In vitro Induction de cellules souches de pulpe dentaire humaine vers des lignées pancréatiques

Ce protocole présente une comparaison entre deux protocoles d’induction différents pour différencier les cellules souches de la pulpe dentaire humaine (hDPSC) vers des lignées pancréatiques in vitro: le protocole intégratif et le protocole non intégratif. Le protocole intégratif génère plus de cellules productrices d’insuline (PI).

En 2000, le succès de la transplantation d’îlots pancréatiques à l’aide du protocole d’Edmonton pour traiter le diabète sucré de type I se heurte encore à certains obstacles. Il s’agit notamment du nombre limité de donneurs de pancréas cadavérique et de l’utilisation à long terme d’immunosuppresseurs. Les cellules souches mésenchymateuses (CSE) ont été considérées comme un candidat potentiel en tant que source alternative de génération de cellules de type îlot. Nos rapports précédents ont illustré avec succès l’établissement de protocoles d’induction pour différencier les cellules souches de la pulpe dentaire humaine (hDPSC) des cellules productrices d’insuline (PI). Cependant, l’efficacité d’induction variait considérablement. Dans cet article, nous démontrons la comparaison de l’efficacité de l’induction pancréatique des hDPSC par le biais de protocoles d’induction intégratifs (manipulation microenvironnementale et génétique) et non intégratifs (manipulation microenvironnementale) pour l’octroi de CPI dérivés de hDPSC (hDPSC-IPC). Les résultats suggèrent une efficacité d’induction distincte pour les deux approches d’induction en termes de structure de colonie en 3 dimensions, de rendement, de marqueurs d’ARNm pancréatique et de propriété fonctionnelle en cas de défi de glucose multidose. Ces résultats soutiendront la mise en place future d’une plate-forme de production de CPI et de lignée pancréatique cliniquement applicable.

Le diabète sucré est une préoccupation mondiale constante. Un rapport de la Fédération internationale du diabète (FID) a estimé que la prévalence mondiale du diabète augmenterait de 151 millions en 2000 à 415 millions en 2015^1,2. La dernière étude épidémiologique a prédit que la prévalence mondiale estimée du diabète passera de 451 millions en 2017 à 693 millions en 2045^1. Le succès de la transplantation d’îlots pancréatiques à l’aide du protocole d’Edmonton a été démontré pour la première fois en 2000, lorsqu’il a été démontré qu’il maintenait la production endogène d’insuline et stabilisait l’état normoglycémique chez les patients diabétiques de type I^3. Cependant, l’application du protocole d’Edmonton se heurte toujours à un problème de goulot d’étranglement. Le nombre limité de donneurs de pancréas cadavérique est le principal problème puisque chaque patient atteint de diabète de type I a besoin d’au moins 2 à 4 donneurs d’îlots. En outre, l’utilisation à long terme d’agents immunosuppresseurs peut provoquer des effets secondaires potentiellement mortels^4,5. Pour y remédier, le développement d’un traitement potentiel pour le diabète au cours de la dernière décennie s’est principalement concentré sur la génération de cellules productrices d’insuline (PI) efficaces à partir de diverses sources de cellules souches⁶.

Les cellules souches sont devenues un traitement alternatif dans de nombreuses maladies, y compris le diabète de type I, qui est causé par la perte de cellules bêta. La transplantation d’PI est la nouvelle méthode prometteuse pour contrôler la glycémie chez ces patients⁷. Deux approches pour générer des PI, les protocoles d’induction intégratifs et non intégratifs, sont présentées dans cet article. Le protocole d’induction imitait le processus naturel de développement pancréatique pour obtenir les PI matures et fonctionnels^8,9.

Pour cette étude, les hDPSC ont été caractérisés par cytométrie en flux pour la détection des marqueurs de surface MSC, le potentiel de différenciation multilignage et la RT-qPCR pour déterminer l’expression de la propriété de stemness et des marqueurs de gènes prolifératifs (données non montrées)^8,9,10. Les hDPSC ont été induits vers des cellules bêta ou PI endodermiques, endodermiques pancréatiques, endocriniens pancréatiques et pancréatiques définitifs(Figure 1),respectivement^7. Pour induire les cellules, une approche d’induction en trois étapes a été utilisée comme protocole de base. Ce protocole a été appelé protocole non intégratif. Dans le cas du protocole intégratif, le facteur de transcription pancréatique essentiel, PDX1, a été surexprimé dans les hDPSC, suivi de l’induction de PDX1 surexprimé dans les hDPSC à l’aide d’un protocole de différenciation en trois étapes. La différence entre le protocole non intégratif et le protocole intégratif est la surexpression de PDX1 dans le protocole intégratif et non dans le protocole non intégratif. La différenciation pancréatique a été comparée entre les protocoles intégratifs et non intégratifs de cette étude.

Ce travail a été effectué conformément à la Déclaration d’Helsinki et approuvé par le Comité d’éthique de la recherche humaine, Faculté de médecine dentaire, Université Chulalongkorn. Les DPSC humains (hDPSC) ont été isolés à partir de tissus de pulpe dentaire humaine extraits à la fois des prémolaires et des molaires en raison de problèmes de dents de sagesse. Le consentement éclairé a été obtenu des patients dans le cadre d’un protocole approuvé (HREC-DCU 2018/054).

1. Protocole d’induction intégrative

1. Préparation du vecteur lentiviral porteur de PDX1
   1. Utilisez des cellules 293FT de rein embryonnaire humain (HEK) pour l’emballage viral. Culture et maintien de ces cellules dans le milieu Eagle modifié (DMEM) de Dulbecco complété par 10% de sérum bovin fœtal (FBS), 1% de L-glutamine et 1% d’antibiotiques-antimycotiques.
   2. Générer des vecteurs PDX1-lentivirus par co-transfection de 10 μg chacun des plasmides d’emballage et d’enveloppe et de 20 μg du plasmide génétique ciblé dans des cellules HEK293FT à l’aide d’un système de transfection de phosphate de calcium, par exemple, psPAX2, pMD2. G, et humain pWPT-PDX1¹¹. Assurez-vous que les cellules sont confluentes à 80% à 90% pendant la période d’infection.
   3. Recueillir le milieu contenant des particules lentivirales à 48 et 72 h après la transfection.
   4. Filtrer le milieu recueilli à l’intérieur d’un filtre de 0,45 μm; concentrer les virus à l’avec un filtre centrifuge à un seuil de poids moléculaire nominal de 100 kDa (NMWCO).
2. Surexpression PDX1
   1. Utilisez le passage 3-5 hDPSC qui sont confluents à 70-80%. Trypsiniser et compter les cellules à l’aide d’un compteur de cellules. Ensemencez 1 x^{10 6} hDPSC sur un plat de 60 mm traité par culture tissulaire et incubez pendant la nuit.
   2. 24 h plus tard, ajouter des particules virales fraîches obtenues à partir de l’étape 1.1.4 pour transduire des cellules prétraitées en polybrène (4 μg/mL de polybrene, 30 min sous 37 °C et 5 % de CO₂₎à la multiplicité d’infection souhaitée (MOI). Par exemple, dans ce cas, le MOI utilisé est de 20. Maintenir les cellules dans l’incubateur de culture cellulaire pendant 24 h à 37 °C avec 5% de CO_2.
   3. Après la période d’infection de 24 heures, jeter le milieu contenant des particules virales. Ajouter des milieux de culture frais et continuer à faire pousser les cellules pendant 48 h. Toutes les cultures sont maintenues à 37 °C et 5 % de CO_2.
   4. Vérifiez la morphologie agrégée des cellules transfectées avant de passer à l’étape d’induction. La transduction de PDX1 est confirmée par une analyse del’expression génique( Figure supplémentaire 1 ).
      REMARQUE: Vérifiez la morphologie de la cellule au microscope avant de passer aux étapes suivantes.
   5. Récoltez et passez à un protocole d’induction en trois étapes (étape 1.3) en tant qu’approche d’induction microenvironnementale.
3. Protocole d’induction en trois étapes
   REMARQUE: Le protocole d’induction en trois étapes a abouti à la série de différenciation pancréatique des hDPSC en endoderme définitif, endoderme pancréatique / endocrinien et cellules bêta pancréatiques / IPC en utilisant respectivement un milieu sans sérum (SFM) A, SFM-B et SFM-C.
   1. Jeter le milieu de culture, puis laver les hDPSC transductés avec 1x solution tamponnée au phosphate (PBS).
   2. Ajouter la solution de trypsine-EDTA à 0,25 % aux cellules et incuber pendant 1 min à 37 °C, 5 % de CO_2.
   3. Ajouter le milieu de culture pour arrêter l’activité de la trypsine et rincer doucement les cellules pour obtenir la suspension unicellulaire. Comptez les cellules et aliquote 1 x 10⁶ cellules dans chaque tube collecteur.
   4. Centrifuger la suspension de la cellule à 468 x g (Force centrifuge relative: RCF), 4 °C, pendant 5 min. Jetez le surnageant et conservez la pastille de cellule.
   5. Resuspendez la pastille dans 3 mL du premier milieu d’induction pancréatique, c’est-à-dire un milieu sans sérum (SFM)-A. Ensemencez les cellules sur une plaque de culture à faible fixation (60 mm). Maintenir les cellules à 37 °C et 5 % de CO₂ pendant 3 jours.
      REMARQUE: Observez la morphologie des cellules sous un microscope inversé avant de passer à l’étape suivante.
   6. Retirez SFM-A et ajoutez 3 mL du deuxième milieu d’induction, c’est-à-dire SFM-B. Maintenir les cellules pendant les 2 prochains jours à 37 °C, 5 % de CO_2.
      REMARQUE: Observez la morphologie des cellules sous un microscope inversé avant de passer à l’étape suivante.
   7. Retirer le SFM-B et ajouter 3 mL du troisième milieu d’induction, c’est-à-dire le SFM-C. Maintenir les cellules pendant les 5 prochains jours dans un incubateur de culture cellulaire maintenu à 37 °C avec 5% de CO_2. Changez le support toutes les 48 h. Observez leur morphologie après 5 jours.
      REMARQUE: Chaque milieu d’induction est complété par différents réactifs comme décrit; SFM-A : 1 % d’albumine sérique bovine (BSA), 1x insuline-transferrine-sélénium (ITS), 4 nM d’activine A, 1 nM de butyrate de sodium et 50 μM de bêta-mercaptoéthanol ; SFM-B : 1 % de BSA, 1x ITS et 0,3 mM de taurine ; et SFM C : 1,5 % de BSA, 1x ITS, 3 mM de taurine, 100 nM de peptide de type glucagon (GLP)-1, 1 mM de nicotinamide et 1x acides aminés non essentiels (AEN).
   8. Assurez-vous de vérifier la morphologie cellulaire sous un microscope inversé après chaque étape. Les cellules deviendront plus agrégées et flotteront en colonies.
   9. Recueillir les colonies cellulaires pour une analyse plus approfondie. Vérifiez la morphologie et la taille de la colonie. Effectuer une analyse de l’expression des marqueurs géniques pancréatiques et une analyse fonctionnelle (test de sécrétion de peptide C stimulé par le glucose).

2. Protocole d’induction non intégratif

REMARQUE: Le protocole non intégratif est le protocole de base pour la livraison des PI avec le processus d’induction en trois étapes en tant qu’approche d’induction microenvironnementale^8,9.

1. Utilisez les passages 3-5 hDPSC à 70% de confluence.
2. Jetez le milieu de culture et lavez les hDPSC avec 1x PBS.
3. Ajouter la solution de trypsine-EDTA à 0,25 % sur les cellules et incuber pendant 1 min à 37 °C, 5 % de CO_2.
4. Ajouter le milieu de culture pour arrêter l’activité de la trypsine et pipeter doucement les cellules pour obtenir la suspension unicellulaire. Comptez les cellules et aliquote 1 x 10⁶ cellules dans chaque tube de collecte.
   1. Centrifuger la suspension de la cellule à 468 x g (RCF), 4 °C, 5 min. Jetez le surnageant.
   2. Resuspendez la pastille en SFM-A et ensemencez-la sur une plaque de culture à faible fixation (60 mm). Culturez les cellules à 37 °C et 5 % de CO₂ pendant 3 jours. Vérifiez la morphologie cellulaire au microscope inversé.
   3. Retirez SFM-A, ajoutez SFM-B (Jour 3) puis maintenez les cellules pendant les 2 jours suivants sous 37 °C, 5% CO₂.
   4. Retirez SFM-B, ajoutez SFM-C (Jour 5) puis maintenez les cellules pendant les 5 jours suivants sous 37 °C, 5% co₂. SFM-C est changé toutes les 48 h.
      REMARQUE: Chaque milieu d’induction est complété par différents réactifs comme décrit; SFM-A : 1 % de BSA, 1x ITS, 4 nM d’activine A, 1 nM de butyrate de sodium et 50 μM de bêta-mercaptoéthanol; SFM-B : 1 % de BSA, 1x ITS et 0,3 mM de taurine ; et SFM C : 1,5 % de BSA, 1x ITS, 3 mM de taurine, 100 nM de GLP-1, 1 mM de nicotinamide et 1x NEA.
   5. Assurez-vous de vérifier la morphologie cellulaire au microscope inversé après chaque étape et au jour 10.
      REMARQUE: Les cellules deviendront plus agrégées et flotteront en colonies.
   6. Recueillir les colonies cellulaires pour une analyse plus approfondie. Vérifiez la morphologie et la taille de la colonie. Effectuer une analyse de l’expression des marqueurs géniques pancréatiques et une analyse fonctionnelle (test de sécrétion de peptide C stimulé par le glucose).

Dans cet article, les résultats des deux protocoles d’induction ont été comparés. Les diagrammes des deux protocoles d’induction sont illustrés à la Figure 2A,C. Dans les deux protocoles, l’évaluation a été réalisée au microscope optique et les images ont été analysées avec ImageJ. Les hDPSC ont pu former des structures de type colonie dès le premier jour d’induction dans les deux protocoles d’induction. La morphologie de la colonie était ronde et dense, et toutes les colonies flottaient dans les vaisseaux de culture tout au long de la période d’induction (Figures 2B, D). Le nombre total de colonies des deux protocoles a également été déterminé; le résultat a montré que le nombre total de colonies dans le cas du protocole d’induction intégrative était légèrement plus élevé que le protocole d’induction non intégrative (Figure 2E). Cependant, la différence n’était pas statistiquement significative. De plus, la distribution de la taille des colonies dans les deux protocoles d’induction a également été évaluée(figure 2F). Selon nos résultats, des colonies de petite à moyenne taille se sont formées lors de l’induction intégrative, ce qui était important pour réduire le noyau nécrotique à l’intérieur de la colonie.

L’analyse des marqueurs du gène pancréatique a été réalisée à l’aide de la RT-qPCR selon notre récente publication¹⁰. Des informations sur la liste des amorces utilisées dans cette étude sont incluses dans le tableau 1. La valeur de l’ARNm a été présentée comme une expression relative de l’ARNm par l’ARN ribosomique normalisé à 18S et le contrôle en utilisant la formule de 2^(-ΔΔCt). Les résultats de cette étude ont révélé que le protocole d’induction intégrative a donné des colonies avec une expression élevée de marqueurs pancréatiques tardifs, y compris ISL-1, MAF-A, GLUT-2, INSULINet GLP-1R (Figure 3), suggérant la différenciation des hDPSC en IC. L’évaluation fonctionnelle des hDPSC-IPC a également été décrite(figure 4)dans cette étude. Un test de sécrétion de peptide C stimulant le glucose^8,9 a été utilisé à l’aide d’un kit ELISA. Les résultats ont montré que les protocoles d’induction intégrative et non intégrative ont donné des colonies capables de sécrétion de peptide C.

Figure 1: Diagramme de la différenciation des MSC vis-à-vis des PI. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2: Morphologie, nombre total de colonies et distribution de la taille des colonies des PI à l’aide de deux protocoles différents. Diagramme du protocole intégratif par surexpression du facteur de transcription essentiel, PDX1, suivi d’un protocole d’induction à trois pentes (A). Morphologie des hDPSC transfectés à chaque étape de l’induction (B). Diagramme de non-intégratif en tant que protocole de base (C). Morphologie des hDPSC-IPCs utilisant le protocole non intégratif (D). Répartition totale de la colonie (E) et de la taille de la colonie (F) de deux protocoles différents. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3: Analyse de l’expression génique pancréatique des hDPSC-IPC obtenue à partir de deux protocoles différents. L’expression de l’ARNm de l’endoderme pancréatique (PDX1 et NGN-3) (A), des marqueurs des îlots pancréatiques (ISL-1, MAF-A, GLUT-2et INSULINE) (B), et du marqueur pancréatique (GLP-1R) (C) a été analysée. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4: Analyse fonctionnelle des hDPSC-IPC obtenue à partir de deux protocoles différents. La sécrétion de peptide C dans chaque protocole d’induction, les protocoles intégratifs(A)et non intégratifs(B),ont été déterminés par un test de sécrétion de peptide C stimulé par le glucose (GSCS). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure supplémentaire 1 : Analyse de l’ARNm PDX1 après transduction PDX1. L’analyse de l’expression de l’ARNm PDX1 après 48 h de transduction PDX1 à MOI 20 dans les hDPSC est montrée. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Tableau 1 : Informations sur l’introduction.

L’augmentation de la production de CPI à partir des CSAM joue un rôle essentiel dans le traitement du diabète. Les étapes critiques du protocole intégratif reposent sur la qualité des cellules à utiliser pour la transduction et la qualité des cellules transduisons. Certaines exigences cellulaires qui devraient être vérifiées pour une transduction réussie sont d’assurer la santé des cellules, la gestion des banques de cellules et les cellules sont dans un état mitotiquement actif. En outre, la surveillance de la viabilité des cellules transduisées joue également un rôle important. Une transduction moins réussie est causée par la faible viabilité des cellules stimulées¹². Pour les protocoles non intégratifs, l’aspect morphologique et les colonies flottantes doivent être atteints car ils sont liés à la maturation de la différenciation pancréatique⁹.

En termes de modification et de dépannage de la technique pour le protocole d’induction intégrative, des cellules saines et de bonne qualité peuvent être obtenues en utilisant des cellules dans les passages 3-5 et 70% -80% de confluence, tandis que la qualité des cellules transduisées doit être surveillée en vérifiant régulièrement la qualité des cellules stimulées avant de passer à l’étape suivante. Cette découverte est en corrélation avec une étude précédente qui mentionnait que plusieurs facteurs influençant l’efficacité de la transduction dépendent de la santé cellulaire, de la confluence cellulaire et du nombre de passages^13. Dans cette étude, le protocole non intégratif avec un processus d’induction en trois étapes fait encore face à des limites, principalement en ce qui concerne la taille des colonies et la formation du nombre de colonies. Ce résultat est cohérent avec notre étude précédente^8,9. Pour surmonter ce problème, nous vous suggérons de vérifier la qualité des cellules ainsi que la qualité des vaisseaux de culture à faible attachement.

La limite de cette technique est la complexité du protocole d’induction intégrative, qui était due à l’utilisation de deux plates-formes consécutives différentes. En outre, le MOI plus élevé n’implique pas une plus grande efficacité de la transduction. Dans une étude similaire utilisant la transduction du lentivirus, un MOI plus élevé ne pourrait pas atteindre une meilleure efficacité de transduction. Les auteurs suggèrent d’utiliser un adjuvant tel que le sulfate de protamine^14. Les limites de l’utilisation des protocoles non intégratifs sont liées à des questions techniques telles que les techniques de manipulation pour la production et la récolte de la colonie et les différentes tailles et structures morphologiques des IC produits.

Le facteur de transcription essentiel, PDX1,était significatif, ayant ainsi un rôle potentiel dans l’engagement de l’induction MSC envers les PI matures^15,16,17,18. La modification du protocole backbone en utilisant des hDPSC surexprimés PDX1suivis d’un protocole d’induction en trois étapes visait principalement à la production réussie à haut rendement d’IPC matures et fonctionnels^19,20,21. Les résultats de ce protocole ont reflété que l’induction du MSC vers les IPC matures nécessitait une expression pré-endodermique de PDX1^9. L’évaluation morphologique a montré que la structure 3D non attachée des colonies pouvait être obtenue dans les deux protocoles en utilisant des vaisseaux à faible fixation. Cette structure était importante pour réaliser la maturation de la différenciation pancréatique^7,9,22,23. De plus, selon l’évaluation de la taille des colonies, le protocole intégratif a entraîné une tendance positive du nombre total de colonies et de la production de colonies de petite à moyenne taille, ce qui peut empêcher un noyau nécrotique de la colonie. Par conséquent, il sera bénéfique pour une transplantation ultérieure^{7,19,21,24,25}. La régulation à la hausse des marqueurs des gènes pancréatiques à un stade avancé (ISL-1, MAF-A, GLUT-2, INSULINEet GLP-1R) a été observée dans ce protocole. Les marqueurs du gène pancréatique à un stade avancé dans le protocole d’induction intégrative étaient plus élevés que dans le protocole de base. Il a été révélé que la surexpression de PDX1 augmentait le nombre de progéniteurs pancréatiques, c’est-à-dire qu’un meilleur résultat en termes de progression du développement pancréatique de stade moyen à avancé pouvait être atteint^19,26,27,28. En outre, pour clarifier la fonction des PI, un test GSCS a été effectué. hDPSC-IPCs produits à partir des deux protocoles ont sécrété du peptide C, suggérant les colonies fonctionnellement actives.

Pour résumer les applications futures de la technique utilisée dans cette étude, les deux protocoles d’induction pancréatique ont pu générer les PI in vitro. En termes de nombre total de colonies, de production de colonies de petite à moyenne taille et d’expression de marqueurs pancréatiques, le protocole intégratif a montré une tendance bénéfique pour la formation de PCI, soutenant une application ultérieure du MSC dans les traitements du diabète à base de cellules souches pour les pratiques humaines et vétérinaires^{7,29,30,31,32}.

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

SK, WR et QDL ont été soutenus par l’Unité de recherche sur les cellules souches vétérinaires et la bioingénierie, Ratchadaphiseksomphot Endowment Fund, Université Chulalongkorn. TO et PP ont été soutenus par Chulalongkorn Academic Advancement dans son projet du^2ème siècle. CS a été soutenu par une subvention de soutien à la recherche de la Faculté des sciences vétérinaires, Chulalongkorn Academic Advancement into Its 2^e Century Project, Veterinary Stem Cell and Bioengineering Research Unit, Ratchadaphiseksomphot Endowment Fund, Chulalongkorn University et Government Research Fund.