במבחנה אינדוקציה של תאי גזע עיסת שיניים אנושית לכיוון שושלות הלבלב

פרוטוקול זה מציג השוואה בין שני פרוטוקולי אינדוקציה שונים להבחנה בין תאי גזע עיסת שיניים אנושית (hDPSCs) כלפי שושלות הלבלב במבחנה: הפרוטוקול האינטגרטיבי והפרוטוקול הלא אינטגרטיבי. הפרוטוקול האינטגרטיבי מייצר יותר תאים המייצרים אינסולין (IPCs).

נכון ל-2000, ההצלחה של השתלת אי הלבלב באמצעות פרוטוקול אדמונטון לטיפול בסוכרת מסוג I עדיין נתקלה בכמה מכשולים. אלה כוללים את המספר המוגבל של תורמי לבלב cadaveric ואת השימוש ארוך הטווח של מדכאי חיסון. תאי גזע מזנכימליים (MSCs) נחשבו למועמד פוטנציאלי כמקור חלופי ליצירת תאים דמויי איון. הדו"חות הקודמים שלנו המחישו בהצלחה את הקמתם של פרוטוקולי אינדוקציה להבחנה בין תאי גזע עיסת שיניים אנושית (hDPSCs) לתאים מייצרי אינסולין (IPCs). עם זאת, יעילות האינדוקציה השתנתה מאוד. במאמר זה, אנו מדגימים את ההשוואה של יעילות אינדוקציה בלבלב hDPSCs באמצעות אינטגרטיבית (מניפולציה מיקרו-וירונימנטלית וגנטית) ופרוטוקולי אינדוקציה לא אינטגרטיביים (מניפולציה מיקרו-וירונימנטלית) לאספקת IPCs שמקורם ב- hDPSC (hDPSC-IPCs). התוצאות מצביעות על יעילות אינדוקציה ברורה הן עבור גישות האינדוקציה במונחים של מבנה מושבה תלת מימדי, תשואה, סמני mRNA הלבלב, ורכוש פונקציונלי על אתגר גלוקוז מרובה מינון. ממצאים אלה יתמכו בהקמה עתידית של IPCs ופלטפורמת ייצור שושלת לבלב ישימים קלינית.

סוכרת היא דאגה גלובלית מתמשכת. דו"ח של הפדרציה הבינלאומית לסוכרת (צה"ל) העריך כי השכיחות העולמית של סוכרת תגדל מ-151 מיליון בשנת 2000 ל-415 מיליון בשנת 2015^1,2. המחקר האחרון המבוסס על אפידמיולוגיה חזה כי שכיחות הסוכרת העולמית המשוערת תגדל מ -451 מיליון בשנת 2017 ל -693 מיליון בשנת 2045¹. ההצלחה של השתלת אי הלבלב באמצעות פרוטוקול אדמונטון הודגמה לראשונה בשנת 2000, כאשר הוכח לשמור על ייצור אינסולין אנדוגני ולייצב את המצב הנורמוגליקמי בסוג I חולי סוכרת³. עם זאת, היישום של פרוטוקול אדמונטון עדיין מתמודד עם בעיה צוואר בקבוק. המספר המוגבל של תורמי לבלב cadaveric הוא הבעיה העיקרית שכן כל חולה עם סוכרת מסוג I דורש לפחות 2-4 תורמי איון. יתר על כן, השימוש ארוך הטווח של סוכנים מדכאי חיסון עלול לגרום לתופעות לוואי מסכנות חיים^4,5. כדי להתמודד עם זה, הפיתוח של טיפול פוטנציאלי לסוכרת בעשור האחרון התמקד בעיקר ביצירת תאים יעילים לייצור אינסולין (IPCs) ממקורות שונים של תאי גזע⁶.

תאי גזע הפכו לטיפול אלטרנטיבי במחלות רבות, כולל סוכרת מסוג I, אשר נגרמת על ידי אובדן של תאי בטא. השתלת IPCs היא השיטה המבטיחה החדשה לשליטה גלוקוז בדם בחולים אלה⁷. במאמר זה מוצגות שתי גישות ליצירת IPCs, פרוטוקולי אינדוקציה אינדוקטיביים ולא אינטגרטיביים. פרוטוקול האינדוקציה חיקה את התהליך ההתפתחותי הטבעי של הלבלב כדי לקבל את IPCs^8,9בוגרים ופונקציונליים .

עבור מחקר זה, hDPSCs התאפיינו בציטומטריית זרימה עבור זיהוי סמן משטח MSC, פוטנציאל בידול מרובה שורות, ו- RT-qPCR כדי לקבוע את הביטוי של מאפיין גזענות וסמני גנים נפוצים (נתונים שאינם מוצגים)^8,9,10. hDPSCs הושרו לקראת אנדודרם סופי, אנדודרם הלבלב, אנדוקריני הלבלב, ותאי בטא הלבלב או IPCs (איור 1), בהתאמה⁷. כדי לגרום לתאים, גישת אינדוקציה בת שלושה שלבים שימשה לפרוטוקול עמוד השדרה. פרוטוקול זה נקרא פרוטוקול לא אינטגרטיבי. במקרה של פרוטוקול אינטגרטיבי, גורם שעתוק הלבלב החיוני, PDX1, התבטא יתר על המידה ב- hDPSCs ואחריו אינדוקציה של PDX1 בלחץ יתר ב- hDPSCs באמצעות פרוטוקול בידול של שלושה שלבים. ההבדל בין פרוטוקול לא אינטגרטיבי ואינטגרטיבי הוא ביטוי יתר של PDX1 בפרוטוקול אינטגרטיבי ולא בפרוטוקול הלא-אינטגרטיבי. ההבחנה בלבלב הושוותה בין הפרוטוקולים האינטגרטיביים והלא אינטגרטיביים במחקר זה.

עבודה זו בוצעה בהתאם להצהרת הלסינקי ואושרה על ידי ועדת האתיקה לחקר האדם, הפקולטה לרפואת שיניים, אוניברסיטת צ'ולאלונגקורן. DPSCs אנושי (hDPSCs) היו מבודדים מרקמות עיסת שיניים אנושיות שחולצו הן premolars והן שיניים שיניים עקב בעיות שיני בינה. הסכמה מדעת התקבלה מהמטופלים על פי פרוטוקול מאושר (HREC-DCU 2018/054).

1. פרוטוקול אינדוקציה אינדוקטיבי

1. הכנת וקטור lentiviral נושא PDX1
   1. השתמש בכליות עובריות אנושיות (HEK) 293FT תאים לאריזה ויראלית. תרבית ושמירה על תאים אלה במדיום הנשר המותנה (DMEM) של דולבק בתוספת סרום בקר עוברי 10%, 1% L-גלוטמין ו-1% אנטי-אנטי-מיקוטיק.
   2. צור PDX1-lentivirus וקטורים על ידי transfection משותף של 10 מיקרוגרם כל אחד מהפלסטידים אריזה ומעטפת ו 20 מיקרוגרם של פלסמיד הגן הממוקד לתוך תאי HEK293FT באמצעות מערכת טרנספקטיון פוספט סידן, למשל, psPAX2, pMD2. G, ו PWPT-PDX1^{אנושי 11.} ודא כי התאים הם 80%-90% מפגש בזמן ההדבקה.
   3. לאסוף את המדיום המכיל חלקיקים lentiviral ב 48 ו 72 שעות לאחר transfection.
   4. לסנן את המדיום שנאסף באמצעות מסנן 0.45 מיקרומטר; לרכז את הווירוסים עם מסנן צנטריפוגלי ב 100 kDa נומינלי משקל מולקולרי לחתוך (NMWCO).
2. ביטוי יתר של PDX1
   1. השתמש במעבר 3-5 hDPSC כי הם 70-80% confluent. Trypsinize וספור את התאים באמצעות מונה תאים. זרע 1 x 10⁶ hDPSCs על צלחת 60 מ"מ תרבית טיפול רקמות ודגרה לילה.
   2. 24 שעות מאוחר יותר, להוסיף חלקיקי וירוס טריים המתקבלים בשלב 1.1.4 כדי להעביר תאים פוליברן שטופלו מראש (4 מיקרוגרם / מ"ל polybrene, 30 דקות תחת 37 °C ו 5% CO₂) בריבוי הרצוי של זיהום (MOI). לדוגמה, במקרה זה, MOI בשימוש הוא 20. לשמור על התאים באינקובטור תרבית התא במשך 24 שעות ב 37 °C (5% CO_2).
   3. לאחר תקופת ההדבקה של 24 שעות, יש להשליך את המדיום המכיל חלקיקים ויראליים. הוסף מדיה תרבית טרי ולהמשיך לגדל את התאים עבור 48 שעות. כל התרבויות נשמרות ב 37 °C (5°F) ו 5% CO_2.
   4. בדוק את המורפולוגיה המצטברת של התאים שהודבקו לפני שתמשיך לשלב האינדוקציה. התמרה PDX1 מאושרת על ידי ניתוח ביטויגנים (איור 1 משלים).
      הערה: בדוק את מורפולוגיית התא תחת מיקרוסקופ לפני שתמשיך לשלבים הבאים.
   5. לקצור ולהמשיך לפרוטוקול אינדוקציה של שלושה שלבים (שלב 1.3) כגישת אינדוקציה מיקרו-ויראלית.
3. פרוטוקול אינדוקציה תלת-שלטי
   הערה: פרוטוקול האינדוקציה בן שלושת השלבים הביא לסדרה של בידול הלבלב של hDPSCs לאנדודרם מוחלט, אנדודרם/אנדוקרין של הלבלב ותאי בטא/IPCs בלבלב באמצעות מדיום ללא סרום (SFM)-A, SFM-B ו- SFM-C, בהתאמה.
   1. השלך את מדיום התרבות ולאחר מכן לשטוף את transduced-hDPSCs עם פתרון 1x פוספט-חוצץ (PBS).
   2. הוסף 0.25% פתרון טריפסין-EDTA לתאים ודגר במשך דקה אחת ב 37 °C (5%), 5% CO₂.
   3. הוסף את מדיום התרבות כדי לעצור את פעילות טריפסין ולשטוף בעדינות את התאים כדי לקבל את ההשעיה של תא בודד. לספור את התאים aliquot 1 x 10⁶ תאים לתוך כל צינור איסוף.
   4. צנטריפוגה השעיית התא ב 468 x גרם (כוח צנטריפוגלי יחסי: RCF), 4 °C (5 דקות). להשליך את supernatant ולשמור את גלולה התא.
   5. Resuspend הכדור ב 3 מ"ל של מדיום אינדוקציה הלבלב הראשון, כלומר, בינוני ללא סרום (SFM)-A. זרע את התאים על צלחת תרבות התקשרות נמוכה (60 מ"מ). לשמור על התאים ב 37 °C (5%) ו 5% CO₂ במשך 3 ימים.
      הערה: התבונן במורפולוגיה של תאים תחת מיקרוסקופ הפוך לפני שתמשיך לשלב הבא.
   6. הסר SFM-A ולהוסיף 3 מ"ל של מדיום האינדוקציה השני, כלומר, SFM-B. לשמור על התאים במשך 2 הימים הבאים ב 37 °C (5°F), 5% CO₂.
      הערה: התבונן במורפולוגיה של תאים תחת מיקרוסקופ הפוך לפני שתמשיך לשלב הבא.
   7. הסר SFM-B והוסף 3 מ"ל של מדיום האינדוקציה השלישי, כלומר, SFM-C. לשמור על התאים במשך 5 הימים הבאים בחממה תרבית התא נשמר ב37 °C (5%) החליפו את המדיום כל 48 שעות. שימו לב למורפולוגיה שלהם לאחר 5 ימים.
      הערה: כל מדיום אינדוקציה מתווסף עם ריאגנטים שונים כמתואר; SFM-A: 1% אלבומין סרום בקר (BSA), 1x אינסולין-טרנספרין-סלניום (ITS), 4 ננומטר של activin A, 1 ננומטר של נתרן butyrate, ו 50 מיקרומטר של בטא-mercaptoethanol; SFM-B: 1% BSA, 1x ITS, ו 0.3 mM טאורין; ו-SFM C: 1.5% BSA, 1x ITS, טאורין 3 מ"מ, 100 ננומטר של פפטיד דמוי גלוקגון (GLP)-1, 1 mM nicotinamide ו-1x חומצות אמינו לא חיוניות (NEAAs).
   8. הקפד לבדוק את מורפולוגיית התא תחת מיקרוסקופ הפוך לאחר כל שלב. התאים יהפכו למצטברים יותר ויצופו כמושבות.
   9. לאסוף מושבות תאים לניתוח נוסף. בדוק אם יש מורפולוגיה וגודל של המושבה. בצע ניתוח ביטוי סמן גן הלבלב וניתוח פונקציונלי (גלוקוז מגורה C-פפטיד הפרשת ישבן).

2. פרוטוקול אינדוקציה לא אינטגרטיבי

הערה: הפרוטוקול הלא-אינטגרטיבי הוא פרוטוקול עמוד השדרה להעברת ה- IPCs עם תהליך האינדוקציה בן שלושת השלבים כגישת אינדוקציה מיקרו-ויראלית^8,9.

1. השתמש במעבר 3-5 hDPSCs ב 70%-80% השפעה.
2. השלך את מדיום התרבות ושטוף hDPSCs עם PBS 1x.
3. הוסף 0.25% פתרון טריפסין-EDTA על התאים ודגר במשך 1 דקות ב 37 °C (5%), 5% CO₂.
4. הוסף את המדיום התרבותי כדי לעצור את פעילות טריפסין ולחבר בעדינות את התאים כדי להשיג את ההשעיה של תא בודד. לספור תאים aliquot 1 x 10⁶ תאים לתוך כל צינור איסוף.
   1. צנטריפוגה השעיית התא ב 468 x גרם (RCF), 4 °C (5 °F), 5 דקות. זרוק את סופר-טבעי.
   2. יש להזרים מחדש את הכדור ב-SFM-A ולזרוע על צלחת תרבות נמוכה (60 מ"מ). תרבית התאים ב 37 °C (5%) ו 5% CO₂ במשך 3 ימים. בדוק את מורפולוגיית התא תחת מיקרוסקופ הפוך.
   3. הסר SFM-A, הוסף SFM-B (יום 3) ולאחר מכן לשמור על התאים במשך 2 הימים הבאים תחת 37 °C (5°F), 5% CO₂.
   4. הסר SFM-B, הוסף SFM-C (יום 5) ולאחר מכן לשמור על התאים במשך 5 הימים הבאים תחת 37 °C (5 °F), 5% CO₂. SFM-C משתנה כל 48 שעות.
      הערה: כל מדיום אינדוקציה מתווסף עם ריאגנטים שונים כמתואר; SFM-A: 1% BSA, 1x ITS, 4 ננומטר של activin A, 1 ננומטר של נתרן butyrate, ו 50 מיקרומטר של בטא-mercaptoethanol; SFM-B: 1% BSA, 1x ITS, ו 0.3 mM טאורין; ו- SFM C: 1.5% BSA, 1x ITS, טאורין 3 מ"מ, 100 ננומטר של GLP-1, 1 mM ניקוטינאמיד ו- 1x NEAAs.
   5. הקפד לבדוק את מורפולוגיית התא תחת המיקרוסקופ ההפוך לאחר כל שלב וביום 10.
      הערה: התאים יהפכו לצבורים יותר ויצופו כמושבות.
   6. לאסוף מושבות תאים לניתוח נוסף. בדוק אם יש מורפולוגיה וגודל של המושבה. בצע ניתוח ביטוי סמן גן הלבלב וניתוח פונקציונלי (גלוקוז מגורה C-פפטיד הפרשת ישבן).

במאמר זה הושוו התוצאות של שני פרוטוקולי האינדוקציה. הדיאגרמות של שני פרוטוקולי האינדוקציה מודגמות באיור 2A, C. בשני הפרוטוקולים, ההערכה בוצעה תחת מיקרוסקופ אור, ותמונות נותחו עם ImageJ. hDPSCs הצליחו ליצור מבנים דמויי מושבה מהיום הראשון של אינדוקציה בשני פרוטוקולי האינדוקציה. המורפולוגיה של המושבה הייתה עגולה וצפופה, וכל המושבות צפו בכלי התרבות לאורך כל תקופת האינדוקציה(איורים 2B,D). כמו כן נקבעה ספירת המושבות הכוללת של שני הפרוטוקולים; התוצאה הראתה כי ספירת המושבות הכוללת במקרה של פרוטוקול אינדוקציה אינדוקטיבי הייתה מעט גבוהה יותר בהשוואה לפרוטוקול האינדוקציה הלא-אינטגרטיבי (איור 2E). עם זאת, ההבדל לא היה מובהק סטטיסטית. יתר על כן, התפלגות גודל המושבה בשני פרוטוקולי האינדוקציה הוערכה גם היא (איור 2F). על פי התוצאות שלנו, מושבות קטנות עד בינוניות נוצרו על אינדוקציה אינטגרטיבית, אשר היה חשוב להפחתת הליבה הנמק בתוך המושבה.

ניתוח סמן גנים הלבלב נערך באמצעות RT-qPCR על פי הפרסום האחרון שלנו¹⁰. מידע על רשימת הפריימרים המשמשים במחקר זה נכלל בטבלה 1. ערך ה- mRNA הוצג כביטוי mRNA יחסי על-ידי נרמול ל- RNA ריבוזומלי של 18S והפקד באמצעות הנוסחה של 2^(-ΔΔCt). תוצאות מחקר זה גילו כי פרוטוקול האינדוקציה האינטגרטיבי הניב מושבות עם ביטוי גבוה של סמני לבלב מאוחרים, כולל ISL-1, MAF-A, GLUT-2, אינסולין, ו- GLP-1R (איור 3), מה שמרמז על בידול של hDPSCs ל- IPCs. ההערכה התפקודית של hDPSC-IPCs תוארה גם היא (איור 4) במחקר זה. הפרשת C-פפטיד מגרה גלוקוז^8,9 בדיקת הועסקה באמצעות ערכת ELISA. התוצאות הראו כי פרוטוקולי האינדוקציה האינטגרטיביים והלא אינטגרטיביים הניבו מושבות שהצליחו להפריש C-פפטיד.

איור 1: דיאגרמה של בידול MSC כלפי IPCs. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2:מורפולוגיה, ספירת מושבות כוללת והתפלגות גודל המושבה של IPCs באמצעות שני פרוטוקולים שונים. דיאגרמה של הפרוטוקול האינטגרטיבי על ידי ביטוי יתר של גורם תמלול חיוני, PDX1, ואחריו פרוטוקול אינדוקציה תלת תלול (A). מורפולוגיה של hDPSCs transfected בכל שלב של אינדוקציה (B). דיאגרמה של לא אינטגרטיבית כפרוטוקול עמוד שדרה (C). מורפולוגיה של hDPSC-IPCs באמצעות הפרוטוקול הלא אינטגרטיבי (D). התפלגות גודל המושבה הכוללת (E) וגודל המושבה (F) של שני פרוטוקולים שונים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: ניתוח ביטוי גנים בלבלב של hDPSC-IPCs שהתקבל משני פרוטוקולים שונים. ביטוי ה- mRNA של אנדודרם הלבלב (PDX1 ו- NGN-3) (A), סמני אי הלבלב (ISL-1, MAF-A, GLUT-2 ו- INSULIN) (B), וסמן הקשור ללבלב (GLP-1R) (C) נותח. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: ניתוח פונקציונלי של hDPSC-IPCs שהתקבל משני פרוטוקולים שונים. הפרשת C-פפטיד בכל פרוטוקול אינדוקציה, פרוטוקולים אינטגרטיביים (A) ולא אינטגרטיביים (B), נקבעו על ידי בדיקת הפרשת C-פפטיד מגורה גלוקוז (GSCS). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור משלים 1: ניתוח PDX1 mRNA לאחר התמרה PDX1. מוצג ניתוח ביטוי PDX1 mRNA לאחר 48 שעות של התמלת PDX1 ב- MOI 20 ב- hDPSCs מוצג. נא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

טבלה 1: מידע פריימר.

השגת ייצור IPCs גבוה יותר מ- MSCs ממלאת תפקיד חיוני בטיפול בסוכרת. השלבים הקריטיים של הפרוטוקול האינטגרטיבי מסתמכים על איכות התאים שישמשו להעברתם ולאיכות התאים המועברים. דרישות תאים מסוימות שיש לבדוק עבור טרנסולציה מוצלחת מבטיחות את תקינות התא, ניהול בנקאות התאים והתאים נמצאים במצב פעיל במיטוטי. יתר על כן, ניטור הכדאיות של תאים transduced גם ממלא תפקיד חשוב. טרנסדוקציה פחות מוצלחת נגרמת על ידי הכדאיות הירודה של התאים מגורה¹². עבור הפרוטוקולים הלא אינטגרטיביים, המראה המורפולוגי והמושבות הצפות צריכות להיות מושגות מכיוון שהן קשורות להבשלת בידול הלבלב⁹.

במונחים של שינוי ופתרון בעיות של הטכניקה עבור פרוטוקול אינדוקציה אינדוקטיבי, תאים בריאים ואיכותיים ניתן להשיג באמצעות תאים במעברים 3-5 ו 70%-80% מפגש, בעוד איכות התאים transduced יש לפקח על ידי בדיקה שגרתית של איכות התאים מגורה לפני המעבר לשלב הבא. ממצא זה נמצא בקורלציה עם מחקר קודם שהזכיר כי מספר גורמים המשפיעים על היעילות של התמרה מסתמכים על בריאות התא, מפגש התאים ומספר המעברים¹³. במחקר זה, הפרוטוקול הלא אינטגרטיבי עם תהליך אינדוקציה של שלושה שלבים עדיין מתמודד עם מגבלות, בעיקר לגבי גודל המושבה ויצירת מספר המושבה. תוצאה זו עולה בקנה אחד עם המחקר הקודם שלנו^8,9. כדי להתגבר על בעיה זו, אנו מציעים לבדוק את איכות התאים, כמו גם את איכות כלי התרבות ההתקשרות הנמוכה.

המגבלה של טכניקה זו היא המורכבות של פרוטוקול האינדוקציה האינטגרטיבית, שנבעה משימוש בשתי פלטפורמות רצופות שונות. יתר על כן, MOI גבוה יותר אינו מרמז על יעילות גבוהה יותר של transduction. במחקר דומה באמצעות התמרה lentivirus, MOI גבוה יותר לא יכול להשיג יעילות transduction טובה יותר. המחברים מציעים להשתמש אדג'ובנט כגון פרוטמין סולפט¹⁴. המגבלות של שימוש בפרוטוקולים שאינם אינטגרטיביים קשורות לנושאים טכניים כגון טכניקות הטיפול לייצור וקציר של המושבה וגדלים שונים ומבנים מורפולוגיים של IPCs המיוצרים.

גורם התמלול החיוני, PDX1, היה משמעותי, ובכך היה בעל תפקיד פוטנציאלי במחויבות של אינדוקציה MSC כלפי IPCs בוגר^15,16,17,18. השינוי של פרוטוקול עמוד השדרה באמצעות PDX1- overexpressed hDPSCs ואחריו פרוטוקול אינדוקציה של שלושה שלבים כוון בעיקר לייצור מוצלח בתפוקה גבוהה של IPCs בוגרים ופונקציונליים^19,20,21. הממצאים של פרוטוקול זה שיקפו כי אינדוקציה MSC כלפי IPCs בוגרים נדרש ביטוי טרום אנדודרמי של PDX1⁹. ההערכה המורפולוגית הראתה כי המבנה 3D שאינו מצורף של מושבות ניתן להשיג בשני הפרוטוקולים באמצעות כלי התקשרות נמוכה. מבנה זה היה חשוב להשגת ההתבגרות של בידול הלבלב^7,9,22,23. בנוסף, על פי הערכת גודל המושבה, הפרוטוקול האינטגרטיבי הביא למגמה חיובית של מספר המושבה הכולל וייצור מושבה קטן עד בינוני, אשר יכול למנוע ליבה נמקית של המושבה. לכן, זה יהיה מועיל להשתלה נוספת^{7,19,21,24,25}. עלייה של סמני גן הלבלב בשלב מאוחר (ISL-1, MAF-A, GLUT-2, אינסולין, ו- GLP-1R) נצפתה בפרוטוקול זה. סמני הגן הלבלב בשלב מאוחר בפרוטוקול האינדוקציה האינטגרטיבית היו גבוהים יותר בהשוואה לפרוטוקול עמוד השדרה. התגלה כי ביטוי יתר של PDX1 הגדיל את מספר אבות הלבלב, כלומר, תוצאה טובה יותר מבחינת ההתקדמות של התפתחות הלבלב באמצע עד מאוחר ניתן להשיג^19,26,27,28. יתר על כן, כדי להבהיר את הפונקציה של IPCs, בדיקת GSCS בוצעה. h hDPSC-IPCs שהופקו משני הפרוטוקולים הפרש C-פפטיד, דבר המצביע על המושבות הפעילות מבחינה תפקודית.

כדי לסכם את היישומים העתידיים של הטכניקה המשמשת במחקר זה, שני פרוטוקולי אינדוקציה הלבלב הצליחו ליצור את IPCs במבחנה. במונחים של ספירת המושבות הכוללת, ייצור מושבה קטנה עד בינונית, וביטוי סמן הלבלב, הפרוטוקול האינטגרטיבי הראה מגמה מועילה להיווצרות IPC, ותומך ביישום MSC נוסף בטיפולי סוכרת מבוססי תאי גזע לפרקטיקות אנושיות ווטרינריות^{7,29,30,31,32}.

למחברים אין מה לחשוף.

SK, WR, ו- QDL נתמכו על ידי תא גזע וטרינרי ויחידת המחקר הביו-הנדסה, קרן הקרן להנדסה של Ratchadaphiseomphot, אוניברסיטת צ'ולאלונגקורן. TO ו- PP נתמכו על ידי קידום אקדמי Chulalongkorn לתוך פרויקט המאה^השנייה שלה. מדעי מדעי המוח נתמכו על ידי מענק תמיכה במחקר של הפקולטה למדעי הווטרינריה, קידום אקדמי Chulalongkorn לתוך פרויקט המאה השנייה שלה, תאי גזע וטרינריים ויחידת מחקר^{ביו-הנדסה, קרן} קרן ראטצ'אדאפיססומפוט, אוניברסיטת צ'ולאלונגקורן וקרן המחקר הממשלתית.