Bir sıçan modelinde deneysel subaraknoid kanamayı indüklemek için kiazmatik öncesi, tek otolog kan enjeksiyonu

Subaraknoid kanama insanda yüksek mortalite ve morbidite yükü taşımaya devam etmektedir. Durum ve patofizyolojisi hakkında daha fazla araştırmayı kolaylaştırmak için, kiazmatik öncesi, tek enjeksiyon modeli sunulmaktadır.

Son yıllarda tedavideki ilerlemelere rağmen, subaraknoid kanama (SAK), oldukça genç bir nüfusu büyük ölçüde etkileyen yüksek bir morbidite ve mortalite yükü taşımaya devam etmektedir. SAK'ın arkasındaki patofizyolojik mekanizmaları araştırmak ve farmakolojik müdahaleleri test etmek için çeşitli SAH hayvan modelleri geliştirilmiştir. Bu makalede sunulan sıçandaki kiazmatik öncesi, tek enjeksiyon modeli, önceden belirlenmiş bir kan hacmine sahip deneysel bir SAH modelidir. Kısaca, hayvan uyuşturulur, entübe edilir ve mekanik ventilasyon altında tutulur. Sıcaklık bir ısıtma yastığı ile düzenlenir. Kuyruk arterine bir kateter yerleştirilerek sürekli kan basıncı ölçümünün yanı sıra kan örneklemesi de sağlanır. Atlantooksipital membran kesilir ve intraserebral basınç ölçümünü sağlamak için cisterna magna'ya basınç kaydı için bir kateter yerleştirilir. Bu kateter intratekal terapötik müdahaleler için de kullanılabilir. Sıçan stereotaksik bir çerçeveye yerleştirilir, bregmanın önünden bir çapak deliği açılır ve çapak deliğinden bir kateter yerleştirilir ve optik kiazmın hemen önüne yerleştirilir. Otolog kan (0.3 mL) kuyruk kateterinden çekilir ve manuel olarak enjekte edilir. Bu, intraserebral basıncın yükselmesine ve serebral kan akışının azalmasına neden olur. Hayvan 30 dakika boyunca yatıştırılır ve deri altı salin ve analjezikler verilir. Hayvan ekstübe edilir ve kafesine geri gönderilir. Ön kiazmatik model, önceden belirlenmiş kan hacmi nedeniyle yüksek bir tekrarlanabilirlik oranına ve hayvanlar arasında sınırlı bir varyasyona sahiptir. İnsanlarda SAH'ı taklit eder, bu da onu SAH araştırması için uygun bir model haline getirir.

Travmatik olmayan subaraknoid kanama (SAK), tüm vakaların yaklaşık% 5'ini temsil eden bir inme şeklidir. Travmatik olmayan SAK'ın en yaygın nedeni, SAH'ların% 85'ini oluşturan bir anevrizmanın (aSAH) ani rüptürüdür. Diğer nedenler arasında arteriyo-venöz malformasyonun rüptürü, koagülopatiler ve perimezensefalik kanamada ven rüptürü^{sayılabilir 1}. İnsidans oranı 100.000 kişi-yılda 9'dur ve mortalite yaklaşık üçte biri ve diğer üçte biri SAH ^2,3'ü takiben günlük yaşamın desteğini gerektirir.

İlk stabilizasyon ve tanı onayını takiben, tedavi kanamanın ciddiyetine bağlıdır. En ciddi şekilde etkilenen hastalar, intraserebral basıncı (ICP) azaltmak için ventriküllere yerleştirilen ekstraventriküler bir drene sahip olacak ve yakından izlendikleri nöroyoğun bakım ünitesine kabul edilecektir. Hastalar (olası) anevrizmayı tanımlamak için bir anjiyografiye tabi tutulacak ve daha sonra yeniden kanamayı önlemek için anevrizmayı saracak veya kırpacaktır⁴. Farmakolojik tedavilerin sayısız denemesine rağmen, sadece bir kalsiyum kanalı antagonisti olan nimodipinin sonuçları iyileştirdiği gösterilmiştir⁵. Şu anda çoklu klinik çalışmalar devam etmektedir. Kapsamlı bir liste için lütfen Daou ve meslektaşları tarafından yapılan incelemeye bakın⁶.

Bir anevrizmanın yırtılması, şimdiye kadar yaşanan en kötü baş ağrısının ani başlangıcı veya gök gürültüsü baş ağrısı olarak tanımlanmıştır. Rüptür, ICP'de dik bir artışa ve ardından serebral kan akışında (CBF) bir azalmaya neden olur. Bu azalma, beynin küresel iskemisi ile sonuçlanır ve bu da bilinç kaybına neden olabilir. Bu daha mekanik yolak, ekstravaze edilmiş kan elementlerinin parçalanmaya başlamasıyla birlikte, steril nöroinflamasyonla sonuçlanan doğuştan gelen bağışıklık sisteminin sitokin salınımına ve aktivasyonuna yol açar. Ayrıca, iyon homeostazında serebral ödem ve rahatsızlık ile sonuçlanan kan-beyin bariyerinin bozulması sıklıkla gözlenir. Tüm bu değişiklikler ve daha fazlası, erken beyin hasarı (EBI) olarak adlandırılır, ilk birkaç gün içinde ortaya çıkar ve nöronal kayıp ve apoptoz ile sonuçlanır⁷.

ASAH'tan etkilenen hastaların yaklaşık 1/3'ünde 4-14. günler arasında gecikmiş serebral iskemi (DCI) gelişecektir⁸. DCI, nöbetler ve yeniden kanama dahil olmak üzere diğer nedenler hariç tutulduğunda, fokal, nörolojik bir bozukluğun başlangıcı veya Glasgow koma ölçeğinde en az 1 saat süren en az iki puanlık bir düşüş olarak tanımlanır. DCI, aSAH^9'u takiben artmış ölüm riski ve azalmış fonksiyonel sonuç ile ilişkilidir. Serebral arterlerin daralması olan serebral vazospazmın (CVS), on yıllardır DCI ile ilişkili olduğu bilinmektedir ve eskiden DCI'nın tek nedeni olduğu düşünülmektedir. O zamandan beri CVS'nin DCI gelişmeden ortaya çıkabileceği gösterilmiştir ve mikrovasküler tromboz ve daralma, kortikal yayılan depresyon ve EBI'nin enflamatuar yanıtı dahil olmak üzere daha fazla faktör tanımlanmıştır^10,11,12.

EBI ve DCI'nın hastalığın seyri ve etkilenen hastaların sonuçları üzerindeki büyük etkisi nedeniyle, hayvan modellerinin bunları mümkün olan en yüksek dereceye kadar taklit etmesi ve yine de tekrarlanabilir olması gerekir. Araştırmacılar, aSAH'ı denemek ve simüle etmek için farelerden insan olmayan primatlara kadar çeşitli hayvanlarda çok çeşitli farklı modeller kullandılar. Sprague-Dawley ve Wistar vahşi tip sıçanlar şu anda en sık kullanılan laboratuvar hayvanlarıdır ve en yaygın modeller endovasküler perforasyon modeli, cisterna-magna çift enjeksiyon modeli ve son olarak bu makale^13'te açıklanacak olan kiazmatik öncesi tek enjeksiyon modelidir.

Kiazmatik öncesi, tek enjeksiyon modeli başlangıçta Prunell ve meslektaşları tarafından diğer deneysel modellerin bazı eksikliklerine karşı koymak için geliştirilmiştir¹⁴. Ameliyat, ustalaşıldığında, oldukça tekrarlanabilir ve hayvanlar arasındaki çeşitliliği en aza indirir. Model, insanlarda SAH'ı, kan enjeksiyonunu takiben ICP'deki ani artış da dahil olmak üzere birçok noktada taklit eder ve CBF^15,16'daki düşüşe bağlı olarak geçici küresel iskemi ile sonuçlanır. İnsanlarda çoğu aSAH'ın meydana geldiği anterior dolaşımı etkiler¹⁷. Mortalite çalışmaya ve enjekte edilen kan miktarına bağlı olarak %10-%33 arasında değişmektedir^14,18. Gecikmiş hücre ölümü ve nöroinflamasyon 2. ve 7. günlerde tespit edilebilir, böylece EBI ve DCI ^19,20'nin sonuçlarını incelemek için değişkenler sağlar.

Çalışma, sıçandaki kiazmatik öncesi tek enjeksiyon modelinin güncellenmiş bir tanımını ve ICP-probunun farmasötiklerin intratekal uygulaması için bir liman olarak nasıl kullanılacağına dair bir açıklama sunmaktadır.

Bu prosedür, bilimsel amaçlar için kullanılan hayvanların korunmasına ilişkin Avrupa Birliği'nin 2010/63/EU sayılı Direktifine uygun olarak yapılır ve Danimarka Hayvan Deneyleri Müfettişliği tarafından onaylanır (lisans no. 2016-15-0201-00940). Cerrahi, steril aletler, eldivenler, kateterler ve dikişler dahil olmak üzere mümkün olan en geniş ölçüde aseptik teknik kullanılarak gerçekleştirilir. Çalışmada, 230-350 g ağırlığındaki erkek ve dişi Sprague-Dawley sıçanları, 12 saatlik aydınlık / karanlık döngüsünde barındırılan, sabit sıcaklık 22 ° C (± 2 ° C) ve% 55 nem oranıyla (% 10 ±) nem oranı kullanılmıştır. Hayvanlara standart chow ve su ad libitum verilir. Hayvanlar ameliyattan sonra tek kafeslerde barındırılır, ancak ICP probu çıkarıldığında grup kafeslerine geri döndürülebilir. Bu protokoldeki anestezik izofluran gazıdır, ancak ketamin (100 mg / mL) ve ksilazin (20 mg / mL) 'nin 1.5 mL / kg'lık 3: 2 intraperitoneal karışımı da etkilidir²¹.

1. Hazırlıklar

1. Entübasyon için 16 G periferik ven kateterini modifiye edin. Modifiye etmek için, iğneyi 1 cm kısaltın ve kalan distal 1 cm'yi enjeksiyon valfine doğru 30 ° bükün. Kateter kanatlarını çıkarın (çoklu kullanım).
2. Bir ICP probu yapmak için, 20 mm'lik bir polietilen boru parçasını kesin (iç çap (ID): 0,58 mm, dış çap (OD): 0,96 mm) ve açık bir lümen tutarak dairesel bir plaka yapmak için bir ucunu yakın. Polietilen borunun sonuna 10 mm silikon boru (ID: 0,76 mm, OD: 2,4 mm) bağlamadan önce polietilen boruyu 1 mm silikon boru (ID: 1,0 mm, OD: 3,0 mm) ile atlatın.
3. Dizüstü bilgisayarı açın ve veri toplama yazılımını açın. Kan basıncı (BP) ve intra serebral basınç (ICP) dönüştürücülerini ve Lazer-Doppler'i üreticinin talimatlarına göre kalibre edin.
4. Kan gazı analizörü aparatını hazırlayın.
   DİKKAT: Buharlaştırıcıda yeterli izofluran bulunduğundan emin olun.
5. O2 ve atmosferik hava akışını açın. _O2'nin akışını% 30'a ve atmosferik havayı% 70'e ayarlayın.
6. Isıtma yastığını yerleştirin ve sıcaklığı 37 ° C'ye ayarlayın.

2. Anestezi

1. Sıçanı,_O2'nin % 30'u ve% 70'i atmosferik hava akışı ile anestezi odasına yerleştirin. İzofluran gazının% 5'ini odaya uygulayın. Yeterli anestezi yaklaşık 4 dakika sürecektir. Solunumu dikkatlice kontrol edin.
2. Anestezi uygulandığında, sıçanı sırtüstü pozisyonda lastik bir bantla atlatılmış ağır bir plakaya yerleştirin. Sıçanın ön dişlerini lastik bandın altına yerleştirin.
3. Dili kavisli forsepslerle dikkatlice çizin. Larenksi pamuklu bir uçla temizleyin. Ses tellerini görselleştirmek için boğazın orta hattına harici bir ışık yerleştirin.
4. Modifiye 16 G periferik ven kateterini kullanarak inspirasyon sırasında entübe edin. Doğru yerleştirildiğinde, stilettoyu çıkarın. Kateteri ventilatöre bağlayın.
   NOT: Tüpün doğru yerleştirilmesi, solunum hızı ile senkronize göğüs hareketleri ile doğrulanır. Karın hareketleri görülürse, ekstübe edin ve sıçanı anestezi ziline tekrar sokun. Hava yollarına zarar verme riski nedeniyle prosedürü üç defadan fazla tekrarlamayın.
5. Entübe edildiğinde, hayvanı_O2'nin % 30'u ve atmosferik havanın% 70'i ile suni solunumda tutun. Anesteziyi izofluranın% 1.5-3'ünde tutun. Kan basıncını 80-100 mmHg arasında tutmak için izofluranı ayarlayın.
6. Solunum cihazının inspiratuar hacmini 3 mL'de ve frekansını 40-45 ilham / dak'da tutun. İnspiratuar hacmi kan gazı analizine göre ayarlayın.
7. Yanağın iç yumuşak dokusundan 2-0 dikiş ile dikiş atın. Kateteri sabitlemek için dikişi enjeksiyon tüpünün etrafına ve periferik ven kateterinin enjeksiyon kapağına bağlayın.
8. Sıçanı ameliyat alanına taşıyın ve kuyruğu cerraha bakacak şekilde sırtüstü pozisyonda yerleştirin.
9. Kuru gözlere karşı koymak için gerektiğinde göz jelini uygulayın.
10. Yeterli anestezi derinliğini doğrulamak için bir parmak tutamağı tutamağı uygulayın. Ameliyat sırasında anestezi derinliğini değerlendirin ve koruyun.

3. Kuyruk kateteri

1. Kuyruğun proksimal 3-4 cm'sini% 0.5 klorheksidin etanol ile dezenfekte edin.
   NOT: Şu andan itibaren, cerrahın takdirine bağlı olarak cerrahi mikroskop kullanın.
2. Ventral tarafta kuyruğun proksimal ucunda 15-20 mm'lik bir cilt kesisi yapın. Arteri kesmemeye dikkat edin.
3. Kavisli bir forseps kullanarak cildi altta yatan bağ dokusundan gevşetin.
4. Arteri açığa çıkaran fasyaya dikkatlice nüfuz edin.
5. Kuyruk arterini kavisli bir forseps kullanarak altta yatan dokudan dikkatlice serbest bırakın.
6. Geminin altına üç siyah ipek iplik sürün. Bir ipliği mümkün olduğunca distal olarak yerleştirin ve cerrahi bir düğümü arterin etrafına sıkıca bağlayın. İpliğin gevşek uçlarını bir hemostat ile tutun.
7. Kalan iki ipliği arterin etrafına gevşek bir şekilde bağlayın.
8. Proksimal ipliği mümkün olduğunca yakından itin. Proksimal ipliğin uçlarını tutmak için bir hemostat uygulayın. Hemostatı hafifçe çekin, ancak kan akışını kısıtlamak ve engellemek için yeterlidir. Hemostatı karın üzerine yerleştirin.
9. Kateterin ucunu 45° açıyla kesin. Arteriyel duvara nüfuz etmeyi önlemek için keskin noktayı kesin.
10. Bir Vannas makası kullanarak, arter çapının 1 / 3'ünü, distal düğümden 3-5 mm uzakta, 30 ° 'lik bir açıyla bir arter kesisi yapın.
11. Kateteri iki düz forseps kullanarak artere yerleştirin. Kateteri tutmak için bir forseps, diğerini ise arteri kateterin üzerine dikkatlice çekmek için kullanın.
12. Kateteri damardan proksimal düğüme kadar yerleştirin ve düğümü hemostattan gevşetin. Kateterdeki kan akışını görselleştirin. Orta ipliği gevşek bir şekilde katetere sabitleyin.
13. Arterin tekrar fasyayla kaplandığı noktaya ve mümkünse hemen ötesine yerleştirmeye devam edin.
14. Kateter yerleşimini ve olası sızıntıyı salinle yıkayarak kontrol edin.
15. Cerrahi düğümler kullanarak iki proksimal ipliği sabitleyin.
    NOT: Kan basıncı ölçümünün pulsatil olması gerekir; Değilse, kateter uygun şekilde yerleştirilmemiştir.
16. Distal ipliği kullanarak cerrahi bir düğüm bağlayarak kateteri insizyonun ucuna sabitleyin.
17. Cilt insizyonunu iki adet emilemeyen monofilament 4-0 sütür ile birlikte gevşek bir şekilde dikin. Katetere nüfuz etmemeye dikkat edin.
    NOT: Ameliyat boyunca nabız genliğinin farkında olun. Bu düşükse, kateteri salinle yıkayın.
18. Kan gazı örneklemesi için kan akışına izin vermek üzere arteriyel kateteri basınç dönüştürücüsünden gevşetin. Kateterin sonuna mikro kılcal bir tüp yerleştirin. Kanın tüpe akmasına izin verin. Kan alındıktan sonra kateteri dönüştürücüye tekrar takın ve kateteri yıkayın.
19. Kılcal tüpü kan gazı analizörüne yerleştirin. pH, pCO2 ve pO2'yi ölçün ve not edin
    NOT: Kan gazı ve kan basıncı değerlerine bağlı olarak, havalandırma oranını değiştirin. Ortalama arteriyel basınç (MAP) çok düşükse, izofluran akış hızını düşürmeye çalışın. Uygun anestezi derinliğini sağlamak için refleksleri test edin.

4. ICP probu

1. Sıçanı stereotaksik çerçeveye yerleştirin. Sıçanı simetrik olarak konumlandırmak önemlidir.
2. Boynun ön fleksiyonunu oluşturmak için stereotaksik çerçevenin altına silindirik bir yastık yerleştirin.
3. Sıçanın kafa derisini, boynunu ve kulakların arkasındaki alanı tıraş edin. Gereksiz saçları çıkarın.
4. Alanı% 0.5 klorheksidin etanol ile dezenfekte edin.
5. Adrenalin ile 0.7 mL 10 mg / 5 μg / mL lidokain ile lokal anestezi yapın, iğneyi orta hatta kafatasının kaudal ucuna yerleştirin. Boynun kas sistemine 0.3-0.4 mL ile enjekte edin. Geri kalanını deri altından bregmanın etrafına ve önüne enjekte edin.
6. İğne delinmesinden orta hatta kaudal olarak ~8 mm bir cilt kesisi yapın.
7. Atlantooksipital membranı tanımlamak için tüm kasları katmanlar halinde keskin bir şekilde diseke edin (orta hattaki kafatasına kaudal olarak mermer renkli üçgen).
8. Boyun kas sistemini kısıtlamak için Alm retraktörünü kullanın. Gerekirse uçlu retraktörü kaudal olarak yerleştirin.
9. Steril ICP probunun ICP dönüştürücüsüne bağlı olup olmadığını kontrol edin. ICP probunu tuzlu suyla yıkayın. ICP probunda hava kabarcığı bulunmadığından emin olun.
10. Atlantooksipital membranı 23 G'lik bir iğne kullanarak kesin. ICP probunu membrandan koaksiyel hale getirmek için bir delik açın.
11. Probu atlantooksipital membrandan yavaşça koaksiyel hale getirin. Probu hafifçe çekin ve 0-5 mmHg arasında değişen bir titreşim eğrisi gösterdiğinden emin olun. Değilse, probu çıkarın, dönüştürücüye bağlantıyı kontrol edin ve lümenden geçen akışı onaylayın.
12. Doku yapıştırıcısından iki damla uygulayın. 1 mm'lik silikon boruyu membrana doğru hareket ettirin ve ICP-prob yer değiştirme riskini en aza indirmek için ek yapıştırıcı uygulayın.
13. Rötraktör(ler)i çıkarın.
14. İnsizyonun sefalik ucuna bir yatay yatak sütürü ve emilemeyen bir monofilament 4-0 sütür kullanarak kaudal uca basit bir kesilmiş sütür yapın.

5. İğnenin ve Lazer-Doppler probunun yerleştirilmesi

1. Orta hatta gözlerin hemen önünde, kaudal olarak 15 mm bir kesi yapın.
2. Bağ dokusunu ve kasları forseps ile çıkarın. Steril bir pamuklu çubuğun ucunu bir rougine olarak kullanın, böylece bregma ve koronal dikişlerin tanımlanmasını mümkün kılar.
3. Alm ekartörünü yerleştirin.
4. Stereotaksik çerçeveye 25 G spinal iğne yerleştirin. İğneyi tam olarak bregma üzerine yerleştirin ve pozisyonu not edin.
   NOT: Stereotaksik çerçevenin orta hat eklemini dikey düzlemde hayvana doğru 30° 'ye yerleştirin.
5. İğneyi bregmadan çıkarın, çerçeveyi 65 mm önden hareket ettirin ve ardından delme bölgesini işaretlemek için iğneyi orta hatta değiştirin.
6. Dura mater kemiğin altında tanımlanana kadar delin. Kemik parçalarını düz forseps kullanarak yavaşça çıkarın ve boşluğu kemik mumu ile doldurun.
7. Lazer-Doppler için bregmanın sağında 3-4 mm lateral ve koronal sütürün hemen önünde başka bir delik açın. Kemiğin içinden sonuna kadar delmek gerekli değildir. Dura mater nüfuz etmemeye dikkat edin.
8. Lazer-doppler'in kan akışını ölçebileceği damarları arayın. Lazer-doppler'i yerleştirin ve değerleri kontrol edin. Minimum 100 FU değeri gereklidir. Mikroskobu çıkarın (yapay ışık).
9. Değerler hala kabul edilebilirse, probu sabitlemek için bir damla yapıştırıcı ekleyin.
10. Değerin 80 FU'nun üzerinde olup olmadığını doğrulamak için yeniden denetleyin. Değer 80 FU'nun altındaysa, 80 FU'nun üzerinde bir değere ulaşmak için probu çıkarın ve yeniden konumlandırın.
    NOT: FU değeri, serebral kan akışını (CBF) gösteren rastgele bir birimdir.

6. SAH'ın İndüksiyonu

1. İğneyi, kafatasının tabanının direnci hissedilene kadar yarımküreler arasındaki orta çizgide kafatasından yavaşça yerleştirin. Optik kiazmın hemen önüne doğru yerleştirmeyi sağlamak için iğneyi 1 mm geri çekin.
2. Kanı enjekte ederken en homojen sonucu elde etmek için iğne ucu sağa bakacak şekilde iğneyi saat yönünde 90° çevirin. Stilettoyu çıkarın (Şekil 3).
3. 15 dakika boyunca dengeleyin ve 80-100 mmHg aralığında ortalama bir arteriyel kan basıncı elde etmek için anestezi seviyesini ayarlayın.
4. Bir kan gazı analizi yapın. Anestezi seviyesini buna göre ayarlayın.
5. Künt 23 G iğneli 1 mL'lik bir şırınga kullanarak kuyruk kateterinden 500 μL kan çekin.
6. Hava enjeksiyonunu önlemek için omurilik iğne odasının ölü alanını kanla doldurun. 23 G iğnesini kan dolu şırıngadan çıkarın ve şırınganın 300 μL kan içerdiğini onaylayın.
7. Şırıngayı spinal iğneye bağlayın. Sıkıca tutun ve MAP'yi aşmak için kanı manuel olarak enjekte edin.
8. Dizüstü bilgisayarda ICP'de dik bir artış ve CBF'de dik bir düşüş gözlemleyin.
   NOT: CBF, ameliyatın başarılı olması için en az 5 dakika boyunca başlangıç puanına kıyasla% 50 veya daha düşük olmalıdır , bkz. Sahte sıçanlar 6.1-6.7 adımlarından geçmez, böylece spinal iğnenin serebruma sokulmasını atlar, olası spontan kanamayı ve iyatrojenik beyin hasarını en aza indirir.

7. İyileşme ve uyanış

1. Deri altından 0.1 mL/100 g hayvan ağırlığı 5.0 mg/mL karprofen ve 1 mL/100 g hayvan ağırlığında izotonik salin uygulayın. Uygulamadan önce sıvıların en azından oda sıcaklığında olduğundan emin olun.
2. Daha sonra sıçanı SAH'ı takiben 30 dakika boyunca anestezi altında tutun.
3. İğneyi, lazer doppler probunu çıkarın ve ardından boşlukları kemik mumu ile doldurun. Emilemeyen monofilament 4-0 dikişli iki yatay yatak sütürü kullanarak insizyonu kapatın.
4. ICP probunu sterna magna'ya enjeksiyon yapmak üzere kullanmak için, silikon boruyu çıkarın ve polietilen boruya bir nokta adaptörü takın.
5. Herhangi bir müdahale planlanmıyorsa, basit, kesilmiş dikişi kesin. ICP probunu bir makas kullanarak mümkün olduğunca kısaltın ve ardından beyin omurilik sıvısının (BOS) sızmasını önlemek için ucunu yapıştırın. Kesiyi emilemeyen bir monofilament 4-0 sütür ile kapatın.
6. Sıçanı stereotaksik çerçeveden çıkarın ve sırtüstü pozisyonda yerleştirin. Gevşek dikişleri kuyruk kesisinden çıkarın.
7. Arteriyel kateterin proksimal ve derinliğinde tek bir dikiş yerleştirin. Kateteri çıkarın ve kanamayı önlemek için dikişi bağlayın. Kuyruk insizyonunu emilemeyen monofilament 4-0 sütür ile dikin.
8. İzofluranı kapatın.
9. Sıçanı ve kürkünü mümkün olduğunca temizleyin.
10. Pedal çekme refleksi yeniden kazanıldığında ve sıçan ventilatörden ayrıldığında spontan solunuma sahip olduğunda, ekstübe edin.
11. Sıçanı yiyecek ve su ad libitum ile tek bir kafese yerleştirin. Kafesin yarısını bir ısıtma plakasının altına yerleştirin ve sıçanı kafesin bu bölgesine yerleştirin.
12. Pinport enjektörünü hassas bir şırıngaya uyarlayarak intratekal uygulama gerçekleştirin ve tedaviyi pinport adaptörü aracılığıyla uygulayın. Bu müdahale uyanık olan hayvanlarda mümkündür. Bkz. Şekil 5.

8. ICP-probu çıkarılması (ameliyat sırasında çıkarılmazsa)

NOT: Cerrahın takdirine bağlı olarak cerrahi mikroskop kullanın.

1. Sıçanı daha önce tarif edildiği gibi anestezi odasına yerleştirin.
2. Anestezi uygulandığında, sıçanı ısıtma yastığı ile operasyon alanında sırtüstü pozisyonda yerleştirin.
3. Burnu anestezi maskesine yerleştirin. _O2 ila% 30, atmosferik hava% 70 ve izofluran seviyelerini% 2 olarak ayarlayın.
4. Kuru gözlere karşı koymak için göz jelini sürekli olarak uygulayın.
5. Kaudal basit kesilmiş dikişi kesin. Kesi açın ve olası nekrotik dokuyu veya kan pıhtılarını çıkarın.
6. ICP probunu bir makas kullanarak mümkün olduğunca kısaltın ve beyin omurilik sıvısının (BOS) sızmasını önlemek için ucunu yapıştırın. Kesiyi emilemeyen bir monofilament 4-0 sütür ile kapatın.
7. İzofluranı kapatın.
8. Sıçan hareket etmeye başladığında, yiyecek ve su ad libitum içeren tek bir kafese yerleştirin. Kafesin yarısını bir ısıtma plakasının üzerine yerleştirin ve sıçanı bu alana yerleştirin.
9. Alışılmış duruma geri döndüğünde, hayvanları ilk 15 dakika boyunca gözetim altında ortak bir kafeste birbirlerine tekrar tanıtın.

Kadınların erkeklere kıyasla daha fazla aSAH riski vardır. Buna rağmen, erkek kemirgenler öncelikle kadınlarda östrus döngüsünün heterojenliğinden kaynaklanan olası önyargı nedeniyle deneylerde kullanılır. Burada sunulan temsili sonuçlar, dişi ve erkek sıçanları karşılaştıran ve modelin dişi hayvanlarda erkek^21'e kıyasla benzer sonuçlar verdiğini doğrulayan yeni bir yayından alınmıştır. Çalışmaya 34 dişi Sprague-Dawley sıçanı (18 SAH ve 16 şems) dahil edildi. Şems'in omurilik iğnesi optik kiazma inmedi veya kan enjekte edilmedi. Diğer tüm işlemler SAH'larla aynı Şems üzerinde yapıldı. Gruplar arasındaki tüm fizyolojik parametreler karşılaştırılabilirdi. Son olarak, erkek sıçanlar üzerinde yapılan önceki deneylerden elde edilen verilerin bir meta-analizi yapılmış ve bu çalışmanın sonuçlarıyla karşılaştırılmıştır²¹.

Döner kutup testi, kaba sensorimotor fonksiyonun bir testidir. Hayvan, 10 rpm'ye kadar dönebilen 150 cm x 45 mm'lik bir direğin bir ucuna yerleştirilir. Amaç, bir kafesin yerleştirildiği direğin uzak ucuna ulaşmaktır. SAH sıçanları, dönen kutuptaki sahte hayvanlara kıyasla 1. ve 2. günlerde önemli ölçüde daha kötü performans gösterdi (Şekil 1).

SAH'ı takiben, hem ET-1 hem de 5-HT reseptör ailesi, serebral arterlerde yukarı regüle edilir, bu da uyarıldığında kasılmanın artmasına neden olur ve böylece CVS^22,23'e katkıda bulunur. Baziler arter (BA) ve orta serebral arterler (MCA) dekapitasyondan sonra çıkarıldı ve miyograf deneyleri için kullanıldı. Hem ET-1 reseptör ailesi için bir agonist olan endotelin 1 (ET-1) hem de 5-HT-reseptör ailesi için bir agonist olan 5-karboksamidotriptamin (5-BT), SAK'ta sahte ile karşılaştırıldığında önemli ölçüde artmış vasküler kasılma üretti (Şekil 2). Duyarlılık, her iki cinsiyette de SAH sonrası kasılmayı ortaya çıkarmak için gereken düşük konsantrasyonlarla gözlemlenebilir.

SAH sonrası artan su içeriği (ödem), insanlarda azalmış fonksiyonel sonucun bir ölçüsüdür²⁴. 2. günde SAM'a kıyasla SAK'ta anlamlı derecede artmış serebral ödem bulundu. Hipokampusta ödem artışına doğru bir eğilim de vardı, ancak bu istatistiksel olarak anlamlı değildi (p = 0.0508)²¹.

Yukarıda belirtilen veriler tarihsel erkek verileriyle karşılaştırıldığında, sonuçlar karşılaştırılabilir. Meta veriler, ET-1 veya 5-BT ilavesini takiben erkek SAH'larda kontraktilitenin arttığını göstermektedir (Şekil 2). Ayrıca, SAH sıçanları, dönen kutup testini yaparken şemslere kıyasla önemli ölçüde daha kötü performans gösterdi. Sonuç, sensörimotor fonksiyonun azaldığını gösterdi (Şekil 1).

Şekil 5A , SAH'ın indüksiyonundan 30 dakika sonra salin perfüzyonunu takiben otolog, enjekte edilen kanın dağılımını göstermektedir. Şekil, kanın pre-kiazmatik enjeksiyonu takiben subaraknoid boşlukta dağıldığını göstermektedir.

Şekil 5B ve Şekil 5C, intratekal olarak enjekte edilen boyaların dağılımını, ardından enjeksiyondan sonra 30 dakika boyunca tüm vücut salin perfüzyonunu göstermektedir. Şekil 5B, 20 mM Evans Blue'nun (suda çözünür) 25 μL'sinin dağılımını ve Şekil 5C, 10 mM Oil Red O'nun (suda çözünmez) 25 μL'sinin dağılımını göstermektedir. Her iki boyanın da cisterna magna'ya enjeksiyonu takiben subaraknoid boşlukta dağıldığı bulundu ve bunun hem suda çözünür hem de çözünmeyen bileşiklerin intratekal enjeksiyonunun uygulanabilir bir modeli olduğunu doğruladı. Fark edilmeye değer, suda çözünmeyen bileşik için arterlerin etrafında birikintilerin oluşmasıdır.

Şekil 1: Erkek ve dişi sıçanlarda SAH'dan sonraki ilk 2 günde duyusal-motor bilişin analizi. Döner kutup testi, SAH'dan sonraki 1. gün ve 2. günde yapıldı. Her iki cinsiyetteki sıçanların, aynı cinsiyetteki sahte ameliyatlı sıçanlara kıyasla önemli eksiklikleri vardı. Gruplar arasındaki davranıştaki istatistiksel farklılıklar, 0. gün, 1. gün ve 2. günde 2 yönlü ANOVA ile test edildi. Dişi dönüş yok ve 3 rpm: p < 0.05. Kadın 10 rpm ve tüm erkek verileri: p < 0.01. Değerler SEM'± araçlardır. Spray, S. et ^al.21'in izniyle yeniden yayınlandı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Erkek ve dişi sıçanlarda SAH'dan 2 gün sonra baziler arter (BA) ve orta serebral arterde (MCA) ET-1 ve 5-BT kaynaklı kasılmalara karşı artan duyarlılığın analizi. (A,B) 60 mM K⁺-uyarılmış (K⁺_max) kontraktil yanıtlar, agonist kaynaklı yanıtların normalleştirilmesinde referans değer olarak kullanıldı. ET-1'e duyarlılık, hem BA hem de MCA'da aynı cinsiyetten sahte olarak ameliyat edilen sıçanlara kıyasla SAH'dan 2 gün sonra anlamlı derecede artmıştır. (C,D) 5-BT'ye duyarlılık, hem BA hem de MCA'da aynı cinsiyetten sahte olarak ameliyat edilen sıçanlara kıyasla SAH'dan 2 gün sonra anlamlı olarak artmıştır. Konsantrasyon-yanıt eğrileri istatistiksel olarak iki yönlü ANOVA ile karşılaştırıldı. Tüm veriler: p < 0.001. Değerler SEM'± araçlardır. Spray, S. et ^al.21'in izniyle yeniden yayınlandı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: SAH'ın indüksiyonundan önceki kuruluma genel bakış. Resmin üst kısmından, 1) enjeksiyon iğnesi, 2) lazer-Doppler probu ve 3) ICP probunun hepsinin yerinde olduğunu unutmayın. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: İntratekal enjeksiyon sonrası numune izi. Kırmızı grafik kan basıncını mmHg cinsinden gösterir. Mavi grafik ICP'yi mmHg cinsinden gösterir ve yeşil grafik CBF'yi rasgele birim FU'da gösterir. ICP'deki ani artış, kan enjeksiyonunun sonucudur. Bunun, CBF'de 5 dakikadan fazla bir süre boyunca taban çizgisinin %50'si > bir düşüşe neden olduğuna dikkat edin. ICP yükselişi ayrıca kan basıncında saniyeler içinde normalleşen küçük bir artışa neden olur. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: İntratekal olarak enjekte edilen kanın ve renkli boyaların dağılımı. (A) SAH indüksiyonundan 30 dakika sonra otolog kanın dağılımı. (B) ICP-kateter yoluyla intratekal enjeksiyonu takiben 20 mM Evans Blue'nun 25 μL'sinin dağılımı. (C) ICP-kateter yoluyla intratekal enjeksiyonu takiben 25 μL 10 mM Oil Red O'nun dağılımı. Tüm hayvanlara intraperitoneal ketamin/ksilazin karışımı ve ardından salin perfüzyonu ile anestezi uygulandı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

SAK'ın kizmatik öncesi tek enjeksiyon modeli, ICP'deki artış, CBF'nin azaltılması, geçici küresel iskemi, nöroinflamatuar belirteçlerin upregülasyonu ve CVS 14,15,16,18,19,20 dahil olmak üzere insan SAK'ının birçok önemli unsurunu taklit eder. ICP probu ayrıca intratekal uygulama için bir liman olarak da kullanılmıştır (Şekil 5). Ayrıca, çalışma, modelin erkek ve dişi hayvanlarda benzer performans gösterdiğini göstermektedir²¹. Model, bir anevrizmanın gelişimini ve ardından yırtılmasını içermez. Bir dizi model, sistemik hipertansiyonun cerrahi veya farmakolojik olarak indüklenmesi ve elastaz^25,26,27 kullanılarak arteriyel duvarın zayıflatılması yoluyla rüptüre bir anevrizmadan SAH üretmeye çalışmıştır. Tüm girişimler hayvanların bir alt kümesinde anevrizmal SAH üretmiştir, ancak bu modeller anevrizmanın ne zaman yırtılacağını tahmin edememe de dahil olmak üzere doğal bir değişkenliğe sahiptir. Modeller SAH^18,28 ile ilgili klinik öncesi araştırmalar için çok uygun değildir.

Diğer murin, SAH modelleri arasında, endovasküler perforasyon modeli, bir anevrizmanın rüptürünü taklit eden, ancak yüksek değişkenlik ve mortaliteye eğilimli bir damarın rüptürünü içerir. Burada açıklanan model, kan hacmi önceden belirlendiğinden ve enjeksiyon basıncı kontrol edilebildiğinden daha iyi izlenebilir ve daha tekrarlanabilirdir. Çift enjeksiyon modelinin gecikmiş CVS üretme olasılığı daha yüksektir, ancak öncelikle posterior dolaşımı etkiler ve fizyolojik olmayan ikinci bir kan enjeksiyonu içerir. Buna karşılık, bu model insanlarda SAH'a benzer, çünkü ön dolaşımın tek bir enjeksiyonudur ve tekrarlanabilir bir ICP artışı^{üretir 18}.

Farklı anestezi rejimlerinin deneysel SAH üzerindeki etkisi belirsizdir ve deneysel veriler çelişkilidir. Bir çalışma, izofluran inhalasyonları kullanıldığında farelerde endovasküler perforasyon modelinde sitokinlerin ve genel nöroinflamasyonun olası inhibisyonunu bildirmiştir²⁹. Başka bir kemirgen modeli, izofluranes³⁰ kullanıldığında azalmış bölgesel CBF ile birlikte solunum parametrelerinin azalmasına ve beyin ödeminin artmasına neden olmuştur. Bununla birlikte, fare modellerinde mortaliteyi karşılaştıran bir meta-analiz, izofluran ve diğer anestezi türleri arasında mortalitede bir fark göstermemiştir³¹. Anlaşmaya varıldığında, yukarıdaki protokol ya izofluran inhalasyonunu ya da intraperitoneal ketamin / ksilazin karışımını her iki grupta da benzer sonuçlarla başarıyla kullanmıştır²¹.

Yüksek tekrarlanabilirlik ve uygun veri toplama sağlamak için, genel vurgu, izleme ekipmanının yerleştirilmesiyle ilgili adımlardır. Kuyruk kateterinin doğru yerleştirilmesi, kan basıncının sürekli izlenmesini ve kan gazı analizleri yapılabilmesini kolaylaştırır. ICP kateterinin uygun şekilde yerleştirilmesi, doğru ICP izlemesini ve ardından intratekal müdahale olasılığını sağlar. Lazer-Doppler probunun uygun şekilde yerleştirilmesi, CBF'nin azalmasının izlenebilmesini sağlar, burada SAH indüksiyonunu takiben en az 5 dakika boyunca başlangıç skorunun% 50 veya daha düşük bir düşüşü güçlü bir iskemi sağlar³². Tüm izleme adımlarının düzenli olmasını sağlayarak, araştırmacı SAH indüksiyonunu takiben doğru veri toplamayı güvence altına alabilir.

Protokol, subaraknoid kanamanın kiazmatik öncesi tek enjeksiyon modelini güncellemeler ve modifikasyonlarla açıklar. Model, SAH-araştırması için değerli olmuştur ve muhtemelen erken beyin hasarı ve gecikmiş serebral iskemi de dahil olmak üzere subaraknoid kanamanın daha iyi anlaşılmasına katkıda bulunmaya devam edecektir.

Yazarların beyan edecekleri çatışan çıkarları yoktur.

Çalışma, Lundbeck Vakfı ve Lundbeck Mükemmellik Hibesi (no. R59-A5404) tarafından desteklenmiştir. Fon verenlerin makalenin herhangi bir bölümünde hiçbir rolü yoktu.