In vitro Indução de células-tronco de polpa dentária humanas em direção a linhagens pancreáticas

Este protocolo apresenta uma comparação entre dois protocolos de indução diferentes para diferenciar células-tronco de polpa dentária humana (hDPSCs) em relação a linhagens pancreáticas in vitro: o protocolo integrativo e o protocolo não integrativo. O protocolo integrativo gera mais células produtoras de insulina (IPCs).

A partir de 2000, o sucesso do transplante de ilhotas pancreáticas usando o protocolo de Edmonton para tratar diabetes mellitus tipo I ainda enfrentou alguns obstáculos. Estes incluem o número limitado de doadores cadavéricos do pâncreas e o uso a longo prazo de imunossupressores. As células-tronco mesenquimais (MSCs) têm sido consideradas como um candidato em potencial como uma fonte alternativa de geração celular semelhante a ilhotas. Nossos relatórios anteriores ilustraram com sucesso o estabelecimento de protocolos de indução para diferenciar células-tronco de polpa dentária humana (hDPSCs) em células produtoras de insulina (IPCs). No entanto, a eficiência da indução variou muito. Neste artigo, demonstramos a comparação da eficiência da indução pancreática do HDPSCs por meio de protocolos integrativos (manipulação microambiental e genética) e não integrativos (manipulação microambiental) para a entrega de IPCs derivados do HDPSC (hDPSC-IPCs). Os resultados sugerem uma eficiência de indução distinta tanto para as abordagens de indução em termos de estrutura de colônia tridimensional, rendimento, marcadores de mRNA pancreático e propriedade funcional no desafio de glicose multidosagem. Esses achados apoiarão o futuro estabelecimento de um IPC clinicamente aplicável e uma plataforma de produção de linhagem pancreática.

Diabetes mellitus é uma preocupação global em curso. Um relatório da Federação Internacional de Diabetes (IDF) estimou que a prevalência global de diabetes aumentaria de 151 milhões em 2000 para 415 milhões em 2015^1,2. O último estudo baseado em epidemiologia previu que a prevalência estimada mundial de diabetes aumentará de 451 milhões em 2017 para 693 milhões em 2045¹. O sucesso do transplante de ilhotas pancreáticas utilizando o protocolo de Edmonton foi demonstrado pela primeira vez em 2000, quando foi demonstrado manter a produção endógena da insulina e estabilizar a condição normóglicêica em pacientes diabéticos tipo I³. No entanto, a aplicação do protocolo de Edmonton ainda enfrenta um problema de gargalo. O número limitado de doadores de pâncreas cadavérico é o principal problema, uma vez que cada paciente com diabetes tipo I requer pelo menos 2-4 doadores de ilhotas. Além disso, o uso a longo prazo de agentes imunossupressores pode causar efeitos colaterais fatais^4,5. Para lidar com isso, o desenvolvimento de uma potencial terapia para diabetes na última década tem focado principalmente na geração de células eficazes produtoras de insulina (IPCs) de várias fontes de células-tronco⁶.

As células-tronco tornaram-se um tratamento alternativo em muitas doenças, incluindo o diabetes tipo I, que é causado pela perda de células beta. O transplante de IPCs é o novo método promissor para o controle da glicemia nesses pacientes⁷. Neste artigo, estão apresentadas duas abordagens para geração de IPCs, protocolos integrativos e não integrativos de indução. O protocolo de indução imitou o processo natural de desenvolvimento pancreático para obter os IPCs amadurecidos e funcionais^8,9.

Para este estudo, os hDPSCs foram caracterizados por citometria de fluxo para detecção de marcadores de superfície MSC, potencial de diferenciação de multilineagem e RT-qPCR para determinar a expressão da propriedade stemness e marcadores genéticos proliferativos (dados não mostrados)^8,9,10. hDPSCs foram induzidos em direção ao endoderme definitivo, endóderme pancreático, endócrina pancreática e células beta pancreáticas ou IPCs(Figura 1), respectivamente⁷. Para induzir as células, uma abordagem de indução de três etapas foi usada como protocolo de espinha dorsal. Este protocolo foi chamado de protocolo não integrativo. No caso do protocolo integrativo, o fator essencial de transcrição pancreática, PDX1,foi superexpresso em hDPSCs seguido pela indução de PDX1 superexpresso em hDPSCs utilizando um protocolo de diferenciação de três etapas. A diferença entre protocolo não integrativo e integrativo é a superexpressão do PDX1 no protocolo integrativo e não no protocolo não integrativo. A diferenciação pancreática foi comparada entre os protocolos integrativos e não integrativos deste estudo.

Este trabalho foi realizado de acordo com a Declaração de Helsinque e aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa Humana, Faculdade de Odontologia da Universidade chulalongkorn. Os DPSCs humanos (hDPSCs) foram isolados de tecidos de polpa dentária humana extraídos tanto de pré-molares quanto de molares devido a problemas de dentes do siso. O consentimento informado foi obtido dos pacientes sob protocolo aprovado (HREC-DCU 2018/054).

1. Protocolo de indução integrativa

1. Preparação do vetor lentiviral que carrega PDX1
   1. Use células de rim embrionário humano (HEK) 293FT para embalagem viral. Cultura e manutenção dessas células no Médio Águia Modificada (DMEM) de Dulbecco suplementado com 10% de soro bovino fetal (FBS), 1% L-glutamina e 1% Antibiótico-Antimycotic.
   2. Gerar vetores PDX1-lentivírus por co-transfecção de 10 μg cada uma das embalagens e plasmídeos de envelope e 20 μg do plasmídeo genético alvo em células HEK293FT usando sistema de transfecção fosfato de cálcio, por exemplo, psPAX2, pMD2. G, e humano pWPT-PDX1¹¹. Certifique-se de que as células são 80%-90% confluentes durante o tempo de infecção.
   3. Colete o meio contendo partículas lentivirais em 48 e 72 h após a transfecção.
   4. Filtrar o meio coletado através de um filtro de 0,45 μm; concentrar os vírus com um filtro centrífuga a 100 kDa nominais de peso molecular (NMWCO).
2. Superexpressão PDX1
   1. Use a passagem 3-5 hDPSC que seja 70-80% confluente. Tentepsinizar e contar as células usando um contador de células. Semente 1 x 10⁶ hDPSCs em um prato tratado de cultura de tecido de 60 mm e incubar durante a noite.
   2. 24 h depois, adicione partículas de vírus frescos obtidas da etapa 1.1.4 para transduzir células pré-tratadas de polibreno (4 μg/mL de polibrene, 30 min abaixo de 37 °C e 5% de CO₂) na multiplicidade desejada de infecção (MOI). Por exemplo, neste caso, o MOI usado é 20. Manter as células na incubadora de cultura celular por 24 h a 37 °C com 5% de CO₂.
   3. Após o período de infecção de 24 horas, descarte o meio contendo partículas virais. Adicione novas mídias culturais e continue crescendo as células por 48 h. Todas as culturas são mantidas a 37 °C e 5% de CO₂.
   4. Verifique a morfologia agregada das células transfeinadas antes de prosseguir para a etapa de indução. A transdução PDX1 é confirmada pela análise de expressão genética(Figura Suplementar 1).
      NOTA: Verifique a morfologia celular sob um microscópio antes de prosseguir para os próximos passos.
   5. Colher e proceder a um protocolo de indução de três etapas (etapa 1.3) como uma abordagem de indução microambiental.
3. Protocolo de indução de três etapas
   NOTA: O protocolo de indução de três etapas resultou na série de diferenciação pancreática de hDPSCs para endoderme definitivo, endoderme/endócrina pancreática e beta-células/IPCs pancreáticos usando meio sem soro (SFM)-A, SFM-B e SFM-C, respectivamente.
   1. Descarte o meio de cultura e, em seguida, lave os fdpscs transduturados com solução tamponada de fosfato 1x (PBS).
   2. Adicione 0,25% de solução trypsin-EDTA às células e incubar por 1 min a 37 °C, 5% de CO₂.
   3. Adicione o meio de cultura para parar a atividade de trippsina e lave suavemente as células para obter a suspensão de célula única. Conte as células e alíquotas 1 x 10⁶ células em cada tubo coletor.
   4. Centrifugar a suspensão celular a 468 x g (Força Centrífuga Relativa: RCF), 4 °C, por 5 min. Descarte o supernatante e salve a pelota da célula.
   5. Resuspenque a pelota em 3 mL do primeiro meio de indução pancreática, ou seja, meio sem soro (SFM)-A. Semente as células em uma placa de cultura de baixa fixação (60 mm). Mantenha as células a 37 °C e 5% de CO₂ por 3 dias.
      NOTA: Observe a morfologia das células sob um microscópio invertido antes de prosseguir para o próximo passo.
   6. Remova o SFM-A e adicione 3 mL do segundo meio de indução, ou seja, SFM-B. Mantenha as células pelos próximos 2 dias a 37 °C, 5% DE CO₂.
      NOTA: Observe a morfologia das células sob um microscópio invertido antes de prosseguir para o próximo passo.
   7. Remova o SFM-B e adicione 3 mL do terceiro meio de indução, ou seja, SFM-C. Manter as células pelos próximos 5 dias em uma incubadora de cultura celular mantida a 37 °C com 5% de CO₂. Troque o meio a cada 48 horas. Observe sua morfologia depois de 5 dias.
      NOTA: Cada meio de indução é complementado com reagentes diferentes como descrito; SFM-A: 1% de albumina de soro bovino (BSA), 1x insulina-transferrina-selênio (ITS), 4 nM de ativação A, 1 nM de butirato de sódio e 50 μM de beta-mercaptoetanol; SFM-B: 1% BSA, 1x ITS e 0,3 mM taurina; e SFM C: 1,5% BSA, 1x ITS, 3 mM taurina, 100 nM de peptídeo semelhante a glucagon (GLP)-1, 1 mM de nicotinamida e 1x aminoácidos não essenciais (NEAAs).
   8. Certifique-se de verificar a morfologia celular sob um microscópio invertido após cada passo. As células se tornarão mais agregadas e flutuarão como colônias.
   9. Colete colônias de células para análise suplementar. Verifique se há morfologia e tamanho da colônia. Realize a análise de expressão de marcador genético pancreático e a análise funcional (ensaio de secreção de C-peptídeo estimulado por glicose).

2. Protocolo de indução não integrativo

NOTA: O protocolo não integrativo é o protocolo backbone para a entrega dos IPCs com o processo de indução de três etapas como abordagem de indução microambiental^8,9.

1. Use a passagem 3-5 hDPSCs a 70%-80% de confluência.
2. Descarte o meio de cultura e lave os hDPSCs com 1x PBS.
3. Adicione 0,25% de solução trypsin-EDTA nas células e incubar por 1 min a 37 °C, 5% DE CO₂.
4. Adicione o meio de cultura para parar a atividade de trippsina e pipeta suavemente as células para obter a suspensão de célula única. Conte células e alíquotas 1 x 10⁶ células em cada tubo de coleta.
   1. Centrifugar a suspensão celular a 468 x g (RCF), 4 °C, 5 min. Descarte o supernatante.
   2. Resuspend a pelota em SFM-A e semente em uma placa de cultura de baixa fixação (60 mm). Cultume as células a 37 °C e 5% de CO₂ por 3 dias. Verifique a morfologia celular sob um microscópio invertido.
   3. Remova o SFM-A, adicione SFM-B (Dia 3) e, em seguida, mantenha as células pelos próximos 2 dias abaixo de 37 °C, 5% DE CO₂.
   4. Remova o SFM-B, adicione SFM-C (Dia 5) e, em seguida, mantenha as células pelos próximos 5 dias abaixo de 37 °C, 5% DE CO₂. O SFM-C é alterado a cada 48 horas.
      NOTA: Cada meio de indução é complementado com reagentes diferentes como descrito; SFM-A: 1% BSA, 1x ITS, 4 nM de ativação A, 1 nM de butirato de sódio e 50 μM de beta-mercaptoetanol; SFM-B: 1% BSA, 1x ITS e 0,3 mM taurina; e SFM C: 1,5% BSA, 1x ITS, 3 mM taurina, 100 nM de GLP-1, 1 mM de nicotinamida e 1x NEAAs.
   5. Certifique-se de verificar a morfologia celular sob o microscópio invertido após cada passo e no dia 10.
      NOTA: As células se tornarão mais agregadas e flutuarão como colônias.
   6. Colete colônias de células para análise suplementar. Verifique se há morfologia e tamanho da colônia. Realize a análise de expressão de marcador genético pancreático e a análise funcional (ensaio de secreção de C-peptídeo estimulado por glicose).

Neste artigo, foram comparados os resultados de ambos os protocolos de indução. Os diagramas de ambos os protocolos de indução são ilustrados na Figura 2A,C. Em ambos os protocolos, a avaliação foi realizada sob um microscópio leve, e as imagens foram analisadas com ImageJ. hDPSCs foram capazes de formar estruturas semelhantes a colônias a partir do primeiro dia de indução em ambos os protocolos de indução. A morfologia da colônia era redonda e densa, e todas as colônias flutuavam nos vasos culturais durante todo o período de indução (Figuras 2B,D). A contagem total de colônias de ambos os protocolos também foi determinada; o resultado mostrou que a contagem total de colônias no caso do protocolo de indução integrativa foi ligeiramente maior em relação ao protocolo de indução não integrativa(Figura 2E). No entanto, a diferença não foi estatisticamente significante. Além disso, também foi avaliada a distribuição do tamanho da colônia em ambos os protocolos de indução (Figura 2F). De acordo com nossos resultados, colônias de pequeno a médio porte foram formadas após a indução integrativa, que foi importante para a redução do núcleo necrosado dentro da colônia.

A análise do marcador genético pancreático foi realizada utilizando-se o RT-qPCR de acordo com nossa recente^{publicação 10}. As informações sobre a lista de primers utilizadas neste estudo estão incluídas na Tabela 1. O valor mRNA foi apresentado como uma expressão relativa de mRNA por normalizado para RNA ribossômico 18S e o controle utilizando a fórmula de 2^(-ΔΔCt). Os resultados deste estudo revelaram que o protocolo de indução integrativa rendeu colônias com alta expressão de marcadores pancreáticos tardios, incluindo ISL-1, MAF-A, GLUT-2, INSULINAe GLP-1R (Figura 3),sugerindo a diferenciação dos HDPSCs em relação aos IPCs. Também foi descrita a avaliação funcional dos IPCs do HDPSC-IPCs (Figura 4) neste estudo. Uma secreção de C-peptídeo estimulante de glicose^8,9 ensaio foi empregado utilizando um kit ELISA. Os resultados mostraram que os protocolos integrativos e não integrativos de indução produziram colônias capazes de segregar c-peptídeos.

Figura 1: Diagrama da diferenciação do MSC em relação aos IPCs. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Morfologia, contagem total de colônias e distribuição do tamanho da colônia de IPCs usando dois protocolos diferentes. Diagrama do protocolo integrativo por superexpressão do fator de transcrição essencial, PDX1, seguido pelo protocolo de indução de trêsíngremes (A). Morfologia dos hDPSCs transfectados em cada etapa de indução (B). Diagrama de não integrativo como protocolo backbone(C). Morfologia de hDPSC-IPCs utilizando o protocolo não integrativo(D). Colônia total(E)e distribuição de tamanho de colônia(F)de dois protocolos diferentes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Análise da expressão genética pancreática dos IPCs hDPSC-IPCs obtidos a partir de dois protocolos diferentes. A expressão mRNA de endoderme pancreático(PDX1 e NGN-3),marcadores de ilhotas pancreáticas(ISL-1, MAF-A, GLUT-2e INSULINA)(B)e marcador relacionado ao pâncreas(GLP-1R)(C). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Análise funcional de hDPSC-IPCs obtidos a partir de dois protocolos diferentes. A secreção de c-peptídeos em cada protocolo de indução, protocolos integrativos (A) e não integrativos(B),foram determinadas por um ensaio de secreção C-peptídeo estimulado por glicose (GSCS). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura suplementar 1: Análise PDX1 mRNA após transdução PDX1. A análise de expressão PDX1 mRNA após 48 h de transdução PDX1 no MOI 20 em hDPSCs é mostrada. Clique aqui para baixar este Arquivo.

Tabela 1: Informações do primer.

Alcançar maior produção de IPCs de MSCs desempenha um papel essencial na terapia do diabetes. As etapas críticas do protocolo integrativo dependem da qualidade das células a serem utilizadas para a transdução e a qualidade das células transduzidas. Alguns requisitos celulares que devem ser verificados para uma transdução bem-sucedida estão garantindo a saúde celular, o gerenciamento de bancos celulares e as células estão em um estado mitoticamente ativo. Além disso, o monitoramento da viabilidade das células transduzidas também desempenha um papel importante. A transdução menos bem sucedida é causada pela baixa viabilidade das células estimuladas¹². Para os protocolos não integrativos, a aparência morfológica e as colônias flutuantes devem ser alcançadas porque estão relacionadas ao amadurecimento da diferenciação pancreática⁹.

Em termos de modificação e solução de problemas da técnica para o protocolo de indução integrativa, células saudáveis e de boa qualidade podem ser obtidas utilizando células nas passagens 3-5 e 70%-80% de confluência, enquanto a qualidade das células transduzidas deve ser monitorada verificando rotineiramente a qualidade das células estimuladas antes de passar para o próximo passo. Esse achado está em correlação com um estudo anterior que mencionou que vários fatores que influenciam a eficiência da transdução dependem da saúde celular, da confluência celular e do número de passagens¹³. Neste estudo, o protocolo não integrativo com um processo de indução de três etapas ainda enfrenta limitações, principalmente no que diz respeito ao tamanho da colônia e à formação de números de colônias. Este resultado é consistente com nosso estudo anterior^8,9. Para superar esse problema, sugerimos verificar a qualidade das células, bem como a qualidade dos vasos de cultura de baixa fixação.

A limitação dessa técnica é a complexidade do protocolo de indução integrativa, que se deveu ao uso de duas plataformas consecutivas diferentes. Além disso, o MOI superior não implica maior eficiência da transdução. Em um estudo semelhante usando transdução de lentivírus, um MOI mais elevado não poderia alcançar melhor eficiência de transdução. Os autores sugerem o uso de um adjuvante como sulfato de protamina¹⁴. As limitações do uso dos protocolos não integrativos estão relacionadas a questões técnicas como as técnicas de manuseio e colheita da colônia e tamanhos variados e estruturas morfológicas dos IPCs produzidos.

O fator de transcrição essencial, PDX1,foi significativo, tendo assim um papel potencial no compromisso da indução do MSC para com os IPCs maduros^15,16,17,18. A modificação do protocolo backbone usando hDPSCs superexpressos PDX1,seguido de um protocolo de indução de três etapas, foi voltada principalmente para a produção bem-sucedida de alta produtividade de IPCs maduros e funcionais^19,20,21. Os achados deste protocolo refletiram que a indução do MSC para IPCs maduros exigia expressão pré-endodêmica do PDX1⁹. A avaliação morfológica mostrou que a estrutura 3D não anexada das colônias poderia ser obtida em ambos os protocolos por meio de vasos de baixa fixação. Essa estrutura foi importante para alcançar o amadurecimento da diferenciação pancreática^7,9,22,23. Além disso, segundo avaliação do tamanho da colônia, o protocolo integrativo resultou em uma tendência positiva do número total de colônias e da produção de colônias de pequeno e médio porte, o que pode impedir um núcleo necrosado da colônia. Portanto, será benéfico para o transplante adicional^{7,19,21,24,25}. A regulação dos marcadores genéticos pancreáticos em estágio final (ISL-1, MAF-A, GLUT-2, INSULINAe GLP-1R) foi observada neste protocolo. Os marcadores genéticos pancreáticos em estágio final no protocolo de indução integrativa foram maiores em comparação com o protocolo backbone. Foi revelado que a superexpressão do PDX1 aumentou o número de progenitores pancreáticos, ou seja, um melhor resultado em termos de progressão do desenvolvimento pancreático de médio para final poderia ser alcançado^19,26,27,28. Além disso, para esclarecer a função dos IPCs, foi realizado um ensaio GSCS. hDPSC-IPCs produzidos a partir de ambos os protocolos secretaram C-peptídeo, sugerindo as colônias funcionalmente ativas.

Para resumir as aplicações futuras da técnica utilizada neste estudo, ambos os protocolos de indução pancreática foram capazes de gerar os IPCs in vitro. Em termos da contagem total de colônias, produção de colônias de pequeno a médio porte e expressão de marcadores pancreáticos, o protocolo integrativo mostrou tendência benéfica para a formação de IPC, apoiando a aplicação adicional de MSC em tratamentos de diabetes baseados em células-tronco para práticas humanas e veterinárias^{7,29,30,31,32}.

Os autores não têm nada a revelar.

SK, WR e QDL foram apoiados pela Unidade veterinária de pesquisa de células-tronco e bioengenharia, Ratchadaphiseksomphot Endowment Fund, Chulalongkorn University. TO e PP foram apoiados pelo Avanço Acadêmico de Chulalongkorn em seu projeto do século^II. CS foi apoiado por uma pesquisa apoiando a bolsa da Faculdade de Ciência Veterinária, o Avanço Acadêmico chulalongkorn em seu projeto do século^2, unidade de pesquisa de células-tronco veterinárias e bioengenharia, Ratchadaphiseksomphot Endowment Fund, Chulalongkorn University e Government Research Fund.