerinin farklı bir alt kümesi olarak tanımlanmıştır (GM-CSF ⁺ IFN-γ^- IL-17A^- IL-22^- efektör CD4 ⁺ T hücreleri) insan ve farelerde. Kontakt aşırı duyarlılık (CHS), insanda alerjik kontakt dermatit (ACD) için mükemmel bir hayvan modeli olarak kabul edilir ve sağlam bir T hücresi aracılı immün yanıt gösterir. T hücresine bağımlı immün yanıtta in vivo Th-GM hücre alt kümesini analiz etmek için standartlaştırılmış ve kapsamlı bir test sağlamak için, bir murin CHS modeli, reaktif, düşük moleküler ağırlıklı, organik hapten, 2,4-dinitroflorobenzen (DNFB) ile duyarlılaştırma/meydan okuma ile indüklendi. Hapten ile bağışıklama üzerine üretilen efektör CD4⁺ T hücrelerindeki Th-GM alt kümesi akış sitometrisi ile analiz edildi. DNFB'nin neden olduğu CHS fare modelinde Th-GM'nin esas olarak lezyonlarda ve drenaj lenf düğümlerinde genişlediğini bulduk. Bu yöntem, Th-GM hücrelerinin biyolojisini ve ACD gibi çeşitli durumlarda GM-CSF'ye odaklanan terapötik stratejilerin farmakolojik araştırmalarını daha fazla incelemek için uygulanabilir.

Granülosit-makrofaj koloni uyarıcı faktör (GM-CSF) üreten T yardımcı hücreleri - Th-GM alt kümesi - insan ve farelerde T yardımcı hücrelerinin farklı bir alt kümesi olarak ortaya çıkmaktadır ve "yalnızca GM-CSF eksprese eden" (GM-CSF ⁺ IFN-γ^- IL-17A^- IL-22^-) tek hücreli RNA analizi, kütle sitometrisi ve GM-CSF kader haritalayıcı fareler ^1,2,3 ile tanımlanan CD4 T hücrelerini içerdiği düşünülmektedir. 2014 yılında, Sheng ve ark. Th-GM alt kümesinin sinyal dönüştürücüsünü ve transkripsiyon 5 (STAT5) programlamasının aktivatörünü bildirdi ve ilk kez "Th-GM" alt kümesini^{kavramsallaştırdı 4,5}. Th-GM hücreleri, GM-CSF, IL-2, TNF-α, IL-3, CCL20 ve kemokin reseptörleri CXC kemokin reseptör tipi (CXCR) 4 veya CXCR6 ^1,2'nin sitokin ekspresyonu ile karakterize edilir. STAT ve/veya NF-κB yolu, Th-GM soy farklılaşması için gereklidir. TCR uyaranları⁶ varlığında naif CD4 T hücrelerini IL-7 kullanarak Th-GM hücrelerine ayırt etmek için bir in vitro yöntem kurulmuştur. Bu arada, sitokinler IL-23 ve IL-1β'nin, Th-GM hücrelerinin ekspresyonunu ve patojenitesini ex vivo ^3,7 koruduğu gösterilmiştir.

Th-GM hücrelerinin yükselmesi, multipl skleroz ve romatoid artrit ^2,8,9 gibi çeşitli otoimmün hastalıklarla ilişkilendirilmiştir ve bu da otoimmünitenin patogenezinde potansiyel bir rol olduğunu düşündürmektedir¹⁰. Biriken kanıtlar, GM-CSF'nin inflamatuar bir mediatör olarak işlev görebileceğini düşündürmektedir. CD4 ⁺ T hücrelerinde genetik olarak Csf2'yi (GM-CSF'yi kodlayan gen) aşırı eksprese eden fareler, fagositlerin merkezi sinir sistemine infiltrasyonu ile birlikte kendiliğinden nörolojik defisitler geliştirdi. Bir T hücresi transfer kolit modelinde, Csf2 ^{− / -} T hücrelerinin Rag1 ^{− / / −} farelere evlat edinilmiş transferi, hastalığın klinik ve histopatolojik özelliklerini önemli ölçüde azaltmıştır. Bununla birlikte, ACD gibi alerjik hastalıklarda Th-GM alt kümesinin rolleri hakkında az sayıda rapor vardır.

ÖKD, iş ve yaşam ortamlarında yüksek prevalansı ile en sık görülen inflamatuar dermatolojik durumlar arasındadır^11,12. Zamansal olarak segmentlere ayrılmış iki fazda gelişen sağlam bir bağışıklık devresinin aracılık ettiği tip IV gecikmeli tip bir aşırı duyarlılık tepkisidir: duyarlılaştırma ve ortaya çıkarma. İnsan ACD'si, hassaslaşmaya yol açan bazı kimyasallara (hapten veya metaller) maruz kalmasıyla tetiklenir. Bu aşama sırasında, T hücresi aracılı bir yanıt, antijen sunan hücreler tarafından sunulan hapten-protein kompleksleri tarafından hazırlanır. Aynı hapten, hapten-spesifik efektör ve hafızaya daha sonra maruz kaldıktan sonra, T hücreleri yeniden aktive edilir ve cilde lokalize olur, bu da çeşitli bağışıklık hücresi popülasyonlarının infiltrasyonunu içeren bir süreçtir. Bu akut enflamatuar yanıt, ortaya çıkma olarak bilinir ve lezyonların tam olarak gelişmesine neden olur¹³. İnsan ACD'si, temas aşırı duyarlılığının (CHS) hayvan modelleri kullanılarak ^{incelenebilir14}.

Reaktif, düşük moleküler ağırlıklı, organik hapten, 2,4-dinitroflorobenzen (DNFB) tarafından indüklenen CHS modeli, ACD^15,16'nın patolojisinin yanı sıra potansiyel terapötik müdahalelerinin araştırılmasında kullanılan yaygın olarak kullanılan bir fare modelidir. Bu nedenle, bu T hücresine bağımlı model, alerjik hastalıkta Th-GM alt kümesinin oluşumunu incelemek için uygulanabilir. Burada, DNFB ile CHS'nin bir murin modelini indükledik, lezyonlarda ve drenaj lenf nodlarında Th-GM oluşumunu analiz ettik ve Th-GM alt kümesinin esas olarak aynı hapten'e yeniden maruz kaldığında genişlediğini bulduk. Bu, Th-GM alt kümesinin ACD gelişimi için gerekli olabileceğini ve ACD'de spesifik bir terapötik hedefi temsil ettiğini düşündürmektedir.

Bu protokolde kullanılan tüm fareler C57BL / 6 genetik arka planındaydı, belirli patojen içermeyen koşullar altında tutuldu ve yiyecek ve su ad libitum ile sağlandı. Tüm deneyler, Sichuan Üniversitesi (20210302059) Batı Çin Tıp Merkezi'nin hayvan refahı etik inceleme organı tarafından onaylandı.

1. Reaktif ve malzeme hazırlama

1. Hassaslaştırıcı olarak% 0.5 DNFB çözeltisi
   1. 10 farenin hassaslaştırılması için, 1.1 mL aseton/zeytinyağı 4: 1 (h/h) karışımı hazırlayın: 880 μL aseton ve 220 μL zeytinyağını karıştırarak 0.1 mL fazla hacmin küçük hacim kayıplarını hesaba katmasına izin verin. 1.1 mL homojenize aseton/zeytinyağı 4:1 karışımına 5 μL DNFB ekleyin.
      NOT: Hassasiyet gününde taze olarak hazırlanın. Aseton / zeytinyağı karışımı bir çeker ocakta hazırlanmalıdır.
2. Challenger olarak% 0.2 DNFB çözümü
   1. 10 fareye meydan okumak için, adım 0.5'de açıklanan 0.25 mL homojenize aseton / zeytinyağı 4: 1.1 karışımına 1.1 μL DNFB ekleyin. Aseton / zeytinyağı 4: 1 karışımını, hassaslaştırmadan sonra farelere meydan okurken bir araç olarak kullanın.
      NOT: Aseton / zeytinyağı karışımı bir davlumbazda hazırlanmalıdır.
3. Anestezik olarak kloral hidrat
   1. % 8'lik bir çalışma çözeltisi elde etmek için 4 g kloral hidratı 50 mL fosfat tamponlu salin (PBS) içinde çözün. Süzün ve 4 °C'de 3 aya kadar saklayın. Bir fare için vücut ağırlığının g'ı başına 5 μL kullanın.
4. 50x kollajenaz IV stoğu
   1. 100 mg / mL'lik bir stok yapmak için 100 mg kollajenaz IV'ü 1 mL bazik RPMI 1640 ortamında (antibiyotik veya fetal sığır serumu [FBS] ile desteklenmemiş) çözün. -20 °C'de 100 μL'lik alikotlarda 6 aya kadar saklayın.
5. 1.000x DNase I stoğu
   1. 5 mg / mL'lik bir stok yapmak için 5 mg DNaz I'i 1 mL 0.15 M NaCl içinde çözün. -20 °C'de 100 μL'lik alikotlarda 6 aya kadar saklayın.
6. Arabelleği durdur
   1. 100 mM'lik bir stok yapmak için 1.681 g EDTA'yı 50 mL bazik RPMI 1640 ortamında çözün. 4 °C'de 2 haftaya kadar saklayın.
7. Yıkama ortamı
   1. 0.372 g EDTA'yı 2 mM'lik bir nihai konsantrasyona ve 5 mL FBS'yi 500 mL PBS ile% 1'lik bir nihai konsantrasyona çözün. Süzün ve 4 °C'de 1 aya kadar saklayın.
8. Boyama tamponu
   1. 0.372 g EDTA'yı 2 mM'lik bir nihai konsantrasyona ve 10 mL FBS'yi 500 mL PBS ile% 2'lik bir nihai konsantrasyona çözün. Süzün ve 4 °C'de 1 aya kadar saklayın.
9. Yeniden stimülasyon reaktifleri
   1. 50 μg / mL'lik bir stok (500x) yapmak için 1 mg forbol 12-miristat 13-asetat (PMA) 20 mL DMSO'da çözün ve -20 ° C'de 50 μL'lik alikotlarda saklayın.
   2. 500 μg / mL'lik bir stok (500x) yapmak için 250 μL iyonomisini 7.75 mL DMSO'da çözelti (4 mg / mL) içinde seyreltin ve 50 μL'lik alikotlarda -20 ° C'de saklayın.
   3. 1 mL protein taşıma inhibitörü solüsyonunu (brefeldin A içeren) 50 μL'de alikotlayın ve alikotları 4 °C'de saklayın.

2. Farelerde CHS'nin indüksiyonu

1. -5. günde, intraperitoneal olarak 400 mg / kg kloral hidrat enjekte ederek fareleri uyuşturun.
2. Evcil hayvan tıraş makinesi kullanarak farenin karnında 2 cm × 2 cm'lik bir alanı tıraş edin.
   NOT: Fare kaplamasını çizmekten kaçının; Kutanöz bariyerin bütünlüğünü sağlam tutun.
3. 100 μL% 0.5 DNFB solüsyonunu tek kullanımlık uçları olan bir mikropipet ile traş edilmiş karın bölgelerine nazikçe ve eşit bir şekilde sürün. Çözücünün bir kısmının buharlaşmasına izin vermek için fareleri 5-10 saniye tutun.
4. -4. günde, başka bir duyarlılık için 2.1-2.3 adımlarını tekrarlayın.
   NOT: İki duyarlılaşma olayı bir olaydan daha iyi çalışır.
5. 0. günde, tek kullanımlık uçlara sahip bir mikropipetleyici kullanarak farelerin sağ kulağına 20 μL% 0.2 DNFB ile meydan okuyun ve sol kulağa araçla aynı hacimde aseton / zeytinyağı 4: 1 karışımı uygulayın.
   NOT: Kulağın dorsal ve ventral taraflarını eşit hacimde DNFB veya araçla zorlayın.
6. Önümüzdeki 3 gün içinde, bir kadran kalınlığı ölçer kullanarak farelerin sağ ve sol kulaklarının kulak kalınlığını günlük olarak ölçün ve kulak kalınlığındaki artışı hesaplayın: sağ kulak kalınlığı - sol kulak kalınlığı.
   NOT: Araçla tedavi edilen kulaklara kıyasla DNFB'ye meydan okuyan fare kulaklarında %0,2 kulak kalınlığında kademeli bir artış gözlenebilir.

3. CHS farelerinin örnek toplanması

1. 3. günde, fareleri 400 mg / kg kloral hidrat intraperitoneal enjeksiyonu ile uyuşturun. Farenin bilinç kaybı durumunda olması için 5-10 dakika bekleyin ve farelerin derin bir şekilde uyuşturulduğunu doğrulamak için her iki arka ayağınıza hafif bir ayak parmağı sıkıştırması yapın.
2. Bir kamera kullanarak fare başına her kulağın fotoğrafını çekin. İltihabın şiddetini 0 ila 5: 0 arasında bir ölçekte değerlendirmek için kulağın kabuklanmasını (kulakta ölçeklenme) ve kızarıklığı (kulakta eritem) bağımsız olarak puanlayın, yok; 1, hafif; 2, orta; 3, işaretli; 4, çok belirgin; 5, en şiddetli.
3. Fareyi servikal çıkık ile ötenazi yapın. Tüm kulağı kesin ve steril keskin makas ve forseps kullanarak farelerin paralel drenaj lenf düğümlerini inceleyin. Dokuları, tek hücreli süspansiyonlar oluşturmak için enzimatik veya fiziksel ayrışma için 5 mL önceden soğutulmuş PBS içeren buz üzerine yerleştirilmiş 6 oyuklu bir plakanın bir kuyucuğuna yerleştirin (Ek Şekil S1A ve Ek Şekil S2A).
4. Histolojik analiz için, kulak örneklerini %4 paraformaldehit içinde sabitleyin, dehidrat edin ve başka bir yerde açıklandığı gibi immünohistokimyasal boyama için parafine gömün¹⁷.

4. Kulaklardan tek hücreli süspansiyonun hazırlanması

1. Kulağın ventral ve dorsal taraflarını, kesilen uçları iki kavisli forseps ile sıkıştırarak ve yırtarak ayırın (Ek Şekil S1B). Bunları, 4.5 mL sindirim tamponu içeren 6 oyuklu bir plakanın kuyusuna yerleştirin ve bu dokuların tamamen sindirim tamponuna daldırıldığından emin olun (Ek Şekil S1C).
   NOT: Sindirim tamponu, %10 FBS + 25 mM HEPES + 2 mg/mL kollajenaz IV + 5 μg/mL DNaz I içeren RPMI 1640'tan oluşturulmuştur.
2. Kulak yaprakçıklarını 37 ° C'lik bir hücre kültürü inkübatöründe 20 dakika inkübe edin. Doku sindirimini kolaylaştırmak için kulak yaprakçıklarını makasla mümkün olduğunca küçük kesin (Ek Şekil S1D) ve numuneyi 40 dakika daha inkübatöre geri koyun.
   NOT: Verimli sindirim 40-50 dakika içinde sağlanabilir. 37 °C'de aşırı sindirim hücre canlılığını etkiler.
3. Kollajenaz IV ve DNaz I'in enzimatik aktivitelerini nötralize etmek için oyuk başına 0.5 mL durdurma tamponu ekleyin.
4. Kulak dokusu parçalarını bir çift kavisli forseps ile 70 μm'lik bir hücre süzgeci içeren 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın ve tüm ortam hacmini aynı hücre süzgecine pipetleyin.
5. 1 mL'lik bir şırınga pistonunun üst ucunu kullanarak dokuları bozun. Sadece beyaz bağ dokuları kalana kadar 70 μm hücre süzgecine karşı dairesel hareketlerle bastırın (Ek Şekil S1D).
6. Hücre süzgeçlerini 1.000 μL yıkama ortamı ile iki kez durulayın. Kuyunun tüm hacmini 40 μm'lik bir hücre süzgeci aracılığıyla 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın. Tüpü buz üzerinde tutun.

5. Drenaj lenf düğümlerinden (dLN'ler) tek hücreli süspansiyonların hazırlanması

1. Lenf düğümlerini bir çift kavisli forseps ile 6 oyuklu bir plakanın kuyusunun üstündeki 70 μm'lik bir hücre süzgecine aktarın (Ek Şekil S2B). 1 mL'lik bir şırınga pistonunun üst ucunu kullanarak lenf düğümlerini ayırın. Sadece beyaz kalıntı kalana kadar 70 μm hücre süzgecine karşı dairesel hareketlerle bastırın (Ek Şekil S2C).
2. Hücre süzgecini 1.000 μL yıkama ortamı ile iki kez durulayın. Kuyu hacminin tamamını 5 mL'lik bir tüpe aktarın. Tüpleri buz üzerinde tutun.

6. Th-GM alt kümesinin bir protein taşıma inhibitörü varlığında 12-miristat 13-asetat (PMA) / iyonomisin ile yeniden uyarılması

1. Kulaktan izole edilen hücreleri ve boşaltılan lenf nodu örneklerini 4 ° C'de 400 × g'da 8 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı atın. Peleti 1.000 μL yıkama ortamı ile nazikçe yeniden süspanse edin.
2. Bir hemositometre kullanarak kulaktan ve drenaj lenf nodundan elde edilen toplam hücre sayısını saymak için her numunenin küçük bir kısmını toplayın. Hücre canlılığını ölçmek için %0,04 tripan mavisi ekleyin.
   NOT: Sonraki T hücresi stimülasyonu ve analizi için hücre canlılığı %60'tan fazla olmalıdır. Hücre yoğunluğu 1-5 × 10⁶ / mL olabilir.
3. Adım 6.1'deki hücreleri santrifüjleyin ve süpernatanı atın. Peletleri% 2 FBS içeren 1.000 μL RPMI 1640 ortamı ile nazikçe yeniden süspanse edin ve 12 oyuklu düz tabanlı doku kültürü plakalarında 1 mL tek hücreli süspansiyon (10⁶ hücre / mL) tohumlayın.
4. 2 μL forbol 12-miristat 13-asetat (PMA) (son konsantrasyon 100 ng / mL), 2 μL iyonomisin (son konsantrasyon 1.000 ng / mL) ve 1 μL protein taşıma inhibitörü ekleyin (Brefeldin A içeren) yukarıda 1 mL tek hücreli süspansiyon içeren 12 oyuklu plakadaki her bir oyuğa ve 37 ° C'de 4 saat inkübe edin.

7. Hücre yüzeyi ve hücre içi boyama ile in vivo olarak üretilen Th-GM alt kümelerinin analizi

1. Uyarılan hücreleri bir pipet kullanarak 1,5 mL'lik santrifüj tüplerine aktarın. Santrifüj tüplerini oda sıcaklığında 400 × g'da 8 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı atın.
2. Hücre peletini 1 mL boyama tamponu ile bir kez yıkayın ve hücreleri adım 7.1'de açıklandığı gibi santrifüjleme ile peletleyin. Hücreleri 0.5 mL boyama tamponunda 1-10 × 10⁶ / mL'de yeniden süspanse edin.
3. 0,5 mL hücre süspansiyonuna 0,5 μL canlılık boya stoğu çözeltisi ( Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin ve hemen girdap yapın. Karışımı karanlıkta oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. Hücreleri 1 mL boyama tamponu ile iki kez yıkayın ve hücreleri peletlemek için 7.1. adımda santrifüjlemeyi tekrarlayın.
4. Peleti 0.1 mL boyama tamponunda yeniden süspanse edin. 1 μL anti-CD4 antikoru (FITC konjuge), 1 μL anti-CD44 antikoru (APC konjuge) ve 1 μL anti-CD62L antikor (PE / Siyanin7-konjuge) hücre süspansiyonunun üç 0.1 mL alikotuna ekleyin. Hemen vorteks yapın ve ışıktan koruyarak oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin.
5. Adım 7.3'te yıkamaları ve santrifüjlemeyi tekrarlayın.
6. Peleti 200 μL IC fiksasyon tamponunda yeniden süspanse edin ve karanlıkta 20 dakika inkübe edin. Bu arada, 1 kısım geçirgenlik tamponunu (1x) 10x) 9 kısım damıtılmış su ile seyrelterek geçirgenleştirme tamponunu (1x) hazırlayın. Hücreleri 1 mL geçirgenlik tamponu (1x) ile 600 × g'da oda sıcaklığında 5 dakika santrifüjleme ile iki kez yıkayın.
7. Pelet, GM-CSF (PE konjuge, 1 μL / test), IFN-γ (BV711 konjuge, 1 μL / test), IL-17A (BV421 konjuge, 1 μL / test) ve IL-22 (PerCP / Siyanin5.5-konjuge, 5 μL / test) ve karanlıkta oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.
8. Adım 7.6'da yıkamaları ve santrifüjlemeyi tekrarlayın.
9. Hücre peletini 200 μL PBS'de yeniden süspanse edin ve süspansiyonu yuvarlak tabanlı bir test tüpüne aktarın. Lekeli hücreleri bir akış sitometresinde çalıştırın.

8. Th-GM alt kümesini tanımlamak için geçit stratejisi

1. Ek Şekil S1'de gösterilen geçit stratejisini kullanarak akış sitometrisi verilerini analiz edin (kullanılan yazılımla ilgili ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakın). Burada kullanılan yazılımı indirin ve bilgisayara kurun.
2. Akış sitometrisi verilerini Dosya |Açık | FCS Dosyalarını yazılıma aktarın ve Yeniden Adlandır sekmesini seçerek her örneğin grubuna ve adına açıklama ekleyin.
3. Yoğunluk Grafiği'ne tıklayarak sol alt köşede bulunan kalıntıları ve büyük boyutlu ve yüksek tanecikli miyeloid hücreleri dışlamak için FSC'ye karşı SSC grafiğindeki lenfositleri seçin (FSC ^düşük SSC ^düşük, P1) ve bu grafiğin X eksenini FSC-A ve Y eksenini SSC-A olarak gösterin.
4. Başka bir yoğunluk grafiği oluşturmak için P1'deki olaylara çift tıklayın ve bu çizimdeki hücre yüksekliğini ve alanını seçerek (FSC-A olarak X ekseni ve FSC-H olarak Y ekseni) tek hücreleri (ilişkili bir çizgi olarak gösterilir, P2 olarak gösterilir) hücre toplamlarından ayırın.
5. Başka bir yoğunluk grafiği oluşturmak için P2'deki olaylara çift tıklayın ve bu grafiğin X eksenini FSC-A ve Y eksenini SSC-A olarak gösterin. FVS 780-olaylarını (P3) kullanarak canlı hücre popülasyonlarını kapatın.
6. Sonraki yoğunluk grafiğini oluşturmak için P3'teki olaylara çift tıklayın ( X ekseni CD4-A ve Y ekseni SSC-A olarak) ve CD4⁺ popülasyonunu (P4) seçerek CD4 T hücrelerini ayırt edin.
7. Başka bir yoğunluk grafiği oluşturmak için P4'teki olaylara çift tıklayın (X ekseni CD44-A ve Y ekseni CD62L-A) ve bu grafiğin sağ üst popülasyonunu seçerek efektör T yardımcı hücrelerini tanımlayın (CD62L^- CD44⁺, P5).

9. İstatistiksel analiz

1. Eşlenmemiş bir t-testi kullanarak iki grubu karşılaştırarak istatistiksel analizler yapın. *P < 0.05, ** P < 0.01, *** P < 0.001 ve **** P < 0.0001 (ortalama ± SD).

Farelerde DNFB'nin neden olduğu CHS (temas aşırı duyarlılığı)
Farelerde CHS'yi indüklemek için, fareler hassaslaştırıldı ve Şekil 1A'da gösterildiği gibi kulak derisine uygulanan DNFB ile sorgulandı. Epidermal süngerimsiozun bir göstergesi olan kulak kalınlığı, DNFB'ye meydan okuyan farelerde araçla tedavi edilen farelere kıyasla belirgin şekilde artmıştır (Şekil 1B, 1. günde 70'e karşı 3 μm, 2. günde 203'e karşı 7.5 μm, 3. günde 276'ya karşı 5 μm). Meydan okumadan yetmiş iki saat sonra, farelerin sağ kulağı eritem, kabuklanma ve kalınlaşma belirtileri gösterirken, araçla tedavi edilen kulak herhangi bir iltihap belirtisi göstermedi (Şekil 1C). DNFB'ye meydan okuyan gruptaki fare kulaklarının kabuklanma ve kızarıklık skorları, araçla tedavi edilen kulaklara göre daha yüksekti (Şekil 1D).

DNFB zorluğundan sonra artan epidermal kalınlaşma ve belirgin inflamatuar infiltrasyon
DNFB ile tedavi edilen deriden alınan H & E lekeli bölümlerin analizi, araçla tedavi edilen cilde kıyasla kulak derisinde artmış epidermal kalınlaşma gösterdi (Şekil 2A, B). İmmünohistokimya sonuçları, kulaklardaki CD45⁺ (total hematopoietik hücreler), Ly6G⁺ (nötrofiller) ve F4/80⁺ (makrofajlar) hücrelerinin infiltrasyonunun, DNFB ile tedavi edilen deride, araçla tedavi edilen dokulara göre anlamlı derecede yüksek olduğunu gösterdi (Şekil 2C,D). Birlikte ele alındığında, DNFB farelerde tipik bir ACD semptomuna neden oldu.

DNFB duyarlılığında Th-GM hücre alt kümesi üretimi / immünolojik modele meydan okuma
Hapten-spesifik naif Th öncü hücrelerinin, hapten duyarlılığı / meydan okuma bağışıklık tepkileri sırasında GM-CSF eksprese eden efektör hücrelere farklılaştığını varsaydık. Bu hipotezi test etmek için, akış sitometrisi ile hücre içi boyama ile DNFB'ye duyarlı / meydan okunmuş veya DNFB'ye duyarlı / araç sorgulu kulaklarda Th hücre farklılaşması araştırıldı (Ek Şekil S3). Zorluktan sonra, fare başına ortalama olarak yaklaşık 4.000 CD4 ⁺ T hücresi ve 1.898 efektör CD4 ⁺ T hücresi vardı (araçla tedavi edilen farelere kıyasla sırasıyla 23.8 kat ve 38.7 kat artış, Ek Şekil S4). Efektör Th hücrelerinde, yani Th-GM'de GM-CSF ⁺ IFN-γ^- IL-17A^- IL-22^- üretimi, DNFB'ye duyarlı / meydan okunmuş kulaklarda 3 kattan daha yüksekti (araç tarafından zorlanan kulaklarda% 8.3'e karşı% 25.6, Şekil 3A, B). DNFB'ye meydan okuyan kulaklarda efektör CD4 T hücrelerinin frekansında, araca meydan okuyan derilere kıyasla yaklaşık 10 kat genişleme vardı, bu da hapten meydan okuması üzerine Th hücre aktivasyonunun kuvvetliliğini gösteriyordu (Şekil 4A, B). Deri infiltratlarındaki Th-GM hücre alt kümesindeki değişiklikler kısmen dLN'lerde yansıtıldı, ancak bu artış dokulardaki kadar belirgin değildi (3.7 kat, Şekil 4C, D). Böylece, Th-GM hücre alt kümesi, bu hapten duyarlılık/meydan okuma immünolojik modelinde başarılı bir şekilde güçlendirildi.

Şekil 1: Farelerde DNFB'nin neden olduğu dermatolojik inflamasyon fenotipik olarak insandaki kontakt dermatite benzer . (A) Önerilen DNFB deneyinin şematik gösterimi. C57BL / 6J fareleri, -5 ve -4. günlerde karın üzerine DNFB sürülerek hassaslaştırıldı, 0. günde DNFB veya kulakta araç ile sorgulandı ve 1, 2 ve 3. günlerde değerlendirildi. (B) Araçla tedavi edilen veya DNFB'ye meydan okuyan farelerde kulak şişmesi (grup başına n = 6). (C) 3. günde araç veya DNFB ile zorlanan farelerde tüm kulakların temsili fotoğrafları. (D) DNFB veya araç ile zorlanan kulaklardaki kızarıklık ve kızarıklık skorları gösterilir (grup başına n = 6). P < 0.001 ve **** P < 0.0001 (ortalama ± SD). Veriler, her grupta 6 örnek bulunan üç bağımsız deneyi temsil etmektedir. Kısaltma: DNFB = 2,4-dinitroflorobenzen. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: DNFB duyarlılığı / zorluğu ile indüklenen farelerde histolojik inflamasyonun tipik değişikliği. (A) Belirtilen grupları temsil eden bireysel farelerden kulak derisinin H&E ile boyanması. (B) Çubuk grafikle gösterilen H & E boyama görüntülerinde ölçülen epidermal kalınlaşma. (C) DNFB veya araç ile zorlanan farelerin kulaklarında CD45, F4 / 80 ve Ly6G'nin immünohistokimyası. Kırmızı oklar pozitif lekeli hücreleri gösterir. (D) CD45-, F4 / 80- veya Ly6G pozitif hücrelerin, fare başına üç veya dört kör farklı bölümden kahverengi lekelenmeyi sayarak miktar tayini. P < 0.001 ve **** P < 0.0001 (ortalama ± SD). Veriler, her grupta 3-5 fare ile yapılan iki bağımsız deneyi temsil etmektedir. Ölçek çubuğu = 1.000 μm (A, C). Kısaltmalar: DNFB = 2,4-dinitroflorobenzen; H&E = hematoksilen ve eozin. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Farelerin kulak derisindeki Th-GM alt kümesi. (A) DNFB ile meydan okunan farelerin veya aracın kulak derisindeki Th-GM alt kümesinin akış sitometrisi, meydan okumadan 3 gün sonra değerlendirildi. (B) Efektör CD4 ⁺ T hücreleri içindeki Th-GM frekansları. Her sembol ayrı bir fareyi temsil eder. P < 0.001 ve **** P < 0.0001 (ortalama ± SD). Veriler, her gruptaki 6 örneği temsil etmektedir. Kısaltmalar: DNFB = 2,4-dinitroflorobenzen; GM-CSF = granülosit-makrofaj koloni uyarıcı faktör; Th-GM = GM-CSF üreten T yardımcısı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Farelerin kulak boşaltan lenf nodlarındaki Th-GM alt kümesi. (A) DNFB veya araç ile zorlanan farelerin kulak drenajı lenf düğümlerindeki efektör CD4⁺ T hücrelerinin akış sitometrisi, meydan okumadan 3 gün sonra değerlendirildi. (B) CD4 ⁺ T hücreleri içindeki efektör CD4 ⁺ T hücrelerinin frekansları. (C) DNFB ile zorlanan farelerin kulak boşaltan lenf düğümlerindeki Th-GM alt kümesinin akış sitometrisi veya meydan okumadan 2 gün sonra değerlendirilen araç. (D) Kulak boşaltan lenf düğümlerinde efektör CD4 ⁺ T hücreleri içindeki Th-GM alt kümesinin yüzdesi. P < 0.001 ve **** P < 0.0001 (ortalama ± SD). Veriler, her gruptaki 6 örneği temsil etmektedir. Kısaltmalar: DNFB = 2,4-dinitroflorobenzen; GM-CSF = granülosit-makrofaj koloni uyarıcı faktör; Th-GM = GM-CSF üreten T yardımcısı; T eff = efektör CD4⁺ T hücreleri. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil S1: Fare kulak derisinin işlenmesi. (A) C57BL/6J farenin kulağı kesilmiş. (B) Kulağın dorsal ve ventral taraflarını ayırmak. (C) Sırt ve ventral tarafları sindirim tamponuna daldırmak. (D) Makaslı küçük kulak broşürleri. (E) Ayrışmadan sonra hücre süzgeci üzerinde kalan saç ve beyaz bağ dokuları. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil S2: Fare kulak lenf düğümlerinin işlenmesi. (A) Bir C57BL / 6J fareden auriküler lenf düğümlerinin diseksiyonu. Kırmızı ok, kulak lenf düğümlerinin yerini gösterir. (B) Auriküler lenf nodu, kıyma işleminden önce 6 oyuklu bir plakanın kuyusunun üstünde 70 μm'lik bir hücre süzgecine aktarıldı. (C) Kıyma işleminden sonra hücre süzgeçlerinde kalan kalıntılar. Kısaltma: DNFB = 2,4-dinitroflorobenzen. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil S3: Auriküler lenf düğümlerinde Th-GM alt kümesini analiz etmek için kullanılan geçit stratejisi. İlk olarak, lenf hücreleri taneciklik ve boyuta göre kapılandı (FSC ^düşük , SSC ^düşük, P1) ve tekiller FSC-A ve FSC-H grafiğinde (P2) seçildi. Daha sonra, ölü hücreler FVS780^- popülasyonu (P3) üzerine geçit yapılarak elimine edildi. Üçüncü olarak, efektör CD4 T hücreleri CD4^+- CD44⁺ popülasyonu (P5) olarak tanımlandı. Son olarak, Th-GM alt kümesi, hücre içi sitokin ekspresyonu, yani IFN-γ^- IL-17A^- IL-22^- GM-CSF ⁺ (P7) ile ayırt edildi. Kısaltmalar: GM-CSF = granülosit-makrofaj koloni uyarıcı faktör; Th-GM = GM-CSF üreten T yardımcısı; IFNγ = interferon-gama. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil S4: Meydan okumadan sonra farelerin dokusundaki toplam GM-CSF eksprese eden efektör CD4 T hücrelerinin bileşimi. (A) Toplam GM-CSF ⁺ CD4 ⁺ CD44 ⁺ hücreleri arasında GM-CSF eksprese eden efektör Th hücrelerinin oranı (%) (B) Meydan okumadan sonra farelerin kulaklarında canlı CD4 ^{+ CD44 +} T hücrelerinde kapılı GM-CSF, IFN-γ ve IL-17A ekspresyonunun akış sitometrisi. Kısaltmalar: GM-CSF = granülosit-makrofaj koloni uyarıcı faktör; Th-GM = GM-CSF üreten T yardımcısı; IFNγ = interferon-gama. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Bu protokol, Th-GM hücre alt kümesinin oluşumunu ve genişlemesini analiz etmek için basit bir in vivo test sağlar. Hapentenler veya antijenler tarafından başlatılan farelerde, insanda bu aktivasyonu taklit eden bir T hücresi aracılı hastalık modelinin kullanılması esastır. DNFB, in vivo olarak T hücresi immün yanıtını tetiklemek için peptit veya protein antijenlerinden daha ekonomik ve zaman kazandıran küçük moleküllü bir haptendir ^18,19. Hastalığın seyri sırasında, 2,4,6-trinitroklorobenzen (TNCB), oksazalon (OXA) veya floresein izotiyosiyanat (FITC) dahil olmak üzere diğer haptenlerle indüksiyona kıyasla DNFB ile meydan okunan kulak şişmesi reaksiyonunun en büyük büyüklüğünü gözlemledik, en azından C57BL / 6J genetik geçmişine sahip farelerde (veriler gösterilmemiştir), ancak yukarıdaki diğer üç reaktifin farelerde temas duyarlılığı oluşturduğu bildirilmiştir¹⁴. Araştırmacılar, hastalığın tam indüksiyonu için uygun fare türünü ve haptenlerini belirlemelidir.

Kulaklardan düşük hücre verimi, daha küçük boyutlu fare dokuları ile çalışırken en sık karşılaşılan sorunlardan biridir. Bu, kollajenaz tiplerinin etkisiz enzimatik aktivitesi veya sindirim için kullanılan son kullanma tarihi geçmiş reaktifler nedeniyle eksik enzimatik sindirimden kaynaklanabilir. Bunun üstesinden gelmek için, iltihaplı kulakları verimli bir şekilde ayrıştırmada kollajenaz I de dahil olmak üzere diğer kollajenazlardan üstün olduğu için kulak derisi sindirimi için kollajenaz tip IV kullandık. Kulaklardan izole edilen hücrelerin daha yüksek canlılığı, PMA/iyonomisin/protein taşıma inhibitörü ile yeniden uyarılma üzerine hücre içi sitokin birikimi için faydalıdır. Ek olarak, yeniden stimülasyon için kullanılan RPMI 1640 ortamındaki kalsiyum konsantrasyonu, steril 1 M kalsiyum klorür stoğu ile 1,5 mM'ye ayarlanabilir ve T hücrelerinde²⁰ maksimum sitokin üretimini elde etmek için yeniden stimülasyon süresi 6 saate kadar uzatılabilir.

Multiparametrik akış sitometrisi, otoimmün reaksiyonlar bağlamında Th-GM hücre alt kümesinin doğru bir şekilde tanımlanmasını ve miktarının belirlenmesini sağlar. Bir sitometre kullanarak veri elde edilirken, uygun PMT voltajlarını belirlemek ve kompanzasyonları ayarlamak için boyanmamış ve tek lekeli numuneler kuruldu. Akış sitometrisi kullanarak bağışıklık hücrelerinin genişletilmiş analizi için okuyucular, kompanzasyon ayarlaması, antikor boyama ayarları ve geçit stratejileri hakkında daha fazla bilgi için akış sitometrisi ^21'in kullanımına ilişkin tanınmış yönergelere başvurabilirler. Özellikle, Th-GM alt kümesinin diğer geleneksel soylara paralel olduğu kabul edilir ve efektör CD4 T hücrelerinde GM-CSF⁺ IFN-γ^- IL-17A^- IL-22^- olarak tanımlanır (Ek Şekil S1). Bu geçit stratejisi, Th-GM hücre biyolojisinin araştırılması için akış sitometrisi verilerini analiz etmek için uygulanmalıdır.

Özetle, bu makale, akış sitometrisi kullanarak DNFB'nin neden olduğu murin temas aşırı duyarlılığında yeni Th-GM soyunu analiz etmek için bir protokol sunmaktadır. Bu yöntem, Th-GM hücrelerinin biyolojisini ve alerjik kontakt dermatit gibi çeşitli durumlarda GM-CSF'ye odaklanan terapötik stratejilerin farmakolojik araştırmalarını daha fazla incelemek için kullanılabilir.

Yazarlar, rekabet eden herhangi bir mali çıkarları olmadığını beyan ederler.

Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (No. 81602763, 81803142, 82003347), Çin Doktora Sonrası Bilim Vakfı Mükemmel Araştırmacı Programı (No. 2017T100700) ve Çin Doktora Sonrası Bilim Vakfı Düzenli Araştırmacı Programı (No. 2016M592673) tarafından desteklenmiştir. Yazarlar, bu çalışmada akış sitometrisine teknik destek için Yan Wang ve Meng-Li Zhu'ya (Batı Çin Hastanesi, Sichuan Üniversitesi Temel Tesisleri) teşekkür eder.