Fare Servikal Heterotopik Kalp Transplantasyon Modeli için Modifiye Manşet Tekniği

Bu protokolde, kardiyak allogreft rejeksiyon mekanizmasını araştırmak için bir fare kalp nakli modeli kullanılmıştır. Bu heterotopik kalp nakli modelinde, modifiye Manşet tekniği kullanılarak kalp implantasyonunun servikal uçtan uca anastomozu ile operasyon etkinliği artırılır ve kalp greftlerinin sağkalımı sağlanır.

Kardiyak allogreft rejeksiyonu, kalp nakli sonrası hastaların uzun dönem sağkalımını sınırlar. Bir fare kalp nakli modeli, insan genleri ile yüksek homolojileri nedeniyle preklinik çalışmalarda kardiyak allogreft rejeksiyonunun mekanizmasını araştırmak için idealdir. Bu anlayış, kardiyak allogreftlerle tedavi edilen hastaların uzun süreli sağkalımını iyileştirmek için benzersiz yaklaşımlar geliştirilmesine yardımcı olacaktır. Bir fare modelinde, abdominal donör kalp implantasyonu genellikle dikişler kullanılarak alıcının aortuna ve inferior vena kavasına uçtan uca bir anastomoz ile gerçekleştirilir. Bu modelde modifiye Manşet tekniği ile vericinin kalbi uçtan uca anastomoz ile alıcının karotis arterine ve juguler venine implante edilir. Transplantasyon ameliyatı dikiş atılmadan yapılır ve bu nedenle alt vücudun kan dolaşımına ve venöz reflüsüne müdahale olmadığı için alıcının sağkalımını artırabilir. Bu fare modeli, kardiyak allogreftlerin immünolojik ve patolojik (akut / kronik) reddedilmesinin altında yatan mekanizmaların araştırılmasına yardımcı olacaktır.

Kalp nakli, terminal kalp yetmezliği için standart tedavi haline gelmiştir. Uluslararası Kalp ve Akciğer Nakli Derneği'ne kayıtlı kuruluşlarda yılda 5.500'den fazla kalp nakli yapılmaktadır. Allojenik kalp nakli alıcıları arasında 1 yıllık ret oranı halen %>10 iken, 3 yıllık ret oranı %36'ya ^{yükselmiştir1,2}. Bununla birlikte, kardiyak allogreft reddi olan hastalarda etkili profilaktik tedaviler eksiktir. Bu nedenle, kardiyak allogreftlerin immünolojik ve patolojik reddinin altında yatan fizyolojik mekanizmaları aydınlatan hayvan modeli çalışmaları gereklidir. Bu tür çalışmalar, kardiyak allogreft reddini önlemeye ve bu hasta popülasyonlarında sağkalım oranlarını iyileştirmeye yardımcı olacak etkili ilaçlar geliştirmek için gerekli yeni hedeflerin araştırılmasına katkıda bulunacaktır.

Kardiyak allogreft rejeksiyonunun bazı potansiyel immünolojik ve patofizyolojik mekanizmaları son zamanlarda heterotopik kalp transplantasyonunun fare modeli çalışmalarında önerilmiştir ^3,4,5. Sonuç olarak, fare heterotopik kalp transplantasyonu, insan genleri ile yüksek homolojisi nedeniyle kalp nakli sonrası kardiyak allogreftlerde meydana gelen immün rejeksiyon ve patolojik yaralanma mekanizmalarını araştırmak için ideal bir preklinik model haline gelmiştir. Yaygın kavram, normal insan anatomisine benzer şekilde dikişler kullanarak alıcı aort ve inferior vena kavada abdominal uçtan uca anastomoz ile bir fare modelinde heterotopik transplantasyon yapılmasıdır. Bununla birlikte, bu prosedür alıcının kan dolaşımına ve alt vücudun venöz reflüsüne müdahale edebilir⁶. Bu nedenle, burada bir fare modelinde modifiye edilmiş bir heterotopik kalp nakli prosedürü önerilmektedir.

Donörün kalbi, modifiye edilmiş bir Manşet tekniği kullanılarak uçtan uca servikal anastomoz ile alıcının karotis arteri ve juguler veni ile implante edilir. Bu modifiye prosedür operatif fizibiliteyi kolaylaştırdı ve alt vücudun kan akımına ve venöz reflüsüne müdahale etmeden kalp greftinin hayatta kalmasını sağladı.

Tüm hayvan deneyleri, Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu, Sekiz Baskı, Ulusal Araştırma Konseyi (ABD) 2011'e uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Hayvan denekleri içeren prosedürler, Chongqing Üniversitesi Kanser Hastanesi, Chongqing, Çin Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanmıştır. Allojenik kalp nakli çalışması için ticari kaynaklardan elde edilen 20-30 g ağırlığındaki erkek BALB/c ve C57BL/6 fareleri (bakınız Malzeme Tablosu) kullanılmıştır. C57BL / 6 fareleri donör ve sinjenik alıcı olarak kullanılırken, BALB / c fareleri allojenik alıcılar olarak görev yaptı. Protokolün şeması Şekil 1'de gösterilmiştir.
NOT: Cerrahi aletler ve solüsyonlar da dahil olmak üzere ameliyat sırasında kullanılan tüm malzemeler sterildir. Cerrahi prosedür aseptik operasyon tekniği prensibine bağlıdır.

1. Alıcı prosedürü

1. Bir başlık ile bağlı 15 x 10 x 10 cm'lik bir indüksiyon odasından% 5 izofluran inhalasyonu yoluyla genel anesteziyi indükleyin (bakınız Malzeme Tablosu).
2. Alıcı fareyi ameliyat masasına bir ısıtma yastığı ile sabitleyin. Burun ve ağız üzerindeki bir yüz maskesi aracılığıyla% 2 izofluranın sürekli solunması ile anesteziyi sürdürün.
   NOT: Yavaş solunum hızı ve ritmi, kornea refleksinin kaybolması ve ayak parmaklarında pedal refleksinin olmaması anestezinin etkinliğini gösterir.
3. Saçı tıraş ettikten sonra, cerrahi bölgeyi üç alternatif tur povidon-iyot ovma ve ardından alkol ile dezenfekte edin. Daha sonra, cildi servikal orta çizgiye paralel olarak sağ mandibuler açıdan kuyruk ucuna kadar 1.5-2 cm kesin.
4. Bir elektro-koagülatör ve mikro-forseps kullanarak sağ dış juguler venin ~ 1 cm'sini diseke edin. Proksimal uçtaki damarı atravmatik bir mikrovasküler kelepçe ile klipsleyin ve distal uçta saklayın.
5. Damarın distal ucunu 22 G poliüretan dikenli manşetten (bakınız Malzeme Tablosu) konik uçlu ve yüzeysel oluklu olarak geçirin. Damarı mikrovasküler bir kelepçe kullanarak manşetin sapıyla sabitleyin.
6. 8-0'ı kaldırın Distal uçtaki ligasyon sütürü, lümeni yüzeysel diken tarafından bağlanan manşetin üzerine içten dışa çevirin ve yüzeyin oluklarına 10-0 cerrahi bir dikişle sabitleyin.
7. Kardiyak greftin implante edilmesi için bir fossa oluşturmak üzere sağ dil altı bezini rezeke edin ve submaksiller bezin sağ lobunu ve sağ sternokleidomastoidi ayırın.
8. Sağ ortak karotis arteri mikro-forseps kullanarak ~ 1 cm boyunca diseke edin ve arteri proksimal uçta atravmatik bir mikrovasküler kelepçe ile klipsleyin. Distal uçta, arteri bırakın ve kesin.
9. Arterin distal ucunu, 26 G poliüretan dikenli bir manşetten (bakınız Malzeme Tablosu) bir konik ucu ve yüzeyde oluklar ile geçirin. Arteri mikrovasküler bir kelepçe kullanarak manşetin sapıyla sabitleyin.
10. Distal uçtaki ligasyon sütürünü çıkarın, lümeni manşetin üzerinden içten dışa çevirin ve yüzeysel bir diken ve 10-0 cerrahi dikiş ile oluklarla sabitleyin.
11. Alıcının damarlarını hazırladıktan sonra, trombozu önlemek için damarlara 100 IU / mL heparin salin bırakın. Daha sonraki implantasyon için servikal insizyonu steril ıslak tuzlu gazlı bezle örtün.

2. Donör prosedürü

1. Donör fare için aynı anestezik prosedürü (adım 1.1) kullanın.
2. Karın kıllarını elektrikli bir tıraş bıçağı kullanarak tıraş edin ve cerrahi bölgeyi üç alternatif tur povidon-iyot ovma ve ardından alkol ile dezenfekte edin.
3. Karnı (2-3 cm) simfiz pubisten subksifoid'e kadar orta hat boyunca bir makasla kesin ve kesilmiş alanı bir retraktör ile genişletin.
4. Bir elektro-koagülatör ve bir mikro-forseps kullanarak abdominal aort ve inferior vena kava'nın 1 cm'sini diseke edin ve inferior vena kava yoluyla 250 IU / mL heparin ile desteklenmiş 1 mL fizyolojik salin enjekte ederek heparinizasyon gerçekleştirin. Bundan sonra, abdominal aort ve inferior vena kava'yı eksize edin.
5. Göğüs duvarını ayırmak için cerrahi bir makas kullanarak her iki taraftaki anterior aksiller çizgi boyunca toraksı eksize edin. Üstün vena kava'yı 8-0 ile ligate cerrahi dikiş.
6. Suprahepatik inferior vena kavaya bir kafa derisi iğnesi yerleştirin. Daha sonra, kan rengi solana kadar donör kalbi perfüze etmek için kafa derisi iğnesinden suprahepatik inferior vena kavadan 100 IU / mL heparin ile takviye edilmiş buz gibi soğuk fizyolojik salin enjekte edin.
7. Donör miyokardını korumak için aort arkından bir kafa derisi iğnesi kullanarak donör kalbini 2-3 mL buz gibi soğuk histidin-triptofan-ketoglutarat (HTK) çözeltisi ( Malzeme Tablosuna bakınız) ile yeniden perfüze edin. Ortalama sıcak iskemi süresi 5 dakikadır.
8. Süperior ve inferior vena kava ve pulmoner veni 5-0 cerrahi sütür ile bağlanın. Donör aort ve pulmoner arteri dallanmadan önce diseke edin ve kesin. Bundan sonra, donörün kalbini çıkarmak için superior ve inferior vena kava ve pulmoner veni bölün.

3. İmplantasyon

1. Donör kalbini, alıcı farenin servikal cebine ters çevrilmiş bir konumda implante edin.
2. Donör pulmoner arterin alıcı eksternal juguler venine uçtan uca anastomozunu gerçekleştirmek için manşeti everted alıcı juguler ven ile donör pulmoner arterin lümenine çekin. Anastomozu düzeltmek için yüzeydeki olukları kullanarak manşeti 10-0 cerrahi bir dikiş ile açın.
3. Donör aortun alıcı karotis artere uçtan uca anastomozu için benzer bir prosedür uygulayın.
4. Donörün kalbini yeniden perfüze etmek için juguler venin atravmatik mikrovasküler kelepçesini ve ardından karotis arteri serbest bırakın. Ortalama soğuk iskemi süresi 15 dakikadır.
5. Kalp greftini sabitleyin ve greftin bükülmesini önlemek için uygun şekilde dikin.
6. Servikal insizyonu 5-0 poliamid monofilament sütür kullanarak sürekli dikişlerle kapatın (bkz.
   NOT: Yara tamamen iyileştikten sonra dikişi alın.
7. Alıcı fareyi anesteziden kurtulana kadar sıcak, kuru ve temiz bir kafesin içinde tutun.
   NOT: İyileşmesi 5-10 dakika sürer.
8. Postoperatif analjezi için 48 saat boyunca her 6 saatte bir alıcı fareye deri altından buprenorfin (0.05 mg / kg) enjekte edin.
   NOT: Analjezi dozu bu çalışma için optimize edilmiştir. Bununla birlikte, analjezi rejimi, kurumsal hayvan kullanım kılavuzlarına uygun olarak herhangi bir ağrı belirtisi varsa uzatılabilir / değiştirilebilir.

Bu fare servikal heterotopik kalp nakli modelinde, alıcı farelerin hayatta kalma oranı yaklaşık% 95.2 idi (21 fareden 20'si hayatta kaldı). Primer ölüm nedeni postoperatif kanamaydı. Düzenli bir ritimle hızlı kalp atışı, implante edilen donör kalbin hayatta kalmasının bir göstergesi olarak hizmet eder.

C57BL/6 ve BALB/c fareler bu modelde sırasıyla ^7,8 MHC (H-2b) ve MHC (H-2d) tipleriydi. Bu iki suş, akut T-hücresi aracılı reddedilmeye neden olan H-2 ile farklılık gösterir⁹. Tüm kardiyak allogreftlerin %62.5'i, kalp atışının palpe edilmesiyle değerlendirildiği gibi, transplantasyondan sonraki 7 gün içinde kaybedildi. Tüm kardiyak allogreftler transplantasyondan sonraki 8 gün içinde kaybedildi. Buna karşılık, tüm izojenik kalp nakilleri 4 haftadan fazla hayatta kaldı (Şekil 2). 4 haftadan fazla hayatta kalan fareler CO₂ inhalasyonu ile ötenazi yapıldı.

Şekil 1: Fare servikal heterotopik kalp transplantasyon modelinin şeması. (A) Alıcıyı hazırlama protokolü: Proksimal uçtaki ortak karotis arter ve eksternal juguler ven kesildikten sonra, damarların vasküler lümeni, eğimli bir ucu ve yüzeydeki olukları olan dikenli manşetten geçtikten sonra kesilir ve sabitlenir. Kesikli kare, manşetin yapısını ve kullanımını gösterir. (B) Donör kalp rezeksiyonu: Donör kalbin inferior vena kava ve aorttan heparin ve HTK solüsyonu ile perfüzyonundan sonra, superior ve inferior vena kava ve pulmoner ven dikişlerle bağlanır. Donörün kalbi daha sonra vasküler damarlar kesilerek rezeke edilir. (C) Donörün kalbinin implantasyonu. Donör pulmoner arter ve aort, alıcının dış juguler venine ve karotis artere manşet yoluyla anastomoz edilir ve alıcının vaskülatürü uçtan uca bir şekilde içten dışa çevrilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Kardiyak greftler için sağkalım eğrisi. Kardiyak greftlerin sağkalım eğrisi, allojenik kalp nakillerinin transplantasyondan sonraki 8 gün içinde kaybolduğunu ve kalp atışının palpasyonu ile değerlendirildiğini göstermektedir. Her grupta toplam 10 alıcı fareye modifiye servikal heterotopik kalp nakli yapıldı. Tüm izojenik kalp nakilleri 4 haftadan fazla hayatta kaldı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: Kalp nakli tekniklerinin karşılaştırılması. Mevcut fare servikal heterotopik kalp transplantasyonu tekniği Oberhuber, R. ve ^ark.10'dan modifiye edilmiştir ve kardiyak greft sağkalımı için ek avantajlara sahiptir.

Fare kalp nakli modeli, kalp nakli sonrası rejeksiyon mekanizmalarının araştırılmasına katkıda bulunarak, kardiyak allogreft alıcılarının uzun süreli sağkalımını iyileştirmek için benzersiz yaklaşımların geliştirilmesine katkıda bulunmaktadır. Bununla birlikte, farelerde kalp nakli, özellikle vasküler anastomozda yüksek düzeyde mikrocerrahi teknikleri gerektiren karmaşık ve zorlu bir iştir^11,12,13. Fare abdominal heterotopik kalp nakli modeli, alıcı aort ve inferior vena kavaya donör aort ve pulmoner arter anastomozu ile dikişler kullanılarak gerçekleştirilir. Bu operasyonda alıcının aort ve inferior vena kavasının bloke edilmesi gerekir. Bu nedenle, alt vücudun iskemisi ve inferior vena kava trombozu, alıcı farelerin sakatlığını ve ölümünü artırabilir. Transplantasyon sırasında vasküler anastomozun zorluklarını azaltmak için, Matsuura ve ark. ilk olarak 1991 yılında manşet tekniğini kullanarak farelerde servikal kalp nakli modelini tanıttılar¹⁴. Bu modelde manşet ile bağlanarak damarların üst sleeve benzeri everted anastomozu anastomoz etkinliğini arttırmıştır. Abdominal kalp nakli fare modelinde dikişli damarların anastomozunun aksine, işlem sonrası kanama olasılığını azaltmıştır. Bu nedenle, anastomoz etkinliğinin iyileştirilmesi, kalp kasının iskemi süresini azaltmış ve kalp greftlerinin hayatta kalma oranını arttırmıştır. Ek olarak, donörün kalbinin servikal implantasyonu, abdominal implantasyona kıyasla alıcı aort ve inferior vena kava dolaşımını kesmez¹⁵; Bu nedenle, alıcı farelerin hayatta kalması artar.

Rupert Oberhuber ve ^ark.10 tarafından kurulan benzersiz bir deneysel fare heterotopik kalp nakli modeli burada açıklanmıştır. Prosedür, modifiye edilmiş bir Manşet tekniğini takiben, donör aort ve pulmoner arterin alıcı karotis artere ve juguler vene uçtan uca servikal anastomozunu içerir. Bu modelde, alıcı farelerin sistemik dolaşımı^10'a müdahale etmez ve donörün kalbi, daha iyi miyokard koruması için inferior vena kava ve aorttan heparin ve HTK çözeltileri ile perfüze edildi. Bununla birlikte, bu modelin kritik bileşeni, Finsterer ve ark.16'nınkine benzer oluklara sahip modifiye edilmiş dikenli manşeti kullanan Oberhuber ve ^{ark.10'unkinden} farklıydı. Konik uç, vasküler lümenin üst kol benzeri bir evertini kolaylaştırır. Yüzeydeki oluklar, dikişler kullanılarak everted damar duvarlarının bir manşet ile sabitlenmesini kolaylaştırır ve manşetin dışındaki diken, anastomozlu damar duvarlarının manşetten kaymasını azaltır (Şekil 1). Bu modifikasyonlar cerrahi süreyi %20 kısaltır ve kalp greftlerinin implantasyon etkinliğini ve sağkalımını artırır. Ayrıca, modifiye dikenli manşet, kafa derisi akupunkturu için kullanılan en yaygın poliüretan kateterden üretilir, böylece prosedürün maliyetini önemli ölçüde azaltır. Mevcut tekniğin Oberhuber ve ^{ark.10'unkiyle} karşılaştırılması Tablo 1'de gösterilmiştir.

Bu modelin benzersiz özelliklerine dikkat edilmelidir. İlk olarak, manşetin uzunluğu ve kalibresi başarılı anastomoz için gereklidir. Manşetin uygun uzunluğu bir sapla ~ 3 mm (1 mm) idi (Şekil 1). Manşetin uygun kalibresi arter ve venler için sırasıyla 26 G ve 22 G'dir. Manşetin uygun olmayan uzunluğu ve kalibresi, anastomozlu damarların bükülmesine veya aşırı gerilmesine neden olur. İkincisi, alıcının damarlarının uygun uzunlukları, manşetin 1,5 ila 2 katıdır. Üçüncüsü, donörün kalbi aşırı basınçla perfüze edilmez ve potansiyel olarak grefte zarar verir. Dördüncüsü, kalp grefti sabitlenir ve manşet, anastomozlu damarların veya greftlerin hareketini veya bükülmesini önlemek için implantasyondan sonra dikiş atılarak uygun bir pozisyonda anastomoz edilir. Beşinci olarak, submaksiller bezin ve sternokleidomastoidin korunması, kalp grefti için bir fossa üretmek üzere sağ dil altı bezini rezeke ederken anastomozlu damarların veya greftin dönmesini veya bükülmesini azaltmaya katkıda bulunur. Altıncı olarak, vasküler lümenin üst üste benzer evertini kolaylaştırmak ve ameliyat sonrası trombozu azaltmak için, anastomoz yapılırken anastomozlu damarlara heparin solüsyonu (100 IU / mL) sağlanabilir.

Bu manşet tekniği, implantasyon sırasında donör ve alıcı damarların anastomozunu kolaylaştırır; Bununla birlikte, manşetin sertliği, sırayla, anastomozlu damarların bükülme riskini artırabilir ve bu da transplantasyon sonrası trombozda bir artışa neden olabilir. Komplikasyonları azaltmak, greft sağkalımını artırmak ve sonraki deneylerde modellerin kullanım oranını artırmak için manşet materyalinin optimizasyonu garanti edilir. Ayrıca, kesiğin fibröz skarı kalp grefti için alanı sınırlayabilir ve uzun süreli sağkalımını etkileyebilir. Ek olarak, kalp greftinin çıkarılması, alıcı farelerin normal hemodinamik kan akışını engelleyebilir. Son olarak, bu model işlevsel değildir ve greftlerin kardiyak fonksiyonunu değerlendirmek için kullanılamaz. Bununla birlikte, bu çalışma kalp transplantasyonunun immünolojik ve patolojik fonksiyonları hakkında bilgi vermektedir.

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Bu çalışma Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (81870304) tarafından Jun Li'ye desteklendi.