In vitro Induzione di cellule staminali della polpa dentale umana verso lignaggi pancreatici

Questo protocollo presenta un confronto tra due diversi protocolli di induzione per differenziare le cellule staminali della polpa dentale umana (hDPSC) verso le linee pancreatiche in vitro:il protocollo integrativo e il protocollo non integrativo. Il protocollo integrativo genera più cellule produttrici di insulina (IPC).

A partire dal 2000, il successo del trapianto di isole pancreatiche utilizzando il protocollo di Edmonton per il trattamento del diabete mellito di tipo I ha ancora affrontato alcuni ostacoli. Questi includono il numero limitato di donatori di pancreas cadaverico e l'uso a lungo termine di immunosoppressori. Le cellule staminali mesenchimali (MSC) sono state considerate un potenziale candidato come fonte alternativa di generazione di cellule simili a isole. I nostri rapporti precedenti hanno illustrato con successo la creazione di protocolli di induzione per differenziare le cellule staminali della polpa dentale umana (hDPSC) dalle cellule produttrici di insulina (IPC). Tuttavia, l'efficienza di induzione variava notevolmente. In questo articolo, dimostriamo il confronto tra l'efficienza di induzione pancreatica delle hDPSC tramite protocolli di induzione integrativi (microambiente e genetica) e non integrativi (manipolazione microambiente) per la fornitura di IPC derivati da hDPSC (hDPSC-IPC). I risultati suggeriscono un'efficienza di induzione distinta per entrambi gli approcci di induzione in termini di struttura della colonia tridimensionale, resa, marcatori di mRNA pancreatico e proprietà funzionali sulla sfida del glucosio multidosaggio. Questi risultati supporteranno la futura creazione di una piattaforma di produzione di IPC e lignaggio pancreatico clinicamente applicabile.

Il diabete mellito è una preoccupazione globale in corso. Un rapporto dell'International Diabetes Federation (IDF) ha stimato che la prevalenza globale del diabete aumenterebbe da 151 milioni nel 2000 a 415 milioni nel 2015^1,2. L'ultimo studio basato sull'epidemiologia ha previsto che la prevalenza stimata del diabete in tutto il mondo aumenterà da 451 milioni nel 2017 a 693 milioni nel 2045¹. Il successo del trapianto di isole pancreatiche utilizzando il protocollo di Edmonton è stato dimostrato per la prima volta nel 2000, quando è stato dimostrato che mantiene la produzione endogena di insulina e stabilizza la condizione normoglicemica nei pazienti diabetici di tipo I³. Tuttavia, l'applicazione del protocollo di Edmonton deve ancora affrontare un problema di collo di bottiglia. Il numero limitato di donatori di pancreas cadaverico è il problema principale poiché ogni paziente con diabete di tipo I richiede almeno 2-4 donatori di isole. Inoltre, l'uso a lungo termine di agenti immunosoppressivi può causare effetti collaterali potenzialmente letali^4,5. Per affrontare questo problema, lo sviluppo di una potenziale terapia per il diabete nell'ultimo decennio si è concentrato principalmente sulla generazione di cellule produttrici di insulina (IPC) efficaci da varie fonti di cellule staminali⁶.

Le cellule staminali sono diventate un trattamento alternativo in molte malattie, tra cui il diabete di tipo I, che è causato dalla perdita di cellule beta. Il trapianto di IPC è il nuovo metodo promettente per il controllo della glicemia in questi^{pazienti 7}. In questo articolo vengono presentati due approcci per la generazione di IPC, protocolli di induzione integrativi e non integrativi. Il protocollo di induzione ha imitato il naturale processo di sviluppo pancreatico per ottenere le IPC mature e funzionali^8,9.

Per questo studio, le hDPSC sono state caratterizzate da citometria a flusso per il rilevamento di marcatori di superficie MSC, potenziale di differenziazione multilinea e RT-qPCR per determinare l'espressione della proprietà di staminalità e dei marcatori genici proliferativi (dati non mostrati)^8,9,10. Le hDPSC sono state indotte verso l'endoderma definitivo, l'endoderma pancreatico, il pancreas endocrino e le beta-cellule pancreatiche o IPC (Figura 1), rispettivamente⁷. Per indurre le cellule, è stato utilizzato un approccio di induzione in tre fasi come protocollo backbone. Questo protocollo è stato chiamato protocollo non integrativo. Nel caso del protocollo integrativo, il fattore essenziale di trascrizione pancreatica, PDX1, è stato sovraespresso nelle hDPSC seguito dall'induzione di PDX1 sovraespresso nelle hDPSC utilizzando un protocollo di differenziazione in tre fasi. La differenza tra protocollo non integrativo e protocollo integrativo è la sovraespressione di PDX1 nel protocollo integrativo e non nel protocollo non integrativo. La differenziazione pancreatica è stata confrontata tra i protocolli integrativi e non integrativi in questo studio.

Questo lavoro è stato eseguito in conformità con la Dichiarazione di Helsinki e approvato dal Comitato Etico della Ricerca Umana, Facoltà di Odontoiatria, Università Chulalongkorn. Le DPSC umane (hDPSC) sono state isolate dai tessuti della polpa dentale umana estratti sia dai premolari che dai molari a causa di problemi ai denti del giudizio. Il consenso informato è stato ottenuto dai pazienti in base a un protocollo approvato (HREC-DCU 2018/054).

1. Protocollo di induzione integrativa

1. Preparazione del vettore lentivirale che trasporta PDX1
   1. Utilizzare cellule di rene embrionale umano (HEK) 293FT per il confezionamento virale. Coltura e mantenimento di queste cellule nel Modified Eagle Medium (DMEM) di Dulbecco integrato con il 10% di siero bovino fetale (FBS), l'1% di L-glutammina e l'1% di antibiotico-antimicotico.
   2. Generare vettori di PDX1-lentivirusmediante co-trasfezione di 10 μg ciascuno dei plasmidi di imballaggio e involucro e 20 μg del plasmide del gene bersaglio in cellule HEK293FT utilizzando il sistema di trasfezione del fosfato di calcio, ad esempio psPAX2, pMD2. G, e umano pWPT-PDX1¹¹. Assicurarsi che le cellule siano confluenti all'80% -90% durante il periodo di infezione.
   3. Raccogliere il mezzo contenente particelle lentivirali a 48 e 72 ore dopo la trasfezione.
   4. Filtrare il mezzo raccolto attraverso un filtro da 0,45 μm; concentrare i virus con un filtro centrifugo a 100 kDa di peso molecolare nominale cut-off (NMWCO).
2. Sovraespressione PDX1
   1. Utilizzare passaggi 3-5 hDPSC che sono confluenti al 70-80%. Tripsinizzare e contare le cellule usando un contatore di cellule. Semina 1 x 10⁶ hDPSC su un piatto da 60 mm trattato con coltura tissutale e incuba durante la notte.
   2. 24 ore dopo, aggiungere particelle virali fresche ottenute dallo step 1.1.4 per trasdurre cellule pretrattizzate con polibrene (4 μg/mL di polibrene, 30 min sotto i 37 °C e 5% di CO₂₎alla molteplicità desiderata di infezione (MOI). Ad esempio, in questo caso, MOI utilizzato è 20. Mantenere le cellule nell'incubatore di colture cellulari per 24 ore a 37 °C con il 5% di CO₂.
   3. Dopo il periodo di infezione di 24 ore, scartare il mezzo contenente particelle virali. Aggiungere nuovi mezzi di coltura e continuare a far crescere le cellule per 48 ore. Tutte le colture sono mantenute a 37 °C e 5% CO₂.
   4. Controllare la morfologia aggregata delle cellule trasfettate prima di procedere alla fase di induzione. La trasduzione della PDX1 è confermata dall'analisi dell'espressionegenica ( Figura supplementare 1).
      NOTA: Controllare la morfologia cellulare al microscopio prima di procedere ai passaggi successivi.
   5. Raccogliere e procedere a un protocollo di induzione in tre fasi (fase 1.3) come approccio di induzione microambiente.
3. Protocollo di induzione in tre fasi
   NOTA: Il protocollo di induzione in tre fasi ha portato alla serie di differenziazione pancreatica delle hDPSC in endoderma definitivo, endoderma pancreatico/endocrino e beta-cellule/IPC pancreatiche utilizzando rispettivamente il mezzo privo di siero (SFM)-A, SFM-B e SFM-C.
   1. Scartare il terreno di coltura e quindi lavare le hDPSC trasdotte con 1x soluzione tamponata con fosfato (PBS).
   2. Aggiungere la soluzione di tripsina-EDTA allo 0,25% alle cellule e incubare per 1 minuto a 37 °C, 5% CO₂.
   3. Aggiungere il terreno di coltura per interrompere l'attività della tripsina e lavare delicatamente le cellule per ottenere la sospensione a singola cellula. Contare le cellule e aliquote 1 x 10⁶ celle in ogni tubo di raccolta.
   4. Centrifugare la sospensione cellulare a 468 x g (Forza Centrifuga Relativa: RCF), 4 °C, per 5 min. Scartare il surnatante e salvare il pellet cellulare.
   5. Ripresa del pellet in 3 mL di primo mezzo di induzione pancreatica, cioè mezzo privo di siero (SFM)-A. Seminare le cellule su una piastra di coltura a basso attacco (60 mm). Mantenere le celle a 37 °C e 5% CO₂ per 3 giorni.
      NOTA: Osservare la morfologia delle cellule al microscopio invertito prima di procedere al passaggio successivo.
   6. Rimuovere SFM-A e aggiungere 3 ml del secondo mezzo di induzione, cioè SFM-B. Mantenere le celle per i prossimi 2 giorni a 37 °C, 5% CO₂.
      NOTA: Osservare la morfologia delle cellule al microscopio invertito prima di procedere al passaggio successivo.
   7. Rimuovere SFM-B e aggiungere 3 mL del terzo mezzo di induzione, cioè SFM-C. Mantenere le cellule per i successivi 5 giorni in un incubatore di colture cellulari mantenuto a 37 °C con il 5% di CO₂. Cambiare il mezzo ogni 48 ore. Osservare la loro morfologia dopo 5 giorni.
      NOTA: Ogni mezzo di induzione è integrato con diversi reagenti come descritto; SFM-A: 1% albumina sierica bovina (BSA), 1x insulina-transferrina-selenio (ITS), 4 nM di activina A, 1 nM di butirrato di sodio e 50 μM di beta-mercaptoetanolo; SFM-B: 1% BSA, 1x ITS e 0,3 mM taurina; e SFM C: 1,5% BSA, 1x ITS, 3 mM taurina, 100 nM di peptide glucagone-simile (GLP)-1, 1 mM nicotinamide e 1x aminoacidi non essenziali (NEAA).
   8. Assicurati di controllare la morfologia cellulare al microscopio invertito dopo ogni passaggio. Le cellule diventeranno più aggregate e galleggieranno come colonie.
   9. Raccogliere colonie cellulari per ulteriori analisi. Controlla la morfologia e le dimensioni della colonia. Eseguire l'analisi dell'espressione del marcatore genico pancreatico e l'analisi funzionale (test di secrezione del peptide C stimolato dal glucosio).

2. Protocollo di induzione non integrativo

NOTA: Il protocollo non integrativo è il protocollo backbone per la fornitura degli IPC con il processo di induzione in tre fasi come approccio di induzione microambiente^8,9.

1. Utilizzare passaggi 3-5 hDPSC al 70% -80% di confluenza.
2. Scartare il terreno di coltura e lavare le hDPPC con 1x PBS.
3. Aggiungere la soluzione di tripsina-EDTA allo 0,25% sulle cellule e incubare per 1 minuto a 37 °C, 5% CO₂.
4. Aggiungere il terreno di coltura per fermare l'attività della tripsina e pipettare delicatamente le cellule per ottenere la sospensione a singola cellula. Contare le cellule e aliquota 1 x 10⁶ celle in ciascun tubo di raccolta.
   1. Centrifugare la sospensione cellulare a 468 x g (RCF), 4 °C, 5 min. Scartare il surnatante.
   2. Risuppendi il pellet in SFM-A e semina su una piastra di coltura a basso attacco (60 mm). Colturare le cellule a 37 °C e 5% CO₂ per 3 giorni. Controllare la morfologia cellulare al microscopio invertito.
   3. Rimuovere SFM-A, aggiungere SFM-B (Giorno 3) e quindi mantenere le cellule per i prossimi 2 giorni sotto i 37 °C, 5% CO₂.
   4. Rimuovere SFM-B, aggiungere SFM-C (Giorno 5) e quindi mantenere le cellule per i prossimi 5 giorni sotto i 37 °C, 5% CO₂. SFM-C viene cambiato ogni 48 ore.
      NOTA: Ogni mezzo di induzione è integrato con diversi reagenti come descritto; SFM-A: 1% BSA, 1x ITS, 4 nM di activina A, 1 nM di butirrato di sodio e 50 μM di beta-mercaptoetanolo; SFM-B: 1% BSA, 1x ITS e 0,3 mM taurina; e SFM C: 1,5% BSA, 1x ITS, 3 mM taurina, 100 nM di GLP-1, 1 mM nicotinamide e 1x NEAA.
   5. Assicurati di controllare la morfologia cellulare al microscopio invertito dopo ogni passaggio e al giorno 10.
      NOTA: le cellule diventeranno più aggregate e fluttueranno come colonie.
   6. Raccogliere colonie cellulari per ulteriori analisi. Controlla la morfologia e le dimensioni della colonia. Eseguire l'analisi dell'espressione del marcatore genico pancreatico e l'analisi funzionale (test di secrezione del peptide C stimolato dal glucosio).

In questo articolo, sono stati confrontati i risultati di entrambi i protocolli di induzione. I diagrammi di entrambi i protocolli di induzione sono illustrati in Figura 2A,C. In entrambi i protocolli, la valutazione è stata eseguita al microscopio ottico e le immagini sono state analizzate con ImageJ. Le hDPSC sono state in grado di formare strutture simili a colonie dal primo giorno di induzione in entrambi i protocolli di induzione. La morfologia della colonia era rotonda e densa, e tutte le colonie galleggiavano nei vasi di coltura per tutto il periodo di induzione (Figure 2B,D). È stato anche determinato il conteggio totale delle colonie di entrambi i protocolli; il risultato ha mostrato che il conteggio totale delle colonie nel caso del protocollo di induzione integrativa era leggermente superiore rispetto al protocollo di induzione non integrativa (Figura 2E). Tuttavia, la differenza non era statisticamente significativa. Inoltre, è stata valutata anche la distribuzione dimensionale della colonia in entrambi i protocolli di induzione (Figura 2F). Secondo i nostri risultati, colonie di piccole e medie dimensioni si sono formate sull'induzione integrativa, che era importante per ridurre il nucleo necrotico all'interno della colonia.

L'analisi dei marcatori genici pancreatici è stata condotta utilizzando RT-qPCR secondo la nostra recente pubblicazione¹⁰. Le informazioni sull'elenco dei primer utilizzati in questo studio sono incluse nella Tabella 1. Il valore dell'mRNA è stato presentato come un'espressione relativa di mRNA normalizzata a 18S RNA ribosomiale e il controllo utilizzando la formula di 2^(-ΔΔCt). I risultati di questo studio hanno rivelato che il protocollo di induzione integrativa ha prodotto colonie con alta espressione di marcatori pancreatici tardivi, tra cui ISL-1, MAF-A, GLUT-2, INSULINAe GLP-1R (Figura 3), suggerendo la differenziazione delle hDPSC verso iPC. In questo studio è stata descritta anche la valutazione funzionale delle hDPSC-IPC (Figura 4). Un test di secrezione di peptide C^8,9 che stimola il glucosio è stato impiegato utilizzando un kit ELISA. I risultati hanno mostrato che i protocolli di induzione integrativi e non integrativi producevano colonie in grado di secernere il peptide C.

Figura 1: Diagramma della differenziazione MSC verso gli IPC. Fare clic qui per visualizzare una versione più ampia di questa figura.

Figura 2: Morfologia, conteggio totale delle colonie e distribuzione delle dimensioni della colonia degli IPC utilizzando due diversi protocolli. Diagramma del protocollo integrativo per sovraespressione del fattore di trascrizione essenziale, PDX1, seguito dal protocollo di induzione a tre ripidi (A). Morfologia delle hDPSC trasfettate in ogni fase di induzione (B). Diagramma di protocollo non integrativo come backbone (C). Morfologia degli hDPSC-IPC utilizzando il protocollo non integrativo (D). Colonia totale (E) e distribuzione delle dimensioni della colonia (F) di due diversi protocolli. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Analisi dell'espressione genica pancreatica di hDPSC-IPC ottenuta da due diversi protocolli. È stata analizzata l'espressione dell'mRNA dell'endoderma pancreatico (PDX1 e NGN-3) (A), dei marcatori delle isole pancreatiche (ISL-1, MAF-A, GLUT-2e INSULINA) (B) e del marcatore pancreatico correlato (GLP-1R) (C). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Analisi funzionale di hDPSC-IPC ottenuti da due diversi protocolli. La secrezione di peptidi C in ciascun protocollo di induzione, protocolli integrativi (A) e non integrativi (B), sono stati determinati da un test di secrezione di peptide C stimolato dal glucosio (GSCS). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 1 supplementare: Analisi dell'mRNA PDX1 dopo trasduzione PDX1. Viene mostrata l'analisi dell'espressione di mRNA PDX1 dopo 48 ore di trasduzione PDX1 a MOI 20 in hDPSC. Fare clic qui per scaricare questo file.

Tabella 1: Informazioni introduttive.

Ottenere una maggiore produzione di IPC da MSC svolge un ruolo essenziale nella terapia del diabete. I passaggi critici del protocollo integrativo si basano sulla qualità delle cellule da utilizzare per la trasduzione e sulla qualità delle cellule trasdotte. Alcuni requisiti cellulari che dovrebbero essere controllati per una trasduzione di successo stanno garantendo la salubrità cellulare, la gestione della banca cellulare e le cellule sono in uno stato mitoticamente attivo. Inoltre, anche il monitoraggio della vitalità delle cellule trasdotte svolge un ruolo importante. La trasduzione meno efficace è causata dalla scarsa vitalità delle cellule stimolate¹². Per i protocolli non integrativi, l'aspetto morfologico e le colonie galleggianti dovrebbero essere raggiunti perché sono correlati alla maturazione del differenziamento pancreatico⁹.

In termini di modifica e risoluzione dei problemi della tecnica per il protocollo di induzione integrativa, cellule sane e di buona qualità possono essere ottenute utilizzando cellule nei passaggi 3-5 e 70%-80% di confluenza, mentre la qualità delle cellule trasdotte deve essere monitorata controllando regolarmente la qualità delle cellule stimolate prima di passare alla fase successiva. Questo risultato è in correlazione con uno studio precedente che ha menzionato che diversi fattori che influenzano l'efficienza della trasduzione si basano sulla salute cellulare, sulla confluenza cellulare e sul numero di passaggi¹³. In questo studio, il protocollo non integrativo con un processo di induzione in tre fasi deve ancora affrontare limitazioni, principalmente per quanto riguarda le dimensioni della colonia e la formazione del numero di colonie. Questo risultato è coerente con il nostro precedente studio^8,9. Per superare questo problema, suggeriamo di controllare la qualità delle cellule e la qualità dei vasi di coltura a basso attacco.

Il limite di questa tecnica è la complessità del protocollo di induzione integrativa, che era dovuto all'uso di due diverse piattaforme consecutive. Inoltre, il MOI più elevato non implica una maggiore efficienza di trasduzione. In uno studio simile che utilizza la trasduzione del lentivirus, un MOI più elevato non è riuscito a ottenere una migliore efficienza di trasduzione. Gli autori suggeriscono di utilizzare un adiuvante come la protamina solfato¹⁴. I limiti dell'utilizzo dei protocolli non integrativi sono legati a questioni tecniche come le tecniche di manipolazione per la produzione e la raccolta della colonia e le diverse dimensioni e strutture morfologiche degli IPC prodotti.

Il fattore di trascrizione essenziale, PDX1,era significativo, avendo così un ruolo potenziale nell'impegno dell'induzione MSC verso gli IPC maturi^15,16,17,18. La modifica del protocollo backbone utilizzando hDPPC PDX1-overexpressedseguita da un protocollo di induzione in tre fasi era principalmente finalizzata alla produzione ad alto rendimento di IPC maturi e funzionali^19,20,21. I risultati di questo protocollo riflettevano che l'induzione di MSC verso IPC maturi richiedeva l'espressione pre-endodermica di PDX1⁹. La valutazione morfologica ha mostrato che la struttura 3D non attaccata delle colonie potrebbe essere ottenuta in entrambi i protocolli utilizzando vasi a basso attacco. Questa struttura è stata importante per raggiungere la maturazione del differenziamento^{pancreatico7,9,22,23.} Inoltre, secondo la valutazione delle dimensioni della colonia, il protocollo integrativo ha determinato un trend positivo del numero totale di colonie e della produzione di colonie di piccole e medie dimensioni, che può impedire un nucleo necrotico della colonia. Pertanto, sarà utile per ulteriori^{trapianti 7,19,21,24,25}. In questo protocollo è stata osservata la sovraregolazione dei marcatori genici pancreatici in stadio avanzato(ISL-1, MAF-A, GLUT-2, INSULINe GLP-1R). I marcatori genici pancreatici in fase avanzata nel protocollo di induzione integrativa erano più alti rispetto al protocollo backbone. È stato rivelato che la sovraespressione di PDX1 ha aumentato il numero di progenitori pancreatici, cioè un risultato migliore in termini di progressione dello sviluppo pancreatico in stadio medio-avanzato potrebbe essere raggiunto^19,26,27,28. Inoltre, per chiarire la funzione degli IPC, è stato eseguito un test GSCS. hDPSC-IPC prodotti da entrambi i protocolli hanno secreto il peptide C, suggerendo le colonie funzionalmente attive.

Per riassumere le future applicazioni della tecnica utilizzata in questo studio, entrambi i protocolli di induzione pancreatica sono stati in grado di generare gli IPC in vitro. In termini di numero totale di colonie, produzione di colonie di piccole e medie dimensioni ed espressione di marcatori pancreatici, il protocollo integrativo ha mostrato una tendenza benefica per la formazione di IPC, supportando un'ulteriore applicazione di MSC nei trattamenti del diabete a base di cellule staminali per pratiche umane e veterinarie^{7,29,30,31,32.}

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

SK, WR e QDL sono stati supportati dall'Unità di ricerca sulle cellule staminali veterinarie e la bioingegneria, Ratchadaphiseksomphot Endowment Fund, Chulalongkorn University. TO e PP sono stati supportati da Chulalongkorn Academic Advancement nel suo progetto^{del 2 °} secolo. CS è stato supportato da una sovvenzione di supporto alla ricerca della Facoltà di Scienze Veterinarie, Chulalongkorn Academic Advancement into Its 2^nd Century Project, Veterinary Stem Cell and Bioengineering Research Unit, Ratchadaphiseksomphot Endowment Fund, Chulalongkorn University e Government Research Fund.