In vitro Inducción de células madre de pulpa dental humana hacia linajes pancreáticos

Este protocolo presenta una comparación entre dos protocolos de inducción diferentes para diferenciar las células madre de la pulpa dental humana (hDPSC) hacia los linajes pancreáticos in vitro:el protocolo integrador y el protocolo no integrativo. El protocolo integrador genera más células productoras de insulina (IMIC).

A partir de 2000, el éxito del trasplante de islotes pancreáticos utilizando el protocolo de Edmonton para tratar la diabetes mellitus tipo I todavía enfrentaba algunos obstáculos. Estos incluyen el número limitado de donantes de páncreas cadavérico y el uso a largo plazo de inmunosupresores. Las células madre mesenquimales (CME) se han considerado un candidato potencial como una fuente alternativa de generación de células similares a los islotes. Nuestros informes anteriores han ilustrado con éxito el establecimiento de protocolos de inducción para diferenciar las células madre de la pulpa dental humana (hDPSC) a las células productoras de insulina (IMC). Sin embargo, la eficiencia de inducción varió mucho. En este artículo, demostramos la comparación de la eficiencia de inducción pancreática de hDPSC a través de protocolos de inducción integrativos (manipulación microambiental y genética) y no integrativos (manipulación microambiental) para administrar IVC derivados de hDPSC (hDPSC-IVC). Los resultados sugieren una eficiencia de inducción distinta para ambos enfoques de inducción en términos de estructura de colonias en 3 dimensiones, rendimiento, marcadores de ARNm pancreático y propiedad funcional en el desafío de glucosa de dosis múltiples. Estos hallazgos apoyarán el establecimiento futuro de una plataforma de producción de IMIC y linaje pancreático clínicamente aplicable.

La diabetes mellitus es una preocupación mundial constante. Un informe de la Federación Internacional de Diabetes (FID) estimó que la prevalencia mundial de la diabetes aumentaría de 151 millones en 2000 a 415 millones en 2015^1,2. El último estudio basado en la epidemiología ha predicho que la prevalencia mundial estimada de diabetes aumentará de 451 millones en 2017 a 693 millones en 2045¹. El éxito del trasplante de islotes pancreáticos utilizando el protocolo de Edmonton se demostró por primera vez en el año 2000, cuando se demostró que mantenía la producción endógena de insulina y estabilizaba la condición normoglucémica en pacientes diabéticos tipo I³. Sin embargo, la aplicación del protocolo de Edmonton todavía se enfrenta a un problema de cuello de botella. El número limitado de donantes de páncreas cadavérico es el problema principal, ya que cada paciente con diabetes tipo I requiere al menos 2-4 donantes de islotes. Además, el uso a largo plazo de agentes inmunosupresores puede causar efectos secundarios potencialmente mortales^4,5. Para abordar esto, el desarrollo de una terapia potencial para la diabetes en la última década se ha centrado principalmente en la generación de células productoras de insulina (IMC) efectivas a partir de diversas fuentes de células madre⁶.

Las células madre se convirtieron en un tratamiento alternativo en muchas enfermedades, incluida la diabetes tipo I, que es causada por la pérdida de células beta. El trasplante de IPC es el nuevo método prometedor para controlar la glucosa en sangre en estos pacientes⁷. En este artículo se presentan dos enfoques para generar ICCI, protocolos de inducción integrativos y no integrativos. El protocolo de inducción imitó el proceso natural de desarrollo pancreático para obtener los IMIC maduros y funcionales^8,9.

Para este estudio, las hDPSC se caracterizaron por citometría de flujo para la detección de marcadores de superficie MSC, potencial de diferenciación multilinaje y RT-qPCR para determinar la expresión de la propiedad de tallo y marcadores genéticos proliferativos (datos no mostrados)^8,9,10. Las hDPSC fueron inducidas hacia el endodermo definitivo, el endodermo pancreático, el endocrino pancreático y las células beta o ICCI pancreáticas(Figura 1),respectivamente⁷. Para inducir las células, se utilizó un enfoque de inducción de tres pasos como protocolo de columna vertebral. Este protocolo se desllamó protocolo no integrador. En el caso del protocolo integrativo, el factor de transcripción pancreático esencial, PDX1,se sobreexpresó en hDPSC seguido de la inducción de PDX1 sobreexpresado en hDPSC utilizando un protocolo de diferenciación de tres pasos. La diferencia entre protocolo no integrativo e integrativo es la sobreexpresión de PDX1 en el protocolo integrativo y no en el protocolo no integrativo. La diferenciación pancreática se comparó entre los protocolos integrativos y no integrativos en este estudio.

Este trabajo se realizó de acuerdo con la Declaración de Helsinki y fue aprobado por el Comité de Ética de investigación humana, Facultad de Odontología, Universidad de Chulalongkorn. Las DPSC humanas (hDPSC) se aislaron de tejidos de pulpa dental humana extraídos de premolares y molares debido a problemas de muelas del juicio. Se obtuvo el consentimiento informado de los pacientes bajo un protocolo aprobado (HREC-DCU 2018/054).

1. Protocolo de inducción integrativa

1. Preparación del vector lentiviral portador de PDX1
   1. Utilice células de riñón embrionario humano (HEK) 293FT para el envasado viral. Culta y mantenga estas células en el Medio Águila Modificada (DMEM) de Dulbecco suplementado con 10% de suero fetal bovino (FBS), 1% de L-glutamina y 1% de antibiótico-antimicótico.
   2. Generar vectores PDX1-lentivirus mediante coinfección de 10 μg cada uno de los plásmidos de empaquetamiento y envoltura y 20 μg del plásmido gen objetivo en células HEK293FT utilizando el sistema de transfección de fosfato de calcio, por ejemplo, psPAX2, pMD2. G, y pWPT-PDX1humano¹¹. Asegúrese de que las células sean 80% -90% confluentes durante el tiempo de la infección.
   3. Recoger el medio que contiene partículas lentivirales a las 48 y 72 h después de la transfección.
   4. Filtrar el medio recogido a través de un filtro de 0,45 μm; concentrar los virus con un filtro centrífugo a un límite de peso molecular nominal de 100 kDa (NMWCO).
2. Sobreexpresión de PDX1
   1. Use pasaje 3-5 hDPSC que sean 70-80% confluentes. Tripsinizar y contar las celdas usando un contador de celdas. Sembrar 1 x 10⁶ hDPSCs en un plato tratado con cultivo de tejidos de 60 mm e incubar durante la noche.
   2. 24 h más tarde, agregue partículas de virus frescas obtenidas de la etapa 1.1.4 para transducir células pretratadas con polibreno (4 μg/ml de polibreno, 30 min por debajo de 37 °C y 5% de CO₂₎a la multiplicidad de infección (MOI) deseada. Por ejemplo, en este caso, MOI utilizado es 20. Mantener las células en el incubador de cultivo celular durante 24 h a 37 °C con un 5% de CO_2.
   3. Después del período de infección de 24 h, deseche el medio que contiene partículas virales. Agregue medios de cultivo frescos y continúe cultivando las células durante 48 h. Todos los cultivos se mantienen a 37 °C y 5% de CO_2.
   4. Compruebe la morfología agregada de las células transfectadas antes de proceder a la etapa de inducción. La transducción de PDX1 se confirma mediante análisis de expresión génica (Figura suplementaria 1).
      NOTA: Compruebe la morfología celular bajo un microscopio antes de proceder a los siguientes pasos.
   5. Cosechar y proceder a un protocolo de inducción de tres pasos (paso 1.3) como un enfoque de inducción microambiental.
3. Protocolo de inducción de tres pasos
   NOTA: El protocolo de inducción de tres pasos dio lugar a la serie de diferenciación pancreática de hDPSC a endodermo definitivo, endodermo pancreático/ endocrino y células beta /IMC pancreáticas utilizando medio libre de suero (SFM)-A, SFM-B y SFM-C, respectivamente.
   1. Deseche el medio de cultivo y luego lave las hDPSC transducidas con 1 solución tamponada con fosfato (PBS).
   2. Añadir solución de tripsina-EDTA al 0,25% a las células e incubar durante 1 min a 37 °C, 5% CO_2.
   3. Agregue el medio de cultivo para detener la actividad de la tripsina y enjuague suavemente las células para obtener la suspensión de una sola célula. Cuente las células y alícuota 1 x 10⁶ células en cada tubo colecta.
   4. Centrifugar la suspensión celular a 468 x g (Fuerza Centrífuga Relativa: RCF), 4 °C, durante 5 min. Deseche el sobrenadante y guarde el pellet celular.
   5. Resuspend el pellet en 3 ml del primer medio de inducción pancreática, es decir, medio libre de suero (SFM)-A. Sepete las células en una placa de cultivo de baja unión (60 mm). Mantenga las células a 37 °C y 5% de CO₂ durante 3 días.
      NOTA: Observe la morfología de las células bajo un microscopio invertido antes de pasar al siguiente paso.
   6. Elimine SFM-A y agregue 3 ml del segundo medio de inducción, es decir, SFM-B. Mantenga las células durante los próximos 2 días a 37 °C, 5% CO₂.
      NOTA: Observe la morfología de las células bajo un microscopio invertido antes de pasar al siguiente paso.
   7. Elimine SFM-B y agregue 3 ml del tercer medio de inducción, es decir, SFM-C. Mantener las células durante los próximos 5 días en una incubadora de cultivo celular mantenida a 37 °C con 5% de CO_2. Cambia el medio cada 48 h. Observa su morfología después de 5 días.
      NOTA: Cada medio de inducción se complementa con diferentes reactivos como se describe; SFM-A: 1% de albúmina sérica bovina (BSA), 1x insulina-transferrina-selenio (ITS), 4 nM de activina A, 1 nM de butirato de sodio y 50 μM de beta-mercaptoetanol; SFM-B: 1% BSA, 1x ITS y 0.3 mM taurina; y SFM C: 1,5% BSA, 1x ITS, 3 mM taurina, 100 nM de péptido similar al glucagón (GLP)-1, 1 mM nicotinamida y 1x aminoácidos no esenciales (NEAA).
   8. Asegúrese de verificar la morfología celular bajo un microscopio invertido después de cada paso. Las células se volverán más agregadas y flotarán como colonias.
   9. Recolectar colonias celulares para su posterior análisis. Verifique la morfología y el tamaño de la colonia. Realizar análisis de expresión de marcadores genéticos pancreáticos y análisis funcionales (ensayo de secreción de péptido C estimulado por glucosa).

2. Protocolo de inducción no integrador

NOTA: El protocolo no integrador es el protocolo troncal para entregar los IVC con el proceso de inducción de tres pasos como un enfoque de inducción microambiental^8,9.

1. Utilice pasaje 3-5 hDPSCs con una confluencia del 70%-80%.
2. Deseche el medio de cultivo y lave las hDPSC con 1x PBS.
3. Añadir una solución de tripsina-EDTA al 0,25% sobre las células e incubar durante 1 min a 37 °C, 5% CO_2.
4. Agregue el medio de cultivo para detener la actividad de la tripsina y pipetee suavemente las células para obtener la suspensión de una sola célula. Cuente las células y alícuota 1 x 10⁶ células en cada tubo de recolección.
   1. Centrifugar la suspensión celular a 468 x g (RCF), 4 °C, 5 min. Deseche el sobrenadante.
   2. Vuelva a colocar el pellet en SFM-A y colópelo en una placa de cultivo de baja fijación (60 mm). Culta las células a 37 °C y 5% de CO₂ durante 3 días. Compruebe la morfología celular bajo un microscopio invertido.
   3. Retire SFM-A, agregue SFM-B (Día 3) y luego mantenga las células durante los próximos 2 días por debajo de 37 ° C, 5% CO₂.
   4. Retire SFM-B, agregue SFM-C (Día 5) y luego mantenga las células durante los próximos 5 días por debajo de 37 ° C, 5% CO₂. SFM-C se cambia cada 48 h.
      NOTA: Cada medio de inducción se complementa con diferentes reactivos como se describe; SFM-A: 1% BSA, 1x ITS, 4 nM de activina A, 1 nM de butirato de sodio y 50 μM de beta-mercaptoetanol; SFM-B: 1% BSA, 1x ITS y 0.3 mM taurina; y SFM C: 1,5% BSA, 1x ITS, 3 mM taurina, 100 nM de GLP-1, 1 mM de nicotinamida y 1x NEAAs.
   5. Asegúrese de verificar la morfología celular bajo el microscopio invertido después de cada paso y en el día 10.
      NOTA: Las celdas se volverán más agregadas y flotarán como colonias.
   6. Recolectar colonias celulares para su posterior análisis. Verifique la morfología y el tamaño de la colonia. Realizar análisis de expresión de marcadores genéticos pancreáticos y análisis funcionales (ensayo de secreción de péptido C estimulado por glucosa).

En este artículo, se compararon los resultados de ambos protocolos de inducción. Los diagramas de ambos protocolos de inducción se ilustran en la Figura 2A,C. En ambos protocolos, la evaluación se realizó bajo un microscopio de luz, y las imágenes se analizaron con ImageJ. Las hDPSC fueron capaces de formar estructuras similares a colonias desde el primer día de inducción en ambos protocolos de inducción. La morfología de la colonia era redonda y densa, y todas las colonias flotaban en los vasos de cultivo durante todo el período de inducción(Figuras 2B,D). También se determinó el recuento total de colonias de ambos protocolos; el resultado mostró que el recuento total de colonias en el caso del protocolo de inducción integrativa fue ligeramente mayor en comparación con el protocolo de inducción no integrativa (Figura 2E). Sin embargo, la diferencia no fue estadísticamente significativa. Además, también se evaluó la distribución del tamaño de la colonia en ambos protocolos de inducción(Figura 2F). Según nuestros resultados, se formaron colonias de tamaño pequeño a mediano tras la inducción integradora, que fue importante para reducir el núcleo necrótico dentro de la colonia.

El análisis de marcadores genéticos pancreáticos se realizó utilizando RT-qPCR según nuestra reciente publicación¹⁰. La información sobre la lista de cebadores utilizados en este estudio se incluye en la Tabla 1. El valor de ARNm se presentó como una expresión relativa de ARNm por ARN ribosómico normalizado a 18S y el control utilizando la fórmula de 2^(-ΔΔCt). Los resultados de este estudio revelaron que el protocolo de inducción integrativa produjo colonias con alta expresión de marcadores pancreáticos tardíos, incluyendo ISL-1, MAF-A, GLUT-2, INSULINAy GLP-1R (Figura 3),lo que sugiere la diferenciación de hDPSCs hacia ICCI. La evaluación funcional de los hDPSC-IIC también se describió (Figura 4) en este estudio. Se empleó un ensayo de secreción de péptido C estimulante de glucosa^8,9 utilizando un kit ELISA. Los resultados mostraron que los protocolos de inducción integrativa y no integrativa produjeron colonias que fueron capaces de secretar péptido C.

Figura 1: Diagrama de la diferenciación de MSC hacia los IMIC. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2:Morfología, recuento total de colonias y distribución del tamaño de las colonias de los IMIC utilizando dos protocolos diferentes. Diagrama del protocolo integrativo por sobreexpresión del factor de transcripción esencial, PDX1, seguido de protocolo de inducción de tres empinadas (A). Morfología de las hDPSC transfectadas en cada paso de la inducción (B). Diagrama de no integrativo como protocolo troncal (C). Morfología de hDPSC-ICT utilizando el protocolo no integrador (D). Colonia total (E) y distribución del tamaño de la colonia (F) de dos protocolos diferentes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Análisis de expresión génica pancreática de hDPSC-ICCI obtenidos a partir de dos protocolos diferentes. Se analizó la expresión de ARNm del endodermo pancreático (PDX1 y NGN-3) (A), marcadores de islotes pancreáticos (ISL-1, MAF-A, GLUT-2e INSULINA) (B) y marcador relacionado con el páncreas (GLP-1R) (C). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Análisis funcional de hDPSC-ICCI obtenidos a partir de dos protocolos diferentes. La secreción de péptido C en cada protocolo de inducción, los protocolos integrativos(A)y no integrativos(B),se determinaron mediante un ensayo de secreción de péptido C estimulado por glucosa (GSCS). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura suplementaria 1: Análisis de ARNm PDX1 después de la transducción PDX1. Se muestra el análisis de expresión de ARNm PDX1 después de 48 h de transducción de PDX1 a MOI 20 en hDPSCs. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Tabla 1: Información de la cartilla.

Lograr una mayor producción de IMIC a partir de las CSPY juega un papel esencial en la terapia de la diabetes. Los pasos críticos del protocolo integrador se basan en la calidad de las células que se utilizarán para la transducción y la calidad de las células transducidas. Algunos requisitos celulares que deben verificarse para una transducción exitosa son garantizar la salubridad celular, el manejo del banco celular y las células estén en un estado mitóticamente activo. Además, el monitoreo de la viabilidad de las células transducidas también juega un papel importante. La transducción menos exitosa es causada por la mala viabilidad de las células estimuladas¹². Para los protocolos no integradores, se debe lograr la apariencia morfológica y las colonias flotantes porque están relacionadas con la maduración de la diferenciación pancreática⁹.

En términos de modificación y solución de problemas de la técnica para el protocolo de inducción integrativa, se pueden obtener células sanas y de buena calidad mediante el uso de células en pasajes de confluencia del 3-5 y del 70% al 80%, mientras que la calidad de las células transducidas debe monitorearse verificando rutinariamente la calidad de las células estimuladas antes de pasar al siguiente paso. Este hallazgo está en correlación con un estudio previo que mencionó que varios factores que influyen en la eficiencia de la transducción dependen de la salud celular, la confluencia celular y el número de pasajes¹³. En este estudio, el protocolo no integrador con un proceso de inducción de tres pasos todavía enfrenta limitaciones, principalmente en lo que respecta al tamaño de la colonia y la formación del número de colonias. Este resultado es consistente con nuestro estudio anterior^8,9. Para superar este problema, sugerimos verificar la calidad de las células, así como la calidad de los vasos de cultivo de baja unión.

La limitación de esta técnica es la complejidad del protocolo de inducción integrativa, que se debió al uso de dos plataformas consecutivas diferentes. Además, el MOI más alto no implica una mayor eficiencia de transducción. En un estudio similar utilizando la transducción de lentivirus, un MOI más alto no pudo lograr una mejor eficiencia de transducción. Los autores sugieren el uso de un adyuvante como el sulfato de protamina¹⁴. Las limitaciones del uso de los protocolos no integradores están relacionadas con cuestiones técnicas como las técnicas de manipulación para la producción y cosecha de la colonia y los diferentes tamaños y estructuras morfológicas de los IIC producidos.

El factor de transcripción esencial, PDX1,fue significativo, por lo que tuvo un papel potencial en el compromiso de la inducción MSC hacia los ICCI maduros^15,16,17,18. La modificación del protocolo de columna vertebral mediante el uso de hDPSC sobreexpresadas PDX1seguidas de un protocolo de inducción de tres pasos se dirigió principalmente a la producción exitosa de alto rendimiento de ICCI maduras y funcionales^19,20,21. Los hallazgos de este protocolo reflejaron que la inducción de MSC hacia IIC maduros requirió expresión preendodérmica de PDX1⁹. La evaluación morfológica mostró que la estructura 3D no unida de las colonias se podía obtener en ambos protocolos mediante el uso de vasos de baja fijación. Esta estructura fue importante para lograr la maduración de la diferenciación pancreática^7,9,22,23. Además, de acuerdo con la evaluación del tamaño de la colonia, el protocolo integrador resultó en una tendencia positiva del número total de colonias y la producción de colonias de tamaño pequeño a mediano, lo que puede prevenir un núcleo necrótico de la colonia. Por lo tanto, será beneficioso para un trasplante adicional^{7,19,21,24,25}. La regulación ascendente de los marcadores genéticos pancreáticos en etapa tardía(ISL-1, MAF-A, GLUT-2, INSULINAy GLP-1R)se observó en este protocolo. Los marcadores genéticos pancreáticos en etapa tardía en el protocolo de inducción integrativa fueron más altos en comparación con el protocolo de columna vertebral. Se reveló que la sobreexpresión de PDX1 aumentó el número de progenitores pancreáticos, es decir, se pudo lograr un mejor resultado en términos de la progresión del desarrollo pancreático en etapa media a tardía^19,26,27,28. Además, para aclarar la función de los IIC, se realizó un ensayo GSCS. Los hDPSC-IMIC producidos a partir de ambos protocolos secretaron péptido C, lo que sugiere las colonias funcionalmente activas.

Para resumir las futuras aplicaciones de la técnica utilizada en este estudio, ambos protocolos de inducción pancreática fueron capaces de generar los ICCI in vitro. En términos del recuento total de colonias, la producción de colonias de tamaño pequeño a mediano y la expresión de marcadores pancreáticos, el protocolo integrador mostró una tendencia beneficiosa para la formación de IPC, apoyando una mayor aplicación de MSC en tratamientos de diabetes basados en células madre para prácticas humanas y veterinarias^{7,29,30,31,32}.

Los autores no tienen nada que revelar.

SK, WR y QDL fueron apoyados por la Unidad de Investigación de Células Madre Veterinarias y Bioingeniería, Fondo de Dotación Ratchadaphiseksomphot, Universidad de Chulalongkorn. TO y PP fueron apoyados por Chulalongkorn Academic Advancement into Its^2nd Century Project. CS fue apoyado por una subvención de apoyo a la investigación de la Facultad de Ciencias Veterinarias, chulalongkorn Academic Advancement into Its^2nd Century Project, Veterinary Stem Cell and Bioengineering Research Unit, Ratchadaphiseksomphot Endowment Fund, Chulalongkorn University y Government Research Fund.