Tüp bebek pankreas soylarına doğru İnsan Diş Pulpası Kök Hücrelerinin İndüksiyonu

Bu protokol, insan diş pulpası kök hücrelerini (hDC'ler) pankreas soylarına in vitroolarak ayırt etmek için iki farklı indüksiyon protokolü arasında bir karşılaştırma sunar: bütünleştirici protokol ve bütünleştirici olmayan protokol. Bütünleştirici protokol daha fazla insülin üreten hücre (IPC) üretir.

2000 yılı itibariyle, tip I diabetes mellitus tedavisinde Edmonton protokolünü kullanarak pankreas adacık naklinin başarısı hala bazı engellerle karşı karşıya kaldı. Bunlar arasında sınırlı sayıda kadavra pankreas bağışçısı ve immünsüpresanların uzun süreli kullanımı saydır. Mezenkimal kök hücreler (MSC' ler) adacık benzeri hücre neslinin alternatif bir kaynağı olarak potansiyel bir aday olarak kabul edilmiştir. Önceki raporlarımız, insan diş hamuru kök hücrelerini (hDC'ler) insülin üreten hücrelere (IPC' ler) ayırt etmek için indüksiyon protokollerinin oluşturulmasını başarıyla ortaya koymuştur. Bununla birlikte, indüksiyon verimliliği büyük ölçüde değişti. Bu yazıda, hDPSC türevli IPC'ler (hDPSC-IPC'ler) sunmak için bütünleştirici (mikroçevresel ve genetik manipülasyon) ve bütünleştirici olmayan (mikroçevronmental manipülasyon) indüksiyon protokolleri yoluyla hDPSC'lerin pankreas indüksiyon verimliliğinin karşılaştırılması gösterilmiştir. Sonuçlar, 3 boyutlu koloni yapısı, verim, pankreas mRNA belirteçleri ve çok dozajlı glikoz zorluğu üzerine fonksiyonel özellik açısından hem indüksiyon yaklaşımları için belirgin indüksiyon verimliliği göstermektedir. Bu bulgular, klinik olarak uygulanabilir bir IPC'lerin ve pankreas soy üretim platformunun gelecekteki kurulmasını destekleyecektir.

Diabetes mellitus devam eden küresel bir endişe kaynağıdır. Uluslararası Diyabet Federasyonu (IDF) raporunda, diyabetin küresel prevalansının 2000 yılında 151 milyondan 2015 yılında 415 milyona yükseleceği tahmin edilmektedir^1,2. Epidemiyoloji temelli en son çalışma, dünya çapında tahmini diyabet prevalansının 2017'de 451 milyondan 2045'te 693 milyona yükseleceğini öngörtü^1. Edmonton protokolü kullanılarak pankreas adacık naklinin başarısı ilk olarak 2000 yılında, tip I diyabetik hastalarda endojen insülin üretiminin sürdürülmesi ve normoglisemik durumun stabilize edildiği gösterildiğinde gösterilmiştir^3. Ancak, Edmonton protokolünün uygulanması hala bir darboğaz sorunuyla karşı karşıyadır. Tip I diyabetli her hasta en az 2-4 adacık bağışçısı gerektirdiğinden, kadavra pankreas donörlerinin sınırlı sayıda olması ana konudur. Ayrıca, immünsüpresif ajanların uzun süreli kullanımı hayatı tehdit eden yan etkilere neden olabilir^4,5. Bunu ele almak için, son on yılda diyabet için potansiyel bir tedavinin geliştirilmesi, esas olarak çeşitli kök hücre kaynaklarından etkili insülin üreten hücrelerin (IPC' ler) üretimine odaklanmıştır⁶.

Kök hücreler, beta hücrelerinin kaybından kaynaklanan diyabet tipi I de dahil olmak üzere birçok hastalıkta alternatif bir tedavi haline geldi. İP'lerin nakli, bu hastalarda kan şekerinin kontrol altına için yeni umut verici yöntemdir⁷. BU makalede, IPC'ler oluşturmak için bütünleştirici ve bütünleştirici olmayan indüksiyon protokolleri olmak üzere iki yaklaşım sunulmuştur. İndüksiyon protokolü, olgunlaşmış ve işlevsel IPC'leri elde etmek için doğal pankreas gelişim sürecini taklit etti^8,9.

Bu çalışma için hDCPCs, MSC yüzey belirteci tespiti için akış sitometrisi, çok satırlı farklılaşma potansiyeli ve rt-qPCR ile karakterize edildi ve sap özelliği ve proliferatif gen belirteçlerinin (veri gösterilmedi) ekspresyonunu belirlemek için⁸,^9,10. hDC'ler kesin endoderm, pankreas endoderm, pankreas endokrin ve pankreas beta hücreleri veya IPC'lere indüklenmiştir (Şekil 1), sırasıyla⁷. Hücreleri indüklamak için omurga protokolü olarak üç aşamalı indüksiyon yaklaşımı kullanılmıştır. Bu protokole bütünleştirici olmayan protokol denirdi. Bütünleştirici protokol durumunda, temel pankreas transkripsiyon faktörü PDX1,hDC'lerde aşırı ifade edildi ve ardından üç adımlı bir farklılaşma protokolü kullanılarak hDC'lerde aşırı ifade edilen PDX1 indüksiyonu yapıldı. Bütünleştirici olmayan ve bütünleştirici protokol arasındaki fark, PDX1'in bütünleştirici olmayan protokolde değil, bütünleştirici protokolde aşırı ifade olmasıdır. Pankreas farklılaşması bu çalışmada bütünleştirici ve bütünleştirici olmayan protokoller arasında karşılaştırıldı.

Bu çalışma Helsinki Bildirgesi'ne uygun olarak gerçekleştirildi ve Chulalongkorn Üniversitesi Diş Hekimliği Fakültesi İnsan Araştırma Etik Kurulu tarafından onaylandı. İnsan DPSC'leri (hDC'ler), yirmilik diş sorunları nedeniyle hem premolarlardan hem de azı dişlerinden çıkarılan insan diş hamuru dokularından izole edildi. Onaylı bir protokol (HREC-DCU 2018/054) kapsamında hastalardan bilgilendirilmiş onam alınmıştır.

1. Bütünleştirici indüksiyon protokolü

1. PDX1 taşıyan lentiviral vektörün hazırlanması
   1. Viral paketleme için insan embriyonik böbrek (HEK) 293FT hücreleri kullanın. Dulbecco'nun Modifiye Kartal Orta (DMEM) hücrelerinde %10 fetal sığır serumu (FBS), %1 L-glutamin ve %1 Antibiyotik-Antimykotik ile desteklenmiş bu hücrelerin kültür ve bakımı.
   2. Kalsiyum fosfat transfeksiyon sistemi kullanarak HEK293FT hücrelerine ambalaj ve zarf plazmidlerinin her biri için 10 μg ve hedeflenen gen plazmidlerinin 20 μg'si eş-transfeksiyon ile PDX1-lentivirüs vektörleri oluşturun, örneğin psPAX2, pMD2. G ve insan pWPT-PDX1^11. Enfeksiyon sırasında hücrelerin% 80-% 90 birleştiğinden emin olun.
   3. Lentiviral parçacıklar içeren ortamı transfeksiyondan sonra 48 ve 72 saat arasında toplayın.
   4. Toplanan ortamı 0,45 μm filtreden geçirin; virüsleri 100 kDa nominal moleküler ağırlık kesme (NMWCO) santrifüj filtre ile konsantre eder.
2. PDX1 aşırı ifade
   1. %70-80 birleştirilmiş 3-5 hDPSC pasajı kullanın. Hücre sayacı kullanarak hücreleri deneyin ve sayın. Tohum 1 x 10⁶ hDPSC 60 mm doku kültürü ile işlenmiş bir çanak üzerine ve bir gecede kuluçkaya yaslayın.
   2. 24 saat sonra, 1.1.4 adımından elde edilen taze virüs parçacıklarını, istenen enfeksiyon çokluğunda (MOI) polibrenin önceden işlenmiş hücrelerini (4 μg / mL polibren, 37 ° C'nin altında 30 dk ve% 5 CO₂₎transdüse etmek için ekleyin. Örneğin, bu durumda, kullanılan MOI 20'dir. Hücre kültürü inkübatöründeki hücreleri % 5 CO 2 ile 37 °C'de₂₄saat boyunca koruyun.
   3. 24 saat enfeksiyon süresinden sonra, viral parçacıklar içeren ortamı atın. Taze kültür medyası ekleyin ve hücreleri 48 saat büyütmeye devam edin. Tüm kültürler 37 °C ve% 5 CO_2'detutulur.
   4. İndüksiyon adımına geçmeden önce transfected hücrelerin toplam morfolojisini kontrol edin. PDX1 transdüksiyon gen ekspresyon analizi ile doğrulanır (Ek Şekil 1).
      NOT: Sonraki adımlara geçmeden önce mikroskop altında hücre morfolojisini kontrol edin.
   5. Mikroçevrimsel indüksiyon yaklaşımı olarak üç adımlı bir indüksiyon protokolünü (adım 1.3) hasat edin ve devam edin.
3. Üç adımlı indüksiyon protokolü
   NOT: Üç aşamalı indüksiyon protokolü, sırasıyla serumsuz ortam (SFM)-A, SFM-B ve SFM-C kullanarak hDC'lerin kesin endoderm, pankreas endoderm/endokrin ve pankreas beta hücreleri/IPC'lere pankreas farklılaşması serisi ile sonuçlandı.
   1. Kültür ortamını atın ve transdüklenmiş hDPSC'leri 1x fosfat tamponlu çözelti (PBS) ile yıkayın.
   2. Hücrelere% 0.25 tripsin-EDTA çözeltisi ekleyin ve 37 ° C' de 1 dakika kuluçkaya yaslanın, % 5 CO₂.
   3. Trypsin etkinliğini durdurmak için kültür ortamını ekleyin ve tek hücre süspansiyonunu almak için hücreleri hafifçe yıkayın. Hücreleri ve aliquot 1 x 10⁶ hücreleri her toplama tüpüne sayın.
   4. Hücre süspansiyonu 468 x g 'da (Göreli Santrifüj Kuvveti: RCF), 4 °C'de 5 dakika santrifüj edin. Üstnatant atın ve hücre pelet kaydedin.
   5. Peleti ilk pankreas indüksiyon ortamının 3 mL'sinde, yani serumsuz ortamda (SFM)-A. Hücreleri düşük bir bağlanma kültürü plakasına (60 mm) yeniden koyun. Hücreleri 3 gün boyunca 37 °C ve% 5 CO_2'de sakla.
      NOT: Bir sonraki adıma geçmeden önce ters mikroskop altında hücre morfolojisini gözlemleyin.
   6. SFM-A'yı çıkarın ve ikinci indüksiyon ortamının 3 mL'si, yani SFM-B ekleyin. Hücreleri önümüzdeki 2 gün boyunca 37 °C,% 5 CO_2'desakla.
      NOT: Bir sonraki adıma geçmeden önce ters mikroskop altında hücre morfolojisini gözlemleyin.
   7. SFM-B'yi çıkarın ve üçüncü indüksiyon ortamının 3 mL'si yani SFM-C ekleyin. %5 CO₂ile 37 °C'de tutulan bir hücre kültürü inkübatöründe hücreleri önümüzdeki 5 gün boyunca koruyun. Ortamı her 48 saat değiştirin. 5 gün sonra morfolojilerini gözlemleyin.
      NOT: Her indüksiyon ortamı açıklandığı gibi farklı reaktiflerle desteklenmiştir; SFM-A: %1 sığır serum albümini (BSA), 1x insülin transferin-selenyum (ITS), 4 nM activin A, 1 nM sodyum bütirat ve 50 μM beta-mercaptoethanol; SFM-B: %1 BSA, 1x ITS ve 0,3 mM taurin; ve SFM C: %1,5 BSA, 1x ITS, 3 mM taurin, 100 nM glukagon benzeri peptit (GLP)-1, 1 mM nikotinamid ve 1x esansiyel olmayan amino asitler (NEAs).
   8. Her adımdan sonra hücre morfolojisini ters mikroskop altında kontrol ettiğinizi unutmayın. Hücreler daha fazla bir araya gelecek ve koloniler olarak yüzecek.
   9. Daha fazla analiz için hücre kolonilerini toplayın. Koloni morfolojisi ve büyüklüğü olup olmadığını kontrol edin. Pankreas gen belirteci ekspresyon analizi ve fonksiyonel analiz yapın (Glikoz uyarılmış C-peptit salgı tahlil).

2. Bütünleştirici olmayan indüksiyon protokolü

NOT: Bütünleştirici olmayan protokol, IPC'leri mikroçevrimsel indüksiyon yaklaşımı^8,9olarak üç adımlı indüksiyon işlemiyle teslim etmek için omurga protokolüdür.

1. Pasaj 3-5 hDC'leri %70-%80 izdiahta kullanın.
2. Kültür ortamını atın ve hDC'leri 1x PBS ile yıkayın.
3. Hücrelere% 0.25 tripsin-EDTA çözeltisi ekleyin ve 37 ° C, 5% CO_2'de1 dakika kuluçkaya yaslayın.
4. Tripsin aktivitesini durdurmak için kültür ortamını ekleyin ve tek hücre süspansiyonu elde etmek için hücreleri hafifçe pipetleyin. Her toplama tüpüne hücreleri ve aliquot 1 x^{10 6} hücreleri sayın.
   1. Hücre süspansiyonu 468 x g (RCF), 4 °C, 5 dk'da santrifüj. Üstnatant atın.
   2. Peletin SFM-A'da yeniden depolanarak düşük ataşman kültür plakasına (60 mm) tohumlayın. Hücreleri 3 gün boyunca 37 °C ve% 5 CO_2'de kültüre edin. Hücre morfolojisini ters mikroskop altında kontrol edin.
   3. SFM-A'yı çıkarın, SFM-B (Gün 3) ekleyin ve sonraki 2 gün boyunca hücreleri 37 °C, % 5 CO₂altında sakleyin.
   4. SFM-B'yi çıkarın, SFM-C (Gün 5) ekleyin ve ardından hücreleri 37 °C, % 5 CO₂altında önümüzdeki 5 gün boyunca koruyun. SFM-C her 48 saat değiştirilir.
      NOT: Her indüksiyon ortamı açıklandığı gibi farklı reaktiflerle desteklenmiştir; SFM-A: %1 BSA, 1x ITS, 4 nM activin A, 1 nM sodyum bütirat ve 50 μM beta-mercaptoethanol; SFM-B: %1 BSA, 1x ITS ve 0,3 mM taurin; ve SFM C: %1,5 BSA, 1x ITS, 3 mM taurin, 100 nM GLP-1, 1 mM nikotinamid ve 1x NEAS.
   5. Her adımdan sonra ve 10.
      NOT: Hücreler daha toplu hale gelecek ve koloniler olarak yüzecektir.
   6. Daha fazla analiz için hücre kolonilerini toplayın. Koloni morfolojisi ve büyüklüğü olup olmadığını kontrol edin. Pankreas gen belirteci ekspresyon analizi ve fonksiyonel analiz yapın (Glikoz uyarılmış C-peptit salgı tahlil).

Bu makalede, her iki indüksiyon protokolünün sonuçları karşılaştırılmıştır. Her iki indüksiyon protokolünün diyagramları Şekil 2A,C'de gösterilmiştir. Her iki protokolde de değerlendirme ışık mikroskobu altında yapıldı ve görüntüler ImageJ ile analiz edildi. hDC'ler her iki indüksiyon protokolünde de indüksiyonun ilk gününden itibaren koloni benzeri yapılar oluşturabildiler. Koloninin morfolojisi yuvarlak ve yoğundu ve tüm koloniler indüksiyon dönemi boyunca kültür damarlarında yüzdü (Şekil 2B,D). Her iki protokolün toplam koloni sayısı da belirlendi; sonuç, bütünleştirici indüksiyon protokolü durumunda toplam koloni sayısının bütünleştirici olmayan indüksiyon protokolüne kıyasla biraz daha yüksek olduğunu göstermiştir (Şekil 2E). Ancak aradaki fark istatistiksel olarak anlamlı değildi. Ayrıca, her iki indüksiyon protokolündeki koloni büyüklüğü dağılımı da değerlendirildi (Şekil 2F). Sonuçlarımıza göre, koloninin içindeki nekrotik çekirdeği azaltmak için önemli olan bütünleştirici indüksiyon üzerine küçük ve orta büyüklükte koloniler kuruldu.

Pankreas gen belirteci analizi rt-qPCR kullanılarak yapıldı son yayınımıza göre¹⁰. Bu çalışmada kullanılan astarların listesi hakkında bilgi Tablo 1'de yer almaktadır. mRNA değeri, 18S ribozomal RNA'ya normalleştirilerek ve 2^(-ΔΔCt)formülü kullanılarak kontrol ile göreli bir mRNA ifadesi olarak sunuldu. Bu çalışmanın sonuçları, bütünleştirici indüksiyon protokolünün, HDC'lerin IPC'lere doğru farklılaştırılmasını öneren ISL-1, MAF-A, GLUT-2, İnSÜLİnve GLP-1R dahilolmak üzere geç pankreas belirteçlerinin yüksek ekspresyonu olan koloniler sağladığını ortaya koydu. Bu çalışmada hDPSC-İp'lerin fonksiyonel değerlendirmesi de tanımlanmıştır (Şekil 4). Bir ELISA kiti kullanılarak glikoz uyarıcı C-peptid salgısı^8,9 tahlil kullanılmıştır. Sonuçlar, bütünleştirici ve bütünleştirici olmayan indüksiyon protokollerinin C-peptid salgılayabilen koloniler sağladığını göstermiştir.

Şekil 1: IPC'lere yönelik MSC farklılaşma şeması.

Şekil 2: Morfoloji, toplam koloni sayısı ve iki farklı protokol kullanılarak IPC'lerin koloni boyutu dağılımı. Temel transkripsiyon faktörü PDX1'in aşırı ifade ile bütünleştirici protokolün şeması ve ardından üç dik indüksiyon protokolü (A). İndüksiyonun her adımında transfected hDPSC'lerin morfolojisi (B). Omurga protokolü olarak bütünleştirici olmayan diyagram (C). Bütünleştirici olmayan iletişim kuralını kullanarak hDPSC-IPC'lerin morfolojisi (D). İki farklı protokolün toplam kolonisi (E) ve koloni büyüklüğü dağılımı (F). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: İki farklı protokolden elde edilen hDPSC-IPC'lerin pankreas gen ekspresyon analizi. Pankreas endoderminin mRNA ekspresyonu (PDX1 ve NGN-3) (A), pankreas adacık belirteçleri (ISL-1, MAF-A, GLUT-2ve İnSÜLİn) (B) ve pankreasla ilgili belirteç (GLP-1R) (C) analiz edildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: İki farklı protokolden elde edilen hDPSC-IPC'lerin fonksiyonel analizi. Her indüksiyon protokolünde C-peptid salgılanması, bütünleştirici (A) ve bütünleştirici olmayan(B) protokoller, glikoz uyarılmış C-peptit salgısı (GSCS) tahlili ile belirlendi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 1: PDX1 transdüksiyondan sonra PDX1 mRNA analizi. HDPSC'lerde MOI 20'de 48 saat PDX1 transdüksiyondan sonra PDX1 mRNA ekspresyon analizi gösterilmiştir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Tablo 1: Astar Bilgisi.

MSC'lerden daha yüksek IPC üretimi elde etmek diyabet tedavisinde önemli bir rol oynar. Bütünleştirici protokolün kritik adımları, transdüksiyon için kullanılacak hücrelerin kalitesine ve transdüklenmiş hücrelerin kalitesine dayanır. Başarılı transdüksiyon için kontrol edilmesi gereken bazı hücre gereksinimleri, hücre sağlığını, hücre bankacılığı yönetimini ve hücrelerin mitotik olarak aktif bir durumda olmasını sağlamaktır. Ayrıca, transdüklenmiş hücrelerin canlılığını izlemek de önemli bir rol oynar. Daha az başarılı transdüksiyon, uyarılmış hücrelerin zayıf yaşayabilirliğinden kaynaklanır¹². Bütünleştirici olmayan protokoller için, pankreas farklılaşmasının olgunlaşmasıyla ilgili oldukları için morfolojik görünüm ve yüzen koloniler elde edilmelidir⁹.

Bütünleştirici indüksiyon protokolü için tekniğin değiştirilmesi ve sorun giderilmesi açısından, 3-5 ve%70-%80'lik kesitlerdeki hücreler kullanılarak sağlıklı ve kaliteli hücreler elde edilebilirken, transdüklenmiş hücrelerin kalitesi bir sonraki adıma geçmeden önce uyarılan hücrelerin kalitesi rutin olarak kontrol edilerek izlenmelidir. Bu bulgu, transdüksiyonun verimliliğini etkileyen birkaç faktörün hücre sağlığına, hücre birleşmesi ve pasaj sayısına dayandığından bahseden önceki bir çalışma ile ilişkilidir¹³. Bu çalışmada, üç aşamalı bir indüksiyon sürecine sahip bütünleştirici olmayan protokol, esas olarak koloni büyüklüğü ve koloni sayısı oluşumu ile ilgili sınırlamalarla karşı karşıyadır. Bu sonuç önceki çalışmamızla tutarlı^8,9. Bu sorunun üstesinden gelmek için, hücrelerin kalitesini ve düşük bağlanma kültürü damarlarının kalitesini kontrol etmeyi öneririz.

Bu tekniğin sınırlandırılması, ardışık iki farklı platformun kullanılmasından kaynaklanan bütünleştirici indüksiyon protokolünün karmaşıklığıdır. Ayrıca, daha yüksek MOI, transdüksiyonun daha yüksek verimliliği anlamına gelmez. Lentivirüs transdüksiyon kullanılarak yapılan benzer bir çalışmada, daha yüksek bir MOI daha iyi transdüksiyon verimliliği elde edemedi. Yazarlar protamin sülfat¹⁴gibi bir adjuvan kullanılmasını önermektedir. Bütünleştirici olmayan protokollerin kullanılmasının sınırlamaları, koloninin üretimi ve hasadı için işleme teknikleri ve üretilen IPC'lerin değişen boyutları ve morfolojik yapıları gibi teknik konularla ilgilidir.

Temel transkripsiyon faktörü, PDX1, böylece MSC indüksiyonunun olgun IPC'lere doğru taahhüdünde potansiyel bir role sahip olmak^15,16,17,18. PdX1-overexpressed hDPSC'ler ve ardından üç adımlı bir indüksiyon protokolü kullanılarak omurga protokolünün değiştirilmesi esas olarak olgun ve işlevsel IPC'lerin başarılı yüksek verimli üretimine yönelikti^19,20,21. Bu protokolün bulguları, olgun IPC'lere yönelik MSC indüksiyonunun PDX1^9'unendodermik öncesi ifadesini gerektirdiğini yansıtmıştır. Morfolojik değerlendirme, kolonilerin bağlı olmayan 3D yapısının düşük bağlanmalı damarlar kullanılarak her iki protokolde de elde edilebileceğini göstermiştir. Bu yapı pankreas farklılaşması 7 , 9^,22,23olgunlaşmasını elde etmek için^önemliydi. Buna ek olarak, koloni büyüklüğü değerlendirmesine göre, bütünleştirici protokol, toplam koloni sayısının ve koloninin nekrotik bir çekirdeğini önleyebilecek küçük ila orta boy koloni üretiminin olumlu bir eğilimi ile sonuçlandı. Bu nedenle, daha fazla transplantasyon için faydalı olacaktır^{7,19,21,24,25}. Bu protokolde geç evre pankreas gen belirteçlerinin(ISL-1, MAF-A, GLUT-2, İnSÜLİnve GLP-1R)yukarı yönlüluğu gözlenmiştir. Bütünleştirici indüksiyon protokolündeki geç evre pankreas gen belirteçleri omurga protokolüne göre daha yüksekti. PDX1'in aşırı ifade edilişinin pankreas progenitörlerinin sayısını artırdığı, yani orta ila geç evre pankreas gelişiminin ilerlemesi açısından daha iyi bir sonuç elde edilebileceği ortaya çıktı^19,26,27,28. Ayrıca, IPC'lerin işlevini netleştirmek için bir GSCS tahlili gerçekleştirildi. Her iki protokolden üretilen hDPSC-IPC'ler C-peptit salgılayarak fonksiyonel olarak aktif kolonileri düşündürmektedir.

Bu çalışmada kullanılan tekniğin gelecekteki uygulamalarını özetlemek gerekirse, her iki pankreas indüksiyon protokolü de IPC'leri in vitro. Toplam koloni sayısı, küçük ve orta boy koloni üretimi ve pankreas belirteci ekspresyumu açısından, bütünleştirici protokol IPC oluşumu için yararlı bir eğilim göstererek, insan ve veteriner uygulamaları için kök hücre bazlı diyabet tedavilerinde daha fazla MSC uygulamasını destekledi⁷,^29,30,31,32.

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

SK, WR ve QDL, Chulalongkorn Üniversitesi Veteriner Kök Hücre ve Biyomühendislik Araştırma Birimi, Ratchadaphiseksomphot Bağış Fonu tarafından desteklendi. TO ve PP, Chulalongkorn Akademik İlerlemesi tarafından^2. CS, VeterinerLik Fakültesi, Chulalongkorn Akademik İlerlemesi^2.